JP2023011890A - 人工エネルギー再生システムを必要としない新規の無真核細胞発現システム - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Abstract
Description
本出願は、2017年2月9日に出願された米国仮特許出願第62/457,073号
の優先権の利益を主張するものであり、その開示内容はこの参照によりその全体で本明細
書に組み込まれる。
システム中の例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/または多糖の製造に関す
る。特定の実施形態は、細胞小器官(例えば、色素体、ミトコンドリアまたはクロロプラ
スト)を利用して無細胞システムにおけるバイオポリマーの継続的製造のためのエネルギ
ーを提供することで、システム内のある特定の望ましくないエネルギー貯蔵分子、例えば
クレアチンリン酸の必要性がなくなる。
スの需要増加は、迅速かつ効率的なタンパク質製造およびスクリーニングプラットフォー
ムを必要とする。Leader et al.(2008)Nat.Rev.Drug
Discov.7(1):21-39;Swartz(2012)Aiche J.58
(1):5-13。無細胞タンパク質合成(CFPS)の新たな技術は、この需要を満た
すのに役立ち得る。Carlson et al.(2012)Biotechnol.
Adv.30(5):1185-94。細胞系発現と比較して、CFPSは、短いプロセ
ス時間ならびに反応条件の直接的制御および監視などの利点を提供する。Swartz(
2012)、上記.労力を要するクローニングおよび形質転換ステップのない複数のタン
パク質の同時発現のために、PCR産物を直接使用することができる。Wu et al
.(2007)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.46(18):335
6-8;Yabuki et al.(2007)J.Struct.Funct.Ge
nomics 8(4):173-91;Gan & Jewett(2014)Bio
technol.J.9(5):641-51。CFPSプラットフォームにより、タン
パク質の折り畳みを促進するアクセサリー因子の追加(Ozawa et al(200
5)J.Biomol.NMR 32(3):235-41;Endo et al.(
2006)Mol.Biotechnol.33(3):199-209;Matsud
a et al(2006)J.Struct.Ltd.Genomics 7(2):
93-100)、または非天然アミノ酸の組み込み(Albayrak & Swart
z(2013)Nucleic Acids Res.41(11):5949-63)
;White et al.(2013)Methods 60:70-4)が可能とな
る。また、生細胞で製造できない細胞毒性タンパク質の発現を促進する。Xu et a
l.(2005)Appl.Biochem.Biotechnol.127(1):5
3-62;Schwarz et al.(2008)Proteomics 8(19
):3933-46;Xun et al.(2009)Protein Expr.P
urif.68(1):22-7。
の低コスト、スケーラビリティ、高生産性のため有利である。Zawada et al
.(2011)Biotechnol.Bioeng.108(7):1570-8;C
aschera & Noireaux(2014)Biochimie 99:162
-8.しかしながら、溶解物は細菌から生じるため、非効率的な酸化的折り畳みにより、
またシャペロンおよびグリコシル化機構の欠如により、複数のサブドメインを有する複合
タンパク質の製造には不適切である。無真核細胞システムは、かかるタンパク質の発現の
ためにより適しており、翻訳後修飾のほとんどの形態をサポートする。Chang et
al.(2005)J.Mol.Biol.353(2):397-409;Zhan
g & Kaufman(2006)Handb.Exp.Pharmacol.(17
2):69-91。最も頻繁に使用されるシステムは、小麦胚芽抽出物(WGE)、昆虫
細胞抽出物(ICE)、およびウサギ網赤血球溶解物(RLL)に基づく。しかし、これ
らのシステムは高価であり、抽出物調製は複雑である。Carlson et al.(
2012),上記。これにより、Leishmania tarentolae(Mur
eev et al(2009)Nat.Biotechnol.27(8):747-
52)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Brodel et al(20
14)Biotechnol.Bioeng.111(1):25-36)、およびSa
ccharomyces cerevisiae(Hodgman&Jewett(20
13)Biotechnol.Bioeng.110(10):2643-54;Gan
& Jewett(2014)、上記)に基づくものなどのさらなる真核CFPSの需
要が生じた。
の特徴である短い反応時間および低タンパク質製造量によって制限されてきた。これらの
性質は、不良なタンパク質収量および製造されたタンパク質の単位当たりの過剰コストに
つながる。
られ得る。Spirin et al.(1988)Science 242:1162
-1164。連続的な反応は、何十時間(または何百時間もの)以上にわたって実施され
、連続流れに依存する方法は、必要な反応基質をチャンバーに絶えず供給する必要がある
。したがって、これらの反応は、かなりの時間およびリソースの投資を必要とする。さら
に、「連続的な」システムでの翻訳は、大量のタンパク質を製造する方向に向けられ、シ
ステムは、静的(「バッチ」)インビトロ翻訳反応を実施するために使用されるものと実
質的に異なる。静的反応は、小さな反応容量(例えばマイクロリットル)で実行すること
ができ、分取量(例えばミリグラム)のタンパク質を製造する方向には向けられない。こ
うしたバッチ反応は、1~2時間で完了し得る。前述の全ての理由から、対応するバッチ
システムと比較して反応期間およびタンパク質収量を増加させる一方で、連続反応システ
ムはより高価な試薬を必要とする。
本明細書に開示される一般的な戦略は、無細胞溶解物系反応において細胞小器官を利用
して、反応システム内のエネルギー再生を提供する。この戦略は、一部の例では、バイオ
ポリマー(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、および複合炭水化物)の改
善されたインビトロ合成を達成するために有用である。特定の実施形態では、無真核細胞
システムにおけるミトコンドリアの存在は、従来のバッチ式および連続反応に対する改善
された反応システムをもたらし、これは例えば、エネルギー送達試薬(例えば、クレアチ
ンリン酸および/またはクレアチンキナーゼ)の添加、および/またはアミノ酸補充の必
要性を著しく低減または除去する一方、反応期間を長くすることによる。一部の例では、
開示された無細胞重合反応は、当該技術分野で現在利用されている従来的反応よりも著し
く効率的である。
含む細胞溶解物、ポリマー鋳型およびポリマーのモノマー単位を合わせることを含む、バ
イオポリマーの合成方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、反応体積は、例
えば、クレアチンリン酸/クレアチンキナーゼエネルギー再生システムを含まず、それに
より、反応体積にリン酸塩が加えられないか、または最小のリン酸塩が加えられるように
なる。特定の実施形態では、細胞小器官はミトコンドリアである。一部の実施形態では、
細胞溶解物は、真核細胞溶解物;例えば、植物(例えば、タバコ、トウモロコシおよびダ
イズ)細胞由来の溶解物である。一部の例における細胞溶解物は、Bright Yel
low-2(BY-2)タバコ細胞由来の溶解物である。一部の実施形態では、ポリマー
鋳型はDNA分子またはRNA分子である。ポリマー鋳型としてRNAを利用する反応は
、翻訳反応を通してモノマーアミノ酸からバイオポリマーとしてポリペプチドを製造する
。ポリマー鋳型としてDNAを利用する反応を利用して、インビトロ複製または転写反応
を通してモノマーヌクレオチドからバイオポリマーとしてさらなる核酸分子(例えば、D
NAおよびRNA)を製造してもよく、または鋳型からの転写に連結させた翻訳反応を通
してポリペプチドを製造してもよい。ある特定の実施形態では、バイオポリマーのエネル
ギーフリー合成の方法は、例えば、限定されないが、細胞小器官、ポリマー鋳型および/
またはモノマー単位を反応体積に加えること、および/または反応体積からバイオポリマ
ーを単離することを含み得る。一部の例では、溶解物の成分が、TCAサイクルからの中
間体で始まる内因性生合成経路を用いてアミノ酸を生成できるので、反応体積は、タンパ
ク質の発現をサポートするためのアミノ酸補充を必要としない。したがって、一部のこう
した例では、細胞小器官を含む溶解物中に存在するアミノ酸は、ポリペプチドの持続した
合成をサポートするのに十分であり得る。
反応体積が外因性クレアチンリン酸および/またはクレアチンキナーゼを含む限り、最小
量の外因性クレアチンリン酸、最小量のクレアチンキナーゼまたはその両方を補充されて
もよい。例えば、反応体積は、15mM以下、10mM以下、5mM以下、1mM以下、
500μM以下、100μM以下、50μM以下、または10μM以下の添加されたクレ
アチンリン酸を含有し得る。別の例では、反応体積は、100μg/mL以下、50μg
/mL以下、10μg/mL以下、5μg/mL以下、1μg/mL以下、0.5μg/
mL以下、または0.1μg/mL以下の添加されたクレアチンキナーゼを含有し得る。
これらの量は、バイオポリマー合成を維持するため(本明細書に開示される長期の期間に
わたりバイオポリマー合成を維持するためなど)に適しておらず、したがって、本明細書
に開示される方法およびシステムに従い、色素体、ミトコンドリア、または葉緑体などの
細胞小器官を含めることを必要とする。
を合成するためのシステムを含む。これらの実施形態では、システムは、水性細胞溶解物
、(内因性または外因性の)細胞小器官、ポリマー鋳型を含む。特定の実施形態では、シ
ステムはポリマーのモノマー単位も含む。インビトロバイオポリマー合成のための従来の
無細胞システムはさらに、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含み、これは合
成反応が進行するにつれてシステム内のエネルギー再生に使用される。本明細書の実施形
態では、システムはクレアチンリン酸を実質的に欠いており、クレアチンリン酸およびク
レアチンキナーゼがシステムに添加されない。ある特定の例では、システムはクレアチン
リン酸およびクレアチンキナーゼのいずれも含まない。特定の実施形態では、バイオポリ
マーの合成のためのシステムは、例えば、限定されないが、pH緩衝剤、マグネシウム(
例えば、Mg(C5H8NO4)2)、カリウム(例えば、KC5H8NO4)、ヌクレ
オシド(例えば、ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸、およびヌクレオチド一
リン酸)、酵素(例えば、RNAポリメラーゼ)、およびクロラムフェニコールをさらに
含んでもよい。特定の実施形態では、グルタミン酸塩以外のアミノ酸はシステムに既に存
在するもの(すなわち、溶解物中および細胞小器官中に存在するアミノ酸)に追加されな
い。一部の例では、前述のシステムは、20時間を超える長期(例えば、約40時間)の
活性を示してもよく、加えられるクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含む以外
は同一の従来のシステムより有意に多くの(例えば、約60%多くの)標的タンパク質を
製造してもよい。
合成するためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、人工エネルギー再生シス
テムを使用することなくバイオポリマーを合成するためのシステムの成分、およびキット
の使用を指示するための書面説明書を含む。例えば、限定されないが、キットは、一つ以
上の別々の体積中に配置された、水性細胞溶解物、(内因性または外因性の)細胞小器官
、ポリマー鋳型、およびポリマーのモノマー単位のうちの一つ以上と共に、キットの成分
の混合を指定する説明書ならびにクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない
任意の外因性成分を含んでもよい。さらなる例として、キットは、pH緩衝剤、マグネシ
ウム、カリウム、ヌクレオシド、酵素(例えば、RNAポリメラーゼ)、およびクロラム
フェニコールのうちの一つ以上をさらに含んでもよい。特定の実施形態によるバイオポリ
マーの合成のためのキットは、水性細胞溶解物(例えば、葉緑体および/またはミトコン
ドリアを含む)、ポリマーのモノマー単位(例えば、ヌクレオシド)、および書面説明書
を含んでもよい。こうした特定の実施形態では、書面説明書は、ユーザーが、組み合わせ
にクレアチンリン酸(エネルギー再生のためのクレアチンキナーゼと共に)を加えること
なく、これらの成分を目的のポリマー鋳型(例えば、ポリペプチドをコードするDNA分
子)および任意の他の試薬に合わせることを指示するものであってもよい。
ンドリアを組み込み、それによって、インビトロ合成の状況内でミトコンドリア機能に影
響する化合物またはタンパク質を定量的に調べるために利用され得る。さらに、TCAサ
イクルの中間体は、アミノ酸の補充が長期のポリペプチド合成に必要ないように、アミノ
酸を産生するために合成反応の間に利用され得る。一部の実施形態では、本明細書の方法
、システム、およびキットで使用するための細胞溶解物は、合成反応の酸素依存性を減少
させる葉緑体を含む。例えば、細胞溶解物は、色素体、葉緑体および/またはミトコンド
リアが溶解物中に保持されるように、光合成活性細胞から調製されてもよく、一方で望ま
しくない細胞材料は除去される。このような特定の例では、本明細書の方法、システム、
およびキットは、色素体由来エネルギー、ミトコンドリア由来エネルギー再生、葉緑体由
来エネルギー再生、または両方の組み合わせを利用し得る。
説明からより明らかになるであろう。
粗溶解物に基づく無細胞タンパク質合成(CFPS)システムは、インビボシステムに
対していくつもの利点を提供し、広範な応用、特に、タンパク質エンジニアリング、バイ
オ医薬品製造、および研究において有用である。従来の粗溶解物は、翻訳、タンパク質折
り畳み、およびエネルギー代謝に必要な成分を含み、そのため、RNA鋳型によりコード
されるほぼあらゆるタンパク質が、溶解物にエネルギー貯蔵試薬が補充される限り、アミ
ノ酸、ヌクレオチド、および塩の存在下でその中で合成される。連結された転写/翻訳シ
ステムでは、DNA鋳型からのタンパク質の合成を指示するために、RNAポリメラーゼ
を加えることができる。細胞内合成とは対照的に、CFPSは、より短いプロセス時間、
タンパク質加水分解の減少、ならびに毒性タンパク質および定義された位置において特定
の化学基または非天然アミノ酸を含有するタンパク質を発現する能力を許容し得る。さら
に、反応は直接的に制御および監視され得る。
細胞溶解物を利用するバイオポリマー合成(例えば、ポリペプチド合成)のための無細胞
システムが本明細書に開示される。実施形態において、システムは、酸化的リン酸化によ
る合成反応の間のエネルギー再生のために細胞小器官(例えば、色素体、ミトコンドリア
または葉緑体)を含む真核細胞溶解物を利用する。ある特定の例では、細胞溶解物は、B
Y-2細胞に由来するミトコンドリアを含むタバコBY-2溶解物である。酸化的リン酸
化中の細胞真核システムでは、電子は、ミトコンドリアの内膜内に位置する電子伝達系を
介して電子供与体から酸素のような電子受容体へと移動する。これらの酸化還元反応はエ
ネルギーを放出し、それはADPをATPにリン酸化するために使用される。本明細書の
実施形態は、このプロセスからのエネルギーを利用して、溶解物中のバイオポリマーの継
続的合成を促進する。したがって、本明細書の実施形態では、電子伝達系の阻害剤および
気密条件を使用して、酸化的リン酸化によるエネルギー再生を停止させ、それにより、シ
ステムの翻訳作用を終了させることにより合成反応を停止させることができる。一部の実
施形態では、システムは、嫌気性または実質的に嫌気性の条件で反応が進行することを可
能にすることができる色素体、葉緑体を含む。
コンドリアを欠いている。代わりに、これらのシステムは、必要なATP再生を達成して
タンパク質の発現をサポートするために、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼの
追加を必要とする。タンパク質の発現をサポートするためにエネルギー再生のために反応
混合物に加えられる遊離リン酸(クレアチンリン酸に由来する)の多くの蓄積は、これら
のシステムの性能における有意な制限因子である。Ezure et al.(2006
)Biotechnol.Prog.22(6):1570-7;Takai et a
l.(2010)Curr.Pharm.Biotechnol.11:272-8;B
rodel et al.(2014)Biotechnol.Bioeng.111(
1):25-36;Hodgman&Jewett(2013)、上記;Schobor
g et al.(2014)Biotechnol.J.9(5):630-40。シ
ステムに導入された遊離リン酸は、マグネシウム(転写および翻訳に必要)に結合し、合
成性能の早期の崩壊および低い生成物収量をもたらす。
「連続流れ」反応を使用して、長持ちするエネルギー供給源を提供し、反応区画内のリン
酸のような阻害成分を希釈する。バイオポリマー合成のための人工エネルギー再生システ
ムを含まない本明細書に記載のシステムは、阻害成分の産生がより少なく、かつそれら自
体のエネルギー再生能力を有するので、反応透析の必要性を低減または排除する。しかし
ながら、本明細書のシステムは、実施者の裁量によって望ましい場合、連続流れの構成で
利用されてもよい。
リマー合成のシステムは一般的に安価であり、またそれらはより長くタンパク質を製造し
、結果的にバイオポリマー収量の増加をもたらす。さらに、本明細書のシステムは、例え
ば、無細胞タンパク質発現のさらなる促進因子として、ミトコンドリアおよび/または葉
緑体機能に影響を与える化合物または経路を調査する可能性を提供する。したがって、本
明細書の実施形態の基本的に異なるシステムは、いっそうさらなる利益を提供するように
最適化され得る。
サポートする能力があり、かかる増殖によって、IVTT反応および/またはタンパク質
分解における基質の枯渇が生じ、標的タンパク質の終了が低減されることがある。したが
って、一部の実施形態では、システムは、微生物増殖を阻害するクロラムフェニコールを
含み、これはこれらの実施形態においてタンパク質の発現を改善し得る。特定の実施形態
では、システムは、例えば、10~500μg/mL(例えば、25~250μg/mL
、50~200μg/mL、および100~200μg/mL)の量のクロラムフェニコ
ールを含む。
の実施形態において驚くべきロバストな発現を提供し得るという発見が本明細書に記載さ
れ、該発現は、標準的なNTP量から予測されたものの約20%以上(例えば、18%以
上、19%以上、20%以上、21%以上、22%以上、23%以上、24%以上、25
%以上、18~25%多い、19~23%多い、約20%多い)であり得る。したがって
、一部の例では、システムは、約150mMのATP、約40mMのGTP、約20mM
のCTP、および約20mMのUTPを含み得る。これらの低減された量のNTPを利用
することのさらなる利点は費用の低減であり、これは従来の植物細胞システムよりもGT
P(最も高価なNTP)の量が低減されることによる。
りの改善を与え得るという驚くべき発見が本明細書に記載される。例えば、プロトプラス
ト形成および溶解物調製の脱液胞化工程の間のソルビトールの使用は、タンパク質産生量
の増加をもたらし得ると同時に、ソルビトールはマンニトールなどの他の一般的に使用さ
れる浸透圧剤よりも安価であるので、システムのコストをさらに低減させ得る。さらなる
例として、IVTT反応の溶解物の比率を50~90%(例えば、55~85%)(v/
v)に増加させることは、いくつかの標的タンパク質のより高い発現を引き起こす。した
がって、本明細書において特定の例は、例えば、約60体積%(例えば、58%、59%
、60%、61%、および62%)、または約80体積%(例えば、78%、89%、8
0%、81%、および82%)の量で、プロトプラスト形成および脱液胞化の間にソルビ
トールを用いて調製された、細胞溶解物の使用を含む。また別の例として、グルコシルグ
リセロールの添加は、IVTT反応のタンパク質収量を劇的に増加させる。例えば、グル
コシルグリセロールのない標準反応と比較して、0,25%~4%の量のグルコシルグリ
セロールは最大80%多くのタンパク質をもたらした。いかなる特定の理論にも束縛され
るものではないが、グルコシルグリセロールは、推定ではタンパク質および膜の安定性を
増加させることによって、反応収量を高める。したがって、一部の実施形態では、システ
ムは0.25~4%(例えば、0.25~2%、0.25~1%、約0.5%、および1
.5%)のグルコシルグリセロールを含む。さらなる例として、必要ではないが、分岐ア
ミノ酸(BCAA)BCAAの追加を利用してタンパク質産生量を増加させることができ
る。したがって、一部の実施形態では、システムは、約0.25~4mMの量または0.
5~2mMの量(例えば、0.48~2.2mM、0.5~2.0mM、0.5~1mM
、および約1mM)のBCAAを含む。
る標的タンパク質の製造は、最大64時間延長され得る。一例では、80体積%の溶解物
および0.5体積%のグルコシルグリセロールとの反応は、ほぼ2.5mg/mLのeY
FPをもたらす。
AAD-12 アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ-12
ADP アデノシン二リン酸
ATP アデノシン三リン酸
BCAA 分岐鎖アミノ酸
BY-2 Bright Yellow-2
BYL BY-2細胞溶解物
CFPS 無細胞タンパク質合成
CFU コロニー形成単位
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CL セルラーゼ酵素
CK クレアチンキナーゼ
CP クレアチンリン酸
Cry1F Bacillus thuringiensis Cry1Fデルタ-エン
ドトキシン
Cry3A B.thuringiensis Cry3Aデルタ-エンドトキシン
CTP シチジン三リン酸
DMSO ジメチルスルホキシド
DOE 実験の設計
DTT ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
eYFP 強化黄色蛍光タンパク質
FADH フラビンアデニンジヌクレオチド
GTP グアノシン三リン酸
ICE 昆虫細胞抽出物
IMAC 固定化金属親和性クロマトグラフィー
IVTT インビトロ転写および翻訳
NADH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
NADPH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
NEB New England Biolabs
NTP ヌクレオチド三リン酸
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PEG ポリエチレングリコール
RLL ウサギ網赤血球溶解物
SEC サイズ排除クロマトグラフィー
TCAサイクルトリカルボン酸サイクル(「クレブスサイクル」)
TTA テノイルトリフルオロアセトン
UTP ウリジントリリン
UTR 非翻訳領域
WGE 小麦胚芽抽出物
単離された:「単離された」生物学的成分(例えば、核酸またはタンパク質)は、当該成
分が天然に存在している、生物体の細胞中の他の生物学的成分(すなわち、他の染色体お
よび染色体外のDNAおよびRNA、ならびにタンパク質)から、当該成分において化学
的変化または機能的変化に影響を与えながら、実質的に分離され、離れて産生され、また
は精製されている(例えば、核酸は、染色体中の残りのDNAと当該核酸を繋ぐ化学的結
合を破壊することにより、染色体から単離することができる)。「単離されている」核酸
分子およびタンパク質としては、標準的な精製法により精製された核酸分子およびタンパ
ク質が挙げられる。またこの用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸
およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチド
を包含する。
ヌクレオチドを指す場合があり、RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖とアンチセ
ンス鎖の両方を含み、ならびにそれらの合成型および混合型ポリマーを含む場合がある。
ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイ
プのヌクレオチドの修飾型を指す場合がある。本明細書で使用される場合、「核酸分子」
は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。別段の言及がない限り、核酸分
子は通常、少なくとも10塩基の長さである。前記用語はDNAの一本鎖および二本鎖の
形を含む。核酸分子は、天然型、および/または非天然型のヌクレオチド結合によって、
共に連結された天然型ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれか、または両方を含
んでもよい。
れてもよく、あるいは非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでもよい。かかる修
飾としては、例えば、標識、メチル化、一つ以上の天然型ヌクレオチドとアナログの置換
、ヌクレオチド間修飾(例えば、非荷電結合:例えばホスホン酸メチル、リン酸トリエス
テル、ホスホロアミダート、およびカルバマート;荷電結合:例えばホスホロチオアート
およびホスホロジチオアート;ペンデント部分(pendent moieties):
例えば、ペプチド;インターカレーター:例えば、アクリジン、ソラレンなど;キレータ
ー;アルキレーター;および修飾結合:例えば、アルファアノマー核酸など)が挙げられ
る。また、「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分的に二重、三重、ヘアピン
型、環状および南京錠型立体配座を含む位相幾何学立体配座も含む。
、色素体、ミトコンドリアまたはクロロプラスト)に適用される場合、その細胞溶解物と
は異なる起源を有するこうした成分を意味する。例えば、その細胞溶解物を起源としない
該溶解物に加えられる色素体、ミトコンドリア、または葉緑体は、該細胞溶解物にとって
外因性である。外因性という用語は、いずれの場合にもその細胞溶解物自体に由来しない
限り、細胞溶解物を派生させるために使用される細胞種と同じ細胞種または異なる細胞種
(例えば、異なる組織または異なる種由来の細胞)からの色素体、ミトコンドリア、また
は葉緑体などの細胞小器官に適用されてもよい。さらに、外因性という用語は、本明細書
に開示されるシステムの細胞溶解物で使用される色素体、ミトコンドリア、または葉緑体
といった細胞小器官に別個にまたは追加で加えられるエネルギー再生システムの成分(例
えば、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ)を意味するために本明細書において
使用され得る。
本開示は、人工再生システムを使用することなく、バイオポリマーを合成するためのシス
テムを提供する。本明細書のシステムには、酸化的リン酸化が活性化され、エネルギー貯
蔵試薬の非存在下での収量の増加を提供する、バイオポリマーの強化されたインビトロ合
成を達成する組成物および方法が含まれる。収量の改善は、反応IVTT成分の組み合わ
せによって得られ、これは実施者によって組み立てられて混合されてもよく、または予混
合された成分、混合されていない成分、もしくはこれら二つの組み合わせとしてキットに
提供されてもよい。実施者は、自分が提供する成分と組み合わせて、キットの成分の一部
またはすべてを利用してもよい;例えば、一部の実施形態では、キットは、DNAまたは
RNA鋳型以外のタンパク質合成のためのシステムのすべての成分を含み、DNAまたは
RNA鋳型は選択されたタンパク質を合成するために実施者によって提供される。システ
ムのすべての成分が、適切な環境条件下で反応体積中で混合されると、反応が開始され、
明細書に記載される重要な変更と共に、一般的に従来のインビトロ無細胞合成反応にした
がって進行する。反応は、成分(例えば、NTPおよびアミノ酸)の一つ以上が反応体積
中で使い果たされるまで、またはシステム内のエネルギー再生プロセスを終了するために
環境条件を調節することによって停止されるまで進行が許容され得る。
の方法に対してタンパク質の製造およびタンパク質の折り畳みにおいて有意な改善をもた
らす。例えば、細胞小器官の存在に起因して、酸化的リン酸化は反応体積で活性であるた
め、本明細書のシステムは、合成阻害に伴う二次エネルギー源の必要性を低減または完全
に回避する。
らのRNAの転写、ポリペプチドへのRNAの翻訳、および単糖からの複合炭水化物の合
成を含む、バイオポリマーの製造/複製に有用である。強化された合成は、一部の例では
、システムで合成されるバイオポリマーの合計量または相対量の増加;単位時間当たりに
合成されるバイオポリマーの合計量または相対量の増加;合成される生物学的活性バイオ
ポリマー(例えば、適切に折り畳まれたかつ/または翻訳後修飾されたタンパク質)の合
計量または相対量の増加;合成される可溶性バイオポリマーの合計量または相対量の増加
、ならびに所与の量のバイオポリマーを合成するために必要な時間および/または費用の
支出の低減のうちの一つ以上を含む。
の翻訳はDNA鋳型からのmRNAのインビトロ合成に連結されてもよい。こうした無細
胞システムは、mRNAの翻訳に必要なすべての因子、例えば、リボソーム、アミノ酸、
tRNA、アミノアシル合成酵素、伸長因子、開始因子、およびリボソームリサイクル因
子を含有する。本明細書の例では、このような無細胞システムは、真核細胞、例えば植物
細胞(例えば、タバコBY-2細胞)から本明細書に記載される方法で調製された細胞溶
解物を含む。
本明細書の実施形態は、任意の真核細胞溶解物を利用するように適合され得る。無真核
細胞溶解物は、様々な翻訳後プロセシング活性を保持する。真核細胞溶解物はまた、多種
多様なウイルスおよび他の原核性RNA、ならびに真核性mRNAのインビトロでの翻訳
をサポートする。細胞溶解物が由来する生物体のコドン用法から逸脱するコドン用法を有
する鋳型mRNAは、例えば、該生物体中の希少なtRNAおよび/またはアミノ酸をシ
ステムに補充することによって、効率的に使用され得る。本明細書の特定の例は、タバコ
BY-2細胞溶解物を利用し、これはバッチ培養および攪拌タンク発酵槽の両方における
懸濁培養において簡便かつコスト効果の高い発酵を提供することが示され、また充分に確
立された遺伝子改変ツールに適している。
び細胞膜の破壊/除去、分解液胞の除去、および内因性mRNAの除去を含み得る。
均質化、酵素消化、高周波音波、減圧、凍結/解凍サイクル、および手動粉砕などの技術
によって破壊され得る。本明細書の特定の実施形態では、植物細胞溶解物は、一つ以上の
細胞壁消化酵素(例えば、Cellulase Onozuka RS(商標)、Pec
tolyase Y-23(商標)、Macerozyme R-10)、および液体酵
素(例えば、Rohament CL(商標)、Rohament PL(商標)、およ
びRohapect UF(商標);これらは元々、果物ジュースおよび抽出物の製造を
意図していた)を使用して細胞壁を消化することにより調製される。Rohament
CL(商標)はセルラーゼ濃縮物を含み、Rohament PL(商標)はペクチナー
ゼ濃縮物であり、Rohapect UF(商標)は、専用のペクチナーゼおよびアラバ
ナーゼを含む酵素複合体を含有する。これらの酵素の組み合わせの使用により、従来の方
法と比較して、100倍を超えてプロトプラスト形成のコストが低減された。
プチドおよびmRNAの合成を妨げるプロテアーゼおよびリボヌクレアーゼなどの望まし
くない酵素を含有する。本明細書の一部の実施形態では、分解液胞は、Percoll勾
配またはその他の任意の密度勾配において遠心分離により除去される。液胞は低密度を有
し、したがってプロトプラストから分離されることができ、高密度脱液胞化プロトプラス
トが得られる。一部の例では、段階的なスクロース密度勾配を脱液胞化のために利用して
もよく、ここでプロトプラストはPercollフリーの上層に直接塗布される。遠心分
離後、脱液胞化プロトプラストは、例えば、40%~70%のPercoll層(使用さ
れる勾配に応じて)の間の界面で濃縮された液体から分離されるが、分離された低密度の
液胞は低密度の勾配にあり、例えば、上層上に浮遊する。
し、その後、Dounce組織粉砕機または窒素分解によって破壊してもよい。核および
破壊されていない細胞の除去後、18Sおよび28SリボソームRNAの完全性が主に影
響を受けないまま、溶解物を処理して内因性mRNAを破壊し、バックグラウンドの翻訳
を最小化し得る。本明細書の特定の例において、ヌクレアーゼS7が使用される。
本明細書のシステムでバイオポリマーの合成を指示するために、保存された情報がポリ
マーに変換されるように、反応に鋳型が存在する必要がある。無細胞タンパク質合成のた
めの鋳型は、対象の任意のポリヌクレオチド(DNA)またはポリペプチド(DNAおよ
び/またはmRNA)をコードするmRNAまたはDNAのいずれかであり得る。連結さ
れた転写/翻訳システムは、認識可能なプロモーターを用いてDNA鋳型からmRNAを
連続的に生成する。内因性RNAポリメラーゼが使用されてもよく、または外因性RNA
ポリメラーゼ(例えば、ファージRNAポリメラーゼ、一般的にT7またはSP6)が、
反応混合物に直接添加されてもよい。別の方法として、mRNAは、RNA依存性RNA
ポリメラーゼであるQBレプリカ―ぜの鋳型にメッセージを挿入することによって継続的
に増幅されてもよい。一部の実施形態では、複数のクローニング領域の一端にポリA配列
を含有するベクターをIVTT反応の鋳型として使用する。例えば、このようなベクター
は、複数のクローニング領域の反対側末端にSP6、T7、またはT3 RNAポリメラ
ーゼプロモーターを含有してもよく、その結果、ベクターへのクローニングは、5’末端
および3’末端におけるポリA配列のRNAポリメラーゼプロモーターに隣接する遺伝子
を産生する。mRNAが鋳型として利用される実施形態では、精製されたmRNAは、反
応混合物に添加される前に化学修飾によって安定化され得る。
チド配列は、より高いレベルの発現を達成するように最適化され得る。いくつかのmRN
A構造特性は、コード配列の5’末端および3’末端における非翻訳領域(UTR)を含
む翻訳効率に影響を及ぼす。5’UTRの構造は、翻訳開始、終結、およびmRNA安定
性に影響を与える。翻訳開始の速度制限ステップの一つは、43S開始前複合体へのmR
NAの結合である。翻訳機構は、リーダーシーケンスにおける5’キャップまたは翻訳エ
ンハンサーによってリクルートされる。本明細書のある特定の実施形態では、鋳型mRN
Aは、PCITE2aにおける5’UTR(これは脳心筋炎ウイルス(EMCV)に由来
する内部リボソーム進入部位(IRES)を含有する);ベクターpF3Aにおけるオオ
ムギ黄萎ウイルス(BYDV)の配列;バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子の5’UT
R;ポリA配列を含む合成の3’UTR;およびARC-1配列エレメントを含む5’U
TR(これは内部18S rRNAセグメントに相補的であり、40Sリボソームサブユ
ニットへの結合を促進する場合がある);タバコモザイクウイルス(TMV)5’-UT
R(オメガ配列)(最初のGUAトリプレットの上流にGAAAGAを付加することによ
って改善され得る)を含む群から選択される非翻訳領域を含有してもよい。
在下で、キャップされたmRNAをインビトロで製造するためにDNA分子が使用される
。非組み込みヌクレオチドおよびキャップアナログは、ゲル濾過によって除去されてもよ
く、その後、ポリペプチド合成の鋳型としての役割を果たす、精製されたmRNAが本明
細書に記載される無細胞システムに導入され得る。
連結されたIVTT反応において、リボヌクレオチド三リン酸(ATP、GTP、CT
P、UTP)およびアミノ酸は、所望のバイオポリマーを合成するために使用されるモノ
マー単位としてシステムで必要とされる。本明細書の一部の実施形態では、システムは、
従来のエネルギー再生システムを伴う同等のシステムに対して、一つ以上のNTPのレベ
ルが低減されて作動する。これらの実施形態では、開示されたシステムは、システムの作
動に対する費用を有利に減少させる。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、
2~10mM、例えば4~8mM、または5~7mMのATPの最終ATP濃度で作動す
る。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、0.8~2.5mM、例えば1~
2mMまたは1.4~1.8mMのGTPの最終GTP濃度で作動する。ある特定の実施
形態では、開示されたシステムは、0.4~2.4mM、例えば0.5~2mMまたは0
.6~1.0mMのCTPの最終CTP濃度で作動する。また、ある特定の実施形態では
、開示されたシステムは、0.4~2.4mM、例えば0.5~2mMまたは0.6~1
.0mMのUTPの最終UTP濃度で作動する。例えば、システムは、6mMまたは約6
mMのATP、1.6mMまたは約1.6mMのGTP、0.8mMまたは約0.8mM
のCTP、および0.8mMまたは約0.8mMのUTPの最終NTP濃度で作動し得る
。特定の例において、合成反応は、約150mMのATP、約40mMのGTP、約20
mMのCTP、および約20mMのUTPを含有する低濃度NTP混合物で補充され、N
TPの最終濃度を提供するのに十分な量でミックスがシステムに追加される。アミノ酸は
また、例えば、最終濃度20~500pMの最終濃度まで加えられ得る。放射性標識アミ
ノ酸(例えば、35Sメチオニンおよび3Hロイシンを連結反応で使用し、その後、対応
するアミノ酸をアミノ酸混合物から外してもよい。
塩の濃度は、本明細書の実施形態によるシステムで制御される。例えば、システムは、
例えば、限定されないが、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、および(例えば、酢
酸または硫酸の)マンガンなどの他の生物学的に関連する塩などの一つ以上の塩を加えら
れてもよい。こうした塩のうちの一つ以上は、カウンター陰イオンとしてアミノ酸を有し
てもよい。合成反応の機能に関してイオン種の間に相互依存性がある。反応媒体内の特定
のイオンの濃度を変化させたとき、それに応じて別のイオンの濃度が変化し得る。例えば
、追加された塩の濃度は、ヌクレオチドなどの他の成分の変化にしたがって同時に制御さ
れ得る。さらに、連続流反応器内の成分の濃度レベルは、経時的に変化し得る。
マグネシウムは、リボソームの組み立てを強化し、組み立てられたリボソームの安定性
を強化するため、タンパク質の翻訳に重要である。マグネシウムはまた、ポリメラーゼ結
合の促進において役割を果たすようである。本明細書の実施形態では、細胞溶解物のマグ
ネシウム濃度は、追加的なマグネシウム化合物によって調節され得る。一部の実施形態で
は、さらなるマグネシウム化合物は塩であり、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシ
ウム、グルタミン酸マグネシウムである。転写および翻訳を連結するために、十分な量の
マグネシウム塩を溶解物に添加して、最終マグネシウム濃度を、RNAがDNAから転写
され、かつRNAがタンパク質に翻訳されるレベルまで上昇させてもよい。一部の例では
、最終的なマグネシウム濃度は1~20mMに調整され得る。例えば、最終マグネシウム
濃度は、使用される溶解物に応じて、5~15mM、7~13mM、2.5mM~5.5
mM、2.5mM~3.5mM、2.6mM~3.0mM、3.0mM~5.25mM、
または4.0mM~4.75mMであり得る。
のマグネシウムレベルは、余分なマグネシウムを添加する前に、マグネシウムアッセイの
使用を通して直接測定されてもよい。例えば、Lancer「Magnesium Ra
pid Star Diagnostic Kit」(Oxford LabWareD
ivision(商標)、Sherwood Medical Co.、St.Loui
s、MO)は、生体液のマグネシウムレベルを正確に測定できる一つのアッセイである。
溶解物の所与のバッチについてマグネシウムイオン濃度が既知であると、追加的なマグネ
シウムを追加して、溶解物のマグネシウム濃度を望ましい範囲内にもたらし得る。
を受ける。したがって、例えば、リボヌクレオチド三リン酸濃度が上昇すると、リボヌク
レオチド三リン酸は溶液中のマグネシウムと会合またはキレート化する傾向があるので、
最適なマグネシウム濃度は同時に増加する。したがって、リボヌクレオチド三リン酸濃度
が増加すると、追加的なマグネシウムも反応に一般的に加えられる。マグネシウムの最適
濃度も細胞溶解物のタイプによって変化する。追加する必要があるマグネシウムの量はま
た、反応混合物で使用される溶解物の濃度によって変化し、溶解物の濃度を増加させると
溶解物自体からのマグネシウムの寄与が増加する。
一般的に、望ましいレベルのバイオポリマー合成を達成するために、カリウムもシステ
ムに加えられる。カリウム(例えば、酢酸カリウムおよびグルタミン酸カリウム)は、一
般的に5~250mM(例えば、5~100mM、5~75mM、5~50mM、および
5~30)の濃度で存在する。特定の例では、カリウム濃度は10~20mMであっても
よく、さらに具体的には約20mMであってもよい。マグネシウムの場合と同様に、内因
性の細胞溶解物成分の存在により、最終的なカリウム濃度はわずかに変化し得る。
合成反応の効率または安定性を改善するために必要に応じて、追加的な成分も特定の実
施形態ではシステムに追加されてもよい。絶対的に必要ではないが、連結された転写およ
び翻訳反応への一つの一般的な追加は、例えば、鎖伸長の効率を刺激するのに十分な量の
ポリアミンである。ポリアミンは、最適なマグネシウムレベルにも影響を与え、翻訳反応
のための効果的なマグネシウム濃度を少し低下させることが知られている。したがって、
ポリアミンは、一部のレベルでマグネシウムを置換することができ、特定の例では連結さ
れた転写および翻訳のための最適なマグネシウムレベルの低下を許容し得る。
ましくない活性に関与する酵素または因子は、抽出物から直接除去されてもよく、または
望ましくない酵素をコードする遺伝子は、不活性化または染色体から欠失されてもよい。
.Sci.U.S.A.81:7421-5を参照)から精製された、または合成の小胞
もシステムに加えられ得る。これらは、タンパク質合成および折り畳みを強化するために
使用され得る。例えば、本明細書に記載されるシステムは、膜タンパク質を活性化するた
め;例えば、タンパク質を挿入もしくは移動させるか、または他の化合物を移動させるた
めに、無細胞反応のために使用されてもよく、またこれらのプロセスは、所望の膜タンパ
ク質を含有する小胞を加えることによって特定の実施形態で支援されてもよい。
に記載されるシステムに加えることができる。このような材料には、例えば、限定されな
いが、他の塩、フォリン酸、環状AMP、タンパク質または核酸分解酵素の阻害剤、RN
asin、タンパク質合成の阻害剤または調節剤、酸化/還元電位の調整剤、DTT、ク
ロラムフェニコール、非変性界面活性剤、緩衝剤成分(反応pHを安定化させるために溶
液中で使用され得るものなど)、PEG、Triton X-100、スペルミン、スペ
ルミジン、およびプトレシンなどが含まれ得る。
めのシステムの成分を含むキットを含む。特定の実施形態では、キットは細胞溶解物を含
み得る。代替的に、キットは、細胞溶解物の調製のための細胞を得るために培養および増
幅させるための細胞を含み得る。特定の実施形態では、キットは、塩、NTP、酵素(例
えば、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ)、酵素阻害剤(例えば、RNasin)、鋳型
、およびその他の添加剤(例えば、クロラムフェニコール)のうちの一つ以上を含み得る
。特定の例において、キットは、システム内の鋳型として使用するために、目的遺伝子を
クローニングすることができるネイキッドベクターを含み得る。細胞溶解物を含むキット
では、溶解物は標準であってもよく、またはその塩濃度の調整がすでに製造中に行われて
いるタイプであってもよく、または追加的に、連結された転写および翻訳のために必要な
成分、試薬もしくは緩衝液のうちの一つ以上が含まれているタイプであってもよい。特定
の例では、キットは鋳型を含まない場合があるが、代わりに鋳型の提供をユーザーに依存
してもよい。キットは、合成反応を実施するために、キットの成分を利用する方法をユー
ザーに知らせるために、一組の説明書を含むか、または説明を含むウェブサイトへのリン
クを含んでもよい。
上述のシステムは、一つ以上のバイオポリマーのインビトロ合成方法において使用され
てもよい。インビトロ合成とは、生物学的抽出物および/または定義された試薬を含む反
応混合物中の生物学的マクロ分子の無細胞合成を指す。本明細書のシステムを使用して、
これらの構成が当技術分野で公知であるように、バッチ、連続フロー、および半連続フロ
ー構成で無細胞合成反応を実施し得る。一部の実施形態では、バッチ培養細胞を使用して
もよい。一部の実施形態では、再現性のある均質な細胞材料の供給を確実にするために、
細胞を攪拌タンク発酵槽内で連続的に生育させることができる。
一部の用途で考慮され得るが、他の用途ではそうではない。例えば、連続システムは一般
的にタンパク質の大規模産業製造に使用されるが、静的システム反応は小規模のインビト
ロ翻訳(例えば、研究の状況)により適する。連続的な翻訳は実施することがはるかに高
価であり、機器への投資、ならびに多くの量の試薬を必要とする。特に、連続真核生物反
応作業を行うために使用されるRNAポリメラーゼのレベルは、単純な研究用途に対して
禁止されている場合がある(すなわち、20,000~30,000U/反応)。さらに
、連続反応は、比較的大容量で実施されるように設計されているが、静的反応は、典型的
には100μl以下のオーダーに過ぎないため、追加的な装置は必要なく、また少量の試
薬のみを必要とする。
数の同時合成を実施するために多重系とされてもよい。連続反応は、試薬の流れを導入す
るために供給機構を使用し、プロセスの一部として最終生成物を単離してもよい。連続反
応および静的反応の両方では、活性合成の期間を延長するために追加的な試薬を導入し得
る。反応器は、バッチ、拡張バッチ、半バッチ、半連続型、流加バッチ、および連続的な
どの任意のモードで実行されてもよく、そのモードは適用目的にしたがって選択されても
よい。
、小規模反応では、反応容量は、1~15μl、少なくとも15μl、少なくとも50μ
l、少なくとも100μl、少なくとも0.5mL、または少なくとも1mLであるが、
10mL未満であってもよい。原則として、十分な酸素(またはその他の電子受容体)が
供給される限り、反応は任意のスケールで行われ得る。最大量の生成物の製造のために、
産業バイオリアクターを使用してもよい。
質単離手段を利用してもよい。一部の実施形態では、連続操作モードで動作し、反応器か
らの生成物出力は膜を通して流れ、タンパク質単離手段に入る。半連続操作モードでは、
膜の外側または外部表面は、所定の順序で周期的に変更される所定の溶液と接触する。こ
れらの溶液は、アミノ酸およびヌクレオチドなどの基質を含み得る。この時点で、反応器
は、透析または透析ろ過バッチまたは流加バッチモードで動作する。フィード溶液は、同
じ膜または別個の注射ユニットを通して反応器に供給されてもよい。合成されたタンパク
質は反応器内に蓄積され、次いでシステム操作の完了後にタンパク質精製の通常方法にし
たがって単離され、精製される。
できる。接線流は、ATPリサイクリングおよび膜の詰まりの防止に有効であり、垂直流
に重ねられ得る。膜に垂直な流れは、陽圧ポンプまたは真空吸引ポンプによって生じるか
、または影響を受け得る。膜の外部表面と接触する溶液は周期的に変更されてもよく、膜
に対して定常的な接線流としてもよい。さらに、反応器は、適切な撹拌手段によって内部
または外部で攪拌されてもよい。
ク質単離手段は、抗体分子または合成された所望のタンパク質を吸着するための成分を固
定化された他の分子で被覆された粒子を充填したユニットおよび適切なサイズの細孔を有
する膜を含み得る。タンパク質単離手段は、交互使用のための二つのカラムを含むことが
好ましい。
方法は、翻訳されている特定のタンパク質の活性を測定するアッセイの利用可能性に依存
する。タンパク質活性を測定するためのアッセイの例は、ルシフェラーゼアッセイシステ
ム、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイシステムである。
これらのアッセイは、翻訳反応から産生される機能的に活性なタンパク質の量を測定する
。活性アッセイは、不適切なタンパク質折り畳みまたはタンパク質活性に必要なその他の
翻訳後修飾の欠如に起因して不活性の全長タンパク質を測定しない。代替的に、特定のタ
ンパク質は、キャピラリー電気泳動によってそのサイズにしたがって検出され得る。
る別の方法は、35S-メチオニン、3H-ロイシン、またはl4C-ロイシンなどの放
射性標識アミノ酸の既知量を使用して反応を実施した後、新規翻訳タンパク質に組み込ま
れた放射性標識アミノ酸の量を測定する。組み込みアッセイは、切断タンパク質産物を含
む、反応で生成されたすべてのタンパク質中の放射性標識アミノ酸の量を測定することに
なる。放射線標識タンパク質はタンパク質ゲル上でさらに分離されてもよく、オートラジ
オグラフィーによって生成物が適切なサイズであること、および二次タンパク質生成物が
製造されていないことが確認されてもよい。
植物材料
タバコ細胞(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yel
low 2、BY-2)を26℃の暗所で20~25%の充填細胞容量を維持しながら5
L発酵槽(Type 100e、Applicon(商標)Biotechnology
、AC Schiedam、オランダ)または振盪フラスコ中で培養した。3%(w/v
)のスクロース、1mg/Lのチアミン-HCl、0.2mg/Lの2,4ジクロロフェ
ノキシ酢酸、100mg/Lのミオイノシトール、250mg/Lのオルトリン酸二水素
カリウム、およびPluronic(登録商標)L-61消泡剤(BASF(商標)、M
ount Olive、NJ、USA)を添加したMurashige-Skoog液体
培地(MurashigeおよびSkoog基底塩混合物)を使用した。
20~25%の一定の充填細胞体積での発酵の指数増殖期の間に、BY-2細胞を採取
した。プロトプラストを調製するために、発酵培地中で直接的に3%(v/v)のRoh
ament(登録商標)CLおよび0.2%(v/v)のRohapect(登録商標)
UF(ペクチナーゼおよびアラバナーゼ)(AB Enzyme(商標)、Darmst
adt、Germany)で処理した。360mMのマンニトールを添加することにより
容量オスモル濃度を調節した。
ner Bio-One(商標)、Frickenhausen、ドイツ)中の0.7M
のマンニトール、20mMのMgCl2および5mMのPIPES-KOH(pH 7.
0)中に(底部から上部まで)70%(v/v、3ml)、40%(v/v、5ml)、
30%(v/v、3ml)、15%(v/v、3ml)および0%(3ml)のPerc
oll(GE(商標)Healthcare、Munich、ドイツ)を含有する不連続
Percoll勾配上にプロトプラストを層状とした。スインギング-バケットローター
(JS-5.3、Beckmann-Coulter(商標)、Krefeld Ger
many)中25℃で1時間、6800×gで遠心分離後、40~70%(v/v)のP
ercoll溶液境界面から脱液胞化プロトプラストを回収し、50mL当たり1錠のC
omplete EDTA-free Protease Inhibitor Mix
ture(Roche Diagnostics(商標)、Mannheim、ドイツ)
を添加した3~3.5容量のTR緩衝液(30mMのHEPES-KOH(pH 7.4
)、60mMのグルタミン酸カリウム、0.5mMのグルタミン酸マグネシウム、2mM
のDTT)に懸濁させた。
)、Melsungen、ドイツ)の15ストロークを使用して氷上で破壊し、核および
非破壊細胞を、500×gで10分間4℃で遠心分離することによって除去した。次いで
上清を1mLのアリコート中、-80℃で凍結した。凍結の前に任意に、上清に0.5m
MのCaCl2を補充し、20℃で15分間、75U/mLのヌクレアーゼS7(Roc
he Diagnostics)で処理し、その後、Ca2+イオンのキレート剤として
2mMのEGTAを補充してヌクレアーゼを不活性化させることができる。
ベクターpIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP-Hisは、T7プロモー
ターおよび最初の6ヌクレオチドとしてGAAAGAを有するタバコモザイクウイルス5
’オメガリーダー配列を含有するアニールしたオリゴヌクレオチドプライマー1(配列番
号1)およびオリゴヌクレオチドプライマー2(配列番号2)をNspI部位およびNc
oI部位を使用してpIVEX1.3_eYFP-His(Dr.Stefan Kub
ick(Fraunhofer Institute for Cell Therap
y and Immunology IZI、Potsdam-Golm、ドイツ)の好
意により提供された)に挿入することにより調製した。N末端ストレプトアビジンアフィ
ニティタグを含有するベクターpIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-e
YFPについて、オリゴヌクレオチドプライマー3(配列番号3)およびオリゴヌクレオ
チドプライマー4(配列番号4)と共に鋳型としてpIX3.0_Strep-eYFP
(Dr.Stefan Kubickの好意により提供された)を使用するPCRにより
Strep-eYFP配列を増幅した。PCR産物をPciIおよびAcc65Iで消化
し、pIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP-HisのNcoI部位およびA
cc65I部位に挿入した。
A、VIP3A、Cry6A、17912、およびCry1Fを有するpIVEXベクタ
ーは、オリゴヌクレオチドプライマー5~24(配列番号5~24)を使用する遺伝子の
PCR増幅、およびGibsonアセンブリー(NEB(商標)、Frankfurt、
ドイツ)によりNcoIおよびKpnIで切断したpIVEX_GAAAGA_Omeg
a_eYFP-HisへのPCR産物のその後の組込みにより作製した。
連結された転写翻訳反応を、25℃および700rpmで40~52時間、サーモミキ
サー(Ditabis(商標)、Pforheim、ドイツによるHLC)中で50μL
のアリコートにおいて実施した。クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼとの反応液は、
40%(v/v)のタバコBY-2細胞溶解物(BYL)、20mMのHEPES-KO
H pH 7.8、10mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸カリ
ウム、3mMのATP、1.2mMのGTP、1.2mMのCTP、1.2mMのUTP
、100μg/mLのクロラムフェニコール、50ng/μLのT7 RNAポリメラー
ゼ、80ng/μlのプラスミド、30mMのクレアチンリン酸および100μg/ml
のクレアチンキナーゼを含んだ。クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない
反応液は、40%(v/v)のBYL、20mMのHEPES-KOH(pH 7.8)
、9mMのグルタミン酸マグネシウム、20mMのグルタミン酸カリウム、4mMのAT
P、1.6mMのGTP、1.6mMのCTP、1.6mMのUTP、100μg/mL
のクロラムフェニコール、30ng/μLのT7 RNAポメラ―ぜ、および40ng/
μLのプラスミドを含んだ。
eYFPからの蛍光シグナルは、485/20nmの励起および528/20nmの吸
収フィルターを用いて、Synergy(商標)HT Multi-Mode Micr
oplate Reader(Biotek(商標)、Bad Friedrichsh
all、ドイツ)を使用して定量化した。eYFPの量は、DNA鋳型なしのBYL翻訳
反応におけるeYFPの異なる濃度に基づいて標準曲線を生成することによって決定した
。eYFP標準は、大腸菌に基づく社内でのインビトロ翻訳システム(Zawada(2
012)Methods Mol.Biol.805:31-41)を使用して製造し、
固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)およびサイズ排除クロマトグラフィー
(SEC)によって精製した。精製されたeYFPの濃度は、比色アッセイを使用して決
定した。Bradford(1976)Anal.Biochem.72: 248-5
4.
標的タンパク質をアミノ酸選択的に蛍光標識するために、FluoroTect(商標
)GreenLys in vitro Translation Labeling
System(Promega(商標)、Mannheim、ドイツ)を製造業者の指示
にしたがって使用した。本製品は、蛍光団BODIPY(登録商標)-FLで標識された
修飾電荷リシンtRNAを含有する。このシステムを使用すると、蛍光標識されたリシン
残基は、翻訳中に複数の部位において新生タンパク質に組み込まれる。
BYL中のミトコンドリアの存在は、親油性カチオン性プローブ5,6-ジクロロ-2
-[3-(5,6-ジクロロ-1,3-ジエチル-1,3-ジヒドロ-2H-ベンズイミ
ダゾール-2-イリデン)-1-プロペニル]-1,3-ジエチル-ヨウ化物(JC-1
、Thermo Scientific(商標)、Waltham、MA、USA)を使
用して実証した。生細胞中では、JC-1は、脱分極したミトコンドリア膜電位で緑色蛍
光モノマー(490nm励起/530nm放射)として存在する。正常および過分極のミ
トコンドリア膜電位では、JC-1はミトコンドリア内で濃縮され、J凝集体を形成し、
これは放射を530nmから590nmにシフトさせる。細胞ミトコンドリアは、増加し
ていく負のミトコンドリア膜電位と共にJ凝集体の増加的により高度になっていく赤色蛍
光(590nm)を示す。Nuydens et al.(1999)J.Neuros
ci.Methods 92:153-9;Reers et al.(1995)Me
thods Enzymol.260:406-17;Salvioli et al.
(1997)FEBS Lett.411:77-82.
1ストック溶液を、最終濃度5μg/mLで10分以内にミトコンドリアを染色するため
に1:1000希釈で使用した。
無細胞タンパク質合成(50μL反応)を、クレアチンリン酸およびクレアチンキナー
ゼのありおよびなしの両方で、BYL系への酸化的リン酸化の阻害剤の添加のありおよび
なしで行った。阻害剤は以下を含有した:アジ化ナトリウム(0.05%、Boguck
a & Wojtczak(1966)Biochim.Biophys.Acta 1
22:381-92)および2-テノイルトリフルオロアセトン(TTA、0.5mM)
;Tappel(1960)Biochem.Pharmacol.3:289-96)
。アジ化ナトリウムを水中に溶解した。TTAをメタノールに溶解した。メタノールを用
いて実施した陰性対照は、この溶媒がこの研究で使用される濃度でタンパク質合成に影響
を与えなかったことを示した。
リン酸の放出を減少させるために、クレアチンリン酸(CP)およびクレアチンキナー
ゼ(CK)から成る人工再生システムは、無細胞BYLシステムで省略された。可変濃度
の反応成分との反応は、CPおよびCKありおよびなし;HEPES-KOH、pH 7
.8(0~80mM)、グルタミン酸マグネシウム(1~12mM)、グルタミン酸カリ
ウム(0~40mM)、プラスミド(10~100ng/μL(4.5~43nM))、
NTP(すなわち、ATP/(GTP/CTP/UTP))(0.5/0.2~4/1.
6mM)、およびT7 RNAポリメラーゼ(20~80ng/μL)、CP(0~40
mM)およびCKありおよびなしで、Design Of Experiment(Do
E)ベースのアプローチ(Design Expert v8.0(State-Eas
e(商標)Inc.,MN,USA)における分別設計(fractional des
igns)および応答表面モデル)を利用して考案した。クロラムフェニコールの濃度は
、CP/CKのシステムから採用した。これらの実験から、両方のシステム(CP/CK
ありおよびなし)に対して好ましい反応成分濃度が得られた。表2
ステムが、約40時間(CP/CKありのBYLでの20時間と比較して)の長期的活性
を示し、最大60%多くの標的タンパク質をもたらすことを明らかにした。図1A。BY
Lにおけるミトコンドリアの存在は、赤色で蛍光を発する選択的色素JC-1(Ther
mo Fischer Scientific、Waltham、MA、USA)を用い
たBYLの染色によって実証され、ミトコンドリアはBYLにおいてそれらの特徴的な膜
電位を保持することを示した。酸化的リン酸化によるエネルギー再生は、電子伝達系の二
つの異なる阻害剤であるアジ化ナトリウムおよびテノイルトリフルオロアセトン(TTA
)の使用によって実証された。アジ化ナトリウムおよびATPの両方は、標的タンパク質
eYFPの劇的に減少した生合成によって示されるように、システムをほぼ完全に阻害す
ることが見出された。図1(B)。
と考えられる。追加されたグルタミン酸マグネシウムおよびグルタミン酸カリウム由来の
グルタミン酸は、ミトコンドリア内のクエン酸回路において代謝され、還元同等物である
NADHおよびFADHの生成がもたらされる。電子は、NADHおよびFADHを介し
て電子伝達系に入り、分子状酸素の消費による酸化的リン酸化を通してATPを生成する
。図2。
りのBYLシステムと比較した。クレアチンリン酸(CP)およびクレアチンキナーゼ(
CK)ありおよびなしの連結されたBYL転写翻訳反応は、25℃で40時間行った。そ
れぞれの場合に、2μLの反応容量を4~12%(w/v)の勾配のSDS-PAGEゲ
ルにロードし、合成されたタンパク質の量をクマシー染色によって視覚化した。AAD1
2、Cry3A、およびCry1Fを含むいくつかの標的タンパク質は、クマシー染色ゲ
ル中の強いバンドで表現されるように、最適化されたシステム(CP/CKなし)におい
て有意に高い発現レベルを示した。
、組み換え型タンパク質のレベルの増加につながる。さらに、BYLシステムは、ミトコ
ンドリア機能に影響を与える化合物またはタンパク質を調査する可能性を提供する。
BY-2溶解物調製のためのソルビトールの使用
BY-2溶解物の調製のために、プロトプラスト形成および脱液胞化の間に容量オスモ
ル濃度を調整するために多量の浸透性物質が必要である。マンニトールはこの目的のため
に日常的に使用され、溶解物調製の合計コストの約10%を占める。浸透性物質としてソ
ルビトール(約10倍安価)を試験した。プロトプラスト形成および脱液胞化のためにマ
ンニトールまたはソルビトールを使用した並行実験では、ソルビトールが驚くべきことに
マンニトールとは同等ではなく、eYFPの発現により決定される溶解物の収量および溶
解物の品質の両方に関してより優れていることが明らかとなった(図5)。さらに、ソル
ビトールのより高い溶解性が、緩衝液の調製を促進することが判明した。しかしながら、
脱液胞化したプロトプラストの最終洗浄のためにはマンニトールがソルビトールより優れ
ていることも判明し、この工程でのソルビトールの利用はより低いeYFP収量およびよ
り粘性の反応混合物につながった。
BY-2溶解物は、IVTT反応液がインキュベートされた時に微生物の増殖をサポー
トする能力があり、結果として反応基質の枯渇をもたらし、結果的に標的タンパク質の収
量が低下する。したがって、いくつかの抗菌物質をIVTT反応システムで試験した。I
VTTでのeYFP産生および微生物増殖に対する効果に関して、クロラムフェニコール
、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、およびアジ化ナトリウムを
調査した。
L反応混合物をLBプレート上に蒔き、微生物増殖を分析した。スペクチノマイシン、ス
トレプトマイシン、アンピシリン、およびアジ化ナトリウムは、微生物増殖に対して阻害
効果を有しないか、またはeYFPの収量に有害な影響を示した。例えば、0.05%(
w/v)の濃度でのアジ化ナトリウムは、恐らくミトコンドリアのエネルギー再生を阻害
することにより、微生物増殖および翻訳活性の両方をほぼ完全に阻害した。クロラムフェ
ニコールのみが、翻訳活性のいかなる喪失もなしに微生物の増殖を阻害することができ(
図3B;図3C)、それにより、IVTTシステムにおける有用性が少なくともその他の
抗菌物質とは異なる。用量応答試験は、100μg/mLのクロラムフェニコールで最も
高いeYFP収量が達成されたが(図3D、200μg/mLのクロラムフェニコールで
微生物増殖の完全な阻害が得られた(図3A)ことを指し示し、SDS-PAGE分析も
また、eYFP収量およびタンパク質安定性に対するクロラムフェニコールの保護効果を
示した。クロラムフェニコールの存在下で実施した反応とは異なり、クロラムフェニコー
ルなしの反応は有意なタンパク質分解を示した。
システム内のNTPの濃度をDoEベースのアプローチによって調整した。ATPおよ
びGTPは転写および翻訳の両方で使用される一方、CTPおよびUTPは転写でのみ使
用されるため、CTPおよびUTPと比較して高濃度のATPおよびGTPは連結された
IVTTシステムに対して有益であると予測された。したがって、単一のNTPの濃度は
、異なる量の固定NTPミックスを使用する代わりに、DoEベースの実験で変化させた
。これらは、96回の実験での三次IV最適設計(cubic IV-optimal
design)を使用して最適濃度についてスクリーニングされた。IVTT反応用のプ
ラスミド鋳型は、pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFPであっ
た。グルタミン酸マグネシウムの濃度は、NTPのマグネシウムへの結合によって調節し
た。表3は、スクリーンされた各因子の濃度範囲を示す。二次モデル(quadrati
c model)を実験データにフィッティングさせた。応答表面モデルを使用して、最
も多くの生成eYFPタンパク質を生じる因子の値を予測した(Zhou et al.
、2010)。すべての非有意項(ANOVAによりp>0.05)を無視し、モデルは
ANOVA表において有意であることが示された(表4)。
のCTP、0.8mMのUTP、および1.6mMのGTPで産生されることが明らかに
なった。図4 これらの結果は、150/40/20/20mMのATP/GTP/C
TP/UTPからなる新しいNTPミックスの開発につながった。2μlの新しいNTP
ミックスを使用すると、IVTTシステムでeYFPの収量は20%増加した。追加的な
利益として、新しいNTPミックスは、他のヌクレオチドと比較して、ATPの10~1
5倍の低コストのため、標準ミックスよりも約40%コストが低い。
標的タンパク質発現に対するIVTT反応の溶解物部分の増加の効果を調査するために
、マンニトールを用いて調製したBYLの他に、プロトプラスト形成および脱液胞化中に
ソルビトールを用いて調製したいくつかのBY-2溶解物を使用して、40%(20μl
)または60%(30μl)の溶解物を用いる50μlの反応を行った。プラスミドpI
VEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFPを鋳型として使用して、25
℃および700rpmで48時間にわたって反応を実施した。ソルビトールで調製した6
0%(v/v)の溶解物を用いる反応は約1mg/mLのeYFPを達成し、これは標準
反応混合物と比較して80%高い収量に対応する(図5)。リボソーム、翻訳因子、シャ
ペロン、およびミトコンドリアの増加した量がエネルギー生成を増加または長期化させ、
それによってより高い収量が得られたと推定される。この結果は、そのような大量におい
てより大きな阻害を生成する有害因子を溶解物が含まないことを示す。
的タンパク質の発現
人工エネルギー再生を伴わない無細胞発現システムが、基質全体にわたり一般的に効果
的であることを確認するために、該システムを使用して、eYFP以外の10個の追加的
な標的遺伝子産物を発現させた。Strepタグ化eYFPおよび他の10個の標的タン
パク質を、ソルビトールを用いて調製した60%のBY-2細胞溶解物中、マンニトール
を用いて調製した40%のBY-2細胞溶解物中、およびCellFree(商標)Sc
iencesのWGEシステムで発現させた。連結された転写翻訳反応を、50μLの容
量で25℃および700rpmで40時間にわたって実施した。WGEシステムを使用し
た連結された転写および翻訳反応は、製造業者の指示にしたがって行った。それぞれの場
合に、1μLの反応混合物および混合された二層反応液をそれぞれ4~12%(w/v)
の勾配のSDS PAGEゲルにロードし、標的タンパク質をクマシー染色により視覚化
した。BYLシステムは、試験した異なる遺伝子のうちの一つごとに成功裏に転写し、ま
た転写後に翻訳を行ってあらゆる場合にタンパク質を産生した。実際、BYLシステムは
、WGEシステムを使用して製造されたものと比較して、一貫してより強いバンドを生じ
させた。Strep-eYFPについて、三つのシステムで産生されたタンパク質を蛍光
リーダーを使用して定量し、eYFP標準曲線と比較したところ、1115μg/mLお
よび441μg/mLがBYLシステムの2セットの条件下で産生され、WGEシステム
では105μg/mLのみが産生されたことが明らかになった。
人工的なエネルギー再生を伴わない無細胞溶解物の安定性を増加させるために、細胞お
よび/またはタンパク質の凍結保護剤として記述された小分子が溶解物の翻訳活性を維持
させることができるという仮説を立てた。こうした分子は極限環境微生物中に天然に存在
し、浸透圧ストレス、熱、乾燥、およびUV光から極限環境微生物を保護し、表面での水
密度の増加を引き起こしてタンパク質の天然コンホメーションを促進することにより膜お
よびタンパク質を安定化させる。しかしながら、凍結保護剤はIVTTシステムに強い阻
害効果を呈することが予想された。
セリドを連結されたIVTT反応に添加し、鋳型プラスミドpIVEX_GAAAGA_
Omega_Strep-eYFPから産生されたeYFPの量を決定した。50μLの
IVTT反応(60%(v/v)のBYL)を、96ウェルプレート中、25℃および5
00rpmで44時間、Kuhnerシェーカー(商標)の制御湿度で実施した。
濃度でeYFPの収量に影響を与えなかった。図6 実際、より高濃度のエクトインお
よびヒドロキシエクトインがシステムを阻害した。対照的に、グルコシルグリセロールは
、eYFPの収量に強い正の影響を及ぼした。0.5%(v/v)のグルコシルグリセロ
ールを含む反応液は、グルコシルグリセリドを含まない標準反応液と比較して、44時間
後に約50%多くのeYFPをもたらした。図6
グルコシルグリセロールの正の影響は、0.5%(v/v)のグルコシルグリセロールな
しおよびありでのIVTT反応において五つの異なる溶解物バッチ(BYL 08.01
.2016、BYL 21.01.2016、BYL 11.03.2016、BYL
01.04.2016、BYL 05.04.2016)にわたって一貫していた。50
μLのIVTT反応を、96ウェルプレート中25℃および500rpmで48時間、制
御湿度(70%)下で、鋳型としてプラスミドpIVEX_GAAAGA_Omega_
Strep-eYFPを使用して60%および80%(v/v)の溶解物部分を用いて三
連で実施した。60%(v/v)の溶解物および0.5%(v/v)のグルコシルグリセ
ロールを使用する反応では、グルコシルグリセロールなしの反応と比較して、約80%多
くのeYFPが産生された。図7 80%(v/v)の溶解物および0.5%(v/v
)のグルコシルグリセロールを使用すると、eYFPの収量は、グルコシルグリセリドな
しの80%(v/v)溶解物を使用する反応と比較して約110%(ほぼ2mg/mLの
eYFP)増加した。図7
人工エネルギー再生を伴わない無細胞システムにおけるIVTT反応の時間経過を、64
時間までの異なる時点で産生されたタンパク質の量を測定することによって決定した。図
8 16時間後、0.5%グルコシルグリセロールありまたはなしでの60%または8
0%の溶解物を使用した反応は、ほぼ同量のタンパク質を産生した。図8 グルコシル
グリセロールなしで、60%および80%(v/v)の両方の溶解物における翻訳活性は
、24時間後にさらに増加しなかった。図8 しかしながら、グルコシルグリセロール
を用いたeYFP産生は、60%および80%(v/v)の両方の溶解物で、少なくとも
64時間まで生産性のほぼ直線的な増加を示した。図8 この結果は、グルコシルグリ
セロールが、翻訳活性を64時間を超えて延長するシステムに対する安定化効果を有する
ことを裏付ける。平均して、80%(v/v)の溶解物および0.5%(v/v)グルコ
シルグリセロールを用いる反応は、ほぼ2.5mg/mLのeYFPをもたらした。
無細胞発現系におけるタンパク質合成を促進する分岐鎖アミノ酸(BCAA)の能力も
試験し、BCAAの添加が標的タンパク質の収量を増加および安定化させることが観察さ
れた。システムに対するBCAAの正の効果を検証するために、振盪フラスコ(SF)ま
たは連続発酵(CF)から調製した四つの溶解物を使用する連結されたIVTT反応に異
なる濃度のBCAAを加えた。Kuhner(商標)シェーカー中の制御された湿度にお
いてプラスミド鋳型pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFPを使
用する25℃および500rpmでの66時間の96ウェルプレート中での80%(v/
v)溶解物を用いる50μLのIVTT反応において、溶解物が振盪フラスコから調製さ
れたのか、それとも連続発酵から調製されたのかに関わらず、BCAAは試験した全濃度
においてeYFPの収量に正の影響を有した。図9 1mMのBCAAを含む反応によ
り、BCAAなしの反応と比較して、約70%多くのeYFP(1mL当たり2.5mg
のeYFPの平均収量)が得られた。
Claims (10)
- バイオポリマーの合成のためのシステムであって、前記システムが、
色素体、葉緑体、ミトコンドリア、または葉緑体およびミトコンドリアを含む水性細胞
溶解物、
ポリマー鋳型、および
前記ポリマーのモノマー単位、を含み、前記システムが、前記細胞溶解物、色素体、葉
緑体、ミトコンドリア、または葉緑体およびミトコンドリアに対して外因性である加えら
れたクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない、システム。 - pH緩衝剤、
マグネシウム、好ましくはMg(C5H8NO4)2、
カリウム、好ましくはKC5H8NO4、
ヌクレオシド三リン酸、
酵素、好ましくはRNAポリメラーゼ、および
クロラムフェニコール、のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項1に記載のシス
テム。 - ミトコンドリアを含む植物細胞由来の水性細胞溶解物、DNA鋳型、HEPES-KO
H pH7.8、Mg(C5H8NO4)2、KC5H8NO4、ヌクレオシド三リン酸
、RNAポリメラーゼ、およびクロラムフェニコールから本質的になる、請求項1に記載
のシステム。 - 少なくとも一つのバイオポリマーの合成方法であって、前記方法が、反応体積中で反応
成分を合わせることを含み、前記反応成分が、
色素体、葉緑体および/またはミトコンドリアを含む細胞溶解物、
ポリマー鋳型、および
前記ポリマーのモノマー単位、を含み、
前記反応成分がクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない、方法。 - 以下の条件:
前記方法によって製造されるバイオポリマーがポリペプチドである、
前記方法が、RNAおよび前記RNAから翻訳されたポリペプチドの連結された合成の
ためのものである、
前記細胞溶解物が真核細胞溶解物である、
前記細胞溶解物がミトコンドリアを含む、
前記色素体、葉緑体、および/またはミトコンドリアが、前記細胞溶解物に対して外因
性である、
前記反応成分がクレアチンキナーゼを含まない、
前記ポリマー鋳型がRNA分子である、
前記ポリマー鋳型がDNA分子である、
前記ポリマーの前記モノマー単位がヌクレオチドである、
前記ポリマーの前記モノマー単位が、前記細胞溶解物中に含まれるアミノ酸である、お
よび
前記反応が、電子伝達系を阻害することまたは前記反応から酸素を除去することによっ
て停止させられる、のいずれかの組み合わせが満足される、請求項4に記載の方法。 - バイオポリマーの合成が20時間を超えて、好ましくは約40時間にわたり起こる、請
求項4に記載の方法。 - キットであって、
一つ以上の別個の体積に配置された、水性細胞溶解物、色素体、ミトコンドリアおよび
/または葉緑体、およびポリマーのモノマー単位、ならびに
キットの成分およびクレアチンリン酸を含まない任意の追加の成分の混合を指定する説
明書 を含む、キット。 - 前記色素体、ミトコンドリアおよび/または葉緑体を含む前記細胞溶解物が一つの体積
中に配置されており、かつ、前記ポリマーの前記モノマー単位が別個の体積中に配置され
ている、請求項7に記載のキット。 - 前記説明書が、前記細胞溶解物、色素体、ミトコンドリアおよび/または葉緑体、なら
びに前記ポリマーのモノマー単位を、クレアチンリン酸を含まない反応体積中でポリマー
鋳型と合わせるようにユーザーに指示する、請求項7に記載のキット。 - ポリマー鋳型をさらに含む、請求項7に記載のキット。
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