CN110785178A

CN110785178A - 不需要人工能量再生系统的新型无真核细胞表达系统

Info

Publication number: CN110785178A
Application number: CN201880016092.9A
Authority: CN
Inventors: K·马杜里; J·阿姆斯特朗; A·埃特; M·本特鲁; S·沃格尔; S·席勒伯格; R·菲舍尔
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2017-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2020-02-11
Also published as: EP3579845A4; JP2020507322A; US10612031B2; JP2023011890A; US20180245087A1; CA3052966A1; WO2018148530A1; EP3579845A1; US20200248191A1

Abstract

本公开内容涉及在利用含有质体、线粒体和/或叶绿体的细胞裂解产物的反应中，用于体外合成生物大分子的系统、方法和试剂盒，其中磷酸肌酸和肌酸激酶不加入反应中以提供人工能量再生。

Description

不需要人工能量再生系统的新型无真核细胞表达系统

优先权声明

本专利申请要求于2017年2月9日提交的美国临时专利申请序列号62/457,073的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容在此以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及生物聚合物的体外生产。一些实施例涉及在无真核细胞系统中产生例如多肽、多核苷酸和/或多糖。特定实施例利用细胞器(例如，质体、线粒体或叶绿体)以对于无细胞系统中的生物聚合物的连续生产提供能量，这消除了对于系统中某些不期望有的储能分子例如磷酸肌酸的需要。

背景技术

对于新治疗性蛋白、技术酶、蛋白质工程和功能基因组学的不断增长的需求，需要快速有效的蛋白质生产和筛选平台。Leader等人(2008)Nat.Rev.Drug Discov.7(1):21-39；Swartz(2012)Aiche J.58(1):5-13。无细胞蛋白质合成(CFPS)的新兴技术可以帮助满足这种需求。Carlson等人(2012)Biotechnol.Adv.30(5):1185-94。与基于细胞的表达相比，CFPS提供诸如更短的处理时间以及反应条件的直接控制和监测的优点。Swartz(2012)，同上。PCR产物可以直接用于多重蛋白质的同时表达，而无需繁琐的克隆和转化步骤。Wu等人(2007)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.46(18):3356-8；Yabuki等人(2007)J.Struct.Funct.Genomics 8(4):173-91；Gan&Jewett(2014)Biotechnol.J.9(5):641-51。CFPS平台允许添加促进蛋白质折叠的辅助因子(Ozawa等人(2005)J.Biomol.NMR32(3):235-41；Endo等人(2006)Mol.Biotechnol.33(3):199-209；Matsuda等人(2006)J.Struct.Funct.Genomics 7(2):93-100)，或掺入非天然氨基酸(Albayrak&Swartz(2013)Nucleic Acids Res.41(11):5949-63)；White等人(2013)Methods 60:70-4)。它们还促进不能在活细胞中产生的细胞毒性蛋白质的表达。Xu等人(2005)Appl.Biochem.Biotechnol.127(1):53-62；Schwarz等人(2008)Proteomics 8(19):3933-46；Xun等人(2009)Protein Expr.Purif.68(1):22-7。

无大肠杆菌(Escherichia coli)细胞的裂解产物被广泛使用，并且由于其低成本、可扩展性和高生产率是有利的。Zawada等人(2011)Biotechnol.Bioeng.108(7):1570-8；Caschera&Noireaux(2014)Biochimie 99:162-8。然而，因为裂解产物源自细菌，所以它们不适合于产生由于无效的氧化折叠而具有多个亚结构域的复杂蛋白质，并且不存在伴侣蛋白和糖基化机制。无真核细胞系统更适合表达此类蛋白质，并且支持大多数形式的翻译后修饰。Chang等人(2005)J.Mol.Biol.353(2):397-409；Zhang&Kaufman(2006)Handb.Exp.Pharmacol.(172):69-91。最常用的系统基于小麦胚芽提取物(WGE)、昆虫细胞提取物(ICE)和兔网织红细胞裂解产物(RLL)。然而，这些系统是昂贵的，并且提取物制备是复杂的。Carlson等人(2012)，同上。这已产生对于另外的真核CFPS的需求，例如基于蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)(Mureev等人(2009)Nat.Biotechnol.27(8):747-52)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Brodel等人(2014)Biotechnol.Bioeng.111(1):25-36)、以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Hodgman&Jewett(2013)Biotechnol.Bioeng.110(10):2643-54；Gan&Jewett(2014)，同上)的那些。

无细胞系统执行体外蛋白质合成的用途已受到例如其为此类系统的特征的短反应时间和低蛋白质生产率限制。这些特点导致低蛋白质产率和成本过高/单位产生的蛋白质。

使用连续流动系统，通过使用连续翻译反应可获得更长的反应时间。Spirin等人(1988)Science 242:1162-1164。连续反应执行超过数十(或甚至数百)小时，并且依靠连续流动的方法必须不断地向室提供必要的反应基质。因此，这些反应需要大量的时间和资源投入。此外，“连续”系统中的翻译涉及产生大量蛋白质，并且该系统与用于执行静态(“分批”)体外翻译反应的那些显著不同。静态反应可以在小反应体积(例如，微升)中运行，并且不涉及产生制备量(例如，毫克)的蛋白质。此类分批反应可以在一至两小时内完成。出于所有上述原因，虽然与相应的分批系统相比，它增加了反应持续时间和蛋白质产率，但连续反应系统需要更昂贵的试剂。

发明内容

本文公开的一般策略利用在基于无细胞裂解产物的反应中的细胞器，以在反应系统中提供能量再生。在一些实施例中，该策略可用于实现生物聚合物(例如，多核苷酸、多肽、多糖和复杂碳水化合物)的改善的体外合成。在特定实施例中，在无真核细胞系统中线粒体的存在导致超过常规分批和连续反应的改善的反应系统，例如，通过显著减少或消除对于添加的能量递送试剂(例如，磷酸肌酸和/或肌酸激酶)和/或氨基酸补充的需要，同时也延长反应持续时间。在一些例子中，所公开的无细胞聚合反应明显比本领域目前利用的常规反应更有效。

本文描述的是用于合成生物聚合物的方法，其包括在反应体积中组合包含细胞器(例如，质体、叶绿体和/或线粒体)的细胞裂解产物、聚合物模板和聚合物的单体单元。在一些实施例中，反应体积不包含例如磷酸肌酸/肌酸激酶能量再生系统，使得不向反应体积中添加磷酸盐或添加最低限度的磷酸盐。在特定实施例中，细胞器是线粒体。在一些实施例中，细胞裂解产物是真核细胞裂解产物；例如，来自植物(例如，烟草、玉米和大豆)细胞的裂解产物。在一些例子中，细胞裂解产物是来自Bright Yellow-2(BY-2)烟草细胞的裂解产物。在一些实施例中，聚合物模板是DNA分子或RNA分子。利用RNA作为聚合物模板的反应通过翻译反应从单体氨基酸产生作为生物聚合物的多肽。利用DNA作为聚合物模板的反应可以用于通过体外复制或转录反应从单体核苷酸产生作为生物聚合物的进一步核酸分子(例如，DNA和RNA)，或通过与从模板转录偶联的翻译反应产生多肽。在某些实施例中，用于生物聚合物的无能量合成的方法可以包括例如但不限于，将细胞器、聚合物模板和/或单体单元加入反应体积中，和/或从反应体积中分离生物聚合物。在一些例子中，反应体积不需要氨基酸补充来支持蛋白质表达，因为裂解产物组分能够使用内源生物合成途径从来自TCA循环的中间产物开始生成氨基酸。因此，在一些此类例子中，存在于包含细胞器的裂解产物中的氨基酸可能足以支持多肽的延长合成。

所公开的细胞裂解产物系统可以仅补充有最低限度量的外源性磷酸肌酸、最低限度量的肌酸激酶或两者，只要反应体积包含其量被视为不适合于能量再生系统的外源性磷酸肌酸和/或肌酸激酶。例如，反应体积可以含有不超过15mM、不超过10mM、不超过5mM、不超过1mM、不超过500μM、不超过100μM、不超过50μM、或不超过10μM添加的磷酸肌酸。在另一个例子中，反应体积可以含有不超过100μg/mL、不超过50μg/mL、不超过10μg/mL、不超过5μg/mL、不超过1μg/mL、0.5μg/mL或不超过0.1μg/mL添加的肌酸激酶。这些量是不适合的，并且因此需要根据本文公开的方法和系统包括细胞器，例如质体、线粒体或叶绿体，以维持生物聚合物合成(包括维持生物聚合物合成共本文公开的延长时期)。

一些实施例包括无需使用人工能量再生系统用于合成生物聚合物的系统。在这些实施例中，该系统包含水性细胞裂解产物、(内源或异源)细胞细胞器、聚合物模板。在特定实施例中，该系统还包括聚合物的单体单元。用于体外生物聚合物合成的常规无细胞系统还包含磷酸肌酸和肌酸激酶，其随着合成反应进行而用于系统中的能量再生。在本文的实施例中，该系统基本上不含磷酸肌酸；不将磷酸肌酸和肌酸激酶加入系统中。在某些例子中，该系统不包含磷酸肌酸或肌酸激酶。在特定实施例中，用于合成生物聚合物的系统还可以包括例如但不限于，pH缓冲剂、镁(例如，Mg(C₅H₈NO₄)₂)、钾(例如，KC₅H₈NO₄)、核苷(例如，三磷酸核苷、二磷酸核苷和一磷酸核苷)、酶(例如，RNA聚合酶)和氯霉素。在具体实施例中，不将除谷氨酸盐外的氨基酸加入已经存在于系统中的那些(即，裂解产物和细胞器中存在的氨基酸)中。在一些例子中，根据前述的系统可以显示大于20小时(例如，约40小时)的延长活性，并且可以产生比包含添加的磷酸肌酸和肌酸激酶在其它方面相同的常规系统显著更多(例如，多约60％)的靶蛋白。

一些实施例包括无需使用人工能量再生系统用于合成生物聚合物的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含无需使用人工能量再生系统用于合成生物聚合物的系统的组分，以及用于指导该试剂盒的使用的书面说明书。例如但不限于，试剂盒可以包含以下一种或多种：以一个或多个分开体积设置的水性细胞裂解产物、(内源或异源)细胞器、聚合物模板和聚合物的单体单元，连同说明指定试剂盒组分以及不含磷酸肌酸和肌酸激酶的任何外源组分的混合物的说明书。作为进一步例子，试剂盒还可以包含pH缓冲剂、镁、钾、核苷、酶(例如RNA聚合酶)和氯霉素中的一种或多种。根据具体实施例用于合成生物聚合物的试剂盒可以包含水性细胞裂解产物(例如，包含叶绿体和/或线粒体)、聚合物的单体单元(例如核苷)和书面说明书。在此类具体实施例中，书面说明书可以指导用户将这些组分与目的聚合物模板(例如，编码多肽的DNA分子)和任何其它试剂组合，而不将磷酸肌酸(连同用于能量再生的肌酸激酶)加入组合中。

本文的实施例掺入用于正在进行的合成反应中的能量再生的活性线粒体，并且从而可以用于定量调查在体外合成的背景下影响线粒体功能的化合物或蛋白质。此外，可以在合成反应期间利用TCA循环的中间产物以产生氨基酸，使得对于延长的多肽合成不需要氨基酸补充。在一些实施例中，用于本文的方法、系统和试剂盒中的细胞裂解产物包含叶绿体，其减少合成反应的氧依赖性。例如，可以从光合活性细胞制备细胞裂解产物，使得质体、叶绿体和/或线粒体保留在裂解产物中，同时去除不需要的细胞材料。在此类具体例子中，本文的方法、系统和试剂盒可以利用质体衍生的能量、线粒体衍生的能量再生、叶绿体衍生的能量再生或两者的组合。

参考下文结合附图进行的对若干实施例的详细说明，前述特征和其他特征将变得更加明显。

附图说明

图1包括无需人工能量再生用于合成生物聚合物的系统的元件和性能，所述系统包括烟草BY-2细胞裂解产物(BYL)。图1(A)显示了该系统与包括磷酸肌酸(CP)和肌酸激酶(CK)的系统的性能比较。使用报告基因(即eYFP)作为模板在25℃下进行偶联的转录-翻译反应52小时。通过使用具有485/20nm激发和528/20nm发射滤光片的荧光阅读器测量荧光强度，来确定荧光报告蛋白的产率。图1(B)显示了分别通过叠氮化钠(叠氮化物)和噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)对抑制电子传递链抑制的报告产率的作用。由三个独立的转录-翻译实验计算平均值和标准差。

图2包括表示在无需使用人工能量再生用于合成的系统中提出的ATP生成机制的图解。谷氨酸盐用作能量源，以通过位于线粒体内部的TCA循环，主要以NADH的形式产生还原等价物。NADH推动氧化磷酸化，其中氧充当最终的电子受体，并且ADP转换成ATP。

图3包括显示了在无需使用人工能量再生用于合成的系统中，不同的抗微生物物质对eYFP产率和微生物生长的作用的图示。使用pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为模板在25℃和700rpm下进行偶联的BYL反应45小时。通过使用荧光阅读器测量荧光强度来确定eYFP的产率。通过在LB板上铺平板0.2μL BYL反应体积来确定菌落形成单位(CFU)的数目，然后将所述反应体积在37℃下温育16小时。由三个独立实验计算平均值和标准差。图3(A)包括不同浓度的氯霉素对微生物生长(CFU/μL)的影响。图3(B)包括不同抗微生物物质对eYFP产率的影响，针对不含抗微生物物质的标准反应中的产率(100％)标准化。图3(C)包括不同抗微生物物质对微生物生长(CFU/μL)的影响。图3(A)包括不同浓度的氯霉素对eYFP产率(μg/mL)的影响。

图4包括在无需使用人工能量再生用于合成的系统中使用的NTP混合物的基于DoE的优化的可视表示。呈现的是在不含磷酸肌酸和肌酸激酶的偶联BYL系统中用于eYFP合成的响应表面和等高线图。显示了不同NTP和谷氨酸镁对产率的作用，而反应体积的其它组分维持在最佳浓度下。该图显示了谷氨酸镁和ATP之间(图4(A))、谷氨酸镁和GTP之间(图4(B))、以及谷氨酸镁和CTP/UTP之间(图4(C))的显著相互作用。使用质粒pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为DNA模板在25℃和700rpm下进行反应46小时。通过使用荧光阅读器测量荧光强度来确定eYFP的产率(以相对荧光单位给出，RFU)。

图5包括显示了在无需使用人工能量再生用于合成的系统中，增加裂解产物浓度对生产率的作用的条形图。具有用甘露醇(蓝色)制备的BY-2细胞裂解产物的反应与具有用山梨糖醇(绿色)制备的新裂解产物的反应进行比较。在96孔板中以50μL的体积执行反应。浅色条代表40％(v/v)裂解产物反应，且深色条代表60％(v/v)裂解产物反应。“M”和“S”分别指定甘露醇和山梨糖醇在裂解产物制备过程中用于原生质体化(protoplastation)、排出(evacuolation)和排出的原生质体的洗涤的用途。使用pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为DNA模板在25℃和700rpm下进行偶联反应48小时。通过使用荧光阅读器测量荧光强度来确定eYFP的产率。由两个独立实验计算平均值和标准差。日期分别指示大“BYL混合物”的合并日和关于每种新裂解产物的制备日。

图6包括条形图，其显示了在没有人工能量再生的偶联IVTT反应中，四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶和葡糖基甘油对eYFP产生的作用。向样品中加入以0-8％(v/v)量的四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶和葡糖基甘油，并且使用质粒pIVX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为模板。使用96孔板在具有60％(v/v)裂解产物部分的50μL中，在25℃和500rpm下在受控湿度(70％)下进行反应44小时。与eYFP标准相比，通过使用荧光阅读器测定产生的eYFP的量。使用IVTT转录-翻译系统产生eYFP标准，并且通过Strep-

进行纯化。然后使用比色测定来测定纯化的eYFP的浓度。数据代表三个独立转录-翻译实验的平均值和标准差。

图7包括显示了葡萄糖基甘油对没有人工能量再生的偶联IVTT反应的影响的条形图。比较了在五个不同裂解产物分批中由质粒pIVX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP产生的eYFP的量。用60％或80％(v/v)裂解产物，并且不连同或连同0.5％(v/v)葡糖基甘油(GG)进行反应。反应在50μL体积中在96孔板中在25℃和500rpm下在受控湿度(70％)下进行48小时。数据代表三个独立转录-翻译实验的平均值和标准差。

图8包括在没有人工能量再生的偶联IVTT反应中eYFP产生的时间过程的图形表示。反应包括60％或80％(v/v)裂解产物，不连同或连同0.5％(v/v)葡糖基甘油(GG)。质粒pIVX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP用作模板，并且通过使用荧光阅读器测定所产生的eYFP的量(与eYFP标准相比)。反应在具有50μL体积的96孔板中在25℃和500rpm下在Kuhner^TM振荡器中在受控湿度(70％)下进行64小时。数据代表使用不同裂解产物分批的三个独立转录-翻译实验的平均值和标准差。

图9包括在没有人工能量再生的偶联IVTT反应中，支链氨基酸(BCAA)对eYFP产生的作用。使用质粒pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为模板，加入0–2mM BCAA作为偶联IVTT反应的最后组分。反应在具有50μL体积的96孔板中在25℃和500rpm下进行66小时。与eYFP标准相比，通过使用荧光阅读器测定产生的eYFP的量。数据代表六个独立转录翻译实验的平均值和标准差。从摇瓶(SF)或连续发酵(CF)制备裂解产物。

具体实施方式

I.若干实施例的概述

基于粗裂解产物的无细胞蛋白质合成(CFPS)系统提供了超过体内系统的几个优点，并且可用于广泛范围的应用中，尤其包括蛋白质工程、生物制药生产和研究。常规粗裂解产物含有翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的组分，因此在氨基酸、核苷酸和盐的存在下，几乎所有蛋白质都由待在其中合成的RNA模板编码，条件是裂解产物补充有储能试剂。在偶联的转录/翻译系统中，可以添加RNA聚合酶以指导从DNA模板的蛋白质合成。与细胞合成形成对比，CFPS可以允许更短的处理时间、减少的蛋白质水解、以及在限定的位置处表达毒性蛋白质或者含有特定化学基团或非天然氨基酸的蛋白质的能力。此外，可以直接控制且监测反应。

本文公开的是用于生物聚合物合成(例如，多肽合成)的无细胞系统，其利用细胞裂解产物而无需人工能量再生系统，消除了对于另外储能试剂的需要。在实施例中，该系统利用包含细胞器(例如，质体、线粒体或叶绿体)的真核细胞裂解产物，用于在合成反应期间通过氧化磷酸化的能量再生。在某些例子中，细胞裂解产物是烟草BY-2裂解产物，其包括源自BY-2细胞的线粒体。在氧化磷酸化期间的细胞真核系统中，电子经由位于线粒体的内膜内的电子传递链，从电子供体转移到电子受体如氧。这些氧化还原反应释放能量，所述能量用于将ADP磷酸化为ATP。本文的实施例利用来自该过程的能量来驱动裂解产物中生物聚合物的持续合成。因此，在本文的实施例中，电子传递链的抑制剂和气密条件可以用于通过氧化磷酸化来停止能量再生，并且从而通过终止系统的翻译活性来停止合成反应。在一些实施例中，该系统包括质体、叶绿体，其可以允许反应在厌氧条件或基本上厌氧的条件下进行。

常规的无真核细胞系统(例如，小麦胚芽提取物和昆虫细胞提取物)缺乏线粒体。相反，这些系统需要添加磷酸肌酸和肌酸激酶来完成必要的ATP再生，以支持蛋白质表达。为了支持蛋白质表达而加入反应混合物中用于能量再生的大量游离磷酸盐(源自磷酸肌酸)是这些系统性能的重要限制因素。Ezure等人(2006)Biotechnol.Prog.22(6):1570-7；Takai等人(2010)Curr.Pharm.Biotechnol.11:272-8；

等人(2014)Biotechnol.Bioeng.111(1):25-36；Hodgman&Jewett(2013)，同上；Schoborg等人(2014)Biotechnol.J.9(5):630-40。引入系统内的游离磷酸盐结合镁(其是转录和翻译所需的)，导致合成性能的早期崩解和低产物收率。

为了延长合成性能，目前可用的无真核细胞系统在透析模式中使用“连续流动”反应，以提供持久的能量供应且稀释反应区室中的抑制性组分如磷酸盐。本文所述的用于生物聚合物合成的没有人工能量再生系统的系统减少或消除了对于反应透析的需要，因为它们产生较少的抑制组分，并且具有其自身的能量再生能力。然而，根据从业者的判断，如果需要，则本文的系统可以以连续流动配置利用。

与常规的无真核细胞蛋白质表达系统相比，本文所述的用于生物聚合物合成的系统一般而言更廉价，并且它们产生蛋白质更久，导致增加的生物聚合物产率。此外，本文的系统提供了调查影响线粒体和/或叶绿体功能的化合物或途径的可能性，例如作为无细胞蛋白质表达的进一步增强剂。因此，可以优化本文实施例的根本不同的系统，以提供甚至进一步的益处。

本文所述的用于生物聚合物合成的一些系统能够支持微生物的生长，并且此类生长可以导致IVTT反应中的底物耗尽和/或蛋白质降解，导致靶蛋白的产率减少。因此，在一些实施例中，该系统包括氯霉素以抑制微生物生长，这可以改善这些实施例中的蛋白质表达。在特定实施例中，该系统包括其量为例如10–500μg/mL(例如，25–250μg/mL、50–200μg/mL和100–200μg/mL)的氯霉素。

本文描述的是以下发现：在一些实施例中，在偶联的体外转录/翻译(IVTT)反应中特定量的NTP可以提供令人惊讶的稳健表达，其可以是由标准NTP量预期的那种的约20％或更多(例如，18％或更多、19％或更多、20％或更多、21％或更多、22％或更多、23％或更多、24％或更多、25％或更多、18-25％更多、19-23％更多、以及大约20％更多)。因此，在一些例子中，该系统可以包括大约150mM ATP、大约40mM GTP、大约20mM CTP和大约20mM UTP。利用这些减少量的NTP的进一步优点是减少的费用，因为GTP(最昂贵的NTP)的量从常规植物细胞系统的那种减少。

本文还描述的是以下令人惊讶的发现：本文系统的几种修改可以给出产物产率和/或质量中的大量改善。例如，在裂解产物制备的原生质体化和排出步骤期间山梨糖醇的使用可以导致增加的蛋白质产率，同时进一步减少系统成本，因为山梨糖醇比其它常用的渗透压剂如甘露醇更便宜。作为进一步的例子，将裂解产物的比例增加至IVTT反应的50–90％(例如，55-85％)(v/v)导致几种靶蛋白的更高表达。因此，本文的特定例子包括细胞裂解产物的使用，所述细胞裂解产物在原生质体化和排出期间用山梨糖醇制备，例如，其量为按体积计约60％(例如，58％、59％、60％、61％和62％)、或按体积计约80％(例如，78％、89％、80％、81％和82％)。作为再一个例子，葡糖基甘油的添加急剧增加IVTT反应的蛋白质产率。例如，与不含葡糖基甘油的标准反应相比，以0.25％至4％的量的葡萄糖基甘油导致至多80％更多的蛋白质。不受任何特定理论的束缚，葡糖基甘油推测通过增加蛋白质和膜稳定性来改善反应产率。因此，在一些实施例中，该系统包含0.25–4％(例如，0.25–2％、0.25–1％、约0.5％和1.5％)的葡糖基甘油。作为进一步的例子，即使不要求支链氨基酸(BCAA)的添加，BCAA也可以用于增加蛋白质生产。因此，在一些实施例中，该系统包括其量为约0.25–4mM或其量为0.5–2mM(例如，0.48–2.2mM、0.5–2.0mM、0.5–1mM和约1mM)的BCAA。

根据前述修改，在本文的具体实施例中，偶联的IVTT反应中靶蛋白的产生可以延长至多64小时。在一个例子中，具有按体积计80％裂解产物和0.5％葡糖基甘油的反应产生几乎2.5mg/mL eYFP。

II.缩写

AAD-12 芳氧基链烷酸酯双加氧酶-12

ADP 二磷酸腺苷

ATP 三磷酸腺苷

BCAA 支链氨基酸

BY-2 Bright Yellow-2

BYL BY-2细胞裂解产物

CFPS 无细胞蛋白质合成

CFU 菌落形成单元

CHO 中国仓鼠卵巢

CL 纤维素酶

CK 肌酸激酶

CP 磷酸肌酸

Cry1F 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Cry1Fδ-内毒素

Cry3A 苏云金芽孢杆菌Cry3A δ-内毒素

CTP 三磷酸胞苷

DMSO 二甲基亚砜

DOE 实验设计

DTT 二硫苏糖醇

EDTA 乙二胺四乙酸

eYFP 增强型黄色荧光蛋白

FADH 黄素嘌呤二核苷酸

GTP 三磷酸鸟苷

ICE 昆虫细胞提取物

IMAC 固定化金属亲和层析

IVTT 体外转录和翻译

NADH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

NADPH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

NEB New England Biolabs

NTP 三磷酸核苷

PCR 聚合酶链反应

PEG 聚乙二醇

RLL 兔网织红细胞裂解产物

SEC 尺寸排阻层析

TCA 循环三羧酸循环(“克雷布斯循环”)

TTA 噻吩甲酰三氟丙酮

UTP 三磷酸尿苷

UTR 非翻译区

WGE 小麦胚芽提取物

III.术语

经分离的：“经分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已从该组分所天然存在的生物体细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白质)基本上分开、分开产生或纯化出来，同时实现组分中的化学或功能变化(例如，核酸可通过断开将该核酸连接到染色体中的其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“经分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达而制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。

核酸分子：如本文所用，术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合形式，可包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义链和反义链两者，以及上述各项的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或这两种类型核苷酸中任一者的修饰形式。如本文所用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可包括天然存在的核苷酸和经修饰的核苷酸，它们通过天然存在的核苷酸连接和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。

如本领域技术人员易于理解的那样，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、一个或多个天然存在的核苷酸被类似的核苷酸间修饰(例如，不荷电的键合：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯和氨基甲酸酯；荷电的键合：例如，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯；悬垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如，吖啶和补骨脂素；螯合剂；烷化剂；以及经修饰的键合：例如，以及α异头核酸)取代。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的、圆形的和挂锁形的(padlocked)构象。

外源的：如应用于加入本文细胞裂解产物中的组分(例如，质体、线粒体或叶绿体)的，术语“外源的”指具有与细胞裂解产物不同起源的此类组分。例如，并非源自细胞裂解产物并且被加入裂解产物中的质粒、线粒体或叶绿体，对细胞裂解产物是外源的。术语外源的可以应用于细胞细胞器，例如来自相同细胞类型或来自不同细胞类型(例如，来自不同组织或不同物种的细胞)的质体、线粒体或叶绿体，作为用于衍生细胞裂解产物的细胞类型，只要在任一情况下细胞器并非源自细胞裂解产物本身。另外，术语外源的可以在本文中用于指能量再生系统的组分(例如，磷酸肌酸和肌酸激酶)，其分开添加或者除与本文公开的系统的细胞裂解产物中使用的任何质体、线粒体或叶绿体细胞器之外添加。

IV.用于生物聚合物合成的系统

本公开内容提供了无需使用人工再生系统用于合成生物聚合物的系统。本文的系统包括实现增强的生物聚合物体外合成的组合物和方法，其中氧化磷酸化被激活，提供了在不存在储能试剂的情况下增加的产率。通过反应性IVTT组分的组合获得改善的产率，所述反应性IVTT组分可以由从业者组装且混合，或者可以作为预混合组分、未混合组分或两者的组合在试剂盒中提供给从业者。从业者可以利用与单独提供的组分组合的试剂盒的一些或所有组分；例如，在一些实施例中，试剂盒包括除DNA或RNA模板外的用于蛋白质合成的系统的所有组分，其由从业者提供以合成她选择的蛋白质。一旦系统的所有组分都在适当的环境条件下在反应体积中混合，反应开始，并且一般根据常规的体外无细胞合成反应进行，具有本文所述的重要变化。可以允许反应进行直至一种或多种组分(例如NTP和氨基酸)在反应体积中耗尽，或者直到通过调整环境条件停止，以终止系统中的能量再生过程。

本文公开的方法和组合物模拟真核细胞的细胞质环境，并且导致蛋白质产生和蛋白质折叠超过现有技术的方法的显著改善。例如，因为由于细胞器的存在，氧化磷酸化在反应体积中是活性的，所以本文的系统减少或完全避免了与合成抑制相关的二次能源的必要性。

本文实施例的系统可用于生物聚合物的生产/复制，包括例如DNA的扩增、从DNA或RNA模板的RNA转录、RNA翻译成多肽、以及从单糖合成复杂碳水化合物。在一些例子中，增强的合成包括以下一种或多种：系统中合成的生物聚合物的总量或相对量中的增加；每单位时间合成的生物聚合物的总量或相对量中的增加；合成的生物活性生物聚合物(例如，正确折叠和/或翻译后修饰的蛋白质)的总量或相对量中的增加；合成的可溶性生物聚合物的总量或相对量中的增加，以及合成给定量的生物聚合物所需的时间和/或金钱中的支出减少。

本文的特定实施例实现mRNA的翻译以产生多肽，所述翻译可以与mRNA从DNA模板的体外合成偶联。此类无细胞系统含有mRNA翻译所需的所有因子，例如核糖体、氨基酸、tRNA、氨酰基合成酶、延伸因子、起始因子和核糖体再循环因子。在本文的例子中，此类无细胞系统包含以本文所述方式从真核细胞例如植物细胞(例如烟草BY-2细胞)制备的细胞裂解产物。

细胞裂解产物

本文的实施例可以适合利用任何真核细胞裂解产物。无真核细胞裂解产物保留各种翻译后加工活性。真核细胞裂解产物还支持广泛多样的病毒和其它原核RNA以及真核mRNA的体外翻译。具有源自生物那种的密码子使用的模板mRNA，可以例如通过用生物中的稀有tRNA和/或氨基酸补充系统而有效地使用，细胞裂解产物由所述生物衍生。本文的特定例子利用烟草BY-2细胞裂解产物，其显示在分批培养和搅拌槽发酵器两者中的悬浮培养中提供简单且成本有效的发酵，并且顺应良好建立的遗传修饰工具。

根据本文实施例的细胞裂解产物的制备尤其可以包括细胞壁(对于植物细胞)和细胞膜的破坏/去除，溶解小泡的去除，以及内源mRNA的去除。

在一些实施例中，细胞壁和膜可以通过技术进行破坏，所述技术包括例如但不限于机械破碎、液体均质化、酶促消化、高频声波、减压、冻/融循环和手动研磨。在本文的特定实施例中，通过使用一种或多种细胞壁消化酶(例如，Cellulase Onozuka RS^TM、PectolyaseY-23^TM、Macerozyme R-10)、以及液体酶(例如，Rohament CL^TM、Rohament PL^TM和RohapectUF^TM，其最初预期用于生产果汁和提取物)消化细胞壁来制备植物细胞裂解产物。RohamentCL^TM包含纤维素酶浓缩物，Rohament PL^TM是果胶酶浓缩物，并且Rohapect UF^TM含有酶复合物，包括专门的果胶酶和阿拉伯聚糖酶。与常规方法相比，这些酶组合的使用使原生质体化的成本减少多于100倍。

同样在裂解产物制备期间，可以去除任何溶解液泡。此类液泡含有不期望有的酶，包括蛋白酶和核糖核酸酶，其干扰多肽和mRNA的合成。在本文的一些实施例中，通过以Percoll梯度或任何其它密度梯度离心去除溶解液泡。液泡具有低密度，并且因此可以与原生质体分开，产生高密度的排出原生质体。在一些例子中，逐步蔗糖密度梯度可以用于排出，其中将原生质体直接应用于不含Percoll的顶层上。在离心后，排出的原生质体将与液泡分开，例如，在40％和70％Percoll层之间的界面处浓缩(取决于所使用的梯度)，而分开的低密度液泡将在较低的密度梯度处；例如，浮在顶层上。

然后可以洗涤经过排出的原生质体，然后通过Dounce组织研磨器或氮减压破坏，以保护不稳定的细胞组分免于氧化。在去除核和未破坏的细胞后，可以处理裂解产物以破坏内源mRNA，同时留下18S和28S核糖体RNA的完整性主要不受影响，从而使本底翻译降到最低。在本文的特定例子中，使用核酸酶S7。

模板

为了指导本文系统中生物聚合物的合成，必须在反应中存在模板，作为待转换成聚合物的贮存信息。用于无细胞蛋白质合成的模板可以是mRNA或DNA，编码任何目的多核苷酸(DNA)或多肽(DNA和/或mRNA)。偶联的转录/翻译系统用可识别启动子从DNA模板连续生成mRNA。可以使用内源RNA聚合酶，或者可以将外源RNA聚合酶(例如，噬菌体RNA聚合酶，通常是T7或SP6)直接加入反应混合物中。可替代地，可以通过将信息插入QB复制酶(RNA依赖性RNA聚合酶)的模板中来连续扩增mRNA。在一些实施例中，在多克隆区的一个末端处含有聚A序列的载体用作IVTT反应中的模板。例如，此类载体可以在多克隆区的另一个末端处含有SP6、T7或T3 RNA聚合酶启动子，使得克隆到载体内产生侧翼为在5'末端处的RNA聚合酶启动子和在3'末端处的聚A序列的基因。在其中利用mRNA作为模板的实施例中，纯化的mRNA可以在它加入反应混合物中之前通过化学修饰来稳定。

可以优化根据本文实施例用作模板的DNA或mRNA序列的核苷酸序列，以实现更高水平的表达。几种mRNA结构特征影响翻译效率，包括在编码序列的5'和3'末端处的非翻译区(UTR)。5'UTR的结构影响翻译起始、终止和mRNA稳定性。翻译起始中的限速步骤之一是mRNA与43S前起始复合物的结合。翻译机制由前导序列中的5'帽或翻译增强子募集。在本文的某些实施例中，模板mRNA可以含有选自以下的非翻译区：pCITE2a中的5'UTR(其含有源自脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES))；载体pF3A中来自大麦黄矮病毒(BYDV)的序列；来自杆状病毒多角体蛋白基因的5’UTR；合成的3’UTR，包括聚A序列；以及包括ARC-1序列元件的5’UTR(其与内部18S rRNA区段互补，并且可以促进与40S核糖体亚基的结合)；烟草花叶病毒(TMV)5'-UTR(ω序列)，其可以通过在初始GUA三联体的上游添加GAAAGA来改善。

在一些实施例中，DNA分子用于体外产生加帽的mRNA，例如，在帽类似物m7G[5’]ppp[5’]G的存在下。可以通过凝胶过滤去除未掺入的核苷酸和帽类似物，然后可以将纯化的mRNA引入如本文所述的无细胞系统内，在其中它充当用于多肽合成的模板。

单体

在偶联的IVTT反应中，系统中需要核糖核苷酸三磷酸(ATP、GTP、CTP、UTP)和氨基酸，作为用于合成所需生物聚合物的单体单元。在本文的一些实施例中，相对于具有常规能量再生系统的可比较系统，该系统以减少水平的一种或多种NTP操作。在这些实施例中，所公开的系统对于系统的操作提供了有利的支出减少。在某些实施例中，所公开的系统以2-10mM，例如4-8mM或5-7mM ATP的最终ATP浓度操作。在某些实施例中，所公开的系统以0.8-2.5mM，例如1-2mM或1.4-1.8mM GTP的最终GTP浓度操作。在某些实施例中，所公开的系统以0.4-2.4mM，例如0.5-2mM或0.6-1.0mM CTP的最终CTP浓度操作。另外，在某些实施例中，所公开的系统以0.4-2.4mM，例如0.5-2mM或0.6-1.0mM UTP的最终UTP浓度操作。例如，该系统可以以在或约6mM ATP、1.6mM GTP、0.8mM CTP和0.8mM UTP的最终NTP浓度操作。在特定例子中，合成反应补充有低浓度的NTP混合物，其含有大约150mM ATP、大约40mM GTP、大约20mM CTP和大约20mM UTP，并且将该混合物以足够的量加入系统中，以提供NTP的最终浓度。还可以加入氨基酸例如至20-500pM的最终浓度。如果在偶联反应中使用放射性标记的氨基酸(例如，³⁵S甲硫氨酸和³H亮氨酸)，则可以从氨基酸混合物中排除相应的氨基酸。

盐

在根据本文实施例的系统中控制盐的浓度。例如，系统可以向其中添加一种或多种盐，包括例如但不限于钾、镁、铵和其它生物学相关的盐，例如锰(例如乙酸锰或硫酸锰)。此类盐中的一种或多种可以具有氨基酸作为抗衡阴离子。关于合成反应的功能，离子种类中存在相互依赖性。当改变反应介质中特定离子的浓度时，可以相应地改变另一种离子的浓度。例如，可以根据其它组分例如核苷酸的变化同时控制添加的盐的浓度。此外，连续流动反应器中组分的浓度水平可以随着时间过去而变。

镁

镁对于蛋白质翻译很重要，因为它增强核糖体组装以及组装核糖体的稳定性。镁看起来也在促进聚合酶结合中起作用。在本文的实施例中，细胞裂解产物的镁浓度可以通过另外的镁化合物进行调整。在一些实施例中，另外的镁化合物是盐；例如，氯化镁、乙酸镁和谷氨酸镁。为了偶联转录和翻译，可以向裂解产物中加入足够量的镁盐，以将最终的镁浓度升高到其中RNA从DNA转录的水平，并且RNA被翻译成蛋白质。在一些例子中，可将最终镁浓度调整至1-20mM。例如，最终的镁浓度可以是5-15mM、7-13mM、2.5mM至5.5mM、2.5mM至3.5mM、2.6mM至3.0mM、3.0mM至5.25mM、或4.0mM至4.75mM，取决于所使用的裂解产物。

为了提供本文系统中的镁浓度的精确控制，在添加另外的镁之前，可以通过使用镁测定直接测量裂解产物镁水平。例如，Lancer“Magnesium Rapid Star Diagnostic Kit”(Oxford LabWareDivision^TM,Sherwood Medical Co.,St.Louis,MO)是可以准确地测量生物流体中的镁水平的一种测定。一旦已知关于给定分批的裂解产物的镁离子浓度，则可添加另外的镁以使裂解产物的镁浓度达到所需范围内。

如上文提示的，反应中的最终镁浓度受其它条件和考虑的影响。因此，例如，随着核糖核苷酸三磷酸浓度上升，存在最佳镁浓度中的伴随增加，因为核糖核苷酸三磷酸趋于与溶液中的镁结合或螯合。因此，当核糖核苷酸三磷酸浓度增加时，一般还将另外的镁加入反应中。镁的最佳浓度也随着细胞裂解产物的类型而变。需要加入的镁的量也随着反应混合物中使用的裂解产物的浓度而变，因为增加裂解产物的浓度将增加来自裂解产物本身的镁的贡献。

钾

通常还将钾加入系统中，以达到所需水平的生物聚合物合成。钾(例如，乙酸钾和谷氨酸钾)一般以5-250mM(例如，5-100mM、5-75mM、5-50mM和5-30)的浓度存在。在特定例子中，钾浓度可以是10-20mM，甚至更特别地，它可以是约20mM。与关于镁的情况一样，由于其存在于内源性细胞裂解产物组分中，最终的钾浓度可能略有不同。

另外的组分

在特定实施例中，还可以根据需要将另外的组分加入系统中，以改善合成反应的效率或稳定性。尽管不是绝对必要的，但偶联的转录和翻译反应的一个常见添加是例如足以刺激链延长效率的多胺量。多胺同样影响最佳镁水平，并且已知多少降低关于翻译反应的有效镁浓度。因此，多胺可以在一定水平上取代镁，并且在特定例子中，可以允许用于偶联的转录和翻译的最佳镁水平的一定降低。

可以向反应混合物中加入对不期望有的酶促活性的代谢抑制剂。可替代地，可以直接从提取物中去除负责不期望有的活性的酶或因子，或者可以从染色体中灭活或缺失编码不期望有的酶的基因。

从宿主生物中纯化(参见Muller&Blobel(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7421-5)或合成的囊泡也可以加入系统中。这些可以用于增强蛋白质合成和折叠。例如，本文描述的系统也可以用于无细胞反应以活化膜蛋白；例如，插入或易位蛋白质或者易位其它化合物，并且在特定实施例中，可以通过添加含有所需膜蛋白的囊泡来辅助这些过程。

除上述组分之外，可以将其它材料(例如在蛋白质合成中特别利用的那些)加入如本文所述的系统中。此类材料可以包括例如但不限于，其它盐、亚叶酸、环AMP、蛋白质抑制剂或核酸降解酶、RNasin、蛋白质合成的抑制剂或调节剂、氧化/还原电位的调节剂、DTT、氯霉素、非变性表面活性剂、缓冲组分(例如可以用于溶液中以稳定反应pH)、PEG、Triton X-100、精胺、亚精胺和腐胺。

一些实施例包括试剂盒，其包括用于合成生物聚合物的系统的组分，而无需使用人工再生系统。在特定实施例中，试剂盒可以包括细胞裂解产物。可替代地，试剂盒可以包括用于培养和扩增的细胞，以产生用于制备细胞裂解产物的细胞。在特定实施例中，试剂盒可以包括盐、NTP、酶(例如聚合酶和核酸酶)、酶抑制剂(例如RNasin)、模板和其它添加剂(例如氯霉素)中的一种或多种。在特定例子中，试剂盒可以包括裸载体，目的基因可以克隆到其内，用于用作系统中的模板。在包括细胞裂解产物的试剂盒中，裂解产物可以是标准，或者它可以是在制造期间已经对其盐浓度做出调整的类型，或者另外其中已包括关于偶联的转录和翻译所需的组分、试剂或缓冲液中的一种或多种。在特定例子中，试剂盒可以不包括模板，而是可以依赖用户来提供模板。试剂盒可以包括一组指令，或包含说明书的网站的链接，告知用户如何利用试剂盒的组分执行合成反应。

V.用于生物聚合物合成的方法

如上所述的系统可以用于体外合成一种或多种生物聚合物的方法中。体外合成指在包含生物提取物和/或限定试剂的反应混合物中的生物大分子的无细胞合成。使用本文的系统，无细胞合成反应可以以分批、连续流动和半连续流动配置执行，因为这些配置是本领域已知的。在一些实施例中，可以使用分批培养的细胞。在一些实施例中，细胞可以在搅拌槽发酵罐中连续生长，以确保均质细胞材料的可再生供应。

在使用静态IVTT反应相对于连续或流通反应之间存在差异，其可能是某些应用而不是其它应用中的考虑。例如，连续系统一般用于蛋白质的大规模工业生产，而静态系统反应更适合于小规模体外翻译(例如，在研究背景中)。连续翻译的执行成本要高得多，需要设备投资以及显著量的试剂。特别地，用于制备连续真核生物反应的RNA聚合酶的水平对于简单的研究应用可能是禁止的(即，多达20,000-30,000U/反应)。此外，连续反应设计为以相对大的体积执行，而静态反应不需要额外的设备，并且仅需要少量的试剂，因为反应体积通常仅为大约100μL或更低。

本文的系统可以利用大规模反应器、小规模反应器，或者可以多路复用以执行多个同时合成。连续反应使用进料机制来引入试剂流，并且可以将最终产物作为该过程的部分分离。在连续反应和静态反应两者中，可以引入另外的试剂以延长用于活性合成的时间段。反应器可以以任何模式例如分批、延长分批、半分批、半连续、补料分批和连续运行，所述模式可以根据应用目的加以选择。

反应可以在任何体积中进行，再次取决于应用和所使用的设备。例如，在小规模反应中，反应体积可以是1-15μL、至少15μL、至少50μL、至少100μL、至少0.5mL、或至少1mL，但可以小于10mL。原则上，只要供应足够的氧(或其它电子受体)，反应可以在任何规模下进行。为了生产最大量的产物，可以使用工业生物反应器。

本文的方法可以利用用于分离合成的生物聚合物的手段；例如，蛋白质分离手段。在以连续操作模式操作的一些实施例中，来自反应器的产物输出流过膜，并且进入蛋白质分离手段内。在半连续操作模式中，膜的外侧或外表面与预定溶液接触，所述预定溶液以预定次序循环变化。这些溶液可以含有底物如氨基酸和核苷酸。此时，反应器以透析、或渗滤分批或补料分批模式操作。可以通过相同的膜或分开的注射单元将进料溶液供应到反应器。合成的蛋白质在反应器中积累，然后在系统操作完成后，根据用于蛋白质纯化的通常方法分离且纯化。

当存在试剂的流动时，液体流动的方向可以与膜垂直和/或相切。切向流对于再循环ATP有效，并且用于防止膜堵塞并且可以叠加在垂直流上。垂直于膜的流动可以由正压泵或真空抽吸泵引起或完成。与膜的外表面接触的溶液可以循环改变，并且可以相对于膜处于稳定的切向流中。此外，可以通过适当的搅拌手段在内部或外部搅拌反应器。

在反应器中的蛋白质合成期间，用于选择性分离所需蛋白质的蛋白质分离手段可以包括填充有颗粒的单元，所述颗粒由固定有组分的抗体分子或其它分子包被，所述组分用于吸附合成的所需蛋白质，以及具有适当大小的孔的膜。优选地，蛋白质分离手段包括用于交替使用的两个柱。

可以以各种方式测量在翻译反应中产生的蛋白质的量。一种方法依赖测定的可用性，所述测定测量待翻译的特定蛋白质的活性。用于测量蛋白质活性的测定的例子是荧光素酶测定系统、或氯霉素乙酰转移酶测定系统。这些测定测量由翻译反应产生的功能活性蛋白质的量。活性测定不测量全长蛋白质，其由于不适当的蛋白质折叠而失活或缺乏蛋白质活性所必需的其它翻译后修饰。可替代地，可以通过毛细管电泳根据其大小检测特定蛋白质。

测量偶联的体外转录和翻译反应中产生的蛋白质的量的另一种方法是使用已知数量的放射性标记的氨基酸如³⁵S-甲硫氨酸、³H-亮氨酸或^l4C-亮氨酸执行反应，并且随后测量放射性标记的氨基酸掺入新近翻译的蛋白质内的量。掺入测定将测量反应中产生的所有蛋白质中放射性标记的氨基酸的量，包括截短的蛋白质产物。放射性标记的蛋白质可以在蛋白质凝胶上进一步分离，并且通过放射自显影确认产物是合适的大小，并且没有产生次级蛋白质产物。

实例

实例1：材料和方法

植物材料

将烟草细胞(烟草(Nicotiana tabacum)L.cv.Bright Yellow 2，BY-2)在5-L发酵罐(100e型，Applicon^TM Biotechnology,AC Schiedam，荷兰)或摇瓶中培养，同时维持在26℃下在黑暗中20-25％的血细胞压积。我们使用Murashige-Skoog液体培养基(Murashige和Skoog基础盐混合物，Duchefa^TM Biochemie，Haarlem，荷兰)，其补充3％(w/v)蔗糖、1mg/L硫胺素-HCl、0.2mg/L 2,4二氯苯氧基乙酸、100mg/L肌醇、250mg/L正磷酸二氢钾和

L-61消泡剂(BASF^TM,Mount Olive,NJ,USA)。

BY-2细胞裂解产物的制备

在发酵的指数生长期过程中以20-25％的恒定血细胞压积收获BY-2细胞。为了制备原生质体，它们直接在发酵培养基中用3％(v/v)CL和0.2％(v/v)

UF(果胶酶和阿拉伯聚糖酶)(AB Enzymes^TM，Darmstadt，德国)进行处理。通过加入360mM甘露醇来调整渗透压。

为了排出所得到的原生质体，将原生质体分层到在50mL聚丙烯管(Greiner Bio-One^TM，Frickenhausen，德国)中的0.7M甘露醇、20mM MgCl₂和5mM PIPES-KOH(pH 7.0)中的不连续Percoll梯度上，所述梯度(从下到上)含有70％(v/v,3ml)、40％(v/v,5ml)、30％(v/v,3ml)、15％(v/v,3ml)和0％(3ml)Percoll(GE^TM Healthcare，Munich，德国)。在吊桶式转子(JS-5.3,Beckmann-Coulter^TM,Krefeld Germany)中在25℃下以6800x g离心1小时后，从40–70％(v/v)Percoll溶液界面回收排出的原生质体，且悬浮于3–3.5体积的TR缓冲液(30mM HEPES-KOH(pH 7.4)、60mM谷氨酸钾、0.5mM谷氨酸镁、2mM DTT)中，补充有一个片剂/50mL完全无EDTA蛋白质抑制剂混合物(Complete EDTA-free Protease InhibitorMixture)(Roche Diagnostics^TM，Mannheim，德国)。

然后使用Dounce^TM匀浆器(Braun TM，Melsungen，德国)的15次冲击，在冰上破碎原生质体，并且通过在4℃下以500x g离心10分钟去除核和未破碎的细胞。然后将上清液以1mL等分试样在-80℃下冷冻。任选地且在冷冻之前，上清液可以补充有0.5mM CaCl₂，并且在20℃下用75U/mL核酸酶S7(Roche Diagnostics)处理15分钟，然后补充有2mM EGTA作为用于Ca²⁺离子的螯合剂，以使核酸酶失活。

质粒构建体

载体pIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP-His通过使用NspI和NcoI位点，将退火的寡核苷酸引物1(SEQ ID NO:1)和寡核苷酸引物2(SEQ ID NO:2)插入pIVEX1.3_eYFP-His(由Dr.Stefan Kubick，Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology IZI，Potsdam-Golm，德国友情提供)内进行制备，所述寡核苷酸引物含有T7启动子和具有GAAAGA作为前六个核苷酸的烟草花叶病毒5'ω前导序列。对于含有N末端链霉抗生物素蛋白亲和标签的载体pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP，使用pIX3.0_Strep-eYFP作为模板(由Dr.Stefan Kubick友情提供)，用寡核苷酸引物3(SEQ ID NO:3)和寡核苷酸引物4(SEQ IDNO:4)，通过PCR扩增Strep-eYFP序列。用PciI和Acc65I消化PCR产物，并且插入pIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP-His的NcoI和Acc65I位点内。

使用寡核苷酸引物5-24(SEQ ID NO:5-24)，通过基因的PCR扩增，以及通过Gibson组装(NEB TM，Frankfurt，德国)，PCR产物随后整合到用NcoI和KpnI切割的pIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP-His内，产生具有21333、22807、AAD12、Cry2A、Cry3A、Trap8VIP3A、VIP3A、Cry6A、17912和Cry1F的pIVEX载体。

表1.寡核苷酸引物和载体插入物。

偶联的转录-翻译无细胞蛋白质合成

偶联的转录-翻译反应以50μL等分试样在25℃和700rpm下在热混合器(通过Ditabis TM，Pforzheim，德国的HLC)中进行40-52小时。具有磷酸肌酸和肌酸激酶的反应含有40％(v/v)烟草BY-2细胞裂解产物(BYL)、20mM HEPES-KOH pH 7.8、10mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸钾、3mM ATP、1.2mM GTP、1.2mM CTP、1.2mM UTP、100μg/mL氯霉素、50ng/μL T7 RNA聚合酶、80ng/μl质粒、30mM磷酸肌酸和100μg/ml肌酸激酶。不含磷酸肌酸和肌酸激酶的反应含有40％(v/v)BYL、20mM HEPES-KOH(pH 7.8)、9mM谷氨酸镁、20mM谷氨酸钾、4mM ATP、1.6mM GTP、1.6mM CTP、1.6mM UTP、100μg/mL氯霉素、30ng/μL T7 RNA聚合酶和40ng/μL质粒。

产物分析

来自eYFP的荧光信号使用具有485/20nm激发和528/20nm发射滤光片的Synergy^TMHT Multi-Mode Microplate Reader(Biotek^TM，Bad Friedrichshall，德国)进行定量。通过在不含DNA模板的BYL翻译反应中，基于不同浓度的eYFP生成标准曲线来确定eYFP的数量。使用基于大肠杆菌的内部体外翻译系统(Zawada(2012)Methods Mol.Biol.805:31-41)产生eYFP标准，并且通过固定化金属亲和层析(IMAC)和尺寸排阻层析(SEC)进行纯化。使用比色测定来确定纯化的eYFP的浓度。Bradford(1976)Anal.Biochem.72:248-54.

靶蛋白的残基特异性标记

为了以氨基酸选择性方式荧光标记靶蛋白，根据制造商的说明书使用FluoroTect^TM GreenLys体外翻译标记系统(Promega^TM，Mannheim，德国)。该产物含有用荧光团-FL标记的经修饰的荷电赖氨酸tRNA。使用该系统，荧光标记的赖氨酸残基在翻译过程中在多重位点处掺入新生蛋白质内。

JC-1染色

使用亲脂性阳离子探针，5,6-二氯-2-[3-(5,6-二氯-1,3-二乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-亚基)-1-丙烯基]-1,3-二乙基-碘化物(JC-1,Thermo Scientific^TM,Waltham,MA,USA)证明BYL中线粒体的存在。在活细胞中，在去极化的线粒体膜电位下，JC-1作为绿色荧光单体(490nm激发/530nm发射)存在。在正常和超极化的线粒体膜电位下，JC-1集中在线粒体内并且形成J聚集体，其将发射从530移至590nm。细胞线粒体证实J聚集体越来越高的红色荧光(590nm)，伴随越来越负的线粒体膜电位。Nuydens等人(1999)J.Neurosci.Methods 92:153–9；Reers等人(1995)Methods Enzymol.260:406–17；Salvioli等人(1997)FEBS Lett.411:77–82。

对于BYL染色，将JC-1以5mg/mL的浓度溶解于DMSO中。JC-1储备溶液以1:1000稀释度用于在10分钟内以5μg/mL的终浓度染色线粒体。

具有用于氧化磷酸化的抑制剂的无细胞蛋白质合成。

连同和不连同氧化磷酸化的抑制剂对BYL系统的添加进行无细胞蛋白质合成(50μL反应)，所述BYL系统具有和不具有磷酸肌酸和肌酸激酶。抑制剂包括：叠氮化钠(0.05％，Bogucka&Wojtczak(1966)Biochim.Biophys.Acta 122:381-92)和2-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA，0.5mM；Tappel(1960)Biochem.Pharmacol.3:289–96)。将叠氮化钠溶于水中。将TTA溶于甲醇中。用甲醇执行的阴性对照证实该溶剂在本研究中使用的浓度下不影响蛋白质合成。

实例2：没有人工能量再生的蛋白质合成

为了减少磷酸盐的释放，在无细胞BYL系统中省略了由磷酸肌酸(CP)和肌酸激酶(CK)组成的人工再生系统。利用基于设计实验(DoE)的方法(Design Expert v8.0(State-Ease^TM Inc.,MN,USA)中的分数设计和响应表面模型)设计具有可变浓度的反应组分的反应，含有以及不含CP和CK；HEPES-KOH pH 7.8(0-80mM)、谷氨酸镁(1-12mM)、谷氨酸钾(0-40mM)、质粒(10–100ng/μL(4.5–43nM))、NTP(即，ATP/(GTP/CTP/UTP))(0.5/0.2–4/1.6mM)和T7 RNA聚合酶(20–80ng/μL)、含有以及不含CP(0–40mM)和CK。由具有CP/CK的系统采用氯霉素浓度。根据这些实验，对于两种系统(含有以及不含CP/CK)获得优选的反应组分浓度。表2。

表2.在含有以及不含CP/CK的偶联BYL系统中反应组分的优选浓度。

组分	+CP/CK	-CP/CK
			HEPES-KOH，pH7.8	20mM	20mM
谷氨酸镁	10mM	9mM
			ATP/(GTP/CTP/UTP)	3/1.2mM	4/1.6mM
磷酸肌酸	30mM	-
			质粒	80ng/μL(～34nM)	40ng/μl(～17nM)
T7聚合酶	50ng/μL	30ng/μl
			谷氨酸钾	10mM	20mM
肌酸激酶	100μg/mL	-
			氯霉素	100μg/mL	100μg/mL

含有CP/CK以及不含CP/CK的BYL系统的比较揭示，不含CP/CK的系统显示延长的活性约40小时(与在含有CP/CK的BYL中的20小时相比较)，并且产生高达多60％的靶蛋白。图1A。通过用选择性染料JC-1(Thermo Fischer Scientific,Waltham,MA,USA)染色BYL来证明BYL中线粒体的存在，所述JC-1发出红色荧光，指示线粒体在BYL中保留其特征性膜电位。通过使用电子传递链的两种不同抑制剂证实通过氧化磷酸化的能量再生；叠氮化钠和噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)。发现叠氮化钠和TTA两者几乎完全抑制该系统，如通过靶蛋白eYFP的急剧减少的生物合成所示。图1(B)。

不含CP/CK的系统中的能量被认为由氧化磷酸化提供。源自添加的谷氨酸镁和谷氨酸钾的谷氨酸盐在线粒体内部的柠檬酸循环中代谢，导致还原等价物NADH和FADH的生成。电子经由NADH和FADH进入电子传递链，以通过分子氧的消耗经由氧化磷酸化生成ATP。图2。

将不含CP/CK的BYL系统中的十种靶蛋白的表达与含有CP/CK的BYL系统进行比较。含有以及不含磷酸肌酸(CP)和肌酸激酶(CK)的偶联的BYL转录-翻译反应在25℃下进行40小时。在每种情况下，将2μL反应体积装载到4-12％(w/v)梯度SDS-PAGE凝胶上，并且通过考马斯染色显现合成蛋白质的量。几种靶蛋白，包括AAD12、Cry3A和Cry1F，在优化的系统(不含CP/CK)中显示显著更高的表达水平，如通过考马斯染色的凝胶中更强的条带所表示的。

没有人工能量再生系统的BYL系统更廉价并且运行更长时间，导致增加水平的重组蛋白质。此外，BYL系统提供了调查影响线粒体功能的化合物或蛋白质的可能性。

实例3：没有人工能量再生的偶联的转录-翻译反应的修饰

山梨糖醇用于BY-2裂解产物制备的用途。

为了制备BY-2裂解产物，需要大量的渗透压物质来调整在原生质体化和排出期间的渗透压。甘露醇照常规用于这个目的，并且它占裂解产物制备的总成本的约10％。我们测试了山梨醇(约10倍廉价)作为渗透压物质的能力。使用甘露醇或山梨糖醇用于原生质体化和排出的平行实验揭示山梨醇令人惊讶地不是甘露醇的等价物；如通过eYFP的表达所确定的，它在裂解产物产率和裂解产物质量两个方面均更好(图5)。此外，发现山梨糖醇的较高溶解度促进缓冲液制备。然而，还发现对于排出原生质体的最终洗涤甘露醇优于山梨糖醇，因为在该步骤中利用山梨糖醇导致较低的eYFP产率和更粘稠的反应混合物。

微生物生长的抑制。

当温育IVTT反应时，BY-2裂解产物能够支持微生物的生长，导致反应底物的耗尽和因而靶蛋白的产率减少。因此，在IVTT反应系统中测试了几种抗微生物物质。关于其对IVTT eYFP产生和微生物生长的作用，调查了氯霉素、壮观霉素、链霉素、氨苄青霉素和叠氮化钠。

将抗微生物物质加入BYL反应中，并且在45小时温育后，将0.2μL BYL反应混合物在LB板上铺平板，以分析微生物生长。壮观霉素、链霉素、氨苄青霉素和叠氮化钠或对微生物生长没有抑制作用，或者显示对eYFP产率的不利影响。例如，以0.05％(w/v)浓度的叠氮化钠几乎完全抑制微生物生长和翻译活性，可能通过抑制线粒体能量再生。仅氯霉素能够抑制微生物生长而没有翻译活性的任何损失(图3B；图3C)，从而使其在IVTT系统中的有用性方面至少不同于其它抗微生物物质。剂量应答研究指示，在100μg/mL氯霉素下达到最高的eYFP产率(图3D，同时在200μg/mL氯霉素下获得微生物生长的完全抑制(图3A)。SDS-PAGE分析也证实氯霉素对eYFP产率和蛋白质稳定性的保护作用。与在氯霉素的存在下执行的反应不同，不含氯霉素的反应显示显著的蛋白质降解。

三磷酸核苷。

通过基于DoE的方法来调整系统中NTP的浓度。由于ATP和GTP用于转录和翻译两者中，而CTP和UTP仅用于转录中，因此预期与CTP和UTP相比，更高浓度的ATP和GTP对于偶联的IVTT系统是有益的。因此，在基于DoE的实验中改变单个NTP的浓度，而不是使用不同体积的固定NTP混合物。使用具有96次运行的立方IV优化设计就最佳浓度筛选这些。用于IVTT反应的质粒模板是pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP。由于NTP与镁的结合，调整谷氨酸镁的浓度。表3显示了关于每种筛选因子的浓度范围。将二次模型拟合到实验数据上。响应表面模型用于预测产生最多产物eYFP蛋白的因子值(Zhou等人，2010)。所有非显著项(通过ANOVAp>0.05)被丢弃，并且模型在ANOVA表中显示为显著的(表4)。

该实验揭示在反应中用6mM ATP、0.8mM CTP、0.8mM UTP和1.6mM GTP产生最多的靶蛋白。图4。这些结果导致了由150/40/20/20mM ATP/GTP/CTP/UTP组成的新NTP混合物的开发。在IVTT系统中，使用2μL新NTP混合物使eYFP产率增加20％。作为另外的益处，新NTP混合物比标准混合物低大约40％，由于与其它核苷酸相比，ATP的成本低10-15倍。

表3.在实验设计中筛选的因子的浓度范围。

因子	浓度
		谷氨酸镁	7–13mM
ATP	2–6mM
		GTP	0.8–2.4mM
CTP/UTP	0.8–2.4mM

表4.根据谷氨酸镁和NTP浓度的产率的ANOVA表。

较大的裂解产物数量的使用。

为了调查增加IVTT反应的裂解产物部分对靶蛋白表达的作用，在原生质体化和排出期间，使用由甘露醇制备的BYL以及由山梨糖醇制备的几种BY-2裂解产物，用40％(20μL)或60％(30μL)裂解产物执行50μL反应。使用质粒pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为模板，在25℃和700rpm下进行反应48小时。与用60％(v/v)山梨糖醇制备的裂解产物的反应实现约1mg/mL eYFP，这对应于与标准反应混合物相比高80％的产率(图5)。据推测，核糖体、翻译因子、分子伴侣和线粒体增加丰度的增加或延长了能量生成，导致更高的产率。这个结果显示裂解产物不含有在如此大的丰度下产生更大抑制的不利因子。

靶蛋白在没有人工能量再生系统的无细胞系统和小麦胚芽提取物中的表达。

为了验证没有人工能量再生的无细胞表达系统一般跨越底物是有效的，该系统用于表达除eYFP外的10种另外的靶基因产物。加上Strep标签的eYFP和其它10种靶蛋白在用山梨糖醇制备的60％BY-2细胞裂解产物、用甘露醇制备的40％BY-2细胞裂解产物和来自CellFree^TM Sciences的WGE系统中表达。偶联的转录-翻译反应在50μL体积中在25℃和700rpm下进行40小时。使用WGE系统的解偶联的转录和翻译反应根据制造商的说明书进行。在每种情况下，分别将1μL反应混合物和混合双层反应装载到4-12％(w/v)梯度SDS PAGE凝胶上，并且通过考马斯染色显现靶蛋白。BYL系统成功地转录了所测试的不同基因中的每一种，并且还用翻译跟随转录以在每种情况下产生蛋白质。事实上，与使用WGE系统生产的那种相比，BYL系统一致地产生更强的条带。对于Strep-eYFP，使用荧光阅读器对三个系统中产生的蛋白质进行定量，并且与eYFP标准曲线进行比较，揭示在BYL系统的两组条件下产生1115μg/mL和441μg/mL，并且在WGE系统中仅产生105μg/mL。

葡糖基甘油的添加和更高裂解产物数量的使用。

为了在没有人工能量再生的情况下增加无细胞裂解产物的稳定性，我们假设被描述为用于细胞和/或蛋白质的冷冻保护剂的小分子可能能够维持裂解产物的翻译活性。此类分子天然存在于嗜极生物中，并且它们可以保护嗜极生物不受渗透压、热、干燥和紫外线。它们通过引起在表面处增加的水密度来促进蛋白质的天然构象，稳定膜和蛋白质。然而，预期冷冻保护剂可以显示出对IVTT系统的强烈抑制作用。

将不同浓度的冷冻保护剂，四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶和葡糖基甘油加入偶联的IVTT反应中，并且测定由模板质粒pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP产生的eYFP的量。50μLIVTT反应(具有60％(v/v)BYL)在96孔板中在25℃和500rpm下，在Kuhner shaker^TM中的受控湿度下进行44小时。

在分别高达1％和2％(v/v)的浓度下，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶对eYFP产率没有影响。图6。事实上，较高浓度的四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶抑制该系统。相比之下，葡萄糖基甘油对eYFP产率具有强烈的正面影响。与不含葡糖基甘油的标准反应相比，含有0.5％(v/v)葡糖基甘油的反应在44小时后产生多约50％的eYFP。图6。

在不含和含有0.5％(v/v)葡糖基甘油的IVTT反应中，葡萄糖基甘油的正面影响跨越五个不同的裂解产物分批(BYL 08.01.2016、BYL 21.01.2016、BYL 11.03.2016、BYL01.04.2016、BYL 05.04.2016)是一致的。50μL IVTT反应用60％和80％(v/v)的裂解产物部分，使用质粒pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP作为模板，在96孔板中在25℃和500rpm下在受控湿度下(70％)下，一式三份执行48小时。与不含葡糖基甘油的反应相比，在使用60％(v/v)裂解产物和0.5％(v/v)葡糖基甘油的反应中，产生多约80％的eYFP。图7。与使用不含葡萄糖基甘油的80％(v/v)裂解产物的反应相比，使用80％(v/v)裂解产物和0.5％(v/v)葡糖基甘油，eYFP产率增加约110％(几乎2mg/mL eYFP)。图7。

通过测量在直至64小时的不同时间点产生的蛋白质的量，来确定在没有人工能量再生的无细胞系统中IVTT反应的时间过程。图8。在16小时后，使用含有或不含0.5％葡萄糖基甘油的60％或80％裂解产物的反应已产生大约相同量的蛋白质。图8。不含葡糖基甘油，60％和80％(v/v)裂解产物两者中的翻译活性在24小时后没有进一步增加。图8。然而，在60％和80％(v/v)裂解产物两者中，具有葡糖基甘油的eYFP生产显示生产率的几乎线性增加直到至少64小时。图8。该结果确认葡糖基甘油对该系统具有稳定作用，其将翻译活性延伸至超过64小时。平均起来，具有80％(v/v)裂解产物和0.5％(v/v)葡糖基甘油的反应产生几乎2.5mg/mL的eYFP。

支链氨基酸的添加。

还测试了支链氨基酸(BCAA)在无细胞表达系统中促进蛋白质合成的能力，并且观察到BCAA的添加增加且稳定了靶蛋白质产率。为了验证BCAA对系统的积极作用，使用由摇瓶(SF)或连续发酵(CF)制备的四种裂解产物，将不同浓度的BCAA加入偶联的IVTT反应中。在Kuhner^TM振荡器中的受控湿度下，使用质粒模板pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep-eYFP，在96孔板中在25℃和500rpm下具有80％(v/v)裂解产物66小时的50μL IVTT反应中，BCAA在所有测试浓度下都eYFP产率都具有是积极影响，无论裂解产物是从摇瓶还是连续发酵制备。图9。与不含BCAAs的反应相比，含有1mM BCAA的反应产生多约70％的eYFP(2.5mg eYFP/mL的平均产率)。

Claims

1.一种用于合成生物聚合物的系统，所述系统包括：

包含质体、叶绿体、线粒体或叶绿体和线粒体的水性细胞裂解产物；

聚合物模板；和

聚合物的单体单元，其中所述系统不包含添加的磷酸肌酸和肌酸激酶，其对所述细胞裂解产物、质体、叶绿体、线粒体或叶绿体和线粒体是外源的。

2.根据权利要求1所述的系统，其还包括以下中的至少一个：

pH缓冲液；

镁，优选Mg(C₅H₈NO₄)₂；

钾，优选KC₅H₈NO₄；

三磷酸核苷；

酶，优选RNA聚合酶；和

氯霉素。

3.根据权利要求1所述的系统，其基本上由来自植物细胞的水性细胞裂解产物组成，包含线粒体；DNA模板；HEPES-KOH，pH7.8；Mg(C₅H₈NO₄)₂；KC₅H₈NO₄；三磷酸核苷；RNA聚合酶；和氯霉素。

4.一种用于合成至少一种生物聚合物的方法，所述方法包括将反应组分以反应体积组合，其中所述反应组分包含：

包含质体、叶绿体和/或线粒体的细胞裂解产物；

聚合物模板；和

所述聚合物的单体单元，

其中所述反应组分不包含磷酸肌酸和肌酸激酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其中满足下述条件的任何组合：

通过所述方法生产的生物聚合物是多肽；

所述方法用于RNA以及由RNA翻译的多肽的偶联合成；

所述细胞裂解产物是真核细胞裂解产物；

所述细胞裂解产物包含线粒体；

所述质体、叶绿体和/或线粒体对所述细胞裂解产物是外源的；

所述反应组分不包含肌酸激酶；

所述聚合物模板是RNA分子；

所述聚合物模板是DNA分子；

所述聚合物的单体单元是核苷酸；

所述聚合物的单体单元是包含在所述细胞裂解产物中的氨基酸；以及

通过抑制电子传递链或从反应中去除氧来终止所述反应。

6.根据权利要求4所述的方法，其中生物聚合物合成发生大于20小时，优选约40小时。

7.一种试剂盒，其包括：

以一个或多个分开体积设置的水性细胞裂解产物、质体、线粒体和/或叶绿体、以及聚合物的单体单元；和

指定所述试剂盒组分和不含磷酸肌酸的任何另外组分的混合的说明书。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中包括所述质体、线粒体和/或叶绿体的所述细胞裂解产物设置在一个体积中，并且所述聚合物的单体单元设置在分开的体积中。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述说明书指导使用者将所述细胞裂解产物、质体、线粒体和/或叶绿体、以及所述聚合物的单体单元与聚合物模板以不含磷酸肌酸的反应体积组合。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其还包含聚合物模板。