JP2020507322A - 人工エネルギー再生システムを必要としない新規の無真核細胞発現システム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年2月9日に出願された米国仮特許出願第62/457,073号の優先権の利益を主張するものであり、その開示内容はこの参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される一般的な戦略は、無細胞溶解物系反応において細胞小器官を利用して、反応システム内のエネルギー再生を提供する。この戦略は、一部の例では、バイオポリマー(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、および複合炭水化物)の改善されたインビトロ合成を達成するために有用である。特定の実施形態では、無真核細胞システムにおけるミトコンドリアの存在は、従来のバッチ式および連続反応に対する改善された反応システムをもたらし、これは例えば、エネルギー送達試薬(例えば、クレアチンリン酸および/またはクレアチンキナーゼ)の添加、および/またはアミノ酸補充の必要性を著しく低減または除去する一方、反応期間を長くすることによる。一部の例では、開示された無細胞重合反応は、当該技術分野で現在利用されている従来的反応よりも著しく効率的である。
粗溶解物に基づく無細胞タンパク質合成(CFPS)システムは、インビボシステムに対していくつもの利点を提供し、広範な応用、特に、タンパク質エンジニアリング、バイオ医薬品製造、および研究において有用である。従来の粗溶解物は、翻訳、タンパク質折り畳み、およびエネルギー代謝に必要な成分を含み、そのため、RNA鋳型によりコードされるほぼあらゆるタンパク質が、溶解物にエネルギー貯蔵試薬が補充される限り、アミノ酸、ヌクレオチド、および塩の存在下でその中で合成される。連結された転写/翻訳システムでは、DNA鋳型からのタンパク質の合成を指示するために、RNAポリメラーゼを加えることができる。細胞内合成とは対照的に、CFPSは、より短いプロセス時間、タンパク質加水分解の減少、ならびに毒性タンパク質および定義された位置において特定の化学基または非天然アミノ酸を含有するタンパク質を発現する能力を許容し得る。さらに、反応は直接的に制御および監視され得る。
AAD−12 アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−12
ADP アデノシン二リン酸
ATP アデノシン三リン酸
BCAA 分岐鎖アミノ酸
BY−2 Bright Yellow−2
BYL BY−2細胞溶解物
CFPS 無細胞タンパク質合成
CFU コロニー形成単位
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CL セルラーゼ酵素
CK クレアチンキナーゼ
CP クレアチンリン酸
Cry1F Bacillus thuringiensis Cry1Fデルタ−エンドトキシン
Cry3A B.thuringiensis Cry3Aデルタ−エンドトキシン
CTP シチジン三リン酸
DMSO ジメチルスルホキシド
DOE 実験の設計
DTT ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
eYFP 強化黄色蛍光タンパク質
FADH フラビンアデニンジヌクレオチド
GTP グアノシン三リン酸
ICE 昆虫細胞抽出物
IMAC 固定化金属親和性クロマトグラフィー
IVTT インビトロ転写および翻訳
NADH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
NADPH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
NEB New England Biolabs
NTP ヌクレオチド三リン酸
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PEG ポリエチレングリコール
RLL ウサギ網赤血球溶解物
SEC サイズ排除クロマトグラフィー
TCAサイクルトリカルボン酸サイクル(「クレブスサイクル」)
TTA テノイルトリフルオロアセトン
UTP ウリジントリリン
UTR 非翻訳領域
WGE 小麦胚芽抽出物
単離された:「単離された」生物学的成分(例えば、核酸またはタンパク質)は、当該成分が天然に存在している、生物体の細胞中の他の生物学的成分(すなわち、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNA、ならびにタンパク質)から、当該成分において化学的変化または機能的変化に影響を与えながら、実質的に分離され、離れて産生され、または精製されている(例えば、核酸は、染色体中の残りのDNAと当該核酸を繋ぐ化学的結合を破壊することにより、染色体から単離することができる)。「単離されている」核酸分子およびタンパク質としては、標準的な精製法により精製された核酸分子およびタンパク質が挙げられる。またこの用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドを包含する。
本開示は、人工再生システムを使用することなく、バイオポリマーを合成するためのシステムを提供する。本明細書のシステムには、酸化的リン酸化が活性化され、エネルギー貯蔵試薬の非存在下での収量の増加を提供する、バイオポリマーの強化されたインビトロ合成を達成する組成物および方法が含まれる。収量の改善は、反応IVTT成分の組み合わせによって得られ、これは実施者によって組み立てられて混合されてもよく、または予混合された成分、混合されていない成分、もしくはこれら二つの組み合わせとしてキットに提供されてもよい。実施者は、自分が提供する成分と組み合わせて、キットの成分の一部またはすべてを利用してもよい;例えば、一部の実施形態では、キットは、DNAまたはRNA鋳型以外のタンパク質合成のためのシステムのすべての成分を含み、DNAまたはRNA鋳型は選択されたタンパク質を合成するために実施者によって提供される。システムのすべての成分が、適切な環境条件下で反応体積中で混合されると、反応が開始され、明細書に記載される重要な変更と共に、一般的に従来のインビトロ無細胞合成反応にしたがって進行する。反応は、成分(例えば、NTPおよびアミノ酸)の一つ以上が反応体積中で使い果たされるまで、またはシステム内のエネルギー再生プロセスを終了するために環境条件を調節することによって停止されるまで進行が許容され得る。
本明細書の実施形態は、任意の真核細胞溶解物を利用するように適合され得る。無真核細胞溶解物は、様々な翻訳後プロセシング活性を保持する。真核細胞溶解物はまた、多種多様なウイルスおよび他の原核性RNA、ならびに真核性mRNAのインビトロでの翻訳をサポートする。細胞溶解物が由来する生物体のコドン用法から逸脱するコドン用法を有する鋳型mRNAは、例えば、該生物体中の希少なtRNAおよび/またはアミノ酸をシステムに補充することによって、効率的に使用され得る。本明細書の特定の例は、タバコBY−2細胞溶解物を利用し、これはバッチ培養および攪拌タンク発酵槽の両方における懸濁培養において簡便かつコスト効果の高い発酵を提供することが示され、また充分に確立された遺伝子改変ツールに適している。
本明細書のシステムでバイオポリマーの合成を指示するために、保存された情報がポリマーに変換されるように、反応に鋳型が存在する必要がある。無細胞タンパク質合成のための鋳型は、対象の任意のポリヌクレオチド(DNA)またはポリペプチド(DNAおよび/またはmRNA)をコードするmRNAまたはDNAのいずれかであり得る。連結された転写/翻訳システムは、認識可能なプロモーターを用いてDNA鋳型からmRNAを連続的に生成する。内因性RNAポリメラーゼが使用されてもよく、または外因性RNAポリメラーゼ(例えば、ファージRNAポリメラーゼ、一般的にT7またはSP6)が、反応混合物に直接添加されてもよい。別の方法として、mRNAは、RNA依存性RNAポリメラーゼであるQBレプリカ―ぜの鋳型にメッセージを挿入することによって継続的に増幅されてもよい。一部の実施形態では、複数のクローニング領域の一端にポリA配列を含有するベクターをIVTT反応の鋳型として使用する。例えば、このようなベクターは、複数のクローニング領域の反対側末端にSP6、T7、またはT3 RNAポリメラーゼプロモーターを含有してもよく、その結果、ベクターへのクローニングは、5’末端および3’末端におけるポリA配列のRNAポリメラーゼプロモーターに隣接する遺伝子を産生する。mRNAが鋳型として利用される実施形態では、精製されたmRNAは、反応混合物に添加される前に化学修飾によって安定化され得る。
連結されたIVTT反応において、リボヌクレオチド三リン酸(ATP、GTP、CTP、UTP)およびアミノ酸は、所望のバイオポリマーを合成するために使用されるモノマー単位としてシステムで必要とされる。本明細書の一部の実施形態では、システムは、従来のエネルギー再生システムを伴う同等のシステムに対して、一つ以上のNTPのレベルが低減されて作動する。これらの実施形態では、開示されたシステムは、システムの作動に対する費用を有利に減少させる。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、2〜10mM、例えば4〜8mM、または5〜7mMのATPの最終ATP濃度で作動する。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、0.8〜2.5mM、例えば1〜2mMまたは1.4〜1.8mMのGTPの最終GTP濃度で作動する。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、0.4〜2.4mM、例えば0.5〜2mMまたは0.6〜1.0mMのCTPの最終CTP濃度で作動する。また、ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、0.4〜2.4mM、例えば0.5〜2mMまたは0.6〜1.0mMのUTPの最終UTP濃度で作動する。例えば、システムは、6mMまたは約6mMのATP、1.6mMまたは約1.6mMのGTP、0.8mMまたは約0.8mMのCTP、および0.8mMまたは約0.8mMのUTPの最終NTP濃度で作動し得る。特定の例において、合成反応は、約150mMのATP、約40mMのGTP、約20mMのCTP、および約20mMのUTPを含有する低濃度NTP混合物で補充され、NTPの最終濃度を提供するのに十分な量でミックスがシステムに追加される。アミノ酸はまた、例えば、最終濃度20〜500pMの最終濃度まで加えられ得る。放射性標識アミノ酸(例えば、35Sメチオニンおよび3Hロイシンを連結反応で使用し、その後、対応するアミノ酸をアミノ酸混合物から外してもよい。
塩の濃度は、本明細書の実施形態によるシステムで制御される。例えば、システムは、例えば、限定されないが、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、および(例えば、酢酸または硫酸の)マンガンなどの他の生物学的に関連する塩などの一つ以上の塩を加えられてもよい。こうした塩のうちの一つ以上は、カウンター陰イオンとしてアミノ酸を有してもよい。合成反応の機能に関してイオン種の間に相互依存性がある。反応媒体内の特定のイオンの濃度を変化させたとき、それに応じて別のイオンの濃度が変化し得る。例えば、追加された塩の濃度は、ヌクレオチドなどの他の成分の変化にしたがって同時に制御され得る。さらに、連続流反応器内の成分の濃度レベルは、経時的に変化し得る。
マグネシウムは、リボソームの組み立てを強化し、組み立てられたリボソームの安定性を強化するため、タンパク質の翻訳に重要である。マグネシウムはまた、ポリメラーゼ結合の促進において役割を果たすようである。本明細書の実施形態では、細胞溶解物のマグネシウム濃度は、追加的なマグネシウム化合物によって調節され得る。一部の実施形態では、さらなるマグネシウム化合物は塩であり、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルタミン酸マグネシウムである。転写および翻訳を連結するために、十分な量のマグネシウム塩を溶解物に添加して、最終マグネシウム濃度を、RNAがDNAから転写され、かつRNAがタンパク質に翻訳されるレベルまで上昇させてもよい。一部の例では、最終的なマグネシウム濃度は1〜20mMに調整され得る。例えば、最終マグネシウム濃度は、使用される溶解物に応じて、5〜15mM、7〜13mM、2.5mM〜5.5mM、2.5mM〜3.5mM、2.6mM〜3.0mM、3.0mM〜5.25mM、または4.0mM〜4.75mMであり得る。
一般的に、望ましいレベルのバイオポリマー合成を達成するために、カリウムもシステムに加えられる。カリウム(例えば、酢酸カリウムおよびグルタミン酸カリウム)は、一般的に5〜250mM(例えば、5〜100mM、5〜75mM、5〜50mM、および5〜30)の濃度で存在する。特定の例では、カリウム濃度は10〜20mMであってもよく、さらに具体的には約20mMであってもよい。マグネシウムの場合と同様に、内因性の細胞溶解物成分の存在により、最終的なカリウム濃度はわずかに変化し得る。
合成反応の効率または安定性を改善するために必要に応じて、追加的な成分も特定の実施形態ではシステムに追加されてもよい。絶対的に必要ではないが、連結された転写および翻訳反応への一つの一般的な追加は、例えば、鎖伸長の効率を刺激するのに十分な量のポリアミンである。ポリアミンは、最適なマグネシウムレベルにも影響を与え、翻訳反応のための効果的なマグネシウム濃度を少し低下させることが知られている。したがって、ポリアミンは、一部のレベルでマグネシウムを置換することができ、特定の例では連結された転写および翻訳のための最適なマグネシウムレベルの低下を許容し得る。
上述のシステムは、一つ以上のバイオポリマーのインビトロ合成方法において使用されてもよい。インビトロ合成とは、生物学的抽出物および/または定義された試薬を含む反応混合物中の生物学的マクロ分子の無細胞合成を指す。本明細書のシステムを使用して、これらの構成が当技術分野で公知であるように、バッチ、連続フロー、および半連続フロー構成で無細胞合成反応を実施し得る。一部の実施形態では、バッチ培養細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、再現性のある均質な細胞材料の供給を確実にするために、細胞を攪拌タンク発酵槽内で連続的に生育させることができる。
植物材料
タバコ細胞(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2、BY−2)を26℃の暗所で20〜25%の充填細胞容量を維持しながら5L発酵槽(Type 100e、Applicon(商標)Biotechnology、AC Schiedam、オランダ)または振盪フラスコ中で培養した。3%(w/v)のスクロース、1mg/Lのチアミン−HCl、0.2mg/Lの2,4ジクロロフェノキシ酢酸、100mg/Lのミオイノシトール、250mg/Lのオルトリン酸二水素カリウム、およびPluronic(登録商標)L−61消泡剤(BASF(商標)、Mount Olive、NJ、USA)を添加したMurashige−Skoog液体培地(MurashigeおよびSkoog基底塩混合物)を使用した。
20〜25%の一定の充填細胞体積での発酵の指数増殖期の間に、BY−2細胞を採取した。プロトプラストを調製するために、発酵培地中で直接的に3%(v/v)のRohament(登録商標)CLおよび0.2%(v/v)のRohapect(登録商標)UF(ペクチナーゼおよびアラバナーゼ)(AB Enzyme(商標)、Darmstadt、Germany)で処理した。360mMのマンニトールを添加することにより容量オスモル濃度を調節した。
ベクターpIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP−Hisは、T7プロモーターおよび最初の6ヌクレオチドとしてGAAAGAを有するタバコモザイクウイルス5’オメガリーダー配列を含有するアニールしたオリゴヌクレオチドプライマー1(配列番号1)およびオリゴヌクレオチドプライマー2(配列番号2)をNspI部位およびNcoI部位を使用してpIVEX1.3_eYFP−His(Dr.Stefan Kubick(Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology IZI、Potsdam−Golm、ドイツ)の好意により提供された)に挿入することにより調製した。N末端ストレプトアビジンアフィニティタグを含有するベクターpIVEX_GAAAGA_Omega_Strep−eYFPについて、オリゴヌクレオチドプライマー3(配列番号3)およびオリゴヌクレオチドプライマー4(配列番号4)と共に鋳型としてpIX3.0_Strep−eYFP(Dr.Stefan Kubickの好意により提供された)を使用するPCRによりStrep−eYFP配列を増幅した。PCR産物をPciIおよびAcc65Iで消化し、pIVEX_GAAAGA_Omega_eYFP−HisのNcoI部位およびAcc65I部位に挿入した。
連結された転写翻訳反応を、25℃および700rpmで40〜52時間、サーモミキサー(Ditabis(商標)、Pforheim、ドイツによるHLC)中で50μLのアリコートにおいて実施した。クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼとの反応液は、40%(v/v)のタバコBY−2細胞溶解物(BYL)、20mMのHEPES−KOH pH 7.8、10mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸カリウム、3mMのATP、1.2mMのGTP、1.2mMのCTP、1.2mMのUTP、100μg/mLのクロラムフェニコール、50ng/μLのT7 RNAポリメラーゼ、80ng/μlのプラスミド、30mMのクレアチンリン酸および100μg/mlのクレアチンキナーゼを含んだ。クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない反応液は、40%(v/v)のBYL、20mMのHEPES−KOH(pH 7.8)、9mMのグルタミン酸マグネシウム、20mMのグルタミン酸カリウム、4mMのATP、1.6mMのGTP、1.6mMのCTP、1.6mMのUTP、100μg/mLのクロラムフェニコール、30ng/μLのT7 RNAポメラ―ぜ、および40ng/μLのプラスミドを含んだ。
eYFPからの蛍光シグナルは、485/20nmの励起および528/20nmの吸収フィルターを用いて、Synergy(商標)HT Multi−Mode Microplate Reader(Biotek(商標)、Bad Friedrichshall、ドイツ)を使用して定量化した。eYFPの量は、DNA鋳型なしのBYL翻訳反応におけるeYFPの異なる濃度に基づいて標準曲線を生成することによって決定した。eYFP標準は、大腸菌に基づく社内でのインビトロ翻訳システム(Zawada(2012)Methods Mol.Biol.805:31−41)を使用して製造し、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。精製されたeYFPの濃度は、比色アッセイを使用して決定した。Bradford(1976)Anal.Biochem.72: 248−54.
標的タンパク質をアミノ酸選択的に蛍光標識するために、FluoroTect(商標)GreenLys in vitro Translation Labeling System(Promega(商標)、Mannheim、ドイツ)を製造業者の指示にしたがって使用した。本製品は、蛍光団BODIPY(登録商標)−FLで標識された修飾電荷リシンtRNAを含有する。このシステムを使用すると、蛍光標識されたリシン残基は、翻訳中に複数の部位において新生タンパク質に組み込まれる。
BYL中のミトコンドリアの存在は、親油性カチオン性プローブ5,6−ジクロロ−2−[3−(5,6−ジクロロ−1,3−ジエチル−1,3−ジヒドロ−2H−ベンズイミダゾール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1,3−ジエチル−ヨウ化物(JC−1、Thermo Scientific(商標)、Waltham、MA、USA)を使用して実証した。生細胞中では、JC−1は、脱分極したミトコンドリア膜電位で緑色蛍光モノマー(490nm励起/530nm放射)として存在する。正常および過分極のミトコンドリア膜電位では、JC−1はミトコンドリア内で濃縮され、J凝集体を形成し、これは放射を530nmから590nmにシフトさせる。細胞ミトコンドリアは、増加していく負のミトコンドリア膜電位と共にJ凝集体の増加的により高度になっていく赤色蛍光(590nm)を示す。Nuydens et al.(1999)J.Neurosci.Methods 92:153−9;Reers et al.(1995)Methods Enzymol.260:406−17;Salvioli et al.(1997)FEBS Lett.411:77−82.
無細胞タンパク質合成(50μL反応)を、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼのありおよびなしの両方で、BYL系への酸化的リン酸化の阻害剤の添加のありおよびなしで行った。阻害剤は以下を含有した:アジ化ナトリウム(0.05%、Bogucka & Wojtczak(1966)Biochim.Biophys.Acta 122:381−92)および2−テノイルトリフルオロアセトン(TTA、0.5mM);Tappel(1960)Biochem.Pharmacol.3:289−96)。アジ化ナトリウムを水中に溶解した。TTAをメタノールに溶解した。メタノールを用いて実施した陰性対照は、この溶媒がこの研究で使用される濃度でタンパク質合成に影響を与えなかったことを示した。
リン酸の放出を減少させるために、クレアチンリン酸(CP)およびクレアチンキナーゼ(CK)から成る人工再生システムは、無細胞BYLシステムで省略された。可変濃度の反応成分との反応は、CPおよびCKありおよびなし;HEPES−KOH、pH 7.8(0〜80mM)、グルタミン酸マグネシウム(1〜12mM)、グルタミン酸カリウム(0〜40mM)、プラスミド(10〜100ng/μL(4.5〜43nM))、NTP(すなわち、ATP/(GTP/CTP/UTP))(0.5/0.2〜4/1.6mM)、およびT7 RNAポリメラーゼ(20〜80ng/μL)、CP(0〜40mM)およびCKありおよびなしで、Design Of Experiment(DoE)ベースのアプローチ(Design Expert v8.0(State−Ease(商標)Inc.,MN,USA)における分別設計(fractional designs)および応答表面モデル)を利用して考案した。クロラムフェニコールの濃度は、CP/CKのシステムから採用した。これらの実験から、両方のシステム(CP/CKありおよびなし)に対して好ましい反応成分濃度が得られた。表2
BY−2溶解物調製のためのソルビトールの使用
BY−2溶解物の調製のために、プロトプラスト形成および脱液胞化の間に容量オスモル濃度を調整するために多量の浸透性物質が必要である。マンニトールはこの目的のために日常的に使用され、溶解物調製の合計コストの約10%を占める。浸透性物質としてソルビトール(約10倍安価)を試験した。プロトプラスト形成および脱液胞化のためにマンニトールまたはソルビトールを使用した並行実験では、ソルビトールが驚くべきことにマンニトールとは同等ではなく、eYFPの発現により決定される溶解物の収量および溶解物の品質の両方に関してより優れていることが明らかとなった(図5)。さらに、ソルビトールのより高い溶解性が、緩衝液の調製を促進することが判明した。しかしながら、脱液胞化したプロトプラストの最終洗浄のためにはマンニトールがソルビトールより優れていることも判明し、この工程でのソルビトールの利用はより低いeYFP収量およびより粘性の反応混合物につながった。
BY−2溶解物は、IVTT反応液がインキュベートされた時に微生物の増殖をサポートする能力があり、結果として反応基質の枯渇をもたらし、結果的に標的タンパク質の収量が低下する。したがって、いくつかの抗菌物質をIVTT反応システムで試験した。IVTTでのeYFP産生および微生物増殖に対する効果に関して、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、およびアジ化ナトリウムを調査した。
システム内のNTPの濃度をDoEベースのアプローチによって調整した。ATPおよびGTPは転写および翻訳の両方で使用される一方、CTPおよびUTPは転写でのみ使用されるため、CTPおよびUTPと比較して高濃度のATPおよびGTPは連結されたIVTTシステムに対して有益であると予測された。したがって、単一のNTPの濃度は、異なる量の固定NTPミックスを使用する代わりに、DoEベースの実験で変化させた。これらは、96回の実験での三次IV最適設計(cubic IV−optimal design)を使用して最適濃度についてスクリーニングされた。IVTT反応用のプラスミド鋳型は、pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep−eYFPであった。グルタミン酸マグネシウムの濃度は、NTPのマグネシウムへの結合によって調節した。表3は、スクリーンされた各因子の濃度範囲を示す。二次モデル(quadratic model)を実験データにフィッティングさせた。応答表面モデルを使用して、最も多くの生成eYFPタンパク質を生じる因子の値を予測した(Zhou et al.、2010)。すべての非有意項(ANOVAによりp>0.05)を無視し、モデルはANOVA表において有意であることが示された(表4)。
標的タンパク質発現に対するIVTT反応の溶解物部分の増加の効果を調査するために、マンニトールを用いて調製したBYLの他に、プロトプラスト形成および脱液胞化中にソルビトールを用いて調製したいくつかのBY−2溶解物を使用して、40%(20μl)または60%(30μl)の溶解物を用いる50μlの反応を行った。プラスミドpIVEX_GAAAGA_Omega_Strep−eYFPを鋳型として使用して、25℃および700rpmで48時間にわたって反応を実施した。ソルビトールで調製した60%(v/v)の溶解物を用いる反応は約1mg/mLのeYFPを達成し、これは標準反応混合物と比較して80%高い収量に対応する(図5)。リボソーム、翻訳因子、シャペロン、およびミトコンドリアの増加した量がエネルギー生成を増加または長期化させ、それによってより高い収量が得られたと推定される。この結果は、そのような大量においてより大きな阻害を生成する有害因子を溶解物が含まないことを示す。
人工エネルギー再生を伴わない無細胞発現システムが、基質全体にわたり一般的に効果的であることを確認するために、該システムを使用して、eYFP以外の10個の追加的な標的遺伝子産物を発現させた。Strepタグ化eYFPおよび他の10個の標的タンパク質を、ソルビトールを用いて調製した60%のBY−2細胞溶解物中、マンニトールを用いて調製した40%のBY−2細胞溶解物中、およびCellFree(商標)SciencesのWGEシステムで発現させた。連結された転写翻訳反応を、50μLの容量で25℃および700rpmで40時間にわたって実施した。WGEシステムを使用した連結された転写および翻訳反応は、製造業者の指示にしたがって行った。それぞれの場合に、1μLの反応混合物および混合された二層反応液をそれぞれ4〜12%(w/v)の勾配のSDS PAGEゲルにロードし、標的タンパク質をクマシー染色により視覚化した。BYLシステムは、試験した異なる遺伝子のうちの一つごとに成功裏に転写し、また転写後に翻訳を行ってあらゆる場合にタンパク質を産生した。実際、BYLシステムは、WGEシステムを使用して製造されたものと比較して、一貫してより強いバンドを生じさせた。Strep−eYFPについて、三つのシステムで産生されたタンパク質を蛍光リーダーを使用して定量し、eYFP標準曲線と比較したところ、1115μg/mLおよび441μg/mLがBYLシステムの2セットの条件下で産生され、WGEシステムでは105μg/mLのみが産生されたことが明らかになった。
人工的なエネルギー再生を伴わない無細胞溶解物の安定性を増加させるために、細胞および/またはタンパク質の凍結保護剤として記述された小分子が溶解物の翻訳活性を維持させることができるという仮説を立てた。こうした分子は極限環境微生物中に天然に存在し、浸透圧ストレス、熱、乾燥、およびUV光から極限環境微生物を保護し、表面での水密度の増加を引き起こしてタンパク質の天然コンホメーションを促進することにより膜およびタンパク質を安定化させる。しかしながら、凍結保護剤はIVTTシステムに強い阻害効果を呈することが予想された。
グルコシルグリセロールの正の影響は、0.5%(v/v)のグルコシルグリセロールなしおよびありでのIVTT反応において五つの異なる溶解物バッチ(BYL 08.01.2016、BYL 21.01.2016、BYL 11.03.2016、BYL 01.04.2016、BYL 05.04.2016)にわたって一貫していた。50μLのIVTT反応を、96ウェルプレート中25℃および500rpmで48時間、制御湿度(70%)下で、鋳型としてプラスミドpIVEX_GAAAGA_Omega_Strep−eYFPを使用して60%および80%(v/v)の溶解物部分を用いて三連で実施した。60%(v/v)の溶解物および0.5%(v/v)のグルコシルグリセロールを使用する反応では、グルコシルグリセロールなしの反応と比較して、約80%多くのeYFPが産生された。図7 80%(v/v)の溶解物および0.5%(v/v)のグルコシルグリセロールを使用すると、eYFPの収量は、グルコシルグリセリドなしの80%(v/v)溶解物を使用する反応と比較して約110%(ほぼ2mg/mLのeYFP)増加した。図7
人工エネルギー再生を伴わない無細胞システムにおけるIVTT反応の時間経過を、64時間までの異なる時点で産生されたタンパク質の量を測定することによって決定した。図8 16時間後、0.5%グルコシルグリセロールありまたはなしでの60%または80%の溶解物を使用した反応は、ほぼ同量のタンパク質を産生した。図8 グルコシルグリセロールなしで、60%および80%(v/v)の両方の溶解物における翻訳活性は、24時間後にさらに増加しなかった。図8 しかしながら、グルコシルグリセロールを用いたeYFP産生は、60%および80%(v/v)の両方の溶解物で、少なくとも64時間まで生産性のほぼ直線的な増加を示した。図8 この結果は、グルコシルグリセロールが、翻訳活性を64時間を超えて延長するシステムに対する安定化効果を有することを裏付ける。平均して、80%(v/v)の溶解物および0.5%(v/v)グルコシルグリセロールを用いる反応は、ほぼ2.5mg/mLのeYFPをもたらした。
無細胞発現系におけるタンパク質合成を促進する分岐鎖アミノ酸(BCAA)の能力も試験し、BCAAの添加が標的タンパク質の収量を増加および安定化させることが観察された。システムに対するBCAAの正の効果を検証するために、振盪フラスコ(SF)または連続発酵(CF)から調製した四つの溶解物を使用する連結されたIVTT反応に異なる濃度のBCAAを加えた。Kuhner(商標)シェーカー中の制御された湿度においてプラスミド鋳型pIVEX_GAAAGA_Omega_Strep−eYFPを使用する25℃および500rpmでの66時間の96ウェルプレート中での80%(v/v)溶解物を用いる50μLのIVTT反応において、溶解物が振盪フラスコから調製されたのか、それとも連続発酵から調製されたのかに関わらず、BCAAは試験した全濃度においてeYFPの収量に正の影響を有した。図9 1mMのBCAAを含む反応により、BCAAなしの反応と比較して、約70%多くのeYFP(1mL当たり2.5mgのeYFPの平均収量)が得られた。
Claims (10)
- バイオポリマーの合成のためのシステムであって、前記システムが、
色素体、葉緑体、ミトコンドリア、または葉緑体およびミトコンドリアを含む水性細胞溶解物、
ポリマー鋳型、および
前記ポリマーのモノマー単位、を含み、前記システムが、前記細胞溶解物、色素体、葉緑体、ミトコンドリア、または葉緑体およびミトコンドリアに対して外因性である加えられたクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない、システム。 - pH緩衝剤、
マグネシウム、好ましくはMg(C5H8NO4)2、
カリウム、好ましくはKC5H8NO4、
ヌクレオシド三リン酸、
酵素、好ましくはRNAポリメラーゼ、および
クロラムフェニコール、のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項1に記載のシステム。 - ミトコンドリアを含む植物細胞由来の水性細胞溶解物、DNA鋳型、HEPES−KOH pH7.8、Mg(C5H8NO4)2、KC5H8NO4、ヌクレオシド三リン酸、RNAポリメラーゼ、およびクロラムフェニコールから本質的になる、請求項1に記載のシステム。
- 少なくとも一つのバイオポリマーの合成方法であって、前記方法が、反応体積中で反応成分を合わせることを含み、前記反応成分が、
色素体、葉緑体および/またはミトコンドリアを含む細胞溶解物、
ポリマー鋳型、および
前記ポリマーのモノマー単位、を含み、
前記反応成分がクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない、方法。 - 以下の条件:
前記方法によって製造されるバイオポリマーがポリペプチドである、
前記方法が、RNAおよび前記RNAから翻訳されたポリペプチドの連結された合成のためのものである、
前記細胞溶解物が真核細胞溶解物である、
前記細胞溶解物がミトコンドリアを含む、
前記色素体、葉緑体、および/またはミトコンドリアが、前記細胞溶解物に対して外因性である、
前記反応成分がクレアチンキナーゼを含まない、
前記ポリマー鋳型がRNA分子である、
前記ポリマー鋳型がDNA分子である、
前記ポリマーの前記モノマー単位がヌクレオチドである、
前記ポリマーの前記モノマー単位が、前記細胞溶解物中に含まれるアミノ酸である、および
前記反応が、電子伝達系を阻害することまたは前記反応から酸素を除去することによって停止させられる、のいずれかの組み合わせが満足される、請求項4に記載の方法。 - バイオポリマーの合成が20時間を超えて、好ましくは約40時間にわたり起こる、請求項4に記載の方法。
- キットであって、
一つ以上の別個の体積に配置された、水性細胞溶解物、色素体、ミトコンドリアおよび/または葉緑体、およびポリマーのモノマー単位、ならびに
キットの成分およびクレアチンリン酸を含まない任意の追加の成分の混合を指定する説明書 を含む、キット。 - 前記色素体、ミトコンドリアおよび/または葉緑体を含む前記細胞溶解物が一つの体積中に配置されており、かつ、前記ポリマーの前記モノマー単位が別個の体積中に配置されている、請求項7に記載のキット。
- 前記説明書が、前記細胞溶解物、色素体、ミトコンドリアおよび/または葉緑体、ならびに前記ポリマーのモノマー単位を、クレアチンリン酸を含まない反応体積中でポリマー鋳型と合わせるようにユーザーに指示する、請求項7に記載のキット。
- ポリマー鋳型をさらに含む、請求項7に記載のキット。
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