CN106459901A - 发酵体系 - Google Patents

发酵体系 Download PDF

Info

Publication number
CN106459901A
CN106459901A CN201580023518.XA CN201580023518A CN106459901A CN 106459901 A CN106459901 A CN 106459901A CN 201580023518 A CN201580023518 A CN 201580023518A CN 106459901 A CN106459901 A CN 106459901A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
volume
density
results
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580023518.XA
Other languages
English (en)
Inventor
丹尼尔·布莱辛
塔尼亚·霍兰德
马库斯·萨克
马蒂亚斯·邦特鲁
西蒙·沃格尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of CN106459901A publication Critical patent/CN106459901A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Abstract

本公开涉及优于现有的发酵策略的新的细胞培养和细胞和/或细胞来源产物的生产方法。根据本公开的工艺和方法可用于有效提供高存活力且代谢活跃的真核细胞用于瞬时生产平台，这是由于该替代生产方法优于现有应用方法(分批式、补料分批式或灌注式策略)且用于生产代谢高度活跃的生物质用于随后的通过病毒或假病毒或者在无细胞体系中的瞬时表达系统或感染的用途。

Description

发酵体系
技术领域
本公开涉及优于现有的发酵策略的新的细胞培养和细胞和/或细胞来源产物的生产方法。根据本公开的工艺和方法可用于有效提供高存活力且代谢活跃的真核细胞用于瞬时生产平台，这是由于该替代的生产方法优于现有应用方法(分批式、补料分批(fed-batch)式或灌注式策略)且用于生产代谢高度活跃的生物质用于随后的通过病毒或假病毒或者在无细胞体系中的瞬时表达系统或感染的用途。
背景技术
生物制药的制造受到诸如上升的体积需求和更严格的安全要求等多种变化的制约。另外，产物质量、产物产率、生产成本和设备利用率是生物制药产业的重要方面。因此，一直都在寻求进一步优化和改进常规制造平台并开发新的能够解决现有瓶颈以及使得新型且创新的生产方法成为可能的制造平台。
一般来说，生物技术产业中发酵罐的使用目前涉及分批式、补料分批式或连续生物反应器式方法用于发酵液制备、生物质生产和发酵产物的制造。生物反应器的加料模式决定了是否将生物反应器或发酵罐分成分批式、补料分批式还是连续生物反应器式。
如果生物反应器仅填充一次而不另外补料(即，添加含营养素的培养基)，则生物反应器以分批方式操作。将允许生物反应器运行到完成。在运行结束时，在再次起始新的发酵之前终止发酵并收获产物。
这些分批式步骤通常包括用目标培养物接种营养培养基、在精确限定的条件下培养特定的时间、并收获微生物和/或回收目标代谢产物。
分批式发酵详情：
分批式发酵为一次填充培养基并接种。接种后，除了如氧和调节pH的碱/酸等少量添加剂以外，反应器为封闭系统。这意味着一旦发酵开始，将不会向反应器供给额外的培养基或营养素。所以，反应器培养物体积(culture volume)在整个过程中是恒定的(除了由于蒸发造成的体积损失以外)。几个重要的细胞培养参数在该方法中变化，例如细胞密度、存活力、溶解氧、营养素和产物浓度。细胞培养物经历滞后、指数和稳定生长期。当达到收获条件时该过程结束并将收获总发酵液。为了产生更多的产物，重复该过程或按比例放大到更大的容器。
重复分批式发酵详情：
重复分批式发酵在接种后以常规分批方式操作。培养参数如细胞密度、溶解氧、营养素和产物浓度在整个过程中变化。将允许生物反应器运行到完成。在运行结束时，在灭菌条件下收获发酵液但在生物反应器中保留固定体积的发酵液并将其用作新的接种物。反应器再次填充新的培养基并开始新一批的发酵周期。在该操作方式下的细胞经历各周期中的新的适应、指数和稳定生长期。重复分批式发酵通过节约准备发酵罐和接种物的时间来增加分批式和补料分批式方法的整个过程的效力。虽然在理想情况下重复分批式基本上与分批式培养相同，但特别是对于药物蛋白的生产，涉及来自前一次培养的记忆效应和遗留。
然而，这几种分批式方法涉及多种缺点。在分批式发酵中，微生物和活细胞的生长通常在变化的、有时是不利的条件下发生。在发酵开始时，细胞需要时间(滞后期)适应培养基。活细胞密度(接种活细胞计数)在最高底物浓度的存在下处于最低水平，这甚至可由于培养基的高摩尔渗透压浓度而导致底物抑制或生长抑制。
在连续式发酵中，灭菌的营养液以特定的速率持续供给至生物反应器，同时从生物反应器中除去当量体积的发酵液以保持生物反应器中的培养物体积在整个过程中基本恒定。
有机体的生长速率将通过取决于培养物的最大生长速率的培养基泵入速率而得以调节。新鲜培养基的速率(所谓的稀释速率)需要低于有机体的最大比生长速率的90％。哺乳动物和植物细胞相对低的倍增次数(大约每天1次)导致低稀释率，因而不得不经过较长的时期来收集洗去的发酵液。这种所谓的收获保持步骤还有一些缺陷。首先，收获的细胞保持在不利条件下，因为收获容器并不包括与发酵罐相同水平的复杂度。典型地，多种参数不再受控。条件的变化导致较低的细胞存活力，细胞破碎引起释放细胞内的污染物如宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA。产物质量可受到包括蛋白降解或改变的翻译后修饰等多种机制的损害。对批次在调控方面的限定也更加困难。批次之间的一致性至关重要，这是因为生长速率的微小变化(例如，可由培养基批次间的细微差异引起)可引起方法中的大幅变化。对于生物药物而言这样的方法必须终止，且产物必然不合格。
连续发酵(恒化器/恒浊器)详情
两种操作方式都是以恒定细胞密度为目标而具有固定反应器体积的连续过程。两种方法中，将新鲜培养基连续供给至反应器同时收获相同体积的发酵液。培养物体积在整个过程中保持恒定，因而新鲜培养基的添加量必须等于培养液的去除量。因而，新鲜培养基输入和发酵液输出相互依赖。
在恒化法中，使用固定的添加新鲜培养基的流速(＝加料速率)和除去培养液的流速(＝收获速率)。流速相同并称为稀释速率，即，发酵罐中的培养物体积保持恒定。一旦细胞培养物已经适应了外部条件，该过程处于稳定的稳态且生长速率与加料速率相匹配。如果体系被干扰如生长速率受到影响，例如可以出现如下情况：当使用新批次的培养基时，或当代谢产物经时累积时，体系会变得不稳定。特别地，如果生长速率降低，细胞被洗出并使细胞密度稳步下降。培养物中细胞数的增加还取决于体积。结果，发酵液不能在不干扰该过程下随意收获。此外，稳定恒化法的细胞密度为外部条件(营养素、温度、通气……)的结果且不能由操作者以别的方式确定。在恒浊法中，稀释速率受浊度调节，以使发酵罐中的细胞密度和培养物体积保持经时恒定。将培养液从发酵罐连续除去并储存在收集容器中。在恒化器/恒浊器的模式下操作的发酵通过连续收集容器中生长的培养物的小级分来提供培养液和包含于其中的产物。小级分必须收集并在非常长的时期内储存在容器中。尤其是对于生物药物，此类保持步骤是不期望的，这是因为其是变化的来源并可负面影响产物质量。例如，保持步骤期间可能发生细胞裂解，蛋白酶可能会降解产物，或者翻译后修饰可能受到影响，这再次增加变化并对产物质量产生影响。在细胞或源自这些细胞的组合物包括产物的情况中甚至更不期望保持步骤。保持步骤减少了细胞存活力、代谢活性和重复性。
连续发酵因其与分批式方法和补料分批式方法相比具有显著高的时空产率而是有利的。因此，它们需要用于实现期望生产能力的较低的设备尺寸，这也意味着构建生产设备的投资较低。
尽管有连续生物反应器的理想特性，但该方法本身敏感且受到如污染风险、细胞或生物质洗出、和生物反应器的生物相中的变化等各种因素的影响。
补料分批式是生物反应器操作的中间模式。在该方法中需要更适合的加料速率以及正确的组分构成。补料分批式提供优于分批式和连续式培养的多种优点。从其实施的概念来看，可容易地得出结论：在可控条件下并借助于发酵中涉及的所需微生物知识，生长用所需组分和/或产物生产用其它底物的加料可以从不耗尽且营养环境可以在发酵过程中维持几乎恒定或所需水平。通常与高浓度底物存在相关的副产物的产生也可通过将其量限制到仅生产生物化学品所需的量来避免。当高浓度底物存在时，细胞"超载"，也就是超过了细胞的氧化能力，且由于克勒勃屈利效应(Crabtree effect)，产生了除目标产物以外的产物，减少了碳通量的功效。此外，这些副产物证明甚至会"污染"目标产物，例如面包酵母生产中的乙醇生产，并且损害细胞生长，减少发酵时间及其相关生产力(Chmiel 2006)。
补料分批式发酵详情：
补料分批式发酵从经典的分批阶段开始。当达到特定条件时开始加料，即提供额外的营养素。在该操作模式中，反应器培养物体积在分批阶段恒定，在加料阶段体积增加。在该模式下，几种培养参数也改变并且细胞经历经典的生长期。与分批式发酵一样的，反应器总体积将在方法结束时获得。
在分批式和补料分批式发酵中，细胞存活力在后期下降，收获时间点必须仔细选择以确保高且一致的产物质量。细胞可经历由代谢负担造成的高应力。死亡和破碎的细胞将细胞内物质如宿主细胞蛋白和DNA以及产物相关的杂质释放到培养基中，这也可能成为问题。
然而，当前几乎所有治疗性抗体都使用补料分批式发酵策略或灌注式策略生产。如用于方法开发的分批限定和时间要求(技术运行、重复性)等某些法规要求和普遍的担忧(参见保持步骤、产物稳定性和质量)以及制药工业内对新式或不同技术典型的不情愿都促成补料分批法巨大的优势。也就是，即使还存在一些情况是有问题的，例如特别是对于N-糖基化是关键性质的抗体产物的产物质量和翻译后修饰。在许多情况下，补料分批培养物长时间温育以使产率最大化，但细胞存活力在培养即将结束之际显著降低，释放细胞内产物、宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA。其不利因素(down-side)是或者可能是较低的产物质量或较高的产物异质性(如糖型)，最终导致较高的失效率(不合规格批次)或较低的产物性质(即，临床效果)。
此外，分批式和补料分批式发酵的低运行-设定-时间比目前由人力和基础设施的投资得以补偿。转换成连续模式有时可以规避这个问题，但这并不总是可行的且不总是期望的。分批式/补料分批式/重复分批式发酵中在稳定期发生的与产物同质性相关的问题可以通过在到达稳定期之前收获/终止进程来解决或避免。然而，不得不接受明显低的产物产率。产物质量的差异经常引起分批排斥(batch rejection)，即，必须扔掉全部材料而无法回收投资成本。
近来，使用真核细胞中的瞬时基因表达的生产技术已赢得了相当大的关注(Derouazi,Girard等人，2004Biotechnol Bioeng；Geisse,Jordan等人，2005Methods MolBiol；Hacker,Derow等人，2005J Biotechnol)。这出于几个原因，包括与转基因体系(如转基因植物)相比较高的产率、短的生产周期(天vs.月或甚至年)、快速响应时间(特别是在紧急情况下)(大流行病、个体化医疗)和快速的产品和临床开发。瞬时生产体系需要大量野生型(即，非转化的)细胞用于转染/转化，这是因为细胞未经长期培养且细胞生长和细胞分化通常是低的或根本未发生。很显然，用作瞬时基因表达宿主的野生型细胞严重影响所得产物的产率和质量。此外，高重复性对于旨在用于临床试验的产品非常重要。
对于瞬时生产技术，可重复地生产高存活力细胞材料是最重要的瓶颈之一。
包括体外转录和体内翻译的无细胞体系也已获得巨大的兴趣，特别是针对高通量筛选和合成生物学用途。特别的优势是(除其它)无细胞体系可以不针对全部细胞的方式修改，核酸可直接添加而无需将其穿过细胞壁和细胞膜递送至细胞内的技术，实验可以标准化且有多重方式测量读数。无细胞体系特别适合微小化和自动化。至于瞬时表达系统，可重复的生产技术用于无细胞体系所需的高度活跃组分目前代表了明显的瓶颈。
因此，本公开的目的是克服现有发酵技术的劣势以提供改进的细胞生物质或细胞来源产物。
发明内容
一种新的细胞培养和细胞和/或细胞来源产物的生产方法提供优于现有发酵策略的多种优势。
新方法与连续恒化法/恒浊法的主要区别在于可变的培养物体积和独立的加料速率和收获速率。与恒化法/恒浊法相对，根据本公开的方法中培养物体积既不像分批式或恒化法/恒浊法在整个过程中恒定也不仅仅像补料分批法在整个过程中升高。可变的培养物体积和分开的加料速率和收获速率是该新方法的主要特征。不同的方法可通过比较培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率来区分(参见图9、10和11)。
本公开方法中的加料流受细胞密度的控制，因而由于细胞以其最大生长速率不断生长而事实上是连续的，但不像恒化器或补料分批式发酵中固定或预定(图11)。
与整个培养物在该方法结束时收获的分批式和补料分批式发酵、以及培养物的增量连续收获的恒化法/恒浊法相对，根据本发明的方法允许在工作范围内的任意时间点收获任意体积。工作范围由实际培养物体积减去保留的最小体积示出。
因此，本公开涉及优于现有的发酵策略的新的细胞培养和细胞和/或细胞来源产物的生产方法。根据本公开的工艺和方法可用于有效提供高存活力且代谢活跃的真核细胞用于瞬时生产平台，这是由于该替代生产方法优于现有应用方法(分批式、补料分批式或灌注式策略)且用于生产代谢高度活跃的生物质用于随后的通过病毒或假病毒或者在无细胞体系中的瞬时表达系统或感染的用途。本公开涉及允许在可变时间点以可变体积收获可重复的发酵液的连续/半连续细胞培养策略，这例如提供用于连续下游加工策略的特别的优势。
本公开还可用于增加来源于稳定的转基因细胞系的生物药物生产的时空产率。此外，根据本公开的工艺和方法可用于实施更有效的上下游方法来提高生产设备利用率。
此外，根据本公开的细胞培养方法能够在任意时间点任意重复收获任意体积而不干扰细胞生长，其中0<收获体积<(实际体积-最小体积)。根据本公开的优势之一在于连续细胞培养方法不需要在非常长的时期内用于收集发酵液的容器和/或调节加料，且收获可任意施行，从而维持细胞生长但不受到收获步骤的明显干扰。
在第一方面，本公开涉及用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在具有可变的细胞培养物体积的细胞培养物中生长，其中所述培养物体积在整个细胞培养过程中不被调节为恒定的，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中所述容器中的细胞培养物体积不通过在收获所述级分之后向所述容器中添加营养培养基来保持连续恒定、和/或其中收获的级分的体积不通过将营养培养基加入到所述容器中来立即补充；
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物。
在一个方面，本公开涉及用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在具有可变的细胞培养物体积的细胞培养物中生长，其中所述培养物体积在整个细胞培养过程中不被调节为恒定的，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中收获的级分的体积不通过将营养培养基加入到所述容器中来立即补充；
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物。
另一方面，本公开涉及用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在具有可变的细胞培养物体积的细胞培养物中生长，其中所述培养物体积在整个细胞培养过程中不被调节为恒定的，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中所述容器中的细胞培养物体积不通过在收获所述级分之后向所述容器中添加营养培养基来保持连续恒定；
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物。
本公开的另一方面涉及用于制备体外翻译用无细胞提取物的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据本公开所述的方法培养和收获细胞，
ii)通过使收获的细胞进行提取处理得到所培养的细胞的无细胞提取物。
另一方面，该公开的实施方案涉及用于生成稳定细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据本公开所述的方法培养和收获细胞，
ii)用核酸转化收获的细胞以获得稳定细胞系。
还在另一方面，该公开的实施方案提供用于以培养基除去的、多孔结构化的且非组织的多层细胞压积体(cell pack)形式的植物细胞材料的生成和用于所述细胞压积体的后续维持的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)通过将细胞从植物细胞悬浮培养物中分离来提供具有多孔结构的细胞压积体，其中所述细胞通过根据本公开所述的方法培养，和其中所述细胞压积体包含的液体的含量减少并调整至相应于0.1和0.9g细胞湿重/cm3之间的细胞压积体密度，从而确立所述细胞压积体的培养基除去和多孔结构化性质，和
(ii)在相对湿度50-100％下的非液体环境中温育所述培养基除去且多孔结构化的细胞压积体。
在详细描述本公开之前，要理解的是本文所用术语仅出于记述特定实施方案的目的，而不意欲受其限制。必须注意的是，如说明书和所附权利要求中使用的，除非语境明确规定，否则单数形式的“一种”、“一个”和“所述”包括单数和/或复数参考。此外，要理解的是，如果给出由数值划定的参数范围，则该范围视为包括这些界限值。
附图说明
图1为根据本公开的培养体系的示意图。
图2为示出烟草BY-2细胞的半连续培养的在线数据的图。
图3为示出烟草BY-2细胞的半连续培养的离线参数的图。
图4为示出不同的全植物表达体系[本氏烟草(N.benthamiana)、普通烟草(N.tabacum)K326和普通烟草SR-1)与烟草BY-2PCPs的比较图，用于筛选农杆菌介导的基因转移后5天的瞬时基因表达(呈抗体累积)。
图5为示出分别由分批培养的细胞和连续培养的细胞制备的无细胞烟草BY-2的转录/翻译偶联(coupled transcription/translation)体系中产生的提高的黄色荧光蛋白(eYFP)的产率的比较图。
图6为示出驱疝花楸(Sorbus torminalis)细胞的半连续培养的在线数据的图。
图7为示出西洋梨(Pyrus communis)细胞的半连续培养的在线数据的图。
图8为示出根据介电常数(permittivity)设定值使用根据本公开的方法与标准普通烟草BY-2分批式发酵相比的改进的图。
图9示出两幅图，A)分批式发酵方法中培养时间内的培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率，B)补料分批式发酵方法中培养时间内的培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率。
图10示出两幅图，A)重复分批式发酵方法中培养时间内的培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率，B)连续恒化/恒浊发酵方法中培养时间内的培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率。
图11为示出考虑培养时间内的培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率的根据本公开发酵方法的特征的图。
图12为示出在分批式发酵方法中转基因普通烟草(Nicotiana tabacum)BY-2细胞系的介电常数以及细胞和培养上清液中2G12抗体浓度的图。
图13为示出在根据本发明的发酵方法中转基因普通烟草BY-2细胞系的介电常数以及细胞和培养上清液中2G12抗体浓度的图。
图14为示出在根据本发明的整个过程中转基因CHO DG44细胞培养物的介电常数、培养基加料体积和累积的收获体积的图。
具体实施方式
本公开涉及以高度一致且可重复的方式生产真核细胞(生物质)和/或真核细胞来源产物如蛋白质的新工艺和方法。本公开的方法为调节细胞密度的细胞培养方法，其中调整培养容器中细胞培养物的体积来调节细胞培养物中的细胞密度。该工艺和方法以高度一致且可重复的方式适用于动植物系体系，其中该方法是稳定可靠的且可重复的生产更好地满足调节需要。本公开的方法的一个优点在于，由于更好的相容性、批次间的一致性和较低的变化而产生用于筛选和产品开发的改进细胞的能力。此外，利用所公开的方法提供高度活跃的(以指数生长的)细胞，给出了(i)高转化效率、(ii)生产力(产物产率、酶活性)和(iii)高代谢活性(应用于无细胞体系)等优势。本公开的工艺和方法由于增加的运行-设定-时间比、要求更少的人力和增加的时空产率而更加经济。特别地，利用所公开的方法，收获时间和收获体积更加灵活，允许应对当运行一些小型生产活动(个体化医疗或产品开发)时难以预测的要求。该方法提供连续发酵策略(恒化器、灌注)的多种优势，但避免/解决与保持步骤期间的细胞存活力、产物稳定性和质量相关的问题。
根据本公开的工艺和方法由新的调节发酵过程中的细胞密度(或者与细胞密度、生物质密度、细胞浓度或单位体积的细胞数相关的任何其它性质)的方式组成。这通过改变发酵液(即，细胞培养物)的体积来调整生物质而得以实现。可以使用控制环路，其中传感器连续测量生物质(输入信号)，控制器生成例如触发泵的输出信号，以从培养基储蓄池向培养容器添加适当体积，从而改变细胞培养物体积。通过添加适当体积，细胞密度保持经时恒定(可选地，可确定细胞密度特定的时间相关函数并相应控制)。如此，细胞不断保持在生长期。在最小和最大填充水平之间操作发酵罐。取出的体积可在该最小和最大范围内变化。最小和最大体积由容器几何结构提供。最小体积为必需保留在发酵罐中以确保所有装置如探针/传感器或搅拌器与发酵液充分接触来提供适合的测量、混合和过程控制的体积。最大填充水平由如下体积限定，在该体积下确保不会发生容器被发酵液的浸没或发泡。如果达到最大填充水平，发酵液必须取出。可选地，可以改变控制环路，即获得更高的细胞密度。可在不同时间收获的发酵液和可变的体积高度一致且可重复。本领域技术人员还将理解，可实施自动收获功能以例如防止实际的细胞培养物体积增加到超过最大体积，或者能够远程收获。自动收获功能可以例如通过使用水平传感器与外部控制泵组合借助例如模拟或数字输出信号来实现。
一个目的是提供新的且有效的真核细胞生产技术，即，在瞬时生产技术中使用所产生的细胞。近来，使用真核细胞的瞬时生产技术已赢得了相当大的关注。这出于几个原因，包括(i)与转基因体系(如转基因植物)相比较高的产率、(ii)短的生产周期(天vs.月或甚至年)、快速响应时间(特别是在紧急情况下(大流行病、个体化医疗))和快速的产品和临床开发。
因此，在有利的实施方案中，根据本公开的工艺和方法用于提供随后用作瞬时生产用宿主细胞的细胞(生物质)。这意味着这些细胞随后将通过适当的手段转染/转化并温育产生目标分子(产物)。细胞存活力对于利用细胞悬浮液(动物和植物细胞)的瞬时生产平台至关重要。对于瞬时生产，还需要大量同源且可重复的起始材料(细胞)。
使用根据本公开的方法的一个优势在于，在某些实施方案中，不发生稳定期并在整个生产过程中保持细胞存活力，因而该过程与分批法、补料分批法和灌注法相比具有优势。
另一优势在于，本公开的工艺和方法可通过使用下述步骤用于运行"发酵级联(fermentation cascade)"：使用根据所公开的细胞生物质的生产方法的第一培养步骤(在抑制重组基因表达的条件下)，接着将这些细胞转入另一发酵罐，然后运行第二阶段，其中诱导基因表达或用病毒感染细胞或在不同于第一培养步骤的条件下温育细胞。这特别有利于其中第二阶段短于细胞生产阶段(更好的时空产率)或者其中在细胞被病毒或假病毒感染时需要物理分选的发酵级联。
对于体外翻译用无细胞提取物(溶胞产物)的生产，需要大量同源起始材料。为了确保所得溶胞产物最佳的生产性，细胞必须处在以高代谢活性和高存活力为特征的指数生长期。另外，接近收获时的细胞密度起到至关重要的作用。
通常，细胞培养物以分批方式生长到期望的细胞密度，收获并立即处理。这需要时间上的高度灵活性，这是因为生长速率在大型发酵过程中变化，使得无法精确预测具体的收获点。此外，在分批方式中不能保证细胞对培养过程的最佳适应。将细胞材料处理成高活性溶胞产物是另一重要因素。已制定的植物系无细胞溶胞产物生产用方案通常耗时且成本高。
因此，本公开的工艺和方法非常适合生产随后用于制备这种基因表达和/或蛋白质生产用“无细胞体系”的真核细胞。这仅仅是因为这些体系的确还需要一致的、可重复的和高存活力的细胞作为起始材料。由于细胞培养物在指数生长期并以恒定的细胞密度连续控制发酵的可能性，所以细胞材料(其导致溶胞产物具备最佳生产性)可在任意时间并以所需的容器最小/最大范围内的体积进行收获。几个月的连续发酵还确保细胞对发酵条件的最佳适应。所得一致的细胞起始材料大大影响了所处理的终产物的质量。在将细胞材料处理成溶胞产物期间，通过将常规的酶替换成原本设计用于食品工业的液体纤维素酶和果胶酶能够使原生质体无性系繁殖(protoplastation)的成本减少超过百倍。同时已观察到改进的每时间单位的原生质体无性系繁殖。这些酶制剂的使用允许植物系溶胞产物以正常的市场价格工业生产。对Komoda等人(2004)所记述的方案的进一步改进，诸如改变的缓冲液、洗涤和离心步骤、以及使用不连续的Percoll密度梯度离心法(discontinuous Percollgradient)代替连续的，导致更快的生产以及更容易的扩展性。
还可由本公开的工艺和方法提供几个更多的优势，诸如提供高度一致且可重复的细胞生物质用于随后的转染/转化以通过瞬时表达生产目标分子，提供允许在可变时间点和以可变体积收获可重复的发酵液的连续细胞培养策略。另外，本公开的工艺和方法不断提供高存活力指数生长的细胞。
此外，本公开的工艺和方法解决了下列问题。在现有技术的连续发酵中，细胞来源产物和/或含有细胞的细胞培养物必须在很长一段时间内收获，收获的材料因而进一步被温育(所谓的保持步骤)。该保持步骤是有问题的，因为(i)细胞存活力将降低和/或(ii)产物质量可受连累。结果，批次的限定更加困难。此外，植物悬浮细胞的连续发酵技术上具有挑战性，这是因为以低流速连续除去上清液导致收获管道堵塞，基本上终止发酵过程。另外，分批式和补料分批式发酵经历低的(不经济的)运行-设定-时间比。此外，产物的同质性(如，抗体的N-糖基化)对于哺乳动物细胞的分批式和补料分批式发酵是关键问题，这是因为细胞存活力在发酵即将结束之际降低，典型地导致细胞裂解，释放胞内产物(不同的N-糖基化)、宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA。本公开的工艺和方法解决了这些问题。
出于意料地，本发明人根据本公开的工艺和方法示出：
-高度一致的且可重复的细胞生物质的连续生成
-半连续培养策略的稳健性(达到超过64天的处理时间)
-与重复分批培养相比增加的时空产率(植物细胞生物质)
-溶解氧调节确保恒定的指数生长速率
-在多个过程中不同植物悬浮细胞(烟草属(Nicotiana)、梨属(Pyrus)和花楸属(Sorbus)物种)的成功培养
-产生的植物细胞对于瞬时基因表达和不同抗体生产的成功应用
-BY-2植物细胞对于无细胞体系的应用阐明了该过程中细胞浓度的增加/降低
-自动收获步骤的实施(减少"动手时间")
总之，本公开涉及具有以高度一致的且可重复的方式生产细胞(生物质)作为使用瞬时生产平台的关键要求用于生产治疗性用途用分子的能力的工艺和方法。
另一直接效果在于，本公开的工艺和方法非常适合提供高度活跃的(指数生长的)细胞，给出了(i)高转化效率和(ii)生产性(产物产率、酶活性等)等优势。同时减少可产生杂质的凋亡或死亡的细胞；蛋白酶和其它不良影响。
本公开的工艺和方法还有另一效果是递送高度活跃的、一致的且可重复的细胞，可用于制备/衍生出无细胞体系用组分。
另一效果为运行-设定-时间比增加，优势在于生产变得更加便宜和更加快速且需要更少的人力。这也是使用诱导表达的微生物系统的主要优势，并且生长和生产阶段可得到明确分离。
还有另一效果是收获时间和收获体积更灵活。这在应对运行一些小型生产活动的难以预料的要求时例如可预期在生产个体化医疗时、或在产品开发周期中当直接响应前一周期的结果时是有利的。
还有另一效果是，本公开的工艺和方法不需要保持步骤，即，它提供了连续发酵策略(恒化器)的多种优势，但避免了涉及保持步骤中细胞存活力、产物稳定性和质量等问题。该特征由于通过减少闲置时间而更好地设备利用率，消除了下游处理的重大瓶颈。
本公开有利的实施方案涉及用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在细胞培养物的限定体积内生长，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物。
术语"限定体积"涉及细胞在其中生长的细胞培养物的限定的起始体积。在初始生长期之后，细胞在发酵容器中限定的体积范围内生长，且调整细胞培养物的体积调节了细胞密度。限定体积作为起始体积还可记述为细胞培养物的最小体积。
本公开的另一有利的实施方案涉及用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在具有可变的细胞培养物体积的细胞培养物中生长，其中所述培养物体积在整个细胞培养过程中不被调节为恒定的，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中所述容器中的细胞培养物体积不通过在收获所述级分之后向所述容器中添加营养培养基来保持连续恒定、和/或其中收获的级分的体积不通过将营养培养基加入到所述容器中来立即补充；
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物。
术语"细胞密度"或"细胞质密度(cell mass density)"是指细胞培养物中每单位体积的细胞数(每单位体积培养基的细胞数、每体积的细胞质量(g/L)、细胞压积体体积(packed cell volume)(％)、每体积的细胞湿重或干重(g/L)、每培养物体积的细胞体积)。细胞密度还包括与细胞密度相关的任意其他性质，生物质密度，细胞体积，和浓度或每体积的细胞数。
术语"细胞培养"是指来自多细胞有机体如动物或植物的细胞的培养。根据本公开，细胞培养物包括真核细胞和液体营养培养基(细胞生长介质或培养基)。
本文使用的术语"细胞来源产物"是指由细胞合成的任何产物或在培养容器中使用由细胞合成的产物制得的产物。细胞来源产物还包括培养容器中在细胞组分的帮助下生成的产物，例如由添加到细胞培养物的底物被从细胞生产/衍生的酶转化的产物。细胞来源产物包括(但不限于)蛋白质如重组蛋白，特别是分泌到细胞培养基中的蛋白质。细胞来源产物还包括病毒。细胞来源产物还包括源自细胞的组分，例如膜、细胞壁、细胞器、蛋白质、酶、核酸、核糖体、色素、初级和次级代谢产物。此外，细胞来源产物还包括细胞提取物或级分(含有前述组分任意组合的混合物)。
根据优选的实施方案，包括在细胞培养物中的真核细胞是天然的(如野生型)或非转基因细胞，在进行第二培养步骤之前转化有至少一个表达载体，载体包括至少一个异源核酸序列、优选可操作地连接至功能性启动子，其中所述至少一个异源核酸序列编码待累积和收获的期望的细胞来源产物。
培养和产生的真核细胞包括人、动物和植物细胞，特别是植物悬浮细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。植物细胞的实例为来自普通烟草(如BY-2、NT1等)、胡萝卜(Dautuscarota)、红豆杉属物种(Taxus sp.)、日日春(Catharanthus roseus)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、西洋梨、驱疝花楸的细胞。昆虫细胞的实例为来自Sf9、Sf21或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(高五)的细胞。哺乳动物细胞的实例为HEK、CHO、BHK、EB66、MDCK(Madin Darby犬肾)细胞、或人类细胞如PER.C6、Hep G2等。
在某些有利的实施方案中，将细胞培养物添加至培养容器中作为起子培养物(starter culture)，例如预先在培养/发酵容器外制备。
本文使用的"起子培养物"为实际进行发酵的微生物培养物。这些起子通常由已被用于发酵/培养的真核细胞充分定殖的培养介质组成。
在本公开的实施方案中，半连续培养方法如下操作：
·在7L生物反应器内接种1.5L培养基(最小体积)
·在0.1bar的超压下培养，不控制pH，恒定的空气供给500mL/min，控温26℃，30％的溶解氧(通过调整搅拌器速度100-300rpm来控制)
·初始分批-阶段依赖于培养的细胞(BY-2细胞，4天)
·开启控制环路以调节生物质浓度(如100g/L BY-2细胞)
·细胞偶联至由于加料新鲜且无菌的培养基(通过用无菌培养基重填储蓄池来供给培养基)而不断增加的反应器体积而连续生长
·必须在达到最大填充体积时收获，自动
·可在最小至最大体积范围内改变悬浮体积的依时独立性收获。
如上所述，本公开的方法由在发酵/培养过程中控制细胞密度的新方法组成。这是通过改变发酵液的体积来调整生物质而实现的。在某些有利的实施方案中，使用密度传感器连续测量生物质(输入信号)和控制器生成触发例如泵的输出信号以从培养基储蓄池向发酵容器添加适当体积的控制环路。通过添加适当体积，细胞密度保持经时恒定(可选地，可定义时间相关函数并相应控制)。借此，细胞恒定保持在生长期。发酵罐在最小和最大填充水平之间操作。取出的体积在一定范围内可变。该范围由必须保留在发酵罐中的最小体积和容器的最大填充体积限定。如果达到最大填充水平，发酵液必须取出。可选地，可改变控制环路，即从而获得更高的细胞密度。可在不同时间收获的发酵液高度一致且可重复。
在有利的实施方案的第一步中，细胞在具有可变细胞培养物体积的细胞培养物中生长，其中培养物体积在整个细胞培养过程中不被调节为恒定。特别地，细胞培养物的体积在处理时间内显著变化。这是由于任意收获由操作人员执行，同时培养基的添加受细胞密度调节。在没有收获时，细胞培养物的体积增加。收获时，细胞培养物的体积任意降低(即，由操作人员决定)但在限定的体积范围内。体积范围限定为等于或低于实际培养物体积减去最小培养物体积。
这尤其与细胞培养物体积保持"连续恒定"或特别是"基本连续恒定"的方法(例如，如恒化器和恒浊器方法中的处理，或者收获的细胞培养物"立即重新装满"的方法)形成对比。
在本发明的背景下，"恒定"，特别是"基本恒定"是指观察到短期波动，且将在长时间窗(extended time window)内的平均值保持为实验限定内的期望值。更准确地说，短期是指小于10分钟的时间段，长时间窗是指超过30分钟的时间段。此外，"连续恒定"、特别是"基本连续恒定"是指至少12h、优选24h、更优选48h和最优选至少72h的时间段。
在第二步中，用密度传感器测量细胞培养物中的细胞密度。在有利的实施方案中，通过密度传感器测量细胞密度，其中密度传感器选自由基于浊度测量、激光散射测量、NIR测量或其它光谱测量、或者电容测量或以线路系统如细胞计数器或者测量细胞密度并允许反馈控制的任何其它方法的传感器组成的组。在某些实施方案中，密度传感器连续测量细胞培养物中的细胞密度。
在第三步中，细胞培养物中的细胞密度通过向细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节，从而保持细胞处在生长期。这里，"生长期"定义为间期(interphase)内的第一期，从前一M期的末尾直到DNA合成的开始称为G1(G表示间隔(gap))。该期内，细胞的在M期相当缓慢的生物合成活性得以高速恢复。G1的持续时间甚至在同一种的不同细胞之间也高度可变。该期内，细胞增加其蛋白质供给、增加细胞器(如线粒体、核糖体)数量，且在大小上增长。
在另一实施方案中，将适当体积的营养培养基从至少一个营养培养基储蓄池转移到培养容器中的细胞培养物。
在某些有利的实施方案中，通过使用控制环路调节细胞密度，所述控制环路包括连续测量细胞密度(输入信号)的密度传感器、和生成触发泵或阀的输出信号的控制器，用于将适当体积的营养培养基添加到细胞培养物。
在某些实施方案中，使用泵将适当体积从培养基储蓄池添加到发酵容器，或者其通过重力或压力驱动并经阀控制。
在另一实施方案中，细胞培养物中的细胞密度被调节为经时恒定或被调节为细胞密度特定的时间相关函数。此外，培养容器可在最小和最大细胞培养物填充水平之间操作。
在第四步中，可在期望的细胞密度下收获细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中所述容器中的细胞培养物体积不通过在收获所述级分之后向所述容器中添加营养培养基来保持连续恒定、特别是不保持基本恒定。
如上所述，细胞培养物的体积在处理时间内显著变化。这是由于任意收获由操作人员执行，同时培养基的添加受细胞密度调节。在没有收获时，细胞培养物的体积增加。收获时，细胞培养物的体积任意降低(即，由操作人员决定)但在限定的体积范围内。体积范围限定为等于或低于实际培养物体积减去最小培养物体积。这尤其与细胞培养物体积保持"基本连续恒定"的方法(例如，如恒化器和恒浊器方法中的处理，或者收获的细胞培养物"立即重新装满"的方法)形成对比。在本发明的背景下，"基本恒定"是指观察到短期波动，且将在长时间窗内的平均值保持为实验限定内的期望值。更准确地说，短期是指小于10分钟的时间段，长时间窗是指超过30分钟的时间段。此外，"基本连续恒定"是指至少12h、优选24h、更优选48h和最优选至少72h的时间段。
在第四步中，可在期望的细胞密度下收获细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中所述容器中的细胞培养物体积不通过在收获所述级分之后向所述容器中添加营养培养基来保持连续恒定特别是不保持基本恒定、和/或其中收获的级分的体积不通过将营养培养基加入到所述容器中来立即补充；
术语"立即补充"是指收获的细胞培养物通过将类似量的新鲜培养基添加到容器而替换。在本公开的背景下，类似量的新鲜培养基定义为与收获的细胞培养物加上或减去25％相同的体积。此外，"立即"是指小于12h、优选小于6h、更优选小于3h的时间段。"立即"还可以被"直接"或"相继"替换。
可被收获的细胞培养物的级分在一定限度内。收获后，剩余体积必须足以支持该过程，即，一定的最小体积的细胞培养物总是留在培养容器中。该最小体积依赖于包括容器、生物质传感器、搅拌器等多个方面。然而，在任何特定的时间，可收获发酵培养物的现有体积减去必须留在培养容器内的最小体积的任意体积分数。
如上所述，根据本公开的工艺和方法可用于灵活提供高度可重复的发酵液而不需要用于随后的下游加工的保持步骤。收获时间点的灵活性使得下游基础设施(单元操作)和人员能够更高效利用。这些特定的特征可用于抵消下游加工中发生的延迟。对于生产生物药物用分批式和补料分批式方法而言，必须接受下游加工中的闲置时间来确保收获时间点的就绪度(readiness)，这是由于非就绪度将导致与规格的偏差，因而造成该批次不合格同时造成巨大的经济损失。相对地，根据本公开的工艺和方法通过从培养容器中除去适当体积的级分而能够使收获时间点推迟。所造成的经济损失小得多，因为整个生产过程中只有一小部分浪费。
在某些实施方案中，多个培养容器连接以增加培养体积(cultivation volume)。这还将使得能够更长时间运行该过程，这是因为容器可从中取出加以清洁(壁生长、过滤器等)并重新配置(取代破损部件、重新校准传感器)，而不必停止培养。培养物需要在连接的容器之间交换(如"泵出")和混合，从而确保所有容器含有同样的培养物。在有利的实施方案中，(i)至少一个额外的培养容器连接至第一培养容器以增加培养体积，(ii)各连接的培养容器中的细胞密度相同，且(iii)细胞培养物在培养容器之间交换。在另一实施方案中，培养容器能够从一套两个以上的连接的培养容器中除去以降低培养体积。
在另一实施方案中，真核细胞在微载体(micro-carriers)的存在下培养。微载体是允许粘附细胞在生物反应器如培养容器中生长的支持基质。几种微载体是商购可得的，包括右旋糖酐类(Cytodex,GE Healthcare)、胶原类(Cultispher,Percell)、大孔凝胶涂布的微载体珠(Percell Biolytica AB)、和聚苯乙烯类(SoloHill Engineering)微载体。它们的差别在于孔隙率、比重、光学性质、动物组分的存在以及表面化学。接着以与新培养基类似的方式提供"空"(即，无细胞)微载体，即，经细胞密度调节它们向细胞培养物的添加。微载体可与新鲜营养培养基储蓄池一起作为上清液供给，或者从单独的储蓄池供给。
在另一实施方案中，进一步处理任选收获的细胞和/或细胞来源产物。第一步中，可通过离心、过滤/真空过滤或沉降将细胞从收获的细胞培养物级分中分离。分离的细胞接着可进一步用于瞬时表达系统。在植物细胞培养物的情况中，细胞可用于W02013/113504Al中记载的瞬时生产方法。在哺乳动物细胞培养物的情况中，细胞可用于瞬时表达。哺乳动物细胞的基因递送可通过病毒(Douglas 2008 Biotechnol Prog)或通过化学试剂如无机化合物(如磷酸钙CaPi,(Jordan和Wurm 2004 Methods))或阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺PEI(Baldi,Hacker等，2012 Protein Expression in Mammalian Cells)或阳离子脂质体(如LipofectAMINE、FuGENE、293fectin)或通过机械方法如显微注射或电穿孔(Pham,Kamen等，2006 Mol 15 Biotechnol)来完成。
某些实施方案中，收获的细胞培养物级分中的细胞来源产物和细胞可通过离心和/或过滤和/或沉降分离。一旦细胞培养上清液从细胞中分离，上清液产物将根据产物的定位而进一步处理。如果细胞来源产物是分泌的，则产物可使用例如层析法或沉淀法从培养上清液中纯化。如果细胞来源产物是细胞内的，则产物必须通过用例如超声波或在搅拌器或球磨机的辅助下均质化细胞而从细胞中提取。之后，细胞碎片可通过过滤或离心从细胞提取物中除去，而细胞提取物可进一步加工。细胞提取物本身可用作产物。或者可使用层析法或沉淀法从细胞提取物纯化产物。
在另一实施方案中，根据本公开的方法包括至少一个达到期望细胞密度的生长期，其中不添加培养基也不收获细胞培养物级分，接着是至少一个连续期(continuousphase)，其中细胞密度保持基本恒定。
在另一实施方案中，根据本公开的方法包括达到期望细胞密度的初始生长期，其中不添加培养基也不收获细胞培养物级分，接着是几个，即两个以上的连续期，其中细胞密度保持基本恒定，且其中连续期被达到更高细胞密度的另一生长期或被达到更低细胞密度的稀释期分隔。
在另一实施方案中，根据本公开的方法包括连续期，其中细胞密度保持恒定，具有超过48h、优选超过96h、更优选超过144h和最优选超过168h的持续时间，其中进行2个以上的收获步骤。
如上所述，根据本公开的方法提供优异的用于多种用途的细胞。例如，所生产的细胞可用于分析试验(例如药物或其它化合物的代谢)、基因表达的诱导(如，肝细胞中的P450、报告基因、或与之组合的任意种类的进一步的细胞培养)。
在有利的实施方案中，根据本公开的工艺和方法提供随后用作瞬时生产用宿主细胞的细胞。这意味着这些细胞随后将通过适当的手段转染/转化并温育以生产目标分子(产物)。这对于利用细胞悬浮液(动物和植物细胞二者)的瞬时转染平台至关重要。
在有利的实施方案中，本公开涉及用于生成稳定细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据本公开所述的方法培养和收获细胞，
ii)用核酸转化收获的细胞以获得稳定细胞系。
在有利的实施方案中，本公开涉及用例如CHO细胞中的MTX实施基因扩增的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据本公开所述的方法培养转染的细胞，
ii)逐步增加例如MTX浓度以增加基因扩增。
本文使用的术语"转化"("transformation")、"转化的"("transformed")和"转染"涉及任意核酸或核酸类似物递送至所生产的真核细胞(宿主细胞)中。转化后，核酸可稳定整合至宿主细胞的基因组中。
可选地，递送的核酸可以不整合至基因组中，并可以在胞质溶胶中或在细胞核中或在任何细胞器中发挥其作用。核酸可为自主复制元件如类病毒、病毒或解构的病毒，或者来自不止一种病毒的必要元件的组合。可选地，递送的核酸可以仅为自主复制元件的组分如类病毒、病毒或解构的病毒。其它组分可由宿主细胞或由转基因宿主细胞提供/补充。
在某些实施方案中，核酸包括在载体、特别是表达载体中。"载体"定义为特别包括任意质粒、黏粒、噬菌体、或病毒载体，双链或单链的线状或环状的，可以或可以不自我转移或移动，并且可转化原核或真核宿主且染色体外存在(例如，具有复制原点的自主复制质粒)。
"表达载体"是指其中核酸在宿主细胞如微生物或植物细胞中的适当启动子或其它转录调控元件的控制下并与之可操作地连接的载体。载体可以为双功能性表达载体，其在多种宿主中起作用。在基因组和次基因组DNA的情况中，可含有其自身启动子或其它调控元件，在cDNA的情况中，可在宿主细胞中的适当启动子或其它表达调控元件的控制下。"可操作地连接"是指作为相同的核酸分子的一部分被连接、适当定位和定向而使转录从启动子起始。
在有利的实施方案中，由本公开的方法生产的细胞为植物细胞并可用于培养基除去的、多孔结构化的且非组织的多层细胞压积体形式的植物细胞材料的生成和用于所述细胞压积体的后续维持(如WO 2013/113504Al中所记述的)。
因此，本公开还涉及用于培养基除去的、多孔结构化的且非组织的多层细胞压积体形式的植物细胞材料的生成和用于所述细胞压积体的后续维持的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)通过将细胞从植物细胞悬浮培养物中分离来提供具有多孔结构的细胞压积体，其中所述细胞通过根据本公开的培养方法培养，和其中所述细胞压积体包含的液体的含量减少并调整至相应于0.1和0.9g细胞湿重/cm3之间的细胞压积体密度，从而确立所述细胞压积体的培养基除去和多孔结构化性质，和
(ii)在相对湿度50-100％下的非液体环境中温育所述培养基除去且多孔结构化的细胞压积体。
特别地，根据本公开的方法的有利实施方案包括(i)第一培养步骤，其中植物细胞悬浮液根据本公开的培养方法培养，用于提供均质化植物生物质，(ii)分离步骤，其中以产生0.1和0.9g细胞湿重/cm3之间、优选0.2和0.85g细胞湿重/cm3之间、最优选0.4和0.8g细胞湿重/cm3之间的密度的多孔细胞压积体的方式将液体培养基从植物细胞分离，和(iii)第二培养步骤，其中细胞压积体进一步在非液体环境中在受控条件(参见上述)下温育至少另一天。根据实际情况和从业者的意图，该第二培养步骤可进行数日。典型地，第二培养步骤进行2至7天，优选3至5天。
另一实施方案中，本公开的工艺和方法用于生产目标分子(与细胞或细胞生物质相对照的)，例如重组蛋白。在该实施方案中，本公开潜在地提供与现有发酵策略相比更均质的、质量更高、还可能产率更高的产物。
本公开的另一实施方案为新方法用于利用转基因细胞生产重组蛋白或细胞来源产物的用途，所述方法包括：
i)根据本公开的方法培养和收获转基因细胞，
ii)从培养上清液中分离细胞，
iii)处理培养上清液(分泌蛋白)或
iv)从细胞中提取目标分子。
如果分泌细胞来源产物，可使用例如层析法或沉降法从培养上清液中纯化产物。如果细胞来源产物为细胞内的，则产物必须通过用例如超声波或在搅拌器或球磨机的辅助下均质化细胞而从细胞中提取。之后，细胞碎片可通过过滤或离心从细胞提取物中除去，而细胞提取物可进一步加工。细胞提取物本身可用作产物。或者可使用层析法或沉淀法从细胞提取物纯化产物。
本公开的另一实施方案为生产高度可比的且可重复的细胞用于生产无细胞体系用组分。对于用于体外翻译的无细胞提取物(溶胞产物)的生产，需要大量均质起始材料/细胞。为了确保所得溶胞产物的最佳生产性，细胞必须处在指数生长期。另外，收获点的细胞密度起到关键作用。通常，细胞培养物以分批模式生长到期望的细胞密度，收获并立即处理。这需要时间方面的高度灵活性，因为生长速度在大型发酵过程中变化，使得无法精确预测具体的收获点。此外，分批模式不能保证细胞对于培养过程的最佳适应。将细胞材料处理成高活性的溶胞产物是另一重要因素。所确立的基于无细胞溶胞产物的植物生产用方案通常是耗时且成本高的。
因此，本公开涉及用于制备体外翻译用无细胞提取物的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据本公开的方法培养和收获细胞，
ii)通过使收获的细胞进行提取处理得到所培养的细胞的无细胞提取物。
如上所述，在有利的实施方案中，收获的细胞处于指数生长期。
在另一实施方案中，提取处理为或包括酶处理。发明人发现在将细胞材料处理成溶胞产物期间，通过将常规的酶替换成原本设计用于食品工业的液体纤维素酶和果胶酶能够使原生质体无性系繁殖的成本减少超过百倍。同时已观察到改进的每时间单位的原生质体无性系繁殖。这些酶制剂的使用允许植物系溶胞产物以正常的市场价格工业生产。
对Komoda等人(Komoda,Naito等.2004 35 Proc Natl Acad Sci U S A)所记述的方案的进一步改进，诸如改变的缓冲液、洗涤和离心步骤、以及使用不连续的Percoll密度梯度离心法代替连续的，导致更快的生产以及更容易的扩展性。原生质体空泡化(evacuolation)的可选记载方法由Sonobe等(Sonobe 1996 J.Plant Res.)描述。Gursinsky等人(Gursinsky,Schulz等，2009 Virology)通过用最终的溶胞产物的S7核酸酶另外消化内源mRNA而示出大幅提高的翻译活性。
此外，包括在收获的细胞培养物级分中的细胞还可用于接种后续发酵过程。
总之，根据本公开方法的培养的和收获的细胞可用于进行后续培养步骤，从而(i)转染/转化细胞，(ii)添加诱导物诱导基因表达，(iii)感染细胞，(IV)在有利于细胞来源产物累积的条件下培养细胞，(iv)将核酸转染至细胞内，(v)和/或将细胞用于分析测定。
如上所述，本公开涉及用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在具有限定体积的细胞培养物中生长，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物，其中
-真核细胞可选自由植物悬浮细胞、昆虫细胞和动物细胞组成的组，和/或
-细胞来源产物可为初级或次级代谢产物或重组蛋白如酶、抗体、抗体片段、疫苗、细胞因子、激素、肽或病毒或病毒样颗粒或核酸，和/或
-细胞培养物可添加到培养容器中作为起子培养物，和/或
-密度传感器可选自由基于浊度测量、激光散射测量、NIR测量、或者电容测量(capacitive measurement)或以线路系统如细胞计数器或者测量细胞密度并允许反馈控制的任何其它方法的传感器组成的组，和/或
-细胞培养物中的细胞密度可连续测量，和/或
-适当体积的营养培养基可从至少一个营养培养基储蓄池转移至培养容器中的细胞培养物中，和/或
-细胞密度可通过使用控制环路调节，所述控制环路包括连续测量细胞密度(输入信号)的传感器、和生成触发泵/或阀的输出信号的控制器，或向细胞培养物添加适当体积的营养培养基，和/或
-细胞培养物中的细胞密度被调节为经时恒定或被调节为所述细胞密度特定的时间相关函数，和/或
-培养容器可在最小和最大细胞培养物填充水平之间操作，和/或
-发酵培养物的最小/最大范围内的任意体积的级分可从培养容器中收获,和/或
-细胞培养物的级分可在细胞处于指数生长期时收获，和/或
-i)至少一个附加培养容器可连接至第一培养容器以增加培养体积，(ii)各连接的培养容器中的细胞密度可相同和(iii)细胞培养物可在培养容器之间交换，和/或
-细胞可在微载体的存在下培养，和/或
-细胞可从收获的细胞培养物级分中分离，和/或
-收获的细胞培养物级分中的细胞来源产物和细胞可通过离心和/或过滤和/或沉降分离，和/或
-包括在收获的细胞培养物级分中的细胞可用于接种后续发酵过程，和/或
-收获的细胞可用于进行后续培养步骤，从而(i)转染/转化细胞，(ii)通过添加诱导物诱导基因表达，(iii)感染细胞，(IV)在有利于细胞来源产物累积的条件下培养细胞，(iv)将核酸转染至细胞内，(v)和/或将细胞用于分析测定，和/或
-细胞可用于制备无细胞提取物，和/或
此外，本公开涉及用于制备体外翻译用无细胞提取物的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据前述方法培养和收获细胞，
ii)通过使收获的细胞进行提取处理得到所培养的细胞的无细胞提取物，其中
-收获的细胞处于指数生长期，和/或
-提取处理包括酶处理，和/或
-酶处理可包括纤维素酶和果胶酶处理，和/或
-可将细胞溶胞产物离心以获得其上清液来制备无细胞提取物。
此外，本公开涉及用于生成稳定细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据前述方法培养和收获细胞，
ii)用核酸转化收获的细胞以获得稳定细胞系。
此外，本公开涉及用于培养基除去的、多孔结构化的且非组织的多层细胞压积体形式的植物细胞材料的生成和用于所述细胞压积体的后续维持的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)通过将细胞从植物细胞悬浮培养物中分离来提供具有多孔结构的细胞压积体，其中所述细胞通过根据权利要求1至17任一项所述的方法培养，和其中所述细胞压积体包含的液体的含量减少并调整至相应于0.1和0.9g细胞湿重/cm3之间的细胞压积体密度，从而确立所述细胞压积体的培养基除去和多孔结构化性质，和
(ii)在相对湿度50-100％下的非液体环境中温育所述培养基除去且多孔结构化的细胞压积体。
图9、10和11示出不同发酵方法，其中所述方法可通过比较培养物体积、细胞密度、加料速率和收获速率来区分。前述图中，细胞密度定义为每mL培养物的细胞数或可转化成该数或与该数相关的参数，培养物体积定义为生物反应器中发酵液的体积，加料体积(volume feed)定义为整个过程中添加到生物反应器的培养基的累积体积，收获体积(volume harvest)定义为整个过程中从生物反应器除去的发酵液的累积体积，加料速率定义为每时间单位添加到生物反应器的培养基的体积(如mL/min)，收获速率定义为每时间单位从生物反应器除去的发酵液的体积(如mL/min)，和稀释速率等于恒化器/恒浊器的加料速率和收获速率。
在有利的实施方案中，根据本公开的方法在7L容器中进行，传感器和叶轮的配置要求最小体积为1L，最大体积为6L(例如由制造商规定的)，培养细胞具有24h的倍增时间。
在第一实例中，实际体积("填充水平")为4L。操作者可例如立即收获3L和处理整个收获，而无需如例如恒化法/恒浊法中所必需的经很长时间收集(也就是所谓的收集或保持步骤)。
可选地，操作者还可决定收获100mL来例如测量细胞培养物的细胞存活力或其他参数，或者进行小规模实验，接着收获2.9L用于进一步处理。
在第二实例中，填充水平为6L。操作者收获3L并例如将细胞用于后续瞬时基因表达实验。在次日早上，由于培养物生长和新鲜培养基的成比例添加，实际体积已例如达到5L。操作者此时可再次收获3L，进行同样的实验，并可确保从培养物收获的细胞具有同样的性质(例如，细胞密度、存活力和其他性质如转染效率)。这与从分批式或补料分批式方法收获的细胞相对。晚上，实际体积为例如2.6L，操作者收获1L，并可再次确保从培养物收获的细胞具有同样的性质。
在第三实例中，实际体积为4L，并将细胞用于体外翻译用无细胞提取物的生成。在这天，几个研究者决定进行此类实验，但他们都没有提前计划和整理来自细胞培养物单元的细胞。9:30时，第一位研究者收获了1L的发酵液，第二位研究者就在十分钟后收获了另外2L。同时，第三位研究者只需要另外250mL但需要等到实际体积达到1.25L。
如果培养物体积达到最大体积，则发酵液需要自动或手动除去。再者，除去的体积可在最大体积减去最小体积的范围内自由选择。本发明的特定特征在于收获体积可如此选择，使得该方法将在未来产生期望的培养液体积，例如，在下午、次日或周末后。再次，收获的发酵液是高度可重复的。
这些实例清楚地示出工作流程可通过允许灵活收获和通过为操作者提供借助研讨对前面收获的处置(可使用或可弃置)而调整收获时间点的时机的可能性而得以优化。从而，根据本发明的方法可容易地适应后续步骤，产生更高的整体灵活性和稳健性。这使得能够更好的利用生产设备。
给出以下实施例以进一步说明本发明而不认为是对其限制的。
方法和实施例
在下列实施例中，提供本公开的材料和方法。应当理解的是，这些实施例仅出于说明目的而不应理解为以任何方式限制本公开。本文所引用的所有公报、专利和专利申请在此以所有目的以其全部内容并入以作参考。。
1.)BY-2植物悬浮细胞在7-L搅拌槽式生物反应器中的培养
在耐高压(autoclaveable)7-L搅拌槽式生物反应器(Applikon,Schiedam,theNetherlands)中在26℃下进行培养。生物反应器填充有最小体积的1.5L改良的MS培养基(Murashige和Skoog,1962；MS-盐4.3g/L，肌醇100mg/L,KH2PO4 200mg/L，HCl-硫胺素1mg/L，2,4-二氯苯氧基乙酸0.2mg/L，蔗糖30g/L)并用6天预培养的BY-2细胞接种。普朗尼克L-61(BASF,Mount Olive,NJ)以0.01％(v/v)的浓度添加来控制发泡和壁生长。发酵使用ez-control(Applikon)控制，BioXpert XP用于收集在线数据。反应器以0.5L/min的恒定流速充气。溶解氧浓度(dO2)通过调节搅拌器速度控制为30％饱和度。监测pH但不控制。使用Futura RFIS系统(Aber Instruments,Aberystwyth,UK)测量可行的在线生物质(viableonline biomass)。使用环形电极(12×120cm)和利用极化校正在0.6MHz的细胞培养模式下操作的标准远程Futura仪同时测量细胞的介电常数和培养基的导电率。用Futura软件控制生物质传感器。该生物反应器的最小工作体积为1.5L，这要求使所有传感器与细胞培养物适当接触来确保适当的测量和具有充分的混合。最大工作体积为5.5L。收获既可手动进行或可通过自动收获步骤进行。因此，水平传感器(level sensor)的输出信号(固定在5.5L填充体积)用于接通外部的泵。BioExpert用于记录水平传感器的输出信号并以发酵配方内的程序性阶段远程控制外部的泵。程序性阶段基于泵的运行时间限定收获体积。收获管在独留(unattended)反应器时(即，在周末期间)连接至外部的泵。每当填充体积达到5.5L并因而接触水平探针时，生成外部泵的起始信号。在该实验中，1L悬浮液的的限定体积泵出反应器。该控制环路充当避免定期监督发酵的需要并防止反应器在独留时充溢的安全措施。
接种和初始滞后期后细胞进入指数生长期。在0.029h-1的指数生长期的比生长速率下，悬浮液在培养116h后达到100g/L鲜重的生物质浓度。介电常数测量用处理值固定为设定点。另外，在培养过程中实际测定值(process value)与间隔5s的相应的介电常数设定点相比较。在该连续生长期的初始，在不同时间点调整介电常数设定点，这是由于离线测量的鲜重低于100g/L。PID(比例积分微分，proportional integral differential)控制器用于过程控制，泵用作执行器，将控制器输出转为执行器输出。在此情况下执行器输出为添加到生物培养器的新鲜培养基的特定体积，取决于测定值的偏移量(offset)、PID设定和用于培养基添加的管线(tubing)。新鲜培养基从槽添加到生物反应器导致发酵液的稀释和介电常数的降低，因而将测定值调整至设定点。初始分批阶段中断后，通过开始生物质控制，培养和生物质生产继续另外64天，产生总计88L悬浮液和8.8kg细胞。培养的1200h中，该过程允许在不同间隔的不同时间点收获可变的体积(0.01L-4.0L)(总计36次收获)。由于在线数据的收集在1200h的处理时间之后被中断，图2和表1仅示出这一时期的数据。
图2示出烟草BY-2细胞用新型培养策略的培养。A：培养过程中氧浓度、搅拌器速度和记录的收获(■)的过程。B：针对电导率、pH和介电常数(生物质浓度)的测定值的发展。C：连续处理期的培养基添加的过程。加料体积代表培养基添加的在线数据，收获体积代表离线记录的收获。
表1示出在发酵过程中的不同时间下不同的可变收获体积以及整个过程中的累积收获体积。例如，体积0.6L在430.1h时收获(表1，收获No.11)，而体积3.2L在793.2h时收获(表1，收获No.24)。
两次连续收获点之间的最短时间为3.6h(表1，收获No.30-31)，而两次收获点之间的最长时间为73.7h(表1，收获No.31-32)。在310.4h至334h的发酵时间之间，进行了三次不同体积的独立收获(表1；收获No.7-9)。这清楚地阐明了收获体积和收获时间间隔高度灵活，因而实现按需收获。
表1：培养期间进行的收获记录
在生产过程中，细胞以相同的比生长速率0.029h-1(在指数生长期确定)指数生长。此外，dO2、pH、电导率和介电常数的在线信号在开启控制环路后在整个过程中保持恒定，因此阐明了该过程的稳健性。特别地，不仅考虑在线信号，而且还在通过确定压积的细胞体积(packed cell volume，PCV)、干重和鲜重的离线参数来离线测量的实际生物质浓度方面，介电常数是恒定的。在线和离线参数的比较示出两种方法之间非常吻合(图3)。
2.)植物细胞中通过瞬时表达的生产和筛选
将新开发的使用烟草BY 2植物细胞压积体(PCPs)(专利号WO 2013/113504 Al)的高通量筛选表达构建体的步骤与叶的标准农杆菌渗入法相比较。用新的培养策略培养的烟草BY-2细胞转移到96孔接收板，在施加真空的同时产生鲜重～200mg的96孔PCPs。通过添加200mL的OD600＝0.1的根瘤农杆菌(A.tumefaciens)菌株GV3101悬浮液来转染PCPs。使用三种细菌培养物，各自载有针对三种抗体之一的表达构建体，因而产生32个转染有各构建体的PCPs。在温育30min后，通过真空过滤除去悬浮液来再生多孔PCPs。对于瞬时基因表达，含有PCPs的接收板在26℃和50％湿度下在植物生长室(phytochamber)中温育5天。同时，将4周的普通烟草K326、普通烟草SR-1和本氏烟草植物用源自与PCPs相同的培养物的根瘤农杆菌悬浮液(OD600＝1)渗透。将各植物上的四片叶子(不同龄)注射细菌并将植物在23℃下16-h光周期温育5天。从PCPs和叶子中提取总可溶性蛋白，并通过表面等离子体共振光谱比较三种抗体的浓度(图4)。
图4示出农杆菌介导的基因转移后5天含有用于筛选瞬时基因表达的烟草BY-2PCPs的不同全植物表达体系(本氏烟草、普通烟草K326和普通烟草SR-1)的比较(以抗体积累表示)。抗体浓度通过SPR光谱确定。
比较示出不同的瞬时表达方法产生在相对抗体产率方面可比的结果，因而示出PCPs可预测全植物中表达构建体的活性。PCP法的特征还在于对于抗体积累而言更低的变异系数，同时实现对于所有三种抗体而言最高的浓度，包括2F5的积累中三倍的增加(表2)。
新开发的培养策略示出为植物细胞压积体的高通量筛选平台所需而提供植物细胞生物质的完美方法。此外，确保了通过连续产生品质相当的植物细胞生物质来筛选的可重复性。
表2：渗透后5天来自不同表达体系的提取物中抗体浓度的定量(BY-2 PCP n＝32，植物种类n＝3)
表达体系 BY-2 PCP 普通烟草SR1 普通烟草K326 本氏烟草
M12[μg/g] 117.9±14.4 95.7±37.3 66.5±4.8 81.2±2.3
2G12[μg/g] 32.3±3.5 19.3±9.3 26.5±8.4 28.9±14.7
2F5[μg/g] 19.0±1.1 6.7±2.3 12.3±0.1 13.8±0.2
3.)体外翻译用无细胞提取物(溶胞产物)的生产
在实验安排上，将由在分批培养物中生长的烟草亮黄2(BY-2)细胞制备的溶胞产物的生产性与连续发酵中生长的那些相比较。在各情况中，一升的含20％压积的细胞体积的BY-2细胞培养物同时进行改良的根据Komoda等人(2004)的溶胞产物制备方案。
在各情况中，在增补有3％(w/v)蔗糖、1mg/L盐酸硫胺素、0.2-mg/L的2,4二氯苯氧基乙酸和100mg/L肌醇的Murashige和Skoog液体培养物(Murashige和Skoog基础盐混合物，Duchefa Biochemie，Haarlem，Niederlande)中生长的一升BY-2细胞培养物在250xg下离心5min。将细胞颗粒在三体积的由3.6g/L的Kao和Michayluk培养基(Duchefa Biochemie)、0.36M甘露醇、3％(v/v)的Rohament CL、2％(v/v)的Rohament PL和0.1％(v/v)的RohapectUF(全部来自AB Enzymes,Darmstadt,Germany)以及植物激素NAA(α-萘二甲酸0.5μg/mL)和BAP(6-苄基氨基嘌呤1μg/mL)组成的原生质体无性系繁殖缓冲液中重悬。用氢氧化钾调节pH为5。在27℃和70rpm下温育悬浮液1.5h。在原生质体无性系繁殖之后，在110×g下离心悬浮液5min并将所得细胞颗粒直接用于在0.7M甘露醇、20mM MgCl2和5mM PIPES-KOH(pH7.0)中的由(从上到下)3mL 0％、3mL 15％、5mL 30％、5mL 40％和3mL 70％Percoll(GEHealthcare,Munich,Germany)组成的不连续的Percoll密度梯度。在12,000×g下离心1h后从40％和70％Percoll层之间的界面回收空泡的原生质体(所谓的迷你原生质体)，并在100×g下在0.7M甘露醇中洗涤5min。将迷你原生质体在三体积的TR缓冲液(30mM HEPES-KOH,pH 7.4，80mM醋酸钾，0.5mM醋酸镁，2mM DTT和每50mL一片剂的完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany))中重悬。随后，在氮气减压室(ParrInstrument,Frankfurt,Germany)中10bar下破坏迷你原生质体30min。通过500×g和4℃下离心10min来除去细胞核和膜碎片。添加0.5mM CaCl2和75U/mL核酸酶S7(RocheDiagnostics)之后，20℃下温育上清液15min。用1mM EGTA增补溶胞产物，在液氮中冷冻，并保存在-80℃，1mL分装。
考虑到反应组分的浓度，所得溶胞产物通过设计实验(DoE)方案优化到最大的体外翻译活性。与由分批模式培养的细胞制备的溶胞产物相比，利用从连续发酵细胞中得到的溶胞产物观察到100％的更高翻译活性(图5)。另外，260nm吸光度作为核糖体浓度的指示剂，所得的更高生产性在从连续发酵细胞中得到的溶胞产物中更高(+20-25％)。
在未偶联的(mRNA作为模板)以及偶联的(质粒DNA作为模板)分批模式中BY-2溶胞产物的生产性几乎两倍高于商购可得的植物类体系(麦芽提取物)。
图5示出在分别由分批培养的细胞和由连续培养的细胞制备的无细胞烟草BY-2的转录/翻译偶联体系中产生的黄色荧光蛋白(eYFP)的提高产率的比较。如图所示，连续培养细胞来源的溶胞产物相对于分批来源的溶胞产物实现了>100％的翻译活性增加。在25℃和750rpm下进行温育至39h。
4.)驱疝花楸悬浮培养物(Elsbeere)在3-L搅拌槽式生物反应器中的培养。在耐高压3-L搅拌槽式生物反应器(Applikon,Schiedam,The Netherlands)中在26℃下进行培养。生物反应器填充有2L的MS培养基(Murashige和Skoog,1962；MS盐4.3g/L，肌醇100mg/L，KH2PO4 200mg/L，HCl-硫胺素1mg/L，2.4-二氯苯氧基乙酸0.2mg/L，蔗糖30g/L)并接种有6天预培养的驱疝花楸细胞。以0.01％(v/v)的浓度添加普朗尼科L-61(BASF,Mount 5Olive,NJ)来控制发泡和壁生长。通过使用烧结金属喷射器以0.1vvm的通气量(aeration rate)将压缩空气自动脉冲入发酵罐中而将溶解氧浓度(dO2)维持在20％的饱和设定点。使用ez-control(Applikon)控制发酵并将BioXpert XP用于收集在线数据。监测pH但不控制。使用Futura RFIS系统(Aber Instruments,Aberystwyth,UK)测量可行的在线生物质。使用环形电极(12×120cm)和利用极化校正在0.6MHz的细胞培养模式下操作的标准远程Futura仪同时测量细胞的介电常数和培养基的导电率。用Futura软件控制生物质传感器。在发酵过程中于不同设定点确定介电常数测量的测定值(40pF/cm 0-4.5dpi；45pF/cm 4.5-8.5dpi；50pF/cm来自8.5-11.5dpi)。培养过程中，将实际测定值与间隔5s的相应的介电常数设定点相比较。PID控制器用于过程控制。具体设定P、I和D参数为P-增益＝20、I-时间＝0和D-时间＝0。执行器将控制器输出转为执行器输出。当介电常数信号超过设定点时，控制泵从培养基槽向生物反应器添加新的无菌培养基，因此稀释培养基并减少介电常数至设定点的值。图6清楚地示出不仅普通烟草(N.tabacum cv.)BY-2细胞适于该发酵策略，而且来自驱疝花楸的悬浮细胞培养物也已成功地培养。在发酵的前4天中，细胞处于分批阶段并首次达到40pF/cm设定点。在接种后4、5天时设定点增至45pF/cm。细胞需要大约一天来达到该设定点。设定点确定为在45pF/cm下持续约4天。在这3天中，可收获总计200mL的悬浮液。在接种后8.5天后设定点再次增加至50pF/cm且又在大约一天后细胞达到该生物质。发酵另外运行3天。11.5天内可收获总计大约400mL的细胞悬浮液。
5.)西洋梨悬浮培养物(Birne)在3-L搅拌槽式生物反应器中的培养。在耐高压3-L搅拌槽式生物反应器(Applikon,Schiedam,The Netherlands)中在26℃下进行培养。生物反应器填充有2L的MS培养基(Murashige和Skoog,1962；MS盐4.3g/L，肌醇100mg/L，KH2PO4200mg/L，HCl-硫胺素1mg/L，2.4-二氯苯氧基乙酸0.2mg/L，蔗糖30g/L)并接种有6天预培养的驱疝花楸细胞。以0.01％(v/v)的浓度添加普朗尼科L-61(BASF,Mount 5Olive,NJ)来控制发泡和壁生长。通过使用烧结金属喷射器以0.1vvm的通气量自动将压缩空气脉冲入发酵罐中而将溶解氧浓度(dO2)维持在20％的饱和设定点。使用ez-control(Applikon)控制发酵并将BioXpert XP用于收集在线数据。监测pH但不控制。使用Futura RFIS系统(AberInstruments,Aberystwyth,UK)测量可行的在线生物质。使用环形电极(12×120cm)和利用极化校正在0.6MHz的细胞培养模式下操作的标准远程Futura仪同时测量细胞的介电常数和培养基的导电率。用Futura软件控制生物质传感器。在发酵过程中于不同设定点确定介电常数测量的测定值。进一步在培养过程中，将实际测定值与间隔5s的相应的介电常数设定点相比较。PID控制器用于过程控制。具体设定P、I和D参数为P-增益＝20、I-时间＝0和D-时间＝0。执行器将控制器输出转为执行器输出。当介电常数信号超过设定点时，控制泵从培养基槽向生物反应器添加新的无菌培养基，因此稀释培养基并减少介电常数至设定点的值。
发酵策略用于来自西洋梨的培养悬浮细胞系。应当研究逐步增加或减少介电常数设定点在过程中的作用。
图7中，"点-线-点"的线示出设定点在整个过程中变化。第一设定点40pF/cm在接种后6天(days past inoculation，dpi)后达到，之后设定点增加至43pF/cm。一旦培养物已达到43pF/cm，设定点再次以5pF/cm的步数增加直至85pF/cm。培养物在18.6dpi后达到85pF/cm并再次降低到80pF/cm。培养物保持该水平大约8天，接着进一步逐步降低设定点至70pF/cm和50pF/cm。在发酵结束时，生物质被稀释为接种后直接达到的介电常数，培养物显示如常规分批式发酵的正常生长。该实验清楚地阐明了整个过程相对于设定点变化的稳健性。该实验清楚地证实，一方面该过程适于西洋梨细胞培养物的培养，另一方面设定点的变化不会负面影响该过程。
6.)时间改进
图8示出基于普通烟草BY-2细胞培养物的生长行为的处理时间和收获生物质的理论计算。两种发酵策略的计算基于5L体积的细胞悬浮液。BY-2细胞培养物在分批式培养中分别需要5天达到20％PCV(100mg/L鲜重)和7天达到50％的PCV(250mg/L鲜重)。两种发酵策略的清洁、预备和灭菌容器的准备时间相同(1天)。对于常规的分批式发酵，可收获整个发酵液(5L)，而对于新方法，最大收获体积4L用于计算。一旦新方法处于稳定状态，可每3天从容器中除去最大收获体积。
图8的上半部示出当收获标准为20％PCV(意指新方法中的设定点)时的生物质的经时收获。分批式培养在5dpi后达到该生物质。两种策略在6pdi后提供生物质第一收获。在第一分批中，常规分批发酵提供0.5kg的生物质，新方法提供0.4kg的生物质。此时，分批式培养似乎更佳。但一旦达到收获标准(意指新方法中的设定点)，新发酵方法仅需要3天便再次提供0.4kg的生物质，代替常规分批式发酵的6天达到0.5kg。如果考虑48天的时间，则可进行8次常规分批式发酵，导致收获4kg生物质。在相同时间框架下的能进行新发酵方法的15次收获产生6kg的生物质。增加的时空产率为约50％。如果收获标准换成50％的PCV(250mg/L)，时空产率的增加变得甚至更高(图8下半图)。BY-2细胞需要8天达到该生物质。考虑48天，利用常规分批式方法的6次生产周期可引导产生7.5kg的生物质。利用新方法的14次生产周期可在47天内引导产生14kg的生物质和增加的时空产率86％。这些数据总结于表3。
表3
该图标根据介电常数设定点示出与标准普通烟草BY-2分批发酵相比的时间改进。
7.)分批式发酵中以及利用根据本公开方法的转基因BY-2细胞系的重组抗体生产
如前所述通过用承载有编码抗体重链和轻链基因的二倍体T-DNA质粒的重组农杆菌的转化生成产生HIV-1中和2G12抗体的转基因烟草BY-2细胞的悬浮细胞系(GFD#5)(Holland,Sack等，2010 Biotechnol Bioeng)。如前所述进行分批式发酵和通过ELISA的2G12抗体累积分析(Holland,Sack等，2010 Biotechnol Bioeng)。分批式发酵进行161小时。48h的滞后期接着104h的指数细胞生长期。培养上清液中的2G12浓度在指数细胞生长期间增加到88ng/mL的水平，直到120h的处理时间。之后，浓度在接下来的41h中下降到35ng/mL的水平，尽管培养物仍处于指数生长期。72h处理时间后细胞内浓度水平为4000ng/mL并在120h后恒定降低至2250ng/mL的水平且保持恒定直至该过程结束(图12)。根据本发明的发酵如下进行。培养物接种有5％(v/v)的7天的预培养物。起始体积为1L于3L玻璃反应器中。这种反应器的最小工作体积为0.5L和最大工作体积为2.7L。在120h的初始分批阶段之后，介电常数设定点设为45pF/cm，并已开启控制器环路。由于培养物已经达到54pF/cm的介电常数，将新鲜培养基泵入反应器中直至达到45pF/cm的介电常数。该设定点之后维持恒定48h，之后增加到90pF/cm。培养物需要37h的生长来达到该介电常数水平，之后在此保持恒定另一58h。在初始阶段(0-120h发酵时间)，两种方法产生水平相当的细胞内的2G12浓度和培养上清液中的2G12浓度。与分批式发酵相比，根据本发明的方法中细胞内的2G12浓度在120h后迅速增加至7000ng/mL，并维持较高的产物水平直至发酵过程结束。培养上清液中的2G12抗体浓度实质上也与分批式发酵方法不同。与之相对，浓度并没有再次降低而是在整个过程中连续增加到终产物浓度1260ng/mL(图13)，与分批式发酵的最大水平相比有14倍的增加。
本实施例清楚地示出根据本发明的新发酵方法不仅适用于生产高度可重复的生物质，而且还有用于增加细胞培养上清液中和细胞内的重组蛋白的累积。在分批式发酵中，细胞内的2G12抗体水平从60h直到160h的收获自4.0μg/mL稳定降低到2.25μg/mL。相对地，根据本发明的新方法中2G12抗体水平自120h到144h从3.7μg/mL增加到7.0μg/mL，与介电常数在45pF/cm下保持恒定的阶段的开始相一致。细胞内的2G12抗体水平增加不只是通过一两种因素增加，而是进一步从120h-288h维持在更高的水平。这也示出根据本发明的方法的特征在于相对于细胞内产物水平更低的可变性，特别是在初始生长期后已开启控制器环路之后。
2G12抗体在细胞培养上清液中的累积显示甚至更高的差异。然而，在分批式发酵中，水平在120h时达到峰值并在之后下降，而新的发酵方法观察到2G12抗体在细胞培养上清液中的稳定增加。
出乎意料的是，不仅在对应于45pF/cm的培养基细胞密度下观察到2G12抗体水平的增加，还在90pF/cm下维持(细胞内2G12)或甚至进一步增加(细胞培养上清液2G12)。因此，细胞培养上清液中的2G12产物水平还显示较低的存活力，特别是在较长的处理持续时间下。细胞培养上清液中的2G12产物水平的持续增加进一步阐明了根据本发明的方法较高的稳健性和其带来更优产物的能力。从分批式发酵的细胞培养上清液中的2G12水平在120h后再次降低的事实明显的是，意味着产物劣化。
本实施例进一步示出可在该过程内容易地改变介电常数的设定点，同时不仅维持细胞生长和存活力，而且还累积了细胞内和上清液中的重组蛋白产物。这阐明了根据本发明的方法的高稳健性以及其对于过程开发和改进的效用和独特的选项。
7.)CHO细胞的发酵
利用生产单克隆抗体的转基因CHO DG44悬浮细胞系进行根据本发明的发酵并如下进行。初始体积为0.8L的PowerCHO-2CD，而没有次黄嘌呤和胸苷(Lonza,12-771Q)，在3L玻璃反应器中增补有4mM的L-谷氨酰胺(最小工作体积＝0.5L，最大工作体积＝2.7)，培养物接种2.8·108个细胞。通过使用烧结金属喷射器以0.1vvm(体积/体积/分钟)的通气量将压缩空气自动脉冲入发酵罐中而将溶解氧浓度(dO2)维持在30％的饱和设定点。温度控制在37℃并使用100rpm的固定的搅拌器速度。监控pH并用0.5M NaOH控制在7.0的设定点。使用ez-control(Applikon)控制发酵并将BioXpert XP用于收集在线数据。使用Futura RFIS系统(Aber Instruments,Aberystwyth,UK)测量可行的在线生物质。使用环形电极(12×120cm)和利用极化校正在0.6MHz的细胞培养模式下操作的标准远程Futura仪同时测量细胞的介电常数和培养基的导电率。用Futura软件控制生物质传感器。培养过程中，将实际测定值与间隔5s的介电常数设定点相比较。PID控制器用于过程控制。具体设定P、I和D参数为P-增益＝20、I-时间＝0和D-时间＝0。执行器将控制器输出转为执行器输出。当介电常数信号超过设定点时，控制泵从培养基储蓄池向生物反应器添加新的无菌的增补有4mM L-谷氨酰胺的PowerCHO-2CD，因此稀释培养物直至介电常数达到设定点。
在发酵接种后，获得介电常数1.2pF/cm，对应于3.5·105个细胞/mL。介电常数设定点限定为3pF/cm并已开启控制器环路。在初始阶段(分批阶段)，培养物的细胞密度增加直至达到该设定点。在该初始阶段细胞培养物体积没有变化。由于细胞的代谢活性，溶解氧浓度和pH值降低直至达到其设定点。
26h后细胞密度从3.5·105个细胞/mL增加到6.8·105个细胞/mL，介电常数显示从1.2pF/cm到2.3pF/cm的相应改变。3pF/cm的设定点在发酵37h后达到并在此后维持。在该阶段中培养物体积增加(图14培养基加料)。50h后收获10mL的任意体积而不影响正在生长的培养物。在73.2h的发酵时间，实施另一830mL的收获，1h后收获另一620mL。此后不久(1.5h)设定点增加到4.5pF/cm，新的设定点在14h后达到。在4.5pF/cm恒定介电常数的第二阶段中，收获三次以上任意的细胞培养物级分，而不干扰细胞培养物。
细胞的存活力通过在Thoma chamber中染色和计数或通过CASY来确定。表4示出的结果阐明了根据本发明的方法在整个发酵时间内可重复地提供高存活力的哺乳动物细胞。特别是还在不同的介电常数下获得高存活力细胞。此外，该方法还产生高质量的细胞来源产物，即，单克隆抗体。特别注意的是，抗体产物在整个发酵时间内增加。为了比较，在发酵73.2h(*)后将细胞培养物的级分收获(保持步骤样品**)到收集容器中并在4℃进行保持步骤24h。细胞存活力清楚地从94％明显降低到85％。保持步骤之前(*)和之后(**)的抗体浓度的比较还示出产物浓度从40μg/mL降低到29μg/mL(表4)。这清楚地阐明了根据本发明的方法的优势。
表4：转基因CHO DG44细胞系的根据本发明的发酵的培养上清液中介电常数、活细胞数、存活力和抗体浓度
该实施例清楚地示出根据本发明的方法还适用于哺乳动物细胞生产高度可重复的活细胞或细胞来源产物，例如抗体和重组蛋白(图14)。
参考文献
所有引用的文献，包括文献参考书、授权的专利和公开的专利申请，如本申请全文所引用的，将其内容引入本文以作参考。
Baldi，L.，D.Hacker，et al.(2012).Large-Scale Transfection of MammalianCells.Protein Expression in Mammalian Cells.J.L.Hartley，Humana Press.801：13-26.
Chmiel，H.(2006).Bioprozesstechnik，ELSEVIER，Spektrum akademischerVerlag.
Derouazi，M.，P.Girard，et al.(2004).″Serum-free large-scale transienttransfection of CHO cells.″Biotechnol Bioene 87(4)：537-545.
Douglas，K.L.(2008).″Toward development of artificial viruses for genetherapy：a comparative evaluation of viral and non-viral transfection.″Biotechnol Prog 24(4)：871-883.
Geisse，S.，M.Jordan，et al.(2005).″Large-scale transient expression oftherapeutic proteins in mammalian cells.″Methods Mol Biol 308：87-98.
Gursinsky，T.，B.Schulz，et al.(2009).″Replication of Tomato bushy stuntvirus RNA in a plant in vitro system.″Virology390(2)：250-260.
Hacker，D.L.，E.Derow，et al.(2005).″The CELO adenovirus Gam1 proteinenhances transient and stable recombinant protein expression in Chinesehamster ovary cells.″J Biotechnol117(1)：21-29.
Holland T，Sack M，Rademacher T，Schmale K，Altmann F，Stadlmann J，FischerR，Hellwig S.2010.Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustainedproduction of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspensionculture.Biotechnol Bioeng 107(2)：278-89.
Jordan，M.and F.Wurm(2004).″Transfection of adherent and suspendedcells by calcium phosphate.″Methods 33(2)：136-143.
Komoda，K.，S.Naito，et al.(2004).″Replication of plant RNA virusgenomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts.″Proc Natl Acad Sci U S A 101(7)：1863-1867.
Pham，P.，A.Kamen，et al.(2006).″Large-Scale transfection of mammaliancells for the fast production of recombinant protein.″Mol Biotechnol 34(2)：225-237.
Sonobe，S.(1996).″Studies on the plant cytoskeleton usingminiprotoplasts of tobacco BY-2 cells.″J.Plant Res.109(4)：437-448.

Claims (15)

1.一种用于生产真核细胞和/或真核细胞来源产物的调节细胞密度的细胞培养方法，其中在所述细胞培养期间，所述细胞密度通过调整培养容器中包括细胞和营养培养基的细胞培养物的体积来调节，所述方法包括下列步骤：
a)使细胞在具有可变的细胞培养物体积的细胞培养物中生长，其中所述培养物体积在整个细胞培养过程中不被调节为恒定的，
b)用密度传感器测量所述细胞培养物中的细胞密度，
c)通过向所述细胞培养物添加适当体积的营养培养基来调节所述细胞培养物中的细胞密度以保持细胞处于生长期，
d)在期望的细胞密度下收获所述细胞培养物的级分，其中收获的级分包括细胞和/或细胞来源产物，和其中所述容器中的细胞培养物体积不通过在收获所述级分之后向所述容器中添加营养培养基来保持连续恒定、和/或其中收获的级分的体积不通过将营养培养基加入到所述容器中来立即补充；
e)按前述顺序重复一个或全部前述步骤来实现细胞培养物级分的重复收获，和
f)任选处理收获的所述细胞和/或细胞来源产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中连续测量所述细胞培养物中的细胞密度。
3.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其中所述细胞密度通过使用控制环路来调节，所述控制环路包括连续测量细胞密度(输入信号)的传感器、和生成触发泵/或阀的输出信号的控制器，或向所述细胞培养物添加适当体积的所述营养培养基。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述细胞培养物中的细胞密度被调节为经时恒定或被调节为所述细胞密度特定的时间相关函数。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述培养容器在最小和最大细胞培养物填充水平之间的体积范围内操作。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中从所述培养容器收获在发酵培养物的最小/最大范围内的任意体积级分。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中(i)至少一个附加培养容器连接至第一培养容器以增加培养体积，(ii)各连接的培养容器中的细胞密度相同和(iii)细胞培养物在培养容器之间交换。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中将包括在收获的细胞培养物级分中的细胞用于接种后续发酵过程。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中收获的细胞用于进行后续培养步骤，从而(i)转染/转化细胞，(ii)添加诱导物来诱导基因表达，(iii)感染细胞，(IV)在有利于细胞来源产物累积的条件下培养细胞，(iv)将核酸转染至细胞内，(v)和/或将细胞用于分析测定。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述细胞用于制备无细胞提取物。
11.一种用于制备体外翻译用无细胞提取物的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据权利要求1至10任一项所述的方法培养和收获细胞，
ii)通过使收获的细胞进行提取处理得到所培养的细胞的无细胞提取物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述收获的细胞处于指数生长期。
13.根据权利要求11至12任一项所述的方法，其中所述提取处理包括酶处理。
14.一种用于生成稳定细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：
i)根据权利要求1至10任一项所述的方法培养和收获细胞，
ii)用核酸转化收获的细胞以获得稳定细胞系。
15.一种用于培养基除去的、多孔结构化的且非组织的多层细胞压积体形式的植物细胞材料的生成和用于所述细胞压积体的后续维持的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)通过将细胞从植物细胞悬浮培养物中分离来提供具有多孔结构的细胞压积体，其中所述细胞通过根据权利要求1至10任一项所述的方法培养，和其中所述细胞压积体包含的液体的含量减少并调整至相应于0.1和0.9g细胞湿重/cm3之间的细胞压积体密度，从而确立所述细胞压积体的培养基除去和多孔结构化性质，和
(ii)在相对湿度50-100％下的非液体环境中温育所述培养基除去且多孔结构化的细胞压积体。
CN201580023518.XA 2014-04-28 2015-04-28 发酵体系 Pending CN106459901A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14166157 2014-04-28
EP14166157 2014-04-28
PCT/EP2015/000867 WO2015165583A1 (en) 2014-04-28 2015-04-28 Fermentation systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106459901A true CN106459901A (zh) 2017-02-22

Family

ID=50630601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580023518.XA Pending CN106459901A (zh) 2014-04-28 2015-04-28 发酵体系

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10988727B2 (zh)
EP (1) EP3136841B1 (zh)
JP (1) JP6723163B2 (zh)
KR (1) KR102352104B1 (zh)
CN (1) CN106459901A (zh)
BR (1) BR112016025013B1 (zh)
CA (1) CA2943198A1 (zh)
CU (1) CU20160159A7 (zh)
ES (1) ES2911309T3 (zh)
PT (1) PT3136841T (zh)
WO (1) WO2015165583A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110669722A (zh) * 2019-10-23 2020-01-10 长春生物制品研究所有限责任公司 一种用于mdck细胞的无血清全悬浮驯化方法
CN111944736A (zh) * 2020-07-06 2020-11-17 深圳大学 一种小立碗藓原生质体及其制备方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3559203B1 (en) * 2016-12-21 2020-12-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Growth control of eukaryotic cells
EP3579845A4 (en) * 2017-02-09 2020-12-30 Dow Agrosciences LLC NEW EUKARYOTE CELL FREE EXPRESSION SYSTEM THAT DOES NOT REQUIRE AN ARTIFICIAL ENERGY REGENERATION SYSTEM
ES2962273T3 (es) 2017-06-02 2024-03-18 Fraunhofer Ges Forschung Procedimiento para la transformación automatizada de un paquete de células vegetales
US10774297B2 (en) * 2017-08-03 2020-09-15 Repligen Corporation Method of actuation of an alternating tangential flow diaphragm pump
CN107904167B (zh) * 2017-11-15 2023-06-06 中国航天员科研训练中心 细胞自动扩增培养设备
TW202045711A (zh) * 2019-06-13 2020-12-16 美商安進公司 生物製品製造中基於生物量之自動灌注控制
WO2023278593A1 (en) * 2021-06-30 2023-01-05 Corteva Agriscience Llc Soybean and maize cell-free expression systems

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02109973A (ja) * 1988-10-19 1990-04-23 Shimadzu Corp 細胞培養装置
WO2013113504A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for the generation and cultivation of a plant cell pack

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3958364A (en) * 1973-12-04 1976-05-25 American Bioculture, Inc. Production of algal bio-polymers
FR2690926B1 (fr) * 1992-05-06 1995-08-04 Lvmh Rech Dispositif du type reacteur a volume variable et procede de culture cellulaire.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02109973A (ja) * 1988-10-19 1990-04-23 Shimadzu Corp 細胞培養装置
WO2013113504A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for the generation and cultivation of a plant cell pack

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
，KELLY A. ET AL.: "The hydraulically integrated serial turbidostat algal reactor (HISTAR) for microalgal production", 《AQUACULTURAL ENGINEERING》 *
HENRY C.LIM ET AL.: "Introduction to Fed-Batch Cultures", 《FED-BATCH CULTURES》 *
ISAMU MAEDA ET AL.: "Simultaneous Control of Turbidity and Dilution Rate Through Adjustment of", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
STEPHAN HELLWIG ET AL.: "Plant cell cultures for the production of recombinant proteins", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110669722A (zh) * 2019-10-23 2020-01-10 长春生物制品研究所有限责任公司 一种用于mdck细胞的无血清全悬浮驯化方法
CN111944736A (zh) * 2020-07-06 2020-11-17 深圳大学 一种小立碗藓原生质体及其制备方法
CN111944736B (zh) * 2020-07-06 2022-06-24 深圳大学 一种小立碗藓原生质体及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3136841A1 (en) 2017-03-08
EP3136841B1 (en) 2022-03-09
JP2017513509A (ja) 2017-06-01
JP6723163B2 (ja) 2020-07-15
US20170037421A1 (en) 2017-02-09
BR112016025013A2 (zh) 2017-08-22
KR102352104B1 (ko) 2022-01-14
ES2911309T3 (es) 2022-05-18
CU20160159A7 (es) 2017-12-08
KR20160145746A (ko) 2016-12-20
PT3136841T (pt) 2022-06-20
BR112016025013B1 (pt) 2022-09-20
WO2015165583A1 (en) 2015-11-05
US10988727B2 (en) 2021-04-27
CA2943198A1 (en) 2015-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106459901A (zh) 发酵体系
Santos et al. Putting the spotlight back on plant suspension cultures
JP4991517B2 (ja) 細胞／組織培養デバイス、システム、および方法
Mishra et al. Growth of hairy‐root cultures in various bioreactors for the production of secondary metabolites
CN103205396B (zh) 一种hek-293t细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法
CN102311937B (zh) 水稻绿色原生质体的制备方法及应用
CN105087529A (zh) 基因工程改造蛋白酶k及其生产方法
CN103320390B (zh) 一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法
CN105039183A (zh) 一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法
CN104789594A (zh) 稳定高效表达人血清白蛋白和白介素ⅱ融合蛋白的cho细胞株的构建方法
CN104099371A (zh) Kap26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基因的应用
CN104093845B (zh) 植物细胞堆叠的产生和培养方法
CN102533761B (zh) 一种花粉特异性启动子及其表达载体和应用
CN106755093A (zh) 果蝇细胞瞬时转染的工艺
US6740526B1 (en) Quantitative transient protein expression in plant tissue culture
Bleckwenn et al. Large‐scale cell culture
CN104974933B (zh) 一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置和方法
CN109576212A (zh) 高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用
CN109136259A (zh) 一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法
KR20220100934A (ko) 접종물을 제조하기 위한 공정 및 시스템
CN102965419A (zh) 一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺
CN105349592B (zh) 代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法
Lee et al. Industrial application and genetic engineering of plant cell cultures
CN104711260B (zh) 水稻缺氮后恢复供氮特异诱导表达的启动子y8a及应用
CN103952438B (zh) 烟草遗传转化后的抑菌培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170222