JP2017513509A - 発酵系 - Google Patents

Abstract

本開示は、既存の発酵戦略に対して利点を有する新規の細胞培養ならびに細胞および／または細胞由来の生産物の生産プロセスに関する。本開示によるプロセスおよび方法は、現在適用されているプロセス（バッチ、流加または灌流戦略）に対して利点を有する代わりの生産プロセスとして、一時的生産プラットホームのための、高い生存能力があって代謝的に活性な真核細胞の効率的な供給のために、および、一時的発現系またはウイルスもしくは偽ウイルスによる感染、または無細胞系での以降の使用のために代謝的に高活性なバイオマスを生成するために用いることができる。

Description

本開示は、既存の発酵戦略に対して利点を有する新規の細胞培養ならびに細胞および／または細胞由来の生産物生産プロセスに関する。本開示によるプロセスおよび方法は、現在適用されているプロセス（バッチ、流加または灌流戦略）に対して利点を有する代わりの生産プロセスとして、一時的生産プラットホームのための、高い生存能力があって代謝的に活性な真核細胞の効率的な供給のために、および、一時的発現系またはウイルスもしくは偽ウイルスによる感染、または無細胞系での以降の使用のために代謝的に高活性なバイオマスを生成するために用いることができる。

バイオ医薬品の製造は、必要とされる体積の増加およびより厳格な安全要求事項などの多くの変更を受ける。さらに、生産物品質、生産物収量、生産費用および設備稼働率は、バイオ医薬品産業の重要な側面である。したがって、従来の製造プラットホームをさらに最適化して、洗練することに、および現在のボトルネックを解消することが可能である新規のものを開発するために、ならびに新規で革新的な生産プロセスを可能にするために継続した関心がある。

バイオテクノロジー産業での発酵槽の使用は、現在、発酵溶液の調製、バイオマスの生産および発酵産物の製造のためにバッチ、流加または連続バイオリアクタープロセスを概して必要とする。バイオリアクターへの供給様式は、バイオリアクターまたは発酵槽がバッチ、流加または連続バイオリアクターに分類されるかを決定する。

さらなる供給（すなわち栄養素含有培地の添加）なしにバイオリアクターが一度充填されるだけであるならば、バイオリアクターはバッチモードで作動している。バイオリアクターは、完了まで動作させられる。操作の終わりに、発酵は終了され、生産物が収集された後に新しい発酵が再び開始される。

これらのバッチ手法は、所望の培養による栄養培地の接種、正確に規定された条件の下での特定の時間の培養、ならびに微生物の収集および／または所望の代謝産物の回収を慣例上含む。

詳細なバッチ発酵：
バッチ発酵は、培地が一度充填されて、接種される。接種の後、リアクターは、酸素およびｐＨを制御するための塩基／酸のような少数の添加剤を除けば、閉鎖系である。これは、発酵が開始されると、追加の培地も栄養素もリアクターに供給されないことを意味する。したがって、リアクター培養体積は、プロセス全体で（蒸発による体積減少を除いて）一定である。いくつかの重要な細胞培養パラメータ、例えば細胞密度、生存率、溶存酸素、栄養素および生産物濃度は、プロセス全体で変化する。細胞培養は、ラグ、指数関数的および定常増殖相を経る。収集条件に到達するとき、プロセスは終了し、全発酵ブロスが収集される。より多くの生産物を生産するために、プロセスが繰り返されるか、またはより大きな容器に規模が変更される。

詳細な反復バッチ発酵：
反復バッチ発酵は、接種の後に正常なバッチモードで作動する。細胞密度、溶存酸素、栄養素および生産物濃度のような培養パラメータは、プロセス全体で変化する。バイオリアクターは、完了まで運転される。運転終了時に、発酵ブロスは無菌条件下で収集されるが、一定の体積の発酵ブロスはバイオリアクター内に残され、新しい接種原の役目を果たした。リアクターは再び新鮮な培地で充填され、新しいバッチ発酵サイクルが開始する。その運転モードの細胞は、各サイクルで新しい適応、指数関数的および定常増殖相を経る。反復バッチ発酵は、発酵槽および接種原を調製するための時間を節約することによって、バッチおよび流加プロセスの全体のプロセス効率を向上させる。理想的には反復バッチはバッチ培養と事実上同一であるが、前の培養からのメモリー効果および繰越しが、特に医薬タンパク質の生産にとって重要である。

しかし、これらのいくつかのバッチプロセスはいくつもの欠点を伴う。バッチ発酵では、微生物および生細胞の増殖が、様々な、時には好ましからぬ条件の下で一般に起こる。発酵の始めに、細胞は、培地に適応する時間（ラグ相）を必要とする。生存能力のある細胞密度（接種原の生存可能な細胞数）は、最高基質濃度の下でその最低レベルにあり、これは培地の高浸透性による基質阻害または増殖抑制をもたらすことさえもある。

連続発酵では、無菌の栄養液が特定の速度で絶えずバイオリアクターに供給されるが、バイオリアクター中の培養体積を全プロセスの間事実上一定にしておくために、等体積の発酵ブロスがバイオリアクターから同時に除去される。

生物体の増殖速度は、培養の最高増殖速度に応じて培地が注入される速度によって制御される。新鮮培地速度（いわゆる希釈速度）は、生物体の最高比増殖速度の９０％未満である必要がある。哺乳動物および植物の細胞の相対的に低い倍加時間（１日につきおよそ１回）は低い希釈速度をもたらし、したがって、洗い流される発酵ブロスはより長い時間にわたって収集されなければならない。このいわゆる収集のホールドステップは、いくつかの欠点を有する。１番目に、収集容器は発酵槽と同じレベルの複雑性を含まないので、収集された細胞は好ましからぬ条件の下に保たれる。一般的に、いくつかのパラメータがもはや制御されない。条件の変化はより低い細胞生存率につながり、細胞破裂は宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡなどの細胞内汚染物質の放出を引き起こす。タンパク質分解または変化した翻訳後修飾を含むいくつかの機構を通して、生産物品質が損なわれることがある。規制上のバッチの定義も、より困難である。例えば培地バッチの微妙な差が引き起こし得る増殖速度の軽微な変化が、プロセスの大きな変化を引き起こし得るので、バッチ間の一貫性は重大な問題である。バイオ医薬品生産物の場合は、そのようなプロセスはそこで終了しなければならず、生産物は不合格にしなければならない。

詳細な連続発酵（ケモスタット／タービドスタット）
両作動モードは、一定の細胞密度を目指す、固定されたリアクター体積による連続プロセスである。両プロセスでは、新鮮な培地がリアクターに連続的に供給されると同時に、同じ体積の発酵ブロスが収集される。培養体積は全プロセスの間一定に保たれ、このように、加えられる新鮮な培地の量は除去される培養ブロスの量と等しくなければならない。したがって、新鮮な培地のインプットと発酵ブロスのアウトプットは互いに依存する。

ケモスタットプロセスでは、新鮮な培地（＝供給速度）を加える流量、および培養ブロス（＝収集速度）を除去する流量を一定とする。これらの流量は同一であり、希釈速度と呼ばれ、すなわち、発酵槽の培養体積は一定に維持される。細胞培養が一度外部の条件に適応すると、プロセスは安定した定常状態にあり、増殖速度は供給速度に一致する。増殖速度が影響されるほど系が乱されることが、例えば新しいバッチの培地が用いられる場合または代謝産物が経時的に蓄積する場合に起き得るが、この場合、系が不安定になることがある。詳細には、増殖速度が低下するならば、細胞は洗い流され、細胞密度は着実に減少する。培養中の細胞数の増加も、体積に依存する。その結果、プロセスを乱すことなく、発酵ブロスを自由に収集することができない。さらに、安定したケモスタットプロセスの細胞密度は外部の条件（栄養素、温度、曝気．．．）の結果であり、それ以外のかたちでオペレーターが規定することはできない。タービドスタットプロセスでは、発酵槽中の細胞密度および培養体積が経時的に一定であるように、希釈速度は濁度によって制御される。培養ブロスは発酵槽から連続的に除去され、収集容器に保存される。ケモスタット／タービドスタットモードで作動する発酵は、容器内で増殖する培養物の小分画を連続的に収集することによって培養ブロスおよびその中に含有される生産物を提供する。小分画は、容器に収集して長期間保存しなければならない。特にバイオ医薬品のためには、そのようなホールドステップは変動源であり、生産物の品質に悪影響を与えることがあるので望ましくない。例えば、ホールドステップの間に細胞溶解が起こることがあり、プロテアーゼが生産物を分解することがあり、または翻訳後修飾に影響することがあり、それは変動を再び増加させて生産物の品質に影響を及ぼす。細胞またはこれらの細胞に由来する組成物が生産物を含む場合、ホールドステップはさらに望ましくない。ホールドステップは、細胞生存率、代謝活性および再生性を低減する。

連続発酵は、バッチおよび流加プロセスと比較して有意により高い時空収率を有するので有利である。したがって、所望の生産能力を達成するために必要とされる設備サイズはより小さく、このことは、生産設備を構築するための投資がより小さいことも意味する。

連続バイオリアクターの理想的特性にもかかわらず、プロセスそれ自体は、汚染のリスク、細胞またはバイオマスの流失およびバイオリアクターの生物相の変化などの様々な因子の影響に感受性があり影響を受ける。

流加は、バイオリアクター運転の中間モデルである。プロセスの間に、正しい成分構成による適切な供給速度が必要とされる。流加は、バッチおよび連続培養と比較して多くの利点を提供する。その実行概念から、制御可能な条件の下で、および発酵に関与する微生物についての必要な知識を用いて、増殖のための必要な構成成分および／または生産物の生産のために必要な他の基質の供給は決して消耗させることができないこと、ならびに発酵過程で栄養環境をほぼ一定にまたは必要なレベルに保つことができると、容易に結論づけることができる。高濃度の基質の存在に一般に関係する副産物の生成は、その量を生化学物質の生産のためにだけ必要とされる量に制限することによって、回避することもできる。高濃度の基質が存在するとき、細胞は「過負荷」になり、すなわち、細胞の酸化受容能を超過し、クラブトリー効果のために目的生産物以外のものが生成され、炭素フラックスの有効性を低減する。さらに、これらの副産物は、目的の生産物に「混入」さえすること、例えばパン酵母生産においてエタノールが生成されること、ならびに細胞増殖を害して発酵時間およびその関係する生産性を低減することが証明されている（Chmiel 2006）。

詳細な流加発酵：
流加発酵は、古典的なバッチ相から始まる。ある特定の条件に到達するときに供給が始まる、すなわち追加の栄養素が提供される。この運転モードでは、リアクター培養体積はバッチ相で一定であり、供給相では体積が増加する。このモードでも、いくつかの培養パラメータが変化し、細胞は古典的増殖相を経る。バッチ発酵の場合のように、プロセス終了後にリアクター内の全体積を収集する。

バッチおよび流加発酵では、細胞生存率は後期に低下するので、高くて一貫した生産物品質を確保するために収集時点を注意深く選択しなければならない。細胞は、代謝負荷のために強いストレスを経験することがある。細胞の死および破裂は、細胞内物体、例えば宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡならびに生産物関連の不純物を培地に放出し、そのことも懸念材料となることがある。

しかし現在、ほとんど全ての治療抗体は、流加発酵戦略または灌流戦略を用いて生産される。プロセス開発のためのバッチ定義および時間的要件などのある特定の規制的側面（技術的運転、反復）および一般懸念（ホールドステップ、生産物の安定性および品質を参照する）、ならびに製薬業界の中での新しいかまたは異なる技術に対する一般的抵抗は、流加方法の大きな優位性に全て寄与している。これは、例えば生産物品質および翻訳後修飾のように、問題があるいくつかの争点があり、特に、Ｎ−グリコシル化が重大な特性である抗体生産物についてそうであるにもかかわらずである。多くの場合、流加培養は収量を最大にするために長時間インキュベートされるが、細胞生存率は培養期間の終わりに向かうにしたがってかなり低下し、細胞内生産物、宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを遊離する。これの不利な面は、より低い生産物品質またはより高い生産物不均質性（例えばグリコ型）であるか、そうである可能性があり、最終的により高い失敗率（規格外バッチ）またはより低い生産物性能（すなわち臨床有効性）につながる。

さらに、バッチおよび流加発酵のための低い運転対セットアップ時間比は、今のところ、マンパワーおよびインフラストラクチャの投資によって補償されている。連続モードに切り替えることによって時にはこれを回避することができるが、これは常に可能とは限らず、常に望ましいとは限らない。バッチ／流加／反復バッチ発酵の定常相の間に発生する生産物均質性に関する問題は、定常相に到達する前に収集すること／プロセスを終了することによって対処するかまたは回避することができる。しかし、そのときにはかなりより低い生産物収量を受け入れなければならない。生産物品質の差はしばしばバッチ拒絶の理由であり、すなわち、原材料全体を廃棄しなければならず、投資された費用は回収されない。

近年、真核細胞での一時的遺伝子発現を用いた生産技術が、かなりの関心を集めている（Derouazi, Girard et al. 2004 Biotechnol Bioeng；Geisse, Jordan et al. 2005 Methods Mol Biol；Hacker, Derow et al. 2005 J Biotechnol）。これは、トランスジェニック系（例えばトランスジェニック植物）と比較してより高い収量、短い生産サイクル（数カ月、さらには数年に対して、数日）、特に緊急事態（世界的流行病、パーソナライズされた医療）における速い応答時間、ならびにより速い生産物および臨床開発を含む、いくつかの理由による。細胞が長期間インキュベートされず、細胞増殖および細胞分裂は一般的に低いか全く起こらないので、一時的生産系は、トランスフェクション／形質転換のために大量の野生型（すなわち形質転換されていない）細胞を必要とする。一時的遺伝子発現のための宿主として用いられる野生型細胞が、生じた生産物の収量および品質に決定的に影響することは明らかである。さらに、臨床試験を予定している生産物にとって、高い再現性が非常に重要である。

一時的生産技術については、高い生存能力のある細胞材料の再現可能な生産は、最も重要なボトルネックの１つである。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を含む無細胞系も、特にハイスループットスクリーニングおよび合成生物学への適用について、かなりの関心を集めている。特定の利点は、（中でも）無細胞系が、完全細胞には適用できない方法で改変することができること、細胞壁および細胞膜を通してそれらを細胞に送達する技術を必要とせずに核酸を直接的に加えることができること、実験を規格化することができること、ならびにリードアウトを測定するための複数の方法があることである。無細胞系は、規模縮小および自動化に特に合う。一時的発現系に関しては、無細胞系のために必要とされる高活性構成成分のための再現可能な生産技術が、現在かなりのボトルネックになっている。

したがって、本開示の目的は、改善された細胞バイオマスまたは細胞由来の生産物を提供するために、現在の発酵技術の不利を克服することであった。

新規の細胞培養ならびに細胞および／または細胞由来の生産物の生産プロセスは、既存の発酵戦略に対していくつかの利点を提供する。

新規プロセスの連続的ケモスタット／タービドスタットプロセスとの主な差は、可変培養体積ならびに供給速度および収集速度の独立性である。ケモスタット／タービドスタットと対照的に、本開示によるプロセスの培養体積は、バッチまたはケモスタット／タービドスタットプロセスのようにプロセス全体で一定でもなく、流加プロセスのようにプロセス全体で単純に増加することもない。可変培養体積ならびにカップリングしていない供給速度および収集速度は、新規プロセスの主要な特徴である。異なるプロセスは、培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度を比較することによって区別することができる（図９、１０および１１を参照する）。

本開示のプロセスの供給流は細胞密度によって制御され、したがって、細胞はそれらの最大増殖速度で絶えず成長しているが、それはケモスタットまたは流加発酵のように固定されずまたはあらかじめ規定されていないので、実際は連続的である（図１１）。

プロセス終了後に培養全体が収集されるバッチおよび流加発酵と対照的に、また、培養の増加分が連続的に収集されるケモスタット／タービドスタットプロセスと対照的に、この発明によるプロセスは、作業範囲内で任意の体積の収集をいつでも可能にする。作業範囲は、実培養体積から保持される最小体積を引くことによって与えられる。

したがって、本開示は、既存の発酵戦略に対して利点を有する新規の細胞培養ならびに細胞および／または細胞由来の生産物の生産プロセスに関する。本開示によるプロセスおよび方法は、現在適用されるプロセス（バッチ、流加または灌流戦略）に対して利点を有する代わりの生産プロセスとして、一時的生産プラットホームのための、高い生存能力があって代謝的に活性な真核細胞の効率的な供給のために、および、一時的発現系またはウイルスもしくは偽ウイルスによる感染、または無細胞系での以降の使用のために代謝的に高活性なバイオマスを生成するために用いることができる。本開示は、様々な時点および様々な体積での再現可能な発酵ブロスの収集を可能にし、例えば連続的下流処理戦略に特定の利点を提供する、連続的／半連続的細胞培養戦略に関する。

本開示は、安定したトランスジェニック細胞株に由来するバイオ医薬品の生産の時空収量を増加させるために用いることもできる。さらに、本開示によるプロセスおよび方法は、生産設備の稼働率を増加させるために、より効率的な上流および下流のプロセスを実行するために用いることができる。

さらに、本開示による細胞培養プロセスは、細胞の増殖を乱すことなく、任意の時間での任意の体積の任意のおよび繰り返しの収集を可能にし、ここで、０＜収集体積＜（実際の体積−最小限の体積）である。本開示によるプロセスの利点の１つは、連続細胞培養プロセスが長時間の発酵ブロスの収集のための容器を必要としないこと、および／または、供給が調節され、収集を恣意的に実行することができ、そのため細胞の増殖が維持され、収集操作によってあまり乱されないことである。

第１の態様では、本開示は、真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための細胞密度調節細胞培養プロセスに関し、ここで、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、前記プロセスは、
ａ）可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
ｂ）細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
ｃ）細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
ｄ）所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および／もしくは細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれず、かつ／または収集される分画の体積は容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ、
ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
ｆ）収集される細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。

一態様では、本開示は、真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための、細胞密度調節細胞培養プロセスに関し、ここで、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、前記プロセスは、
ａ）可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
ｂ）細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
ｃ）細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
ｄ）所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含み、収集される分画の体積は容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ、
ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
ｆ）収集される細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。

別の態様では、本開示は、真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための、細胞密度調節細胞培養プロセスに関し、ここで、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、前記プロセスは、
ａ）可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
ｂ）細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
ｃ）細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
ｄ）所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれない、ステップ、
ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
ｆ）収集される細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。

本開示の別の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物の調製のための方法であって、
ｉ）本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）収集される細胞を、使用する抽出処理にかけることによって培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法に関する。

さらなる態様では、この開示の実施形態は、安定した細胞株を生成するための方法であって、
ｉ）本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）収集される細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法に関する。

さらに別の態様では、この開示の実施形態は、培地が取り除かれた、多孔構造の、組織ではない多層細胞パックの形態の植物細胞材料の生成のための、および前記細胞パックの以降の維持のための方法であって、
（ｉ）植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、細胞は本開示による方法によって培養され、細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、１ｃｍ^３あたり０．１〜０．９ｇの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
（ｉｉ）前記の、培地が取り除かれた、多孔構造の細胞パックを５０〜１００％の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法を提供する。

本開示を詳細に記載する前に、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の請求項で用いるように、内容が明らかに別途指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には単数形および／または複数形が含まれる点に注意しなければならない。数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合には、範囲はこれらの限界値を含むとみなされることをさらに理解するべきである。

本開示による培養系のスキームである。 タバコＢＹ−２細胞の半連続培養のオンラインデータを示す図である。 タバコＢＹ−２細胞の半連続培養のオフラインパラメータを示す図である。 アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介遺伝子導入の５日後の一時的遺伝子発現（抗体蓄積として提示される）のスクリーニングのための、異なる完全植物発現系（Ｎ．ベンタミアーナ（N. benthamiana）、タバコ（N. tabacum）Ｋ３２６およびタバコ（N. tabacum）ＳＲ−１）とタバコＢＹ−２ ＰＣＰとの比較を示す図である。 バッチ培養細胞および連続培養細胞からそれぞれ調製された、カップリングされた転写／翻訳無細胞タバコＢＹ−２系で生産された増強された黄色蛍光性タンパク質（ｅＹＦＰ）の収量の比較を示す図である。 ソルブス・トルミナリス（Sorbus torminalis）細胞の半連続培養のオンラインデータを示す図である。 セイヨウナシ（Pyrus communis）細胞の半連続培養のオンラインデータを示す図である。 誘電率設定点に依存する標準のタバコ（N. tabacum）ｃｖ ＢＹ−２バッチ発酵と比較した本開示によるプロセスの使用の改善を示す図である。 Ａ）バッチ発酵プロセスでの培養時間中の培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度、ならびにＢ）流加発酵プロセスでの培養時間中の培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度を示す２つの図である。 Ａ）反復バッチ発酵プロセスでの培養時間中の培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度、ならびにＢ）連続ケモスタット／タービドスタット発酵プロセスでの培養時間中の培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度を示す２つの図である。 培養時間中の培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度からみた本開示による発酵プロセスの特性を示す図である。 バッチ発酵プロセスの上でのトランスジェニックタバコ（Nicotiana tabacum）ＢＹ−２細胞株の誘電率ならびに細胞および培養上清中の２Ｇ１２抗体濃度を示す図である。 本発明による発酵プロセスの上でのトランスジェニックタバコ（Nicotiana tabacum）ＢＹ−２細胞株の誘電率ならびに細胞および培養上清中の２Ｇ１２抗体濃度を示す図である。 本発明によるプロセス全体でのトランスジェニックＣＨＯ ＤＧ４４細胞培養の誘電率、培地供給体積および累積収集体積を示す図である。

本開示は、真核細胞（バイオマス）および／またはタンパク質のような真核細胞由来の生産物を高度に一貫して再現可能な方法で生産するための新規のプロセスおよび方法に関する。本開示のプロセスは細胞密度調節細胞培養プロセスであり、そこでは、培養容器中の細胞培養の体積を調整することが細胞培養の中の細胞密度を調節する。プロセスおよび方法は、高度に一貫して再現可能な方法の、植物および哺乳動物をベースとした系に適しており、そこではプロセスが確固としており、再現可能な生産は規制上の必要条件をより良好に満たす。本開示のプロセスの１つの利点は、より優れた比較性、バッチ間の一貫性およびより低い変動に基づく、スクリーニングおよび生産物開発のために改善された細胞を生産する能力である。さらに、開示されるプロセスによる高い生存能力のある（指数関数的に増殖する）細胞を提供する能力は、（ｉ）高い形質転換効率、（ｉｉ）生産性（生産物収量、酵素活性）および（ｉｉｉ）高い代謝活性（無細胞系での適用）の利点を与える。本開示のプロセスおよび方法は、運転対セットアップ時間比の増加、より少ないマンパワーの必要性および時空収量の増加のためにより経済的である。特に、収集時間および収集体積は開示プロセスでより柔軟であり、いくつかの小さい生産行動（パーソナライズされた医療または生産物開発）を実行するときに、より予測可能でない要求に対応することを可能にする。この方法は連続発酵戦略（ケモスタット、灌流）の利点の多くを提供するが、ホールドステップの間の細胞生存率、生産物安定性および品質に関係する問題点を回避／解決する。

本開示によるプロセスおよび方法は、発酵プロセスの間に細胞密度（または細胞密度、バイオマス密度、細胞濃度または体積あたりの細胞数に関連する任意の他の特性）を制御するための新規方法からなる。これは、発酵ブロス（すなわち細胞培養）の体積を変更することによってバイオマスを調整することによって達成される。センサーがバイオマス（インプットシグナル）を連続的に測定するコントロールループを用いることができ、コントローラは、例えばポンプが培地貯蔵槽から培養容器に適当な体積を加えることを誘発するアウトプットシグナルを生成し、それによって細胞培養体積を変更する。適当な体積を加えることによって、細胞密度は経時的に一定に保たれる（あるいは、細胞密度についての時間依存関数を規定し、それに応じて制御することができる）。これを行うことによって、細胞は増殖相に継続的に保たれる。発酵槽は、最小から最大の充填レベルの間で操作される。引き抜く体積は、この最小および最大範囲の中で変動してもよい。最小および最大の体積は、容器の幾何構造によって与えられる。最小体積は、プローブ／センサーまたは撹拌機のような全ての設備がプロセスの適切な測定、混合および制御を提供するのに十分に発酵ブロスと接触することを確実にするために、発酵槽中に保持されなければならない体積である。最大充填レベルは体積によって規定され、そのことは、発酵ブロスまたは泡により容器があふれることがないことを確実にする。最大充填レベルに到達するならば、発酵ブロスは抜き取らなければならない。あるいは、コントロールループを変更すること、すなわちより高い細胞密度を得ることができる。異なる時間に収集することができる発酵ブロスおよび可変体積が、高度に一貫し、再現可能である。当業者は、例えば実際の細胞培養体積が最大体積を超えて増加することを阻止するために、または遠隔収集を可能にするために、自動収集機能を実行することができることも理解する。例えば、自動収集機能は、例えばアナログまたはデジタルのアウトプットシグナルにより外部的に制御されるポンプと組み合わせてレベルセンサーを用いることにより、実現することができる。

新しくて効率的な真核細胞生産技術、すなわち生成細胞を一時的生産技術で用いるための真核細胞生産技術を提供することが目的であった。真核細胞を用いる一時的生産技術は、近年かなりの関心を集めている。これは、（ｉ）トランスジェニック系（例えばトランスジェニック植物）と比較してより高い収量、（ｉｉ）短い生産サイクル（数日対数カ月、またはさらには数年）、特に緊急事態（世界的流行病、パーソナライズされた医療）における速い応答時間、ならびにより速い生産物および臨床開発を含む、いくつかの理由による。

したがって、有利な実施形態では、本開示によるプロセスおよび方法は、一時的生産のための宿主細胞としてその後用いられる細胞（バイオマス）を提供するために用いられる。このことは、目的の分子（生産物）を生産するために、これらの細胞がその後適当な手段によってトランスフェクト／形質転換され、インキュベートされることを意味する。細胞懸濁液（動物および植物両方の細胞）を利用する一時的生産プラットホームのために、細胞生存率はきわめて重要である。一時的生産のためには、大量の均質で再現可能な出発材料（細胞）も必要である。

本開示によるプロセスを用いることの１つの利点は、一部の実施形態では、生産プロセス全体において定常相が発生せず、細胞生存率が維持されること、したがって、バッチ、流加および灌流方法と比較して本プロセスが利点を有することである。

さらなる利点は、本開示のプロセスおよび方法は、細胞バイオマスを生産する（組換え遺伝子の発現を抑圧する条件の下で）ための開示方法による第１の培養ステップを用いて「発酵カスケード」を実行し、その後別の発酵槽にこれらの細胞を移し、次に、遺伝子発現を誘導するか、細胞をウイルスに感染させるか、または細胞を第１の培養ステップと異なる条件の下でインキュベートする第２の段階を実行するために用いることができることである。このことは、第２の段階が細胞生産段階より短い（より優れた時空収量）か、または例えば細胞がウイルスもしくは偽ウイルスに感染している場合など、物理的分離が必要とされる発酵カスケードにとって特に有利である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物（溶解物）の生産のためには、大量の均質な出発材料の必要性がある。生じる溶解物の最適な生産性を確実にするために、細胞は、高い代謝活性および高い生存率で特徴づけられる指数関数的増殖相になければならない。さらに、収集時点の細胞密度は、重大な役割を演ずる。従来、細胞培養は所望の細胞密度までバッチモードで増殖させ、収集され、直ちに処理される。大きな発酵プロセスでは増殖速度が変動して特定の収集時点の正確な予測を不可能にするので、これは時間に関して高い柔軟性を必要とする。さらに、培養プロセスへの細胞の最適な適応は、バッチモードでは保証することができない。高活性溶解物への細胞材料の処理は、別の重要な因子である。植物をベースとした無細胞溶解物の生産のための確立されたプロトコールは、しばしば時間がかかり、費用集約的である。

したがって、本開示のプロセスおよび方法は、遺伝子発現および／またはタンパク質生産のためにそのような「無細胞系」を調製するためにその後用いられる真核細胞を生産するのに理想的に適している。これは、単にこれらの系が、出発材料として一貫した再現可能で高い生存能力のある細胞も必要とするからである。指数関数的増殖相でのおよび一定細胞密度での細胞培養の連続制御発酵の可能性のために、最適な生産性で溶解物をもたらす細胞材料は、任意の時間および容器の最小／最大範囲内の必要な体積で収集することができる。数カ月間の連続発酵は、発酵条件への細胞の最適な適応も確実にする。生じる一貫した細胞出発材料は、処理済の最終生産物の品質に大いに影響する。溶解物への細胞材料の処理の間、従来の酵素を、本来食品産業のために設計された液状セルラーゼおよびペクチナーゼと置き換えることによって、プロトプラステーションのための費用を、百倍を超えて低減することができた。同じく、時間単位あたりのプロトプラステーションの改善も観察された。これらの酵素調製物の使用は、通常の市場価格での植物ベースの溶解物の商業生産を可能にする。改変された緩衝液、洗浄および遠心分離ステップ、ならびに連続の代わりの不連続なパーコール勾配の使用のようなKomoda et al. (2004)によって記載されるプロトコールへのさらなる変更は、より速い生産ならびにより容易なスケーラビリティにつながった。

一時的発現によって目的の分子を生産するためのトランスフェクション／形質転換のための以降の使用のために高度に一貫した再現可能な細胞バイオマスを提供すること、様々な時点および様々な体積での再現可能な発酵ブロスの収集を可能にする連続細胞培養戦略を提供することのような、本開示のプロセスおよび方法によって対処することができるいくつかのさらなる利点がある。さらに、本開示のプロセスおよび方法は、高い生存率を有する指数関数的に増殖する細胞を連続的に提供する。

さらに、本開示のプロセスおよび方法は、以下の問題点を解決する。先行技術の連続発酵では、細胞由来の生産物および／または細胞を含有する細胞培養は長期間収集しなければならず、したがって収集される材料はさらにインキュベートされる（いわゆるホールドステップのように）。（ｉ）細胞生存率が低下し、および／または（ｉｉ）生産物品質が損なわれることがあるので、このホールドステップは問題を含む。その結果として、バッチの定義は、より困難である。さらに、低い流速での懸濁液の連続除去は収集パイプの閉塞につながって、事実上発酵プロセスを停止させるので、植物懸濁細胞の連続発酵は技術的に困難を伴う。さらに、バッチおよび流加発酵は、低い（不経済な）運転対セットアップ時間比を被る。さらに、発酵の終了に向かうにしたがって細胞生存率が低下し、細胞溶解、細胞内生産物（異なるＮ−グリコシル化）、宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡの放出を一般的にもたらすので、生産物均質性（例えば抗体のＮ−グリコシル化）は哺乳動物細胞のバッチおよび流加発酵の重大な問題である。本開示のプロセスおよび方法は、これらの問題点を解決する。

驚くべきことに、本開示によるプロセスおよび方法の発明者らは、以下を明らかにする：
− 高度に一貫した再現可能な細胞バイオマスの連続生成
− 半連続培養戦略の頑健性（６４日間を超えるプロセス時間を達成）
− 反復バッチ培養と比較して増加した時空収量（植物細胞バイオマス）
− 溶存酸素調節は一定の指数関数的増殖速度を確実にする
− いくつかのプロセスの間の異なる植物懸濁細胞（ニコチアーナ属（Nicotiana）、パイルス属（Pyrus）およびソルブス属（Sorbus）の種）の良好な培養
− 一時的遺伝子発現および異なる抗体の生産のための生成植物細胞の適用の成功
− 実証された無細胞系のためのＢＹ−２植物細胞の適用
− プロセス内の細胞濃度の増加／低下
− 自動化収集手順（「ハンズオン時間」の低減）の実行例

要約すると、本開示は、治療的適用のための分子を生産するために一時的生産プラットホームを用いるための決定的な必要条件として、高度に一貫した再現可能な方法で細胞（バイオマス）を生産する能力を有するプロセスおよび方法に関する。

別の直接的な効果は、本開示のプロセスおよび方法が、高い生存能力のある（指数関数的に増殖する）細胞を提供するのに理想的に適し、（ｉ）高い形質転換効率および（ｉｉ）生産性（生産物収量、酵素活性など）の利点を与えることである。不純物、プロテアーゼおよび他の望ましくない効果を生じ得るアポトーシス細胞または死細胞が、同時並行的に低減される。

本開示のプロセスおよび方法のさらに別の効果は、無細胞系のために構成成分を調製し／導くために用いることができる、高い生存能力があり、一貫した再現可能な細胞を生ずることである。

別の効果は、運転対セットアップ時間比が増加することであり、その利点は生産がより安く、より速くなり、より少ないマンパワーを必要とすることである。これは、誘導可能な発現が用いられ、増殖相と生産相の明らかな分離が可能になる微生物系にとっても主な利点である。

さらに別の効果は、収集時間および収集体積がより柔軟であることである。これは、例えば、パーソナライズされた医薬品を生産するときに予想されるか、または前のサイクルの結果に直接的に応答するときの生産開発サイクルで予想することができる通り、いくつかの小さな生産行動の実行からのより予測可能でない要求に対応するときに有利である。

さらに別の効果は、本開示のプロセスおよび方法がホールドステップを必要としないことであり、すなわち、それは連続発酵戦略（ケモスタット）の利点の多くを提供するが、ホールドステップの間の細胞生存率、生産物安定性および品質に関係する問題点を回避する。この特徴は、それがアイドル時間の低減によってより優れた装置稼働率を可能にするので、下流処理でのかなりのボトルネックを排除する。

本開示の有利な実施形態は、真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための、細胞密度調節細胞培養プロセスに関し、ここで、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、前記プロセスは、
ａ）規定体積の細胞培養で細胞を増殖させるステップ、
ｂ）細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
ｃ）細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
ｄ）所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含むステップ、
ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
ｆ）収集される細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。

用語「規定体積」は、細胞が増殖している細胞培養の規定の開始体積を指す。初期増殖相の後、細胞は発酵容器中の規定体積範囲内で増殖し、細胞培養の体積を調整することは細胞密度を調節する。開始体積として規定される体積は、細胞培養の最小体積と呼ぶこともできる。

本開示のさらなる有利な実施形態は、真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための、細胞密度調節細胞培養プロセスに関し、ここで、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、前記プロセスは、
ａ）可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
ｂ）細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
ｃ）細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
ｄ）所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および／もしくは細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれず、かつ／または収集される分画の体積は容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ、
ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
ｆ）収集される細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。

用語「細胞密度」または「細胞質量密度」は、細胞培養中の単位体積あたりの細胞数（培養培地体積あたりの細胞数、体積あたりの細胞質量（ｇ／Ｌ）、パックされた細胞体積（％）、体積あたりの湿または乾燥細胞重量（ｇ／Ｌ）、培養体積の体積あたりの細胞体積）を指す。細胞密度には、体積あたりの細胞密度、バイオマス密度、細胞体積および濃度または細胞数に関連する任意の他の特性も含まれる。

用語「細胞培養」は、動物または植物のような多細胞生物体からの細胞の培養を指す。本開示により、細胞培養は、真核細胞および液体栄養培地（細胞増殖培地または培養培地）を含む。

本明細書で用いる用語「細胞由来の生産物」は、細胞によって合成される任意の生産物、または細胞によって合成される生産物を用いて培養容器中で作製される生産物を指す。細胞由来の生産物は、細胞構成成分の助けを借りて培養容器で生成される生産物、例えば細胞によって生産される／由来する酵素によって細胞培養に加えられた基質から変換される生産物も含む。細胞由来の生産物は、組換えタンパク質、特に細胞培養培地に分泌されるタンパク質のようなタンパク質を含む（これに限定されない）。細胞由来の生産物には、ウイルスも含まれる。細胞由来の生産物は、細胞に由来する構成成分、例えば、膜、細胞壁、オルガネラ、タンパク質、酵素、核酸、リボソーム、色素、一次および二次代謝産物も含む。さらに、細胞由来の生産物は、細胞抽出物または分画（前述の構成成分の任意の組合せを含有する混合物）も含む。

好ましい実施形態により、細胞培養に含まれる真核細胞は、天然（例えば野生型）であるか、または第２の培養ステップを実施する前に、好ましくは機能的プロモーターに作動可能に連結している少なくとも１つの異種核酸配列を含む少なくとも１つの発現ベクターで形質転換される、非トランスジェニック細胞であり、前記少なくとも１つの異種核酸配列は、蓄積され、収集される所望の細胞由来の生産物をコードする。

培養されて生産される真核細胞には、ヒト、動植物の細胞、特に植物懸濁細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が含まれる。植物細胞の例は、タバコ（Nicotiana tabacum）（例えばＢＹ−２、ＮＴ１など）、ニンジン（Daucus carota）、イチイ属の種（Taxus sp.）、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）、トウモロコシ（Zea mays）、ダイズ（Glycine max）、ニコチアーナ・ベンタミアーナ（Nicotiana benthamiana）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、セイヨウナシ（Pyrus communis）、ソルブス・トルミナリス（Sorbus torminalis）からの細胞である。昆虫細胞の例は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１またはイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）からの細胞である。哺乳動物細胞の例は、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＥＢ６６、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）細胞またはＰＥＲ．Ｃ６、Ｈｅｐ Ｇ２のようなヒト細胞である。

一部の有利な実施形態では、細胞培養は、例えば事前に、および培養／発酵容器の外で調製されるスターター培養として培養容器に加えられる。

本明細書で用いるように、「スターター培養」は発酵を実際に実行する微生物培養である。これらのスターターは、発酵／培養のために用いられる真核細胞がよく定着している培養培地から通常なる。

本開示の一実施形態では、半連続培養プロセスが以下のように操作される：
・ ７Ｌバイオリアクター内での１．５Ｌ培地（最小体積）の接種
・ ０．１バールの過度の圧力、制御されないｐＨ、５００ｍＬ／分の一定空気供給、２６℃の制御された温度および３０％溶存酸素（撹拌機速度を１００〜３００ｒｐｍに調節することによって制御される）による培養
・ 培養される細胞（ＢＹ−２細胞を４日間）に依存する初期バッチ相
・ バイオマス濃度（例えば１００ｇ／ＬのＢＹ−２細胞）を調節するコントロールループの開始
・ 新鮮で無菌の培地の供給（無菌培地で貯蔵槽を補充することによる培地の供給）による、増加するリアクター体積にカップリングされた細胞の連続増殖
・ 最大充填体積に到達するときに必要な収集、自動化されている
・ 最小から最大の体積の範囲内の、可能な様々な懸濁液体積の時間非依存的収集。

前述の通り、本開示のプロセスは、発酵／培養プロセスの間に細胞密度を制御するための新規の方法からなる。これは、発酵ブロスの体積を変更することによってバイオマスを調整することによって達成される。一部の有利な実施形態では、密度センサーがバイオマス（インプットシグナル）を連続的に測定するコントロールループが用いられ、コントローラは、例えばポンプが培地貯蔵槽から発酵容器に適当な体積を加えることを誘発するアウトプットシグナルを生成する。適当な体積を加えることによって、細胞密度は経時的に一定に保たれる（あるいは、細胞密度についての時間依存関数を規定し、それに応じて制御することができる）。これを行うことによって、細胞は増殖相に継続的に保たれる。発酵槽は、最小から最大の充填レベルの間で操作される。引き抜く体積は、ある特定の範囲の中で変動してもよい。範囲は、発酵槽で保持されなければならない最小体積および容器の最大充填体積によって規定される。最大充填レベルに到達するならば、発酵ブロスを抜き取らなければならない。あるいは、コントロールループは、すなわちより高い細胞密度を得るように変更することができる。異なる時間に収集することができる発酵ブロスは、高度に一貫し、再現可能である。

有利な実施形態の第１のステップでは、可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させたが、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない。特に、細胞培養体積は、プロセス時間にわたってかなり変化する。これはオペレーターによって実施される恣意的な収集によるものであるが、培養培地の添加は細胞密度によって調節される。収集されない期間は、細胞培養体積は増加する。収集時には、細胞培養体積は、規定体積範囲内ではあるが自由裁量によって減少する（すなわちオペレーターによって選択される）。体積範囲は、実際の培養体積から最小培養体積を引いた体積以下であると規定される。

これは、特に細胞培養体積が「連続的に一定に」保たれるプロセスと、もしくは例えばケモスタットおよびタービドスタットプロセスで実行されるように「連続的に事実上一定に」保たれるプロセスと特に、または収集される細胞培養が「直ちに補充される」プロセスと対照的である。

本発明の文脈内で、「一定」、特に「事実上一定」は、短期変動が観察されること、および長期ウィンドウでの平均値が実験的限界の範囲内で所望の値に維持されることを意味する。より正確には、短期は１０分未満の時間を意味し、長期ウィンドウは３０分を超える時間を指す。さらに、「連続的に一定」、特に「連続的に事実上一定」は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、より好ましくは４８時間、最も好ましくは少なくとも７２時間の時間を指す。

第２のステップでは、細胞培養中の細胞密度は密度センサーで測定される。有利な実施形態では、細胞密度は密度センサーによって測定され、それにより、密度センサーは、濁度測定、レーザー散乱測定、ＮＩＲ測定もしくは他の分光器測定、または容量測定に基づくセンサー、または細胞カウンターのようなライン系にあるセンサーまたは細胞密度を測定し、フィードバックコントロールを可能にする任意の他の方法からなる群から選択される。一部の実施形態では、密度センサーは、細胞培養中の細胞密度を連続的に測定する。

第３のステップでは、細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節する。前のＭ期の終わりからＤＮＡ合成の開始までの中間期の中の第１期と規定される「増殖相」は、Ｇ１（Ｇはギャップを示す）と呼ばれる。この期の間に、Ｍ期にかなり減速される細胞の生合成活動は、高速で再開する。同じ種の異なる細胞の間でさえ、Ｇ１の持続期間はかなり変動する。この期には、細胞はタンパク質の供給を増加させ、オルガネラ（ミトコンドリア、リボソームなど）の数を増加させ、サイズが増大する。

さらなる実施形態では、少なくとも１つの栄養培地貯蔵槽から適当な体積の栄養培地が培養容器中の細胞培養に移される。

一部の有利な実施形態では、細胞密度（インプットシグナル）を連続測定している密度センサーを含むコントロールループ、および細胞培養に適当な体積の栄養培地を加えるためにポンプまたはバルブを始動させるアウトプットシグナルを生成するコントローラを用いて、細胞密度は調節される。

一部の実施形態では、ポンプを用いることにより適当な体積が培地貯蔵槽から発酵容器に加えられるか、またはそれは重力もしくは加圧によって送られ、バルブを通して制御される。

さらなる実施形態では、細胞培養中の細胞密度は、経時的に一定であるように、または細胞密度についての、特定の時間依存関数（a specific time-dependent function）となるように調節される。さらに、培養容器は、最小および最大の細胞培養充填レベルの間で操作することができる。

第４のステップでは、所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集することができ、収集される分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は連続的に一定に保たれず、特に、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって事実上一定に保たれない。

前述の通り、細胞培養体積は、プロセス時間にわたってかなり変化する。これはオペレーターによって実施される恣意的な収集によるものであるが、培養培地の添加は細胞密度によって調節される。収集されない期間は、細胞培養体積は増加する。収集時には、細胞培養体積は、規定体積範囲内ではあるが自由裁量によって減少する（すなわちオペレーターによって選択される）。体積範囲は、実際の培養体積から最小培養体積を引いた体積以下であると規定される。これは、特に細胞培養体積が、例えばケモスタットおよびタービドスタットプロセスで実行されるように「連続的に事実上一定に」保たれるプロセスと、または収集される細胞培養が「直ちに補充される」プロセスと対照的である。本発明の文脈の範囲内で、「事実上一定」は、短期変動が観察されること、および長期ウィンドウでの平均値が実験限界の範囲内で所望の値に維持されることを意味する。より正確には、短期は１０分未満の時間を意味し、長期ウィンドウは３０分を超える時間を指す。さらに、「連続的に事実上一定」は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、より好ましくは４８時間、最も好ましくは少なくとも７２時間の時間を指す。

第４のステップでは、所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集することができ、収集される分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は連続的に一定に保たれず、特に、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって事実上一定に保たれず、ならびに／または収集される分画の体積は、容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない。

用語「直ちに補充される」は、同程度の量の新鮮な培地を容器に加えることによる、収集された細胞培養の置き換えを指す。本開示の文脈内で、同程度の量の新鮮な培地は、収集された細胞培養の２５％の増減の体積と同じ体積であると規定される。さらに、「直ちに」は、１２時間未満、好ましくは６時間未満、より好ましくは３時間未満の時間を指す。「直ちに」は、「すぐに」または「連続して」に置き換えることもできる。

収集することができる細胞培養の分画は、ある特定の限界の範囲内である。収集の後、残りの体積はプロセスをサポートするのに十分でなければならず、すなわちある特定の最小体積の細胞培養が常に培養容器に残っていなければならない。この最小体積は、容器、バイオマスセンサー、撹拌機などを含むいくつかのものに依存する。しかし、任意の所定の時間に、発酵培養の現在体積から培養容器に残っていなければならない最小体積を引いた体積の任意の体積分画を収集することができる。

前述の通り、本開示によるプロセスおよび方法は、以降の下流処理のためにホールドステップを必要とせずに高度に再現可能な発酵ブロスを柔軟に提供するために用いることができる。収集時点の柔軟性は、下流インフラストラクチャ（単位操作）およびスタッフのより高い稼働率を可能にする。これらの特定の特徴は、下流処理で起こる遅れを補償するために用いることができる。バイオ医薬品の生産のためのバッチおよび流加プロセスについては、非迅速性は仕様書からの逸脱をもたらし、したがって同時の甚大な経済損失を伴うバッチ拒絶につながるので、収集時の迅速性を確実にするために、下流処理でのアイドル時間が受け入れられなければならない。対照的に、本開示によるプロセスおよび方法は、培養容器からの適当な体積分画の除去によって収集時点の延期を可能にする。全体の生産プロセスの一部だけが無駄になるので、生じる経済損失はずっと小さい。

一部の実施形態では、培養体積を増加させるために複数の培養容器が連結される。培養を中止する必要なしに容器をセットから取り出してそれらを洗浄し（壁増殖、フィルターなど）、それらを再構成する（壊れたパーツの交換、センサーの再調整）ことができるので、このことはプロセスをより長く実行することも可能にするだろう。全ての容器が同じ培養を含有することを確実にするために、連結した容器の間で培養を交換し（例えば「ポンプで送る」）、混ぜる必要がある。有利な実施形態では、（ｉ）培養体積を増加させるために少なくとも１つの追加の培養容器が第１の培養容器に連結され、（ｉｉ）連結した各培養容器中の細胞密度は同じであり、（ｉｉｉ）培養容器の間で細胞培養は交換される。別の実施形態では、培養体積を減少させるために２つ以上の連結した培養容器のセットから培養容器を取り除くことができた。

さらなる実施形態では、真核細胞はマイクロキャリアの存在下で培養される。マイクロキャリアは、培養容器のようなバイオリアクターでの接着細胞の増殖を可能にする支持マトリックスである。デキストランベース（Ｃｙｔｏｄｅｘ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、コラーゲンベース（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ、Ｐｅｒｃｅｌｌ）、マクロポーラスのゼラチンコートのマイクロキャリアビーズ（Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）、Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ ＡＢ）、およびポリスチレンベース（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のマイクロキャリアを含め、数種類のマイクロキャリアが市販されている。それらは、それらの空隙率、比重、光学特性、動物成分の存在および表面化学が異なる。そこで、新しい培地として「空の」（すなわち無細胞の）マイクロキャリアが同様の方法で提供され、すなわち細胞培養へのそれらの添加は細胞密度を通して調節される。マイクロキャリアは、新鮮な栄養培地貯蔵槽と一緒に懸濁液として、または別の貯蔵槽から供給することができる。

さらなる実施形態では、任意選択で収集される細胞および／または細胞由来の生産物はさらに処理される。第１のステップでは、細胞は、遠心分離、濾過／真空濾過または沈降によって、収集された細胞培養分画から単離することができる。単離細胞は、いずれかの一時的発現系のためにさらに用いることができる。植物細胞培養の場合には、細胞は、国際公開第２０１３／１１３５０４号パンフレットに記載される一時的生産プロセスのために用いることができる。哺乳動物細胞の培養の場合には、細胞は、一時的発現のために用いることができる。哺乳動物細胞のための遺伝子送達は、ウイルス（Douglas 2008 Biotechnol Prog）、または無機化合物（例えばリン酸カルシウムＣａＰｉ（Jordan and Wurm 2004 Methods））もしくはカチオン性ポリマー（例えばポリエチレンイミンＰＥＩ（Baldi, Hacker et al. 2012 Protein Expression in Mammalian Cells））もしくはカチオン性脂質（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、ＦｕＧＥＮＥ、２９３ｆｅｃｔｉｎ）のような化学薬剤、またはマイクロインジェクションもしくはエレクトロポレーション（Pham, Kamen et al. 2006 Mol Biotechnol）のような機械的方法のいずれかによって実行することができる。

一部の実施形態では、収集された細胞培養分画中の細胞由来の生産物および細胞は、遠心分離および／または濾過および／または沈降によって分離することができる。一度細胞培養上清が細胞から単離されると、上清および生産物は生産物の限局化によってさらに処理される。細胞由来の生産物が分泌される場合は、生産物は、例えばクロマトグラフィーまたは沈殿方法を用いて培養上清から精製することができる。細胞由来の生産物が細胞内である場合は、例えば超音波で、またはブレンダーもしくはボールミルの助けを借りて細胞をホモジナイズすることによって、生産物を細胞から抽出しなければならない。その後、濾過または遠心分離によって細胞断片を細胞抽出物から除去することができ、細胞抽出物をさらに続けて処理することができる。細胞抽出物は、それ自体生産物として用いることができる。または、生産物は、例えばクロマトグラフィーまたは沈殿方法を用いて細胞抽出物から精製することができる。

さらなる実施形態では、本開示によるプロセスは、培地が添加されず、細胞培養の分画が収集されない、所望の細胞密度に到達するための少なくとも１つの増殖相と、続いて細胞密度が事実上一定に保たれる少なくとも１つの連続相を含む。

別の実施形態では、本開示によるプロセスは、培地が添加されず、細胞培養の分画が収集されない、所望の細胞密度に到達するための初期増殖相と、続いて、細胞密度が事実上一定に保たれるいくつかの、すなわち２つ以上の連続相であって、より高い細胞密度に到達するための別の増殖相か、またはより低い細胞密度に到達するための希釈相のいずれかによって分離される連続相を含む。

別の実施形態では、本開示によるプロセスは、細胞密度が一定に保たれ、４８時間を超える、好ましくは９６時間を超える、より好ましくは１４４時間を超える、最も好ましくは１６８時間を超える持続期間を有し、２つ以上の収集ステップが実施される連続相を含む。

前述の通り、本開示によるプロセスは、いくつかの用途のための優れた細胞を提供する。例えば、生産される細胞は、分析アッセイ（例えば薬物または他の化合物の代謝）、遺伝子発現の誘導（例えば肝細胞でのＰ４５０、リポーター遺伝子、またはその細胞組合せの任意の種類のさらなる培養）のために用いることができる。

有利な実施形態では、本開示によるプロセスおよび方法は、一時的生産のための宿主細胞としてその後用いられる細胞を提供する。このことは、目的の分子（生産物）を生産するために、これらの細胞がその後適当な手段によってトランスフェクト／形質転換され、インキュベートされることを意味する。細胞懸濁液（動物および植物両方の細胞）を利用する一時的生産プラットホームのために、これはきわめて重要である。

有利な実施形態では、本開示は、安定した細胞株を生成するための方法であって、
ｉ）本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）収集される細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法に関する。

有利な実施形態では、本開示は、例えばＣＨＯ細胞のＭＴＸで遺伝子増幅を実行するための方法であって、
ｉ）トランスフェクトされた細胞を本開示のプロセスで培養するステップ、
ｉｉ）情報増幅を増加させる例えばＭＴＸ濃度の段階的増加のステップ
を含む方法に関する。

本明細書で用いる用語「形質転換」、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、生産された真核細胞（宿主細胞）への、任意の核酸または核酸類似体の送達に関連する。形質転換の後、核酸を宿主細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。

あるいは、送達される核酸はゲノムに組み込まれなくてもよく、サイトゾルまたは核または任意の細胞オルガネラのいずれかでその効果を発揮することができる。核酸は、ウイロイド、ウイルスもしくは解体されたウイルスなどの自己複製エレメントであってもよく、または１つを超えるウイルスからの必要なエレメントの組合せであってもよい。あるいは、送達される核酸は、ウイロイド、ウイルスまたは解体されたウイルスなどの自己複製エレメントの構成成分だけであってもよい。他の構成成分は、宿主細胞またはトランスジェニック宿主細胞によって提供／補充されてもよい。

一部の実施形態では、核酸はベクターに、特に発現ベクターに含まれる。「ベクター」には、とりわけ、自己伝染性または移行性であってもなくてもよく、原核または真核生物の宿主を形質転換することができて染色体外に存在する、二本鎖または一本鎖の線状または環状の任意のプラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスのベクターが含まれると規定される（例えば複製起点を有する自己複製プラスミド）。

「発現ベクター」は、核酸が、微生物または植物細胞などの宿主細胞での転写のための適当なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、それに作動可能に連結しているベクターを指す。ベクターは、複数の宿主で機能する二機能的発現ベクターであってもよい。ゲノムまたはサブゲノムのＤＮＡの場合、これはそれ自身のプロモーターまたは他の調節エレメントを含有することができ、ｃＤＮＡの場合は、これは宿主細胞での発現のための適当なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあってもよい。「作動可能に連結する」は、同じ核酸分子の一部として連結し、転写がプロモーターから開始されるように好適に配置および配向されることを意味する。

有利な実施形態では、本開示のプロセスで生産される細胞は植物細胞であり、培地が取り除かれた、多孔構造の、組織ではない多層細胞パックの形態の植物細胞材料の生成のために、および前記細胞パックの以降の維持のために用いることができる（国際公開第２０１３／１１３５０４号パンフレットに記載される）。

したがって、本開示は、培地が取り除かれた、多孔構造の、組織ではない多層細胞パックの形態の植物細胞材料の生成のための、および前記細胞パックの以降の維持のための方法であって、
（ｉ）植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、細胞は本開示による培養方法によって培養され、細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、１ｃｍ^３あたり０．１から０．９ｇの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
（ｉｉ）前記の培地を取り除いた多孔構造の細胞パックを５０〜１００％の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法にも関する。

特に、本開示による方法の有利な実施形態は、（ｉ）均質な植物バイオマスの供給のための、植物細胞懸濁液が本開示の培養プロセスにより培養される第１の培養ステップ、（ｉｉ）１ｃｍ^３あたり０．１〜０．９、好ましくは０．２〜０．８５、最も好ましくは０．４〜０．８ｇの湿細胞重量の密度を有する多孔性細胞パックが生成されるような方法で液体培地が植物細胞から分離される分離ステップ、および（ｉｉｉ）少なくともさらに１日、制御された条件（上を参照する）の下の非液状環境で細胞パックがさらにインキュベートされる第２の培養ステップを含む。実際の状況および実務者の意図によっては、この第２の培養ステップを数日間実施することができる。一般的に、第２の培養ステップは、２〜７日間、好ましくは３〜５日間実施される。

別の実施形態では、本開示のプロセスおよび方法は、組換えタンパク質などの目的の分子（細胞または細胞バイオマスとは対照的に）を生産するために用いられる。この実施形態では、開示はより高い品質のより均質な生産物を潜在的に提供し、現在確立されている発酵戦略と比較して多分より高い収率でもある。

本開示の別の実施形態は、トランスジェニック細胞により組換えタンパク質または細胞由来の生産物を生産する新しいプロセスの使用であって、
ｉ）本開示のプロセスによってトランスジェニック細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）培養上清からの細胞の分離のステップ、
ｉｉｉ）培養上清（分泌タンパク質）を処理するステップ、または
ｉｖ）細胞からの目的の分子の抽出のステップ
を含む使用である。

細胞由来の生産物が分泌される場合は、生産物は、例えばクロマトグラフィーまたは沈殿方法を用いて培養上清から精製することができる。細胞由来の生産物が細胞内である場合は、例えば超音波で、またはブレンダーもしくはボールミルの助けを借りて細胞をホモジナイズすることによって、生産物を細胞から抽出しなければならない。その後、濾過または遠心分離によって細胞断片を細胞抽出物から除去することができ、細胞抽出物をさらに続けて処理することができる。細胞抽出物は、それ自体生産物として用いることができる。または、生産物は、例えばクロマトグラフィーまたは沈殿方法を用いて細胞抽出物から精製することができる。

本開示の別の実施形態は、無細胞系のための構成成分の生産のために高度に同等で再現可能な細胞を生産することである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物（溶解物）の生産のためには、大量の均質な出発材料／細胞の必要性がある。生じる溶解物の最適な生産性を確実にするために、細胞は、指数関数的増殖相になければならない。さらに、収集時点の細胞密度は、重大な役割を演ずる。従来、細胞培養は所望の細胞密度までバッチモードで増殖させ、収集され、直ちに処理される。大きな発酵プロセスでは増殖速度が変動して特定の収集時点の正確な予測を不可能にするので、これは時間に関して高い柔軟性を必要とする。さらに、培養プロセスへの細胞の最適な適応は、バッチモードでは保証することができない。高活性溶解物への細胞材料の処理は、別の重要な因子である。植物をベースとした無細胞溶解物の生産のための確立されたプロトコールは、しばしば時間がかかり、費用集約的である。

したがって、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物の調製のための方法であって、
ｉ）本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）収集される細胞を、使用する抽出処理にかけることによって培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法に関する。

前述の通り、有利な実施形態では、収集される細胞は指数関数的増殖相にある。

さらなる実施形態では、抽出処理は酵素処理であるかまたはそれを含む。溶解物への細胞材料の処理の間に、従来の酵素を、本来食品産業のために設計された液状セルラーゼおよびペクチナーゼと置き換えることによって、プロトプラステーションのための費用を、百倍を超えて低減することができることを発明者らは発見した。同じく、時間単位あたりのプロトプラステーションの改善も観察された。これらの酵素調製物の使用は、通常の市場価格での植物ベースの溶解物の商業生産を可能にする。

改変された緩衝液、洗浄および遠心分離ステップ、ならびに連続の代わりの不連続なパーコール勾配の使用のような、Komoda et al. （Komoda, Naito et al. 2004 Proc Natl Acad Sci U S A）によって記載されるプロトコールへのさらなる改変は、より速い生産ならびにより容易なスケーラビリティにつながった。プロトプラストの空胞化の代わりの記載方法は、Sonobe et al.（Sonobe 1996 J. Plant Res.）によって記載された。Gursinsky et al.（Gursinsky, Schulz et al. 2009 Virology）は、最終溶解物のＳ７−ヌクレアーゼによる内生植物ｍＲＮＡの追加の消化によって、高度に改善された翻訳活性を示す。

さらに、収集された細胞培養分画に含まれる細胞は、以降の発酵プロセスを接種するために用いることもできる。

要約すると、本開示のプロセスによる培養、収集された細胞は、以降の培養ステップを実施するために用いることができ、それによって、（ｉ）細胞はトランスフェクト／形質転換され、（ｉｉ）遺伝子発現はインデューサーの添加によって誘導され、（ｉｉｉ）細胞は感染させられ、（ＩＶ）細胞由来の生産物の蓄積を有利にする条件下で細胞は培養され、（ｉｖ）核酸は細胞にトランスフェクトされ、（ｖ）および／または、細胞は分析アッセイのために用いられる。

前述のように、本開示は、真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための、細胞密度調節細胞培養プロセスに関し、ここで、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、前記プロセスは、
ａ）規定体積の細胞培養で細胞を増殖させるステップ、
ｂ）細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
ｃ）細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
ｄ）所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含むステップ、
ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
ｆ）収集される細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含み、
− 真核細胞は、植物懸濁細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択することができ、ならびに／または
− 細胞由来の生産物は、一次もしくは二次性の代謝産物、もしくは酵素、抗体、抗体断片、ワクチン、サイトカイン、ホルモン、ペプチドもしくはウイルスもしくはウイルス様粒子もしくは核酸のような組換えタンパク質であってもよく、ならびに／または
− 細胞培養はスターター培養として培養容器に加えることができ、ならびに／または
− 密度センサーは、濁度測定、レーザー散乱測定、ＮＩＲ測定もしくは容量測定に基づくセンサー、もしくは細胞カウンターのようなライン系にあるセンサー、もしくは細胞密度を測定し、フィードバックコントロールを可能にする任意の他の方法からなる群から選択することができ、ならびに／または
− 細胞培養中の細胞密度は連続的に測定することができ、ならびに／または
− 少なくとも１つの栄養培地貯蔵槽から適当な体積の栄養培地を培養容器中の細胞培養に移すことができ、ならびに／または
− 細胞密度は、細胞密度（インプットシグナル）を連続測定しているセンサーを含むコントロールループ、およびポンプもしくはバルブを始動させるアウトプットシグナルを生成するかもしくは細胞培養に適当な体積の栄養培地を加えるコントローラを用いて調節することができ、ならびに／または
− 細胞培養中の細胞密度は、経時的に一定であるように、もしくは細胞密度についての、特定の時間依存関数となるように調節することができ、ならびに／または
− 培養容器は、最小および最大の細胞培養充填レベルの間で操作することができ、ならびに／または
− 発酵培養の、最小／最大範囲内の任意の体積分画を培養容器から収集することができ、ならびに／または
− 細胞が指数関数的増殖相にあるとき、細胞培養の分画を収集することができ、ならびに／または
− （ｉ）培養体積を増加させるために少なくとも１つの追加の培養容器を第１の培養容器に連結することができ、（ｉｉ）連結した各培養容器中の細胞密度は同じであってもよく、（ｉｉｉ）培養容器の間で細胞培養を交換することができ、ならびに／または
− 細胞はマイクロキャリアの存在下で培養することができ、ならびに／または
− 細胞は収集された細胞培養分画から単離することができ、ならびに／または
− 収集された細胞培養分画中の細胞由来の生産物および細胞は、遠心分離および／もしくは濾過および／もしくは沈降によって分離することができ、ならびに／または
− 収集された細胞培養分画に含まれる細胞は、以降の発酵プロセスを接種するために用いることができ、ならびに／または
− 収集された細胞は以降の培養ステップを実施するために用いることができ、それによって、（ｉ）細胞はトランスフェクト／形質転換され、（ｉｉ）遺伝子発現はインデューサーの添加によって誘導され、（ｉｉｉ）細胞は感染させられ、（ＩＶ）細胞由来の生産物の蓄積を有利にする条件下で細胞は培養され、（ｉｖ）核酸は細胞にトランスフェクトされ、（ｖ）および／もしくは細胞は分析アッセイのために用いられ、ならびに／または、
− 細胞は無細胞抽出物を調製するために用いることができる。

さらに、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物の調製のための方法であって、
ｉ）前記プロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）収集された細胞を、使用する抽出処理にかけることによって培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法に関し、ここで
− 収集された細胞は指数関数的増殖相にあってもよく、ならびに／または
− 抽出処理は酵素処理を含むことができ、ならびに／または
− 酵素処理はセルロースおよびペクチナーゼ処理を含むことができ、ならびに／または
− 無細胞抽出物を調製するためにその上清を得るために細胞溶解物を遠心分離することができる。

さらに、本開示は、安定した細胞株を生成するための方法であって、
ｉ）前記プロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ｉｉ）収集された細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法に関する。

さらに、本開示は、培地が取り除かれた、多孔構造の、組織ではない多層細胞パックの形態の植物細胞材料の生成のための、および前記細胞パックの以降の維持のための方法であって、
（ｉ）植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法によって細胞が培養され、細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、１ｃｍ^３あたり０．１から０．９ｇの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
（ｉｉ）前記の、培地が取り除かれた、多孔構造の細胞パックを５０〜１００％の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法に関する。

図９、１０および１１は異なる発酵プロセスを示しており、これによって諸プロセスが、培養体積、細胞密度、供給速度および収集速度を比較することによって区別され得る。前述の図では、細胞密度は、培養中の１ｍＬあたりの細胞数またはその数に変換もしくは関連付けることができるパラメータと規定され、培養体積は、バイオリアクター中の発酵ブロスの体積と規定され、供給体積はプロセスの間にバイオリアクターに加えられる培地の累積体積と規定され、収集体積はプロセスの間にバイオリアクターから除去される発酵ブロスの累積体積と規定され、供給速度は時間単位あたりのバイオリアクターに加えられた培地の体積（例えばｍＬ／分）と規定され、収集速度は時間単位（例えばｍＬ／分）あたりのバイオリアクターから除去された発酵ブロスの体積と規定され、希釈速度は、ケモスタット／タービドスタットの供給速度および収集速度に等しい。

有利な実施形態では、本開示によるプロセスは７Ｌ容器で実行され、例えば製造業者によって明記されるように、センサーおよびインペラーの構成は、最小体積が１Ｌであり、最大体積が６Ｌであることを必要とし、培養される細胞は２４時間の倍加時間を有する。

第１の例では、実際の体積（「充填レベル」）は４Ｌである。例えばケモスタット／タービドスタットプロセスで必要であるように、長時間にわたってそれを収集する（これは収集またはホールドステップとも呼ばれる）必要性なしで、オペレーターは例えば３Ｌを一度に収集し、収集物全体を処理することができる。

あるいは、オペレーターは、例えば細胞培養の細胞生存率もしくは他のパラメータを測定するか、または小規模の実験を実施するために１００ｍＬを収集し、次にさらなる処理のためにその後２．９Ｌを収集すると決定することもできる。

第２の例では、充填レベルは６Ｌである。オペレーターは３Ｌを収集し、例えば以降の一時的遺伝子発現実験のために細胞を用いる。翌日の午前中に、培養の増殖および新鮮な培地の比例した添加のために、実際の体積は例えば５Ｌに到達した。オペレーターは次に３Ｌを再び収集し、同じ実験を実施することができ、培養から収集される細胞が同じ特性（例えば、細胞密度、生存率およびトランスフェクション効率などの他の性能特性）を有すると確信することができる。これは、バッチまたは流加プロセスから収集される細胞と対照的である。夕方には、実際の体積は例えば２．６Ｌであり、オペレーターは１Ｌを収集し、培養から収集される細胞が同じ特性を有すると再び確信することができる。

第３の例では、実際の体積は４Ｌであり、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のために用いられる無細胞抽出物の生成のために用いられる。この日、数人の研究者がそのような実験を実施することを決めたが、それらの誰も事前計画を立てておらず、細胞培養ユニットに細胞を注文していない。９：３０に第１の研究者は１Ｌの発酵ブロスを収集し、第２の研究者はわずか１０分後にもう２Ｌを収集する。同時に、第３の研究者はわずかもう２５０ｍＬを要求するが、実際の培養体積が１．２５Ｌに到達するまで少し待つ必要がある。

培養体積が最大体積に到達すると、発酵ブロスを自動的にまたは手動で除去する必要がある。再び、除去する体積は、最大体積から最小体積を引いた体積の範囲内であれば自由に選択することができる。将来、例えば午後、翌日または週末後にプロセスが所望体積の培養ブロスを産出するように収集体積を選択することができることは、本発明に特有の特徴である。再び、収集される発酵ブロスは、高度に再現可能である。

これらの例は、柔軟な収集を可能にすることによって、および前の収集（使用または廃棄することができる）の故意の配置を通じて収集時点のタイミングを調整する可能性をオペレーターに与えることによって、作業の流れを最適化することができることを明らかに示す。それによって、本発明によるプロセスは以降のステップに容易に適合させることができ、それはより高い全体的柔軟性および頑健性をもたらす。これは、生産設備のより優れた使用法を可能にする。

以下の実施例は、限定するものとみなされることなしに、本発明をさらに例示するために与えられる。

方法および実施例
以下の実施例では、本開示の材料および方法が提供される。これらの実施例は例示だけが目的であり、この開示を限定するものと決して解釈されるべきでないことを理解すべきである。本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにここに参照により完全に組み込まれる。

１．）７Ｌ撹拌タンクバイオリアクターでのＢＹ−２植物懸濁細胞の培養
培養は、高圧滅菌可能な７Ｌ撹拌タンクバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）内で２６℃で実行した。バイオリアクターは、１．５Ｌの最小体積の改変ＭＳ培地（ムラシゲおよびスクーグ、１９６２；ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２００ｍｇ／Ｌ、ＨＣｌ−チアミン１ｍｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．２ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ）で充填し、６日前培養のＢＹ−２細胞で接種した。発泡および壁増殖を制御するために、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ−６１（ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）を０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で加えた。ｅｚ−コントロール（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）を用いて発酵を制御し、ＢｉｏＸｐｅｒｔ ＸＰを用いてオンラインデータを収集した。リアクターは、０．５Ｌ／分の一定の流量で曝気した。撹拌速度を調節することによって、溶存酸素濃度（ｄＯ_２）を３０％の飽和に制御した。ｐＨは監視したが、制御しなかった。Ｆｕｔｕｒａ ＲＦＩＳシステム（Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ、ＵＫ）を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極（１２×１２０ｃｍ）および分極補正により０．６ＭＨｚの細胞培養モードで動作している標準のリモートＦｕｔｕｒａ機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Ｆｕｔｕｒａソフトウェアで制御した。このバイオリアクターの最小作業体積は１．５Ｌであり、それは、正しい測定を確実にするために全てのセンサーが細胞培養と適切に接触すること、および十分な混合を有することが要求された。最大作業体積は、５．５Ｌであった。収集は、手動または自動収集方法のいずれかで実施した。したがって、外部ポンプのスイッチを入れるために、５．５Ｌの充填体積に固定されたレベルセンサーのアウトプットシグナルを用いた。レベルセンサーのアウトプットシグナルを記録するために、および外部ポンプを発酵レシピ内のプログラム相でリモートコントロールするために、ＢｉｏＥｘｐｅｒｔを用いた。プログラム相は、ポンプの運転時間に基づいて収集体積を規定した。リアクターが無人のとき（すなわち週末中）、収集チューブを外部ポンプに連結した。充填体積が５．５Ｌに到達し、したがってレベルプローブに接触したときはいつでも、外部ポンプの開始シグナルが生成された。その実験では、１Ｌの規定体積の懸濁液がリアクターから汲み出された。このコントロールループは、発酵の定期的監視の必要性を回避するための、およびそれが無人のときにリアクターのオーバーフローを防止するための安全性尺度の役目を果たした。

接種および初期ラグ相の後、細胞は指数関数的増殖相に入った。指数関数的増殖相の０．０２９ｈ^−１の比増殖速度で、１１６時間の培養の後に懸濁液は新鮮重量１Ｌあたり１００ｇのバイオマス濃度に到達した。誘電率測定のプロセス値を、セットポイントとして固定した。培養プロセスではさらに、実際のプロセス値を５秒間隔の対応する誘電率セットポイントと比較した。オフライン測定新鮮重量が１００ｇ／Ｌ未満であったので、この連続増殖相の初めに、誘電率セットポイントは異なる時点で調整された。プロセスコントロールのためにＰＩＤ（比例積分微分）コントローラを用い、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換するアクチュエータとしてポンプを用いた。この場合、アクチュエータアウトプットは、培地添加のために用いられたプロセス値、ＰＩＤ設定およびチュービングのオフセットに基づいてバイオリアクターに加えられた新鮮培地のある特定の体積であった。バイオリアクターへのタンクからの新鮮培地の添加は、発酵ブロスの希釈および誘電率の低下をもたらし、このようにプロセス値をセットポイントに調整した。初期バッチ相が遮断された後、バイオマスコントロールを開始することによって、培養およびバイオマス生産はさらに６４日間続き、合計８８Ｌの懸濁液および８．８ｋｇの細胞を産出した。１２００時間の培養の間、プロセスは、異なる間隔の異なる時点で様々な体積（０．０１Ｌ〜４．０Ｌ）を収集することを可能にした（合計３６収集物）。オンラインデータの収集は１２００時間のプロセス時間の後に遮断されたので、図２および表１はこの期間のデータだけを提示する。

図２は、新規培養戦略によるタバコＢＹ−２細胞の培養を示す。Ａ：培養プロセスの間の酸素濃度、撹拌機速度および記録された収集（黒塗り四角）の経過。Ｂ：伝導率、ｐＨおよび誘電率（バイオマス濃度）のプロセス値の進行。Ｃ：連続プロセス相の間の培地添加の経過。供給体積は、培地添加のオンラインデータおよびオフライン記録収集物の収集体積を表す。

表１は、発酵プロセスの間の異なる時間での異なる様々な収集体積およびプロセス全体の間の累積収集体積を示す。例えば、４３０．１時間時に０．６Ｌの体積が収集され（表１、収集番号１１）、７９３．２時間時に３．２Ｌの体積が収集された（表１、収集番号２４）。

２つの連続収集時点の間の最短時間は３．６時間であり（表１、収集番号３０〜３１）、２つの収集時点の間の最長時間は７３．７時間（表１、収集番号３１〜３２）であった。３１０．４時間から３３４時間の発酵時間の間で、異なる体積による３つの個別の収集が実行された（表１；収集番号７〜９）。これは、収集体積および収集時間の間隔が高度に柔軟であり、したがって、オンデマンドでの収集を可能にすることを明らかに実証する。

生産相の間に、細胞は、指数関数的増殖相の間に判定された０．０２９ｈ^−１の同じ比増殖速度で指数関数的に増殖していた。さらに、ｄＯ_２、ｐＨ、伝導率および誘電率のオンラインシグナルは、プロセス全体でコントロールループを開始した後に一定であり、このように、プロセスの頑健性を実証した。特に、誘電率は、オンラインシグナルを考慮して一定であっただけでなく、パックした細胞体積（ＰＣＶ）、乾燥重量および新鮮重量のオフラインパラメータを判定することによってオフラインで測定された実際のバイオマス濃度に関しても一定であった。オンラインおよびオフラインのパラメータの比較は、両方法の間での優れた一致を示した（図３）。

２．）植物細胞での一時的発現による生産およびスクリーニング
タバコＢＹ ２植物細胞パック（ＰＣＰ）を用いた発現構築物のハイスループットスクリーニングのために新たに開発された手法（国際公開第２０１３／１１３５０４号パンフレット）を、標準の葉のアグロインフィルトレーションと比較した。新規培養戦略で培養したタバコＢＹ−２細胞を９６ウェル受けプレートに移し、真空を加えることによって約２００ｍｇの新鮮重量の９６ウェルＰＣＰを同時に生成した。ＯＤ_６００＝０．１の２００ｍＬのＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株ＧＶ３１０１懸濁液を加えることによって、ＰＣＰにトランスフェクトした。３つの抗体のうちの１つのための発現構築物を各々有する３つの細菌培養を用い、このように、各構築物をトランスフェクトした３２個のＰＣＰを生成した。３０分間のインキュベーションの後、真空濾過によって懸濁液を除去して、多孔性ＰＣＰを再生した。一時的遺伝子発現のために、ＰＣＰを含有する受けプレートを、植物チャンバー内で２６℃および５０％湿度で５日間インキュベートした。同様に、４週苗のタバコ（Nicotiana tabacum）Ｋ３２６、タバコ（N. tabacum）ＳＲ−１およびＮ．ベンタミアーナ（N. benthamiana）植物を、ＰＣＰのために用いたのと同じ培養に由来するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）懸濁液（ＯＤ６００＝１）で浸潤させた。各植物の上の４枚の葉（異なる古さ）に細菌を注入し、１６時間光周期の２３℃で植物を５日間インキュベートした。全可溶性タンパク質をＰＣＰおよび葉から抽出し、３つの抗体の濃度を表面プラズモン共鳴分光法によって比較した（図４）。

図４は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介遺伝子導入の５日後の一時的遺伝子発現（抗体蓄積として提示される）のスクリーニングのための、異なる完全植物発現系（Ｎ．ベンタミアーナ（N. benthamiana）、タバコ（N. tabacum）Ｋ３２６およびタバコ（N. tabacum）ＳＲ−１）とタバコＢＹ−２ ＰＣＰとの比較を示す。抗体濃度は、ＳＰＲ分光法によって判定した。

この比較は、異なる一時的発現方法が相対抗体収量に関して同等の結果をもたらすことを示し、したがって、ＰＣＰが完全植物での発現構築物の活性を予測することができることを示した。ＰＣＰ方法は、２Ｆ５の蓄積の３倍の増加を含む、全３つの抗体の最高濃度を達成しつつ、抗体蓄積の大いに低い変動係数によっても特徴づけられた（表２）。

新たに開発された培養戦略は、植物細胞パックによりハイスループットスクリーニングプラットホームの需要に対して植物細胞バイオマスを供給する完全な方法となる。さらに、同等の品質の植物細胞バイオマスを連続的に生成することによって、それはスクリーニングの反復性を確実にする。

３．）ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物（溶解物）の生産
実験的配置で、バッチ培養で増殖させたタバコブライトイエロー２（ＢＹ−２）細胞から調製した溶解物の生産性を、連続発酵で増殖させたものと比較した。各場合に、２０％のパックされた細胞体積を有するＢＹ−２細胞培養の１リットルを、Komoda et al. (2004)による溶解物調製のための改変プロトコールに同時にかけた。

各場合に、３％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン、０．２ｍｇ／Ｌの２，４ジクロロフェノキシ酢酸および１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトールを追加したムラシゲおよびスクーグ液体培養（ムラシゲおよびスクーグ基礎塩混合液、Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、Ｈａａｒｌｅｍ、Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ）で増殖させたＢＹ−２細胞培養の１リットルを、２５０×ｇで５分間遠心分離した。３．６ｇ／ＬのＫａｏおよびＭｉｃｈａｙｌｕｋ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）、０．３６Ｍマンニトール、３％（ｖ／ｖ）Ｒｏｈａｍｅｎｔ ＣＬ、２％（ｖ／ｖ）Ｒｏｈａｍｅｎｔ ＰＬおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｒｏｈａｐｅｃｔ ＵＦ（全てＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから）ならびに植物ホルモンＮＡＡ（α−ナフタル酸０．５μｇ／ｍＬ）およびＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン１μｇ／ｍＬ）からなる３容のプロトプラステーション緩衝液に、細胞ペレットを再懸濁させた。水酸化カリウムでｐＨ５を調整した。２７℃および７０ｒｐｍで１．５時間、懸濁液をインキュベートした。プロトプラステーションの後、懸濁液を１１０×ｇで５分間遠心分離し、生じた細胞ペレットを、０．７Ｍマンニトール、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２および５ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）中に（上から下まで）３ｍＬの０％、３ｍＬの１５％、５ｍＬの３０％、５ｍＬの４０％および３ｍＬの７０％パーコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からなる不連続パーコール勾配に直接加えた。１２．０００×ｇで１時間の遠心分離の後、空胞化プロトプラスト（いわゆるミニプロトプラスト）を、４０％と７０％パーコール層の間の界面から回収し、１００×ｇで５分間、０．７Ｍマンニトールで洗浄した。ミニプロトプラストを、３容のＴＲ緩衝液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、８０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴおよび５０ｍＬあたり１錠の完全無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））に再懸濁した。その後、窒素減圧チャンバー（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、ミニプロトプラストを１０バールで３０分間破壊した。４℃および５００×ｇで１０分間の遠心分離によって、核および膜断片を除去した。０．５ｍＭのＣａＣｌ_２および７５Ｕ／ｍＬのヌクレアーゼＳ７（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の添加の後、上清を２０℃で１５分間インキュベートした。溶解物に１ｍＭのＥＧＴＡを加え、液体窒素で凍結させ、１ｍＬのアリコートにして−８０℃で保存した。

反応構成成分の濃度に関して、生じた溶解物は、実験計画（ＤｏＥ）法によって最大ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳活性に最適化した。バッチモードで培養された細胞から調製した溶解物と比較すると、連続発酵細胞から得られた溶解物で、１００％より高い翻訳活性が観察された（図５）。さらに、リボソームの濃度および結果としてのより高い生産性の指標としての２６０ｎｍの吸収は、連続発酵細胞から得られた溶解物でより高かった（＋２０〜２５％）。

カップリングされていない（鋳型としてｍＲＮＡ）ならびにカップリングされた（鋳型としてプラスミドＤＮＡ）バッチモードでは、ＢＹ−２溶解物の生産性は、市販されている植物ベースの系（コムギ胚芽抽出物）のほぼ２倍高い。

図５は、バッチ培養細胞および連続培養細胞からそれぞれ調製された、カップリングされた転写／翻訳無細胞タバコＢＹ−２系で生産された、増強された黄色蛍光性タンパク質（ｅＹＦＰ）の収量の比較を示す。グラフに示すように、バッチ由来の溶解物と比較して、連続培養細胞由来の溶解物からは翻訳活性の１００％を超える増加を達成することができた。インキュベーションは、２５℃および７５０ｒｐｍで最高３９時間実施した。

４．）３Ｌの撹拌タンクバイオリアクターでのソルブス・トルミナリス（Sorbus torminalis）懸濁培養（Ｅｌｓｂｅｅｒｅ）の培養。
培養は、高圧滅菌可能な３Ｌ撹拌タンクバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）内で２６℃で実行した。バイオリアクターを２ＬのＭＳ培地（ムラシゲおよびスクーグ、１９６２；ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２００ｍｇ／Ｌ、ＨＣｌ−チアミン１ｍｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．２ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ）で充填し、６日間前培養したソルブス・トルミナリス（Sorbus torminalis）細胞で接種した。発泡および壁増殖を制御するために、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ−６１（ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）を０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で加えた。焼結金属スーパージャーを用いて０．１ｖｖｍの曝気速度で発酵槽に圧縮空気を自動的にパルス注入することによって、溶存酸素濃度（ｄＯ２）を２０％の飽和セットポイントに維持した。ｅｚ−コントロール（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）を用いて発酵を制御し、ＢｉｏＸｐｅｒｔ ＸＰを用いてオンラインデータを収集した。ｐＨを監視したが、制御しなかった。Ｆｕｔｕｒａ ＲＦＩＳシステム（Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ、ＵＫ）を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極（１２×１２０ｃｍ）および分極補正により０．６ＭＨｚの細胞培養モードで動作している標準のリモートＦｕｔｕｒａ機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Ｆｕｔｕｒａソフトウェアで制御した。誘電率測定のプロセス値を、発酵プロセスの間の異なるセットポイントに固定した（４０ｐＦ／ｃｍ ０〜４．５ｄｐｉ；４５ｐＦ／ｃｍ ４．５〜８．５ｄｐｉ；５０ｐＦ／ｃｍ ８．５〜１１．５ｄｐｉ）。培養プロセスでは、実際のプロセス値を５秒間隔の対応する誘電率セットポイントと比較した。プロセス制御のために、ＰＩＤコントローラを用いた。Ｐ、ＩおよびＤパラメータの具体的設定は、Ｐ−ゲイン＝２０、Ｉ−時間＝０およびＤ−時間＝０であった。アクチュエータは、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換した。誘電率シグナルがセットポイントを超えたとき、バイオリアクターに培地タンクから新しい無菌培地を加え、このようにして培地を希釈し、誘電率をセットポイント値まで低減するようにポンプを制御した。図６は、タバコ（N. tabacum）ｃｖ．ＢＹ−２細胞だけが発酵戦略に適しているのでなく、ソルブス・トルミナリス（Sorbus torminalis）からの懸濁細胞培養も良好に培養されたことを明らかに示す。発酵の最初の４日間、細胞はバッチ相にあって、初めて４０ｐＦ／ｃｍのセットポイントに到達した。接種から４、５日後、セットポイントを４５ｐＦ／ｃｍに増加した。このセットポイントに到達するために、細胞はおよそ１日を必要とした。セットポイントは、およそ４日の間４５ｐＦ／ｃｍに固定した。これらの３日の間に、合計２００ｍＬの懸濁液を収集することができた。接種から８．５日後、セットポイントは５０ｐＦ／ｃｍに再び増加され、およそ１日後に細胞は再びこのバイオマスに到達した。さらに３日間、発酵を行った。１１．５日間で、合計でおよそ４００ｍＬの細胞懸濁液を収集することができた。

５．）３Ｌの撹拌タンクバイオリアクターでのセイヨウナシ（Pyrus communis）懸濁培養（Ｂｉｒｎｅ）の培養
培養は、高圧滅菌可能な３Ｌ撹拌タンクバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）内で２６℃で実行した。バイオリアクターを２ＬのＭＳ培地（ムラシゲおよびスクーグ、１９６２；ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２００ｍｇ／Ｌ、ＨＣｌ−チアミン１ｍｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．２ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ）で充填し、６日間前培養したソルブス・トルミナリス（Sorbus torminalis）細胞で接種した。発泡および壁増殖を制御するために、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ−６１（ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）を０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で加えた。焼結金属スーパージャーを用いて０．１ｖｖｍの曝気速度で発酵槽に圧縮空気を自動的にパルス注入することによって、溶存酸素濃度（ｄＯ２）を２０％の飽和セットポイントに維持した。ｅｚ−コントロール（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）を用いて発酵を制御し、ＢｉｏＸｐｅｒｔ ＸＰを用いてオンラインデータを収集した。ｐＨを監視したが、制御しなかった。Ｆｕｔｕｒａ ＲＦＩＳシステム（Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ、ＵＫ）を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極（１２×１２０ｃｍ）および分極補正により０．６ＭＨｚの細胞培養モードで動作している標準のリモートＦｕｔｕｒａ機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Ｆｕｔｕｒａソフトウェアで制御した。誘電率測定のプロセス値を、発酵プロセスの間の異なるセットポイントに固定した。培養プロセスではさらに、実際のプロセス値を５秒間隔の対応する誘電率セットポイントと比較した。プロセス制御のために、ＰＩＤコントローラを用いた。Ｐ、ＩおよびＤパラメータの具体的設定は、Ｐ−ゲイン＝２０、Ｉ−時間＝０およびＤ−時間＝０であった。アクチュエータは、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換した。誘電率シグナルがセットポイントを超えたとき、バイオリアクターに培地タンクから新しい無菌培地を加え、このようにして培地を希釈し、誘電率をセットポイント値まで低減するようにポンプを制御した。

セイヨウナシ（Pyrus communis）からの懸濁細胞株を培養するために、この発酵戦略を用いた。プロセス内の誘電率セットポイントの段階的上昇または低下の効果を、調査するべきである。

図７で、「点−線−点」の線は、プロセス全体でのセットポイントの変化を示す。４０ｐＦ／ｃｍの最初のセットポイントは接種から６日後（ｄｐｉ）に到達し、その後、セットポイントは４３ｐＦ／ｃｍに上昇させた。同じく培養が４３ｐＦ／ｃｍに到達したならば、セットポイントは８５ｐＦ／ｃｍまで５ｐＦ／ｃｍ段階で再び上昇させた。１８．６ｄｐｉの後に培養は８５ｐＦ／ｃｍに到達し、８０ｐＦ／ｃｍに再び低下させた。培養はそのレベルにおよそ８日間保ち、その後、７０ｐＦ／ｃｍおよび５０ｐＦ／ｃｍへのセットポイントのさらなる段階的低下が続いた。発酵の終わりに、接種の直後に到達した誘電率までバイオマスを希釈し、培養は古典的なバッチ発酵と同様の正常な増殖を示した。この実験は、セットポイントの変更に対する全プロセスの頑健性を明らかに実証する。一方ではプロセスがセイヨウナシ（Pyrus communis）細胞培養の培養に適しており、他方ではセットポイントの変化がプロセスにマイナスの影響を及ぼさないことを、この実験は明らかに実証する。

６．）時間の改善
図８は、タバコ（N. tabacum）ＢＹ−２細胞培養の増殖行動に基づくプロセス時間および収集されたバイオマスの理論的な計算を示す。両発酵戦略の計算は、５Ｌの細胞懸濁液の体積に基づいた。ＢＹ−２細胞培養は、２０％ＰＣＶ（１００ｍｇ／Ｌの新鮮重量）に到達するのにバッチ培養では５日間を、５０％のＰＣＶ（２５０ｍｇ／Ｌの新鮮重量）のためには７日間をそれぞれ必要とする。容器を洗浄、調製および滅菌するセットアップ時間は、両発酵戦略で同じであった（１日）。古典的なバッチ発酵では、発酵ブロス全体を収集することができ（５Ｌ）、新しいプロセスについては、４Ｌの最大収集体積が計算のために用いられた。新しいプロセスが定常状態に入ると、３日おきに最大収集体積を容器から取り出すことができた。

図８の上部は、収集基準が２０％ＰＣＶ（新しいプロセスでのセットポイントを意味する）であるときの、経時的なバイオマスの収集を示す。バッチ培養は、５ｄｐｉの後にこのバイオマスに到達した。両戦略は、６ｄｐｉの後にバイオマスの最初の収集を提供する。第１のバッチでは、古典的なバッチ発酵は、０．５ｋｇのバイオマスを提供し、新しいプロセスは０．４ｋｇのバイオマスを提供する。その時点では、バッチ培養はより優れているように見える。しかし、収集基準（新しいプロセスでのセットポイントを意味する）に到達すると、古典的なバッチ発酵で０．５ｋｇのために６日間を必要とする代わりに、新しい発酵プロセスは０．４ｋｇのバイオマスを再び提供するためにわずか３日間を必要とする。４８日間の時間を考えるならば、８回の古典的なバッチ発酵を実行することができ、４ｋｇのバイオマスの収集につながる。同じ時間枠で、１５回の収集を新しい発酵プロセスは実行することができ、６ｋｇのバイオマスにつながる。これは、時空収量の約５０％の増加である。時空収量の増加は、収集基準が５０％のＰＣＶ（２５０ｍｇ／Ｌ）に移行するとさらにより高くなる（図８の下のグラフ）。そのバイオマスに到達するのに、ＢＹ−２細胞は８日間を必要とする。４８日間を考慮すると、古典的なバッチプロセスにより６つの生産サイクルを実行することができ、７．５ｋｇのバイオマスにつながる。新しいプロセスでは、１４の生産サイクルを４７日間で実行することができ、１４ｋｇのバイオマスおよび時空収量の８６％の増加につながる。これらのデータを、表３で合併する。

このグラフは、誘電率セットポイントに依存する標準のタバコ（N. tabacum）ｃｖ．ＢＹ−２バッチ発酵と比較した時間の改善を示す。

７．）バッチ発酵での、および本開示によるプロセスによるトランスジェニックＢＹ−２細胞株の組換え抗体生産
前に記載されるように（Holland, Sack et al. 2010 Biotechnol Bioeng）抗体重鎖および軽鎖遺伝子をコードする二元Ｔ−ＤＮＡプラスミドを有する組換えアグロバクテリウム菌による形質転換によって、ＨＩＶ−１中和２Ｇ１２抗体を生産するトランスジェニックタバコＢＹ−２細胞懸濁細胞株（ＧＦＤ＃５）を生成した。バッチ発酵およびＥＬＩＳＡによる２Ｇ１２抗体蓄積の分析は、前記の通りに実施した（Holland, Sack et al. 2010 Biotechnol Bioeng）。バッチ発酵は、１６１時間実行した。４８時間のラグ相の後に、１０４時間の指数関数的細胞増殖相が続いた。培養上清中の２Ｇ１２濃度は、指数関数的細胞増殖の間に、１２０時間のプロセス時間まで８８ｎｇ／ｍＬのレベルまで上昇した。その後、濃度は次の４１時間で３５ｎｇ／ｍＬのレベルに低下したが、培養はなお指数関数的増殖相にあった。細胞内濃度レベルは、７２時間のプロセス時間の後に４０００ｎｇ／ｍＬであり、１２０時間後の２２５０ｎｇ／ｍＬのレベルまで継続的に低下し、プロセス終了まで一定であった（図１２）。本発明による発酵は、以下の通りに実施した。培養を、７日間前培養の５％（ｖ／ｖ）で接種した。開始体積は、３Ｌガラスリアクター内の１Ｌであった。このリアクタータイプの最小作業体積は０．５Ｌで、最大作業体積は２．７Ｌである。１２０時間の初期バッチ相の後、誘電率セットポイントを４５ｐＦ／ｃｍに設定し、コントローラループを開始した。培養が５４ｐＦ／ｃｍの誘電率に既に到達したので、４５ｐＦ／ｃｍの誘電率に到達するまで新鮮な培地をリアクターに注入した。このセットポイントはその後４８時間一定に保ち、その後９０ｐＦ／ｃｍに増加した。この誘電率レベルに到達するために培養は３７時間の増殖を必要とし、それはその後さらに５８時間一定に保った。初期相（０〜１２０時間の発酵時間）では、両プロセスは、細胞内２Ｇ１２濃度および培養上清中の２Ｇ１２濃度について同等のレベルを与えた。バッチ発酵と対照的に、本発明によるプロセスでの細胞内２Ｇ１２濃度は、１２０時間後に７０００ｎｇ／ｍＬに鋭く上昇し、より高い生産物レベルが発酵プロセスの終了まで維持された。培養上清中の２Ｇ１２抗体濃度も、バッチ発酵プロセスとかなり異なった。それと対照的に、濃度は再び低下しなかったが、１２６０ｎｇ／ｍＬの最終生産物濃度まで全プロセスにわたってむしろ連続的に上昇し（図１３）、バッチ発酵の最大レベルと比較して１４倍の増加であった。

本発明による新規発酵プロセスは高度に再現可能なバイオマスの生産に適しているだけでなく、細胞培養上清および細胞の両方の中での組換えタンパク質の蓄積を増加させるのに有益であることを、この実施例は明らかに示す。バッチ発酵では、細胞内２Ｇ１２抗体レベルは、６０時間から１６０時間時の収集にかけて、４．０μｇ／ｍＬから２．２５μｇ／ｍＬまで着実に減少した。対照的に、本発明による新規プロセスでの２Ｇ１２抗体レベルは、１２０時間から１４４時間にかけて３．７μｇ／ｍＬから７．０μｇ／ｍＬまで増加し、誘電率が４５ｐＦ／ｃｍの一定に保たれた相の開始と一致する。細胞内２Ｇ１２抗体レベルの増加がほとんど２倍増加しただけでなく、さらに、それは１２０時間から２８８時間にかけてより高いレベルのままだった。これは、本発明によるプロセスが、特に初期増殖相の後にコントローラループが開始された後の細胞内生産物レベルに関して、より低い変動性によって特徴づけられることも示す。

細胞培養上清中の２Ｇ１２抗体の蓄積は、さらにより大きい差を示した。バッチ発酵ではレベルが１２０時間でピークに達し、その後低下したのに対して、新規発酵プロセスでは細胞培養上清中の２Ｇ１２抗体の安定した増加が観察された。

驚くべきことに、２Ｇ１２抗体レベルの増加は４５ｐＦ／ｃｍに相当する中間細胞密度で観察されただけでなく、９０ｐＦ／ｃｍでも維持された（細胞内２Ｇ１２）か、またはさらに増加さえした（細胞培養上清２Ｇ１２）。したがって、細胞培養上清中の２Ｇ１２生産物レベルは、特により長いプロセス期間で、より低い変動性も示した。細胞培養上清中の２Ｇ１２生産物レベルの継続的増加は、本発明によるプロセスのより高い頑健性およびより優れた生産物を生ずるその能力をさらに実証する。バッチ発酵の細胞培養上清中の２Ｇ１２レベルが１２０時間後に再び低下したという、生産物が分解されたことを意味する事実から、これは明白である。

この実施例は、細胞増殖および生存率を維持するだけでなく、細胞と上清の両方で組換えタンパク質生産物の蓄積を維持しつつ、誘電率のセットポイントをプロセス内で容易に変更することができることをさらに示す。これは、本発明によるプロセスの高い頑健性ならびにプロセス開発および改善のためのその有用性および特異なオプションを実証する。

７．）ＣＨＯ細胞の発酵
本発明による発酵は、モノクローナル抗体を生産するトランスジェニックＣＨＯ ＤＧ４４懸濁細胞株で実行し、以下の通りに実施した。開始体積は、３Ｌガラスリアクター（最小作業体積＝０．５Ｌ、最大作業体積＝２．７）内の４ｍＭのＬ−グルタミンを追加したヒポキサンチンおよびチミジンなしの０．８ＬのＰｏｗｅｒＣＨＯ−２ ＣＤ（Ｌｏｎｚａ、１２−７７１Ｑ）であって、培養には２．８・１０^８個の細胞を接種した。焼結金属スーパージャーを用いて０．１ｖｖｍ（体積／体積／分）の曝気速度で発酵槽に圧縮空気を自動的にパルス注入することによって、溶存酸素濃度（ｄＯ２）を３０％の飽和セットポイントに維持した。温度を３７℃に制御し、１００ｒｐｍの固定した撹拌機速度を用いた。ｐＨを監視し、０．５Ｍ ＮａＯＨで７．０のセットポイントに制御した。ｅｚ−コントロール（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）を用いて発酵を制御し、ＢｉｏＸｐｅｒｔ ＸＰを用いてオンラインデータを収集した。Ｆｕｔｕｒａ ＲＦＩＳシステム（Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ、ＵＫ）を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極（１２×１２０ｃｍ）および分極補正により０．６ＭＨｚの細胞培養モードで動作している標準のリモートＦｕｔｕｒａ機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Ｆｕｔｕｒａソフトウェアで制御した。培養プロセスでは、実際のプロセス値を５秒間隔の誘電率セットポイントと比較した。プロセス制御のために、ＰＩＤコントローラを用いた。Ｐ、ＩおよびＤパラメータの具体的設定は、Ｐ−ゲイン＝２０、Ｉ−時間＝０およびＤ−時間＝０であった。アクチュエータは、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換した。誘電率シグナルがセットポイントを超えたとき、４ｍＭのＬ−グルタミンを追加した新しい無菌のＰｏｗｅｒＣＨＯ−２ ＣＤを培地貯蔵槽からバイオリアクターに加え、このように、誘電率がセットポイントに到達するまで培養を希釈するようにポンプを制御した。

接種の後、細胞数３．５・１０^５／ｍＬに対応した１．２ｐＦ／ｃｍの誘電率が得られた。誘電率セットポイントを３ｐＦ／ｃｍと規定し、コントローラループを開始した。初期相（バッチ相）では、培養の細胞密度は、このセットポイントに到達するまで増加した。この初期相の間、細胞培養体積は変化しなかった。細胞の代謝活性のために、それらのセットポイントに到達するまで、溶存酸素濃度およびｐＨ値は低下する。

２６時間の後、細胞密度は細胞数３．５・１０^５／ｍＬから６．８・１０^５／ｍＬまで増加し、誘電率は、１．２ｐＦ／ｃｍから２．３ｐＦ／ｃｍの対応する変化を示した。３７時間の発酵の後に３ｐＦ／ｃｍのセットポイントに到達し、その後維持された。この相の間に、培養体積は増加した（図１４培地供給）。５０時間の後、増殖する培養に影響することなく任意の体積、１０ｍＬを収集した。７３．２時間の発酵時間で８３０ｍＬの別の収集を実行し、１時間後にさらなる６２０ｍＬを収集した。その後まもなく（１．５時間）、セットポイントを４．５ｐＦ／ｃｍに上げ、新しいセットポイントには１４時間後に到達した。４．５ｐＦ／ｃｍの一定誘電率の第２の相の間に、細胞培養を乱すことなく、さらに３つの恣意的な細胞培養分画を収集した。

ＴｈｏｍａチャンバーでまたはＣＡＳＹによって染色および計数することによって、細胞の生存率を判定した。表４に示す結果は、本発明によるプロセスが、高い生存能力のある哺乳動物細胞を発酵時間全体にわたって再現可能に生ずることを実証する。特に、高い生存能力のある細胞は、異なる誘電率でも得られた。さらに、このプロセスは高品質の細胞由来の生産物、すなわちモノクローナル抗体ももたらした。特に注目に値することに、発酵時間全体にわたって、抗体生産物が増加した。比較のために、発酵の７３．２時間後（^＊）に、細胞培養の分画（ホールドステップ試料^＊＊）を収集容器に収集し、ホールドステップを４℃で２４時間実施した。細胞生存率は、９４％から８５％まで、有意に明らかに低下した。ホールドステップの前（^＊）および後（^＊＊）の抗体濃度の比較も、生産物濃度が４０μｇ／ｍＬから２９μｇ／ｍＬまで低下したことを示す（表４）。これは、本発明によるプロセスの利点を明らかに実証する。

この実施例は、本発明によるプロセスが、高度に再現可能な生存能力のある細胞または細胞由来の生産物、例えば抗体および組換えタンパク質のいずれかを生産するための哺乳動物細胞にも適することを明らかに示す（図１４）。

参考文献
本出願全体を通して引用されている、参考文献、公布特許および公開特許出願を含む全ての引用文献の内容は、これにより参照により明示的に組み込まれる。
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Claims (15)

1. 真核細胞および／または真核細胞由来の生産物の生産のための細胞密度調節細胞培養プロセスであって、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、
   ａ）可変細胞培養体積を有する細胞培養で前記細胞を増殖させるステップであって、前記培養体積は前記細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
   ｂ）前記細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
   ｃ）前記細胞を増殖相に保つために適当な体積の前記栄養培地を前記細胞培養に加えることによって前記細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
   ｄ）所望の細胞密度で前記細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される前記分画は細胞および／または細胞由来の生産物を含み、かつ前記容器中の前記細胞培養体積は、前記分画を収集した後に前記容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれず、かつ／または収集される前記分画の体積は前記容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ；
   ｅ）細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの１つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
   ｆ）収集される前記細胞および／または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
   を含む細胞密度調節細胞培養プロセス。
2. 前記細胞培養中の細胞密度が連続的に測定される、請求項１に記載のプロセス。
3. 前記細胞密度が、前記細胞密度（インプットシグナル）を連続測定するセンサーを含むコントロールループ、およびポンプもしくはバルブを始動させるアウトプットシグナルを生成するかまたは前記細胞培養に適当な体積の前記栄養培地を加えるコントローラを用いて調節される、請求項１または２に記載のプロセス。
4. 前記細胞培養中の細胞密度が経時的に一定であるように、または前記細胞密度についての、特定の時間依存関数であるように調節される、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロセス。
5. 前記培養容器が最小および最大細胞培養充填レベルの間の体積範囲で操作される、請求項１から４のいずれか一項に記載のプロセス。
6. 前記発酵培養の、最小／最大範囲内の任意の体積分画が前記培養容器から収集される、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロセス。
7. （ｉ）前記培養体積を増加させるために少なくとも１つの追加の培養容器が第１の培養容器に連結され、（ｉｉ）連結した各培養容器中の細胞密度が同じであり、（ｉｉｉ）前記培養容器の間で前記細胞培養が交換される、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
8. 収集される前記細胞培養分画に含まれる細胞が以降の発酵プロセスに接種するために用いられる、請求項１から７のいずれか一項に記載のプロセス。
9. 収集される前記細胞が以降の培養ステップを実施するために用いられ、それによって（ｉ）前記細胞がトランスフェクト／形質転換され、（ｉｉ）遺伝子発現がインデューサーの添加によって誘導され、（ｉｉｉ）前記細胞は感染させられ、（ＩＶ）細胞由来の生産物の蓄積を有利にする条件下で前記細胞が培養され、（ｉｖ）核酸が前記細胞にトランスフェクトされ、および／または（ｖ）前記細胞が分析アッセイのために用いられる、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロセス。
10. 前記細胞が無細胞抽出物を調製するために用いられる、請求項１から９のいずれか一項に記載のプロセス。
11. ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための無細胞抽出物の調製のための方法であって、
    ｉ）請求項１から１０のいずれか一項のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
    ｉｉ）収集される前記細胞を、使用する抽出処理にかけることによって前記培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
    を含む方法。
12. 収集される前記細胞が指数関数的増殖相にある、請求項１１に記載の方法。
13. 抽出処理が酵素処理を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 安定した細胞株を生成するための方法であって、
    ｉ）請求項１から１０のいずれか一項のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
    ｉｉ）収集される前記細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
    を含む方法。
15. 培地が取り除かれた、多孔構造の、組織ではない多層細胞パックの形態の植物細胞材料の生成のための、および前記細胞パックの以降の維持のための方法であって、
    （ｉ）植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって前記細胞が培養され、前記細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、１ｃｍ^３あたり０．１から０．９ｇの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
    （ｉｉ）前記の、培地が取り除かれた、多孔構造の細胞パックを５０〜１００％の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
    を含む方法。