JP6723163B2 - 発酵系 - Google Patents
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Description
バッチ発酵は、培地が一度充填されて、接種される。接種の後、リアクターは、酸素およびpHを制御するための塩基/酸のような少数の添加剤を除けば、閉鎖系である。これは、発酵が開始されると、追加の培地も栄養素もリアクターに供給されないことを意味する。したがって、リアクター培養体積は、プロセス全体で(蒸発による体積減少を除いて)一定である。いくつかの重要な細胞培養パラメータ、例えば細胞密度、生存率、溶存酸素、栄養素および生産物濃度は、プロセス全体で変化する。細胞培養は、ラグ、指数関数的および定常増殖相を経る。収集条件に到達するとき、プロセスは終了し、全発酵ブロスが収集される。より多くの生産物を生産するために、プロセスが繰り返されるか、またはより大きな容器に規模が変更される。
反復バッチ発酵は、接種の後に正常なバッチモードで作動する。細胞密度、溶存酸素、栄養素および生産物濃度のような培養パラメータは、プロセス全体で変化する。バイオリアクターは、完了まで運転される。運転終了時に、発酵ブロスは無菌条件下で収集されるが、一定の体積の発酵ブロスはバイオリアクター内に残され、新しい接種原の役目を果たした。リアクターは再び新鮮な培地で充填され、新しいバッチ発酵サイクルが開始する。その運転モードの細胞は、各サイクルで新しい適応、指数関数的および定常増殖相を経る。反復バッチ発酵は、発酵槽および接種原を調製するための時間を節約することによって、バッチおよび流加プロセスの全体のプロセス効率を向上させる。理想的には反復バッチはバッチ培養と事実上同一であるが、前の培養からのメモリー効果および繰越しが、特に医薬タンパク質の生産にとって重要である。
両作動モードは、一定の細胞密度を目指す、固定されたリアクター体積による連続プロセスである。両プロセスでは、新鮮な培地がリアクターに連続的に供給されると同時に、同じ体積の発酵ブロスが収集される。培養体積は全プロセスの間一定に保たれ、このように、加えられる新鮮な培地の量は除去される培養ブロスの量と等しくなければならない。したがって、新鮮な培地のインプットと発酵ブロスのアウトプットは互いに依存する。
流加発酵は、古典的なバッチ相から始まる。ある特定の条件に到達するときに供給が始まる、すなわち追加の栄養素が提供される。この運転モードでは、リアクター培養体積はバッチ相で一定であり、供給相では体積が増加する。このモードでも、いくつかの培養パラメータが変化し、細胞は古典的増殖相を経る。バッチ発酵の場合のように、プロセス終了後にリアクター内の全体積を収集する。
a)可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
b)細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および/もしくは細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれず、かつ/または収集される分画の体積は容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ、
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。
a)可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
b)細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および/または細胞由来の生産物を含み、収集される分画の体積は容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ、
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。
a)可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
b)細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および/または細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれない、ステップ、
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。
i)本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集される細胞を、使用する抽出処理にかけることによって培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法に関する。
i)本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集される細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法に関する。
(i)植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、細胞は本開示による方法によって培養され、細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、1cm3あたり0.1〜0.9gの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
(ii)前記の、培地が取り除かれた、多孔構造の細胞パックを50〜100%の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法を提供する。
− 高度に一貫した再現可能な細胞バイオマスの連続生成
− 半連続培養戦略の頑健性(64日間を超えるプロセス時間を達成)
− 反復バッチ培養と比較して増加した時空収量(植物細胞バイオマス)
− 溶存酸素調節は一定の指数関数的増殖速度を確実にする
− いくつかのプロセスの間の異なる植物懸濁細胞(ニコチアーナ属(Nicotiana)、パイルス属(Pyrus)およびソルブス属(Sorbus)の種)の良好な培養
− 一時的遺伝子発現および異なる抗体の生産のための生成植物細胞の適用の成功
− 実証された無細胞系のためのBY−2植物細胞の適用
− プロセス内の細胞濃度の増加/低下
− 自動化収集手順(「ハンズオン時間」の低減)の実行例
a)規定体積の細胞培養で細胞を増殖させるステップ、
b)細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および/または細胞由来の生産物を含むステップ、
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。
a)可変細胞培養体積を有する細胞培養で細胞を増殖させるステップであって、培養体積は細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
b)細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および/もしくは細胞由来の生産物を含み、容器中の細胞培養体積は、前記分画を収集した後に容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれず、かつ/または収集される分画の体積は容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ、
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む。
・ 7Lバイオリアクター内での1.5L培地(最小体積)の接種
・ 0.1バールの過度の圧力、制御されないpH、500mL/分の一定空気供給、26℃の制御された温度および30%溶存酸素(撹拌機速度を100〜300rpmに調節することによって制御される)による培養
・ 培養される細胞(BY−2細胞を4日間)に依存する初期バッチ相
・ バイオマス濃度(例えば100g/LのBY−2細胞)を調節するコントロールループの開始
・ 新鮮で無菌の培地の供給(無菌培地で貯蔵槽を補充することによる培地の供給)による、増加するリアクター体積にカップリングされた細胞の連続増殖
・ 最大充填体積に到達するときに必要な収集、自動化されている
・ 最小から最大の体積の範囲内の、可能な様々な懸濁液体積の時間非依存的収集。
i)本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集される細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法に関する。
i)トランスフェクトされた細胞を本開示のプロセスで培養するステップ、
ii)情報増幅を増加させる例えばMTX濃度の段階的増加のステップ
を含む方法に関する。
(i)植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、細胞は本開示による培養方法によって培養され、細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、1cm3あたり0.1から0.9gの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
(ii)前記の培地を取り除いた多孔構造の細胞パックを50〜100%の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法にも関する。
i)本開示のプロセスによってトランスジェニック細胞を培養、収集するステップ、
ii)培養上清からの細胞の分離のステップ、
iii)培養上清(分泌タンパク質)を処理するステップ、または
iv)細胞からの目的の分子の抽出のステップ
を含む使用である。
i)本開示のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集される細胞を、使用する抽出処理にかけることによって培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法に関する。
a)規定体積の細胞培養で細胞を増殖させるステップ、
b)細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)細胞を増殖相に保つために適当な体積の栄養培地を細胞培養に加えることによって細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される分画は細胞および/または細胞由来の生産物を含むステップ、
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含み、
− 真核細胞は、植物懸濁細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択することができ、ならびに/または
− 細胞由来の生産物は、一次もしくは二次性の代謝産物、もしくは酵素、抗体、抗体断片、ワクチン、サイトカイン、ホルモン、ペプチドもしくはウイルスもしくはウイルス様粒子もしくは核酸のような組換えタンパク質であってもよく、ならびに/または
− 細胞培養はスターター培養として培養容器に加えることができ、ならびに/または
− 密度センサーは、濁度測定、レーザー散乱測定、NIR測定もしくは容量測定に基づくセンサー、もしくは細胞カウンターのようなライン系にあるセンサー、もしくは細胞密度を測定し、フィードバックコントロールを可能にする任意の他の方法からなる群から選択することができ、ならびに/または
− 細胞培養中の細胞密度は連続的に測定することができ、ならびに/または
− 少なくとも1つの栄養培地貯蔵槽から適当な体積の栄養培地を培養容器中の細胞培養に移すことができ、ならびに/または
− 細胞密度は、細胞密度(インプットシグナル)を連続測定しているセンサーを含むコントロールループ、およびポンプもしくはバルブを始動させるアウトプットシグナルを生成するかもしくは細胞培養に適当な体積の栄養培地を加えるコントローラを用いて調節することができ、ならびに/または
− 細胞培養中の細胞密度は、経時的に一定であるように、もしくは細胞密度についての、特定の時間依存関数となるように調節することができ、ならびに/または
− 培養容器は、最小および最大の細胞培養充填レベルの間で操作することができ、ならびに/または
− 発酵培養の、最小/最大範囲内の任意の体積分画を培養容器から収集することができ、ならびに/または
− 細胞が指数関数的増殖相にあるとき、細胞培養の分画を収集することができ、ならびに/または
− (i)培養体積を増加させるために少なくとも1つの追加の培養容器を第1の培養容器に連結することができ、(ii)連結した各培養容器中の細胞密度は同じであってもよく、(iii)培養容器の間で細胞培養を交換することができ、ならびに/または
− 細胞はマイクロキャリアの存在下で培養することができ、ならびに/または
− 細胞は収集された細胞培養分画から単離することができ、ならびに/または
− 収集された細胞培養分画中の細胞由来の生産物および細胞は、遠心分離および/もしくは濾過および/もしくは沈降によって分離することができ、ならびに/または
− 収集された細胞培養分画に含まれる細胞は、以降の発酵プロセスを接種するために用いることができ、ならびに/または
− 収集された細胞は以降の培養ステップを実施するために用いることができ、それによって、(i)細胞はトランスフェクト/形質転換され、(ii)遺伝子発現はインデューサーの添加によって誘導され、(iii)細胞は感染させられ、(IV)細胞由来の生産物の蓄積を有利にする条件下で細胞は培養され、(iv)核酸は細胞にトランスフェクトされ、(v)および/もしくは細胞は分析アッセイのために用いられ、ならびに/または、
− 細胞は無細胞抽出物を調製するために用いることができる。
i)前記プロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集された細胞を、使用する抽出処理にかけることによって培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法に関し、ここで
− 収集された細胞は指数関数的増殖相にあってもよく、ならびに/または
− 抽出処理は酵素処理を含むことができ、ならびに/または
− 酵素処理はセルロースおよびペクチナーゼ処理を含むことができ、ならびに/または
− 無細胞抽出物を調製するためにその上清を得るために細胞溶解物を遠心分離することができる。
i)前記プロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集された細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法に関する。
(i)植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法によって細胞が培養され、細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、1cm3あたり0.1から0.9gの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
(ii)前記の、培地が取り除かれた、多孔構造の細胞パックを50〜100%の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法に関する。
以下の実施例では、本開示の材料および方法が提供される。これらの実施例は例示だけが目的であり、この開示を限定するものと決して解釈されるべきでないことを理解すべきである。本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにここに参照により完全に組み込まれる。
培養は、高圧滅菌可能な7L撹拌タンクバイオリアクター(Applikon、Schiedam、the Netherlands)内で26℃で実行した。バイオリアクターは、1.5Lの最小体積の改変MS培地(ムラシゲおよびスクーグ、1962;MS塩4.3g/L、ミオイノシトール100mg/L、KH2PO4 200mg/L、HCl−チアミン1mg/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸0.2mg/L、スクロース30g/L)で充填し、6日前培養のBY−2細胞で接種した。発泡および壁増殖を制御するために、Pluronic L−61(BASF、Mount Olive、NJ)を0.01%(v/v)の濃度で加えた。ez−コントロール(Applikon)を用いて発酵を制御し、BioXpert XPを用いてオンラインデータを収集した。リアクターは、0.5L/分の一定の流量で曝気した。撹拌速度を調節することによって、溶存酸素濃度(dO2)を30%の飽和に制御した。pHは監視したが、制御しなかった。Futura RFISシステム(Aber Instruments、Aberystwyth、UK)を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極(12×120cm)および分極補正により0.6MHzの細胞培養モードで動作している標準のリモートFutura機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Futuraソフトウェアで制御した。このバイオリアクターの最小作業体積は1.5Lであり、それは、正しい測定を確実にするために全てのセンサーが細胞培養と適切に接触すること、および十分な混合を有することが要求された。最大作業体積は、5.5Lであった。収集は、手動または自動収集方法のいずれかで実施した。したがって、外部ポンプのスイッチを入れるために、5.5Lの充填体積に固定されたレベルセンサーのアウトプットシグナルを用いた。レベルセンサーのアウトプットシグナルを記録するために、および外部ポンプを発酵レシピ内のプログラム相でリモートコントロールするために、BioExpertを用いた。プログラム相は、ポンプの運転時間に基づいて収集体積を規定した。リアクターが無人のとき(すなわち週末中)、収集チューブを外部ポンプに連結した。充填体積が5.5Lに到達し、したがってレベルプローブに接触したときはいつでも、外部ポンプの開始シグナルが生成された。その実験では、1Lの規定体積の懸濁液がリアクターから汲み出された。このコントロールループは、発酵の定期的監視の必要性を回避するための、およびそれが無人のときにリアクターのオーバーフローを防止するための安全性尺度の役目を果たした。
タバコBY 2植物細胞パック(PCP)を用いた発現構築物のハイスループットスクリーニングのために新たに開発された手法(国際公開第2013/113504号パンフレット)を、標準の葉のアグロインフィルトレーションと比較した。新規培養戦略で培養したタバコBY−2細胞を96ウェル受けプレートに移し、真空を加えることによって約200mgの新鮮重量の96ウェルPCPを同時に生成した。OD600=0.1の200mLのA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)株GV3101懸濁液を加えることによって、PCPにトランスフェクトした。3つの抗体のうちの1つのための発現構築物を各々有する3つの細菌培養を用い、このように、各構築物をトランスフェクトした32個のPCPを生成した。30分間のインキュベーションの後、真空濾過によって懸濁液を除去して、多孔性PCPを再生した。一時的遺伝子発現のために、PCPを含有する受けプレートを、植物チャンバー内で26℃および50%湿度で5日間インキュベートした。同様に、4週苗のタバコ(Nicotiana tabacum)K326、タバコ(N. tabacum)SR−1およびN.ベンタミアーナ(N. benthamiana)植物を、PCPのために用いたのと同じ培養に由来するA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)懸濁液(OD600=1)で浸潤させた。各植物の上の4枚の葉(異なる古さ)に細菌を注入し、16時間光周期の23℃で植物を5日間インキュベートした。全可溶性タンパク質をPCPおよび葉から抽出し、3つの抗体の濃度を表面プラズモン共鳴分光法によって比較した(図4)。
実験的配置で、バッチ培養で増殖させたタバコブライトイエロー2(BY−2)細胞から調製した溶解物の生産性を、連続発酵で増殖させたものと比較した。各場合に、20%のパックされた細胞体積を有するBY−2細胞培養の1リットルを、Komoda et al. (2004)による溶解物調製のための改変プロトコールに同時にかけた。
培養は、高圧滅菌可能な3L撹拌タンクバイオリアクター(Applikon、Schiedam、The Netherlands)内で26℃で実行した。バイオリアクターを2LのMS培地(ムラシゲおよびスクーグ、1962;MS塩4.3g/L、ミオイノシトール100mg/L、KH2PO4 200mg/L、HCl−チアミン1mg/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸0.2mg/L、スクロース30g/L)で充填し、6日間前培養したソルブス・トルミナリス(Sorbus torminalis)細胞で接種した。発泡および壁増殖を制御するために、Pluronic L−61(BASF、Mount Olive、NJ)を0.01%(v/v)の濃度で加えた。焼結金属スーパージャーを用いて0.1vvmの曝気速度で発酵槽に圧縮空気を自動的にパルス注入することによって、溶存酸素濃度(dO2)を20%の飽和セットポイントに維持した。ez−コントロール(Applikon)を用いて発酵を制御し、BioXpert XPを用いてオンラインデータを収集した。pHを監視したが、制御しなかった。Futura RFISシステム(Aber Instruments、Aberystwyth、UK)を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極(12×120cm)および分極補正により0.6MHzの細胞培養モードで動作している標準のリモートFutura機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Futuraソフトウェアで制御した。誘電率測定のプロセス値を、発酵プロセスの間の異なるセットポイントに固定した(40pF/cm 0〜4.5dpi;45pF/cm 4.5〜8.5dpi;50pF/cm 8.5〜11.5dpi)。培養プロセスでは、実際のプロセス値を5秒間隔の対応する誘電率セットポイントと比較した。プロセス制御のために、PIDコントローラを用いた。P、IおよびDパラメータの具体的設定は、P−ゲイン=20、I−時間=0およびD−時間=0であった。アクチュエータは、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換した。誘電率シグナルがセットポイントを超えたとき、バイオリアクターに培地タンクから新しい無菌培地を加え、このようにして培地を希釈し、誘電率をセットポイント値まで低減するようにポンプを制御した。図6は、タバコ(N. tabacum)cv.BY−2細胞だけが発酵戦略に適しているのでなく、ソルブス・トルミナリス(Sorbus torminalis)からの懸濁細胞培養も良好に培養されたことを明らかに示す。発酵の最初の4日間、細胞はバッチ相にあって、初めて40pF/cmのセットポイントに到達した。接種から4、5日後、セットポイントを45pF/cmに増加した。このセットポイントに到達するために、細胞はおよそ1日を必要とした。セットポイントは、およそ4日の間45pF/cmに固定した。これらの3日の間に、合計200mLの懸濁液を収集することができた。接種から8.5日後、セットポイントは50pF/cmに再び増加され、およそ1日後に細胞は再びこのバイオマスに到達した。さらに3日間、発酵を行った。11.5日間で、合計でおよそ400mLの細胞懸濁液を収集することができた。
培養は、高圧滅菌可能な3L撹拌タンクバイオリアクター(Applikon、Schiedam、The Netherlands)内で26℃で実行した。バイオリアクターを2LのMS培地(ムラシゲおよびスクーグ、1962;MS塩4.3g/L、ミオイノシトール100mg/L、KH2PO4 200mg/L、HCl−チアミン1mg/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸0.2mg/L、スクロース30g/L)で充填し、6日間前培養したソルブス・トルミナリス(Sorbus torminalis)細胞で接種した。発泡および壁増殖を制御するために、Pluronic L−61(BASF、Mount Olive、NJ)を0.01%(v/v)の濃度で加えた。焼結金属スーパージャーを用いて0.1vvmの曝気速度で発酵槽に圧縮空気を自動的にパルス注入することによって、溶存酸素濃度(dO2)を20%の飽和セットポイントに維持した。ez−コントロール(Applikon)を用いて発酵を制御し、BioXpert XPを用いてオンラインデータを収集した。pHを監視したが、制御しなかった。Futura RFISシステム(Aber Instruments、Aberystwyth、UK)を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極(12×120cm)および分極補正により0.6MHzの細胞培養モードで動作している標準のリモートFutura機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Futuraソフトウェアで制御した。誘電率測定のプロセス値を、発酵プロセスの間の異なるセットポイントに固定した。培養プロセスではさらに、実際のプロセス値を5秒間隔の対応する誘電率セットポイントと比較した。プロセス制御のために、PIDコントローラを用いた。P、IおよびDパラメータの具体的設定は、P−ゲイン=20、I−時間=0およびD−時間=0であった。アクチュエータは、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換した。誘電率シグナルがセットポイントを超えたとき、バイオリアクターに培地タンクから新しい無菌培地を加え、このようにして培地を希釈し、誘電率をセットポイント値まで低減するようにポンプを制御した。
図8は、タバコ(N. tabacum)BY−2細胞培養の増殖行動に基づくプロセス時間および収集されたバイオマスの理論的な計算を示す。両発酵戦略の計算は、5Lの細胞懸濁液の体積に基づいた。BY−2細胞培養は、20%PCV(100mg/Lの新鮮重量)に到達するのにバッチ培養では5日間を、50%のPCV(250mg/Lの新鮮重量)のためには7日間をそれぞれ必要とする。容器を洗浄、調製および滅菌するセットアップ時間は、両発酵戦略で同じであった(1日)。古典的なバッチ発酵では、発酵ブロス全体を収集することができ(5L)、新しいプロセスについては、4Lの最大収集体積が計算のために用いられた。新しいプロセスが定常状態に入ると、3日おきに最大収集体積を容器から取り出すことができた。
前に記載されるように(Holland, Sack et al. 2010 Biotechnol Bioeng)抗体重鎖および軽鎖遺伝子をコードする二元T−DNAプラスミドを有する組換えアグロバクテリウム菌による形質転換によって、HIV−1中和2G12抗体を生産するトランスジェニックタバコBY−2細胞懸濁細胞株(GFD#5)を生成した。バッチ発酵およびELISAによる2G12抗体蓄積の分析は、前記の通りに実施した(Holland, Sack et al. 2010 Biotechnol Bioeng)。バッチ発酵は、161時間実行した。48時間のラグ相の後に、104時間の指数関数的細胞増殖相が続いた。培養上清中の2G12濃度は、指数関数的細胞増殖の間に、120時間のプロセス時間まで88ng/mLのレベルまで上昇した。その後、濃度は次の41時間で35ng/mLのレベルに低下したが、培養はなお指数関数的増殖相にあった。細胞内濃度レベルは、72時間のプロセス時間の後に4000ng/mLであり、120時間後の2250ng/mLのレベルまで継続的に低下し、プロセス終了まで一定であった(図12)。本発明による発酵は、以下の通りに実施した。培養を、7日間前培養の5%(v/v)で接種した。開始体積は、3Lガラスリアクター内の1Lであった。このリアクタータイプの最小作業体積は0.5Lで、最大作業体積は2.7Lである。120時間の初期バッチ相の後、誘電率セットポイントを45pF/cmに設定し、コントローラループを開始した。培養が54pF/cmの誘電率に既に到達したので、45pF/cmの誘電率に到達するまで新鮮な培地をリアクターに注入した。このセットポイントはその後48時間一定に保ち、その後90pF/cmに増加した。この誘電率レベルに到達するために培養は37時間の増殖を必要とし、それはその後さらに58時間一定に保った。初期相(0〜120時間の発酵時間)では、両プロセスは、細胞内2G12濃度および培養上清中の2G12濃度について同等のレベルを与えた。バッチ発酵と対照的に、本発明によるプロセスでの細胞内2G12濃度は、120時間後に7000ng/mLに鋭く上昇し、より高い生産物レベルが発酵プロセスの終了まで維持された。培養上清中の2G12抗体濃度も、バッチ発酵プロセスとかなり異なった。それと対照的に、濃度は再び低下しなかったが、1260ng/mLの最終生産物濃度まで全プロセスにわたってむしろ連続的に上昇し(図13)、バッチ発酵の最大レベルと比較して14倍の増加であった。
本発明による発酵は、モノクローナル抗体を生産するトランスジェニックCHO DG44懸濁細胞株で実行し、以下の通りに実施した。開始体積は、3Lガラスリアクター(最小作業体積=0.5L、最大作業体積=2.7)内の4mMのL−グルタミンを追加したヒポキサンチンおよびチミジンなしの0.8LのPowerCHO−2 CD(Lonza、12−771Q)であって、培養には2.8・108個の細胞を接種した。焼結金属スーパージャーを用いて0.1vvm(体積/体積/分)の曝気速度で発酵槽に圧縮空気を自動的にパルス注入することによって、溶存酸素濃度(dO2)を30%の飽和セットポイントに維持した。温度を37℃に制御し、100rpmの固定した撹拌機速度を用いた。pHを監視し、0.5M NaOHで7.0のセットポイントに制御した。ez−コントロール(Applikon)を用いて発酵を制御し、BioXpert XPを用いてオンラインデータを収集した。Futura RFISシステム(Aber Instruments、Aberystwyth、UK)を用いて、生存能力のあるオンラインバイオマスを測定した。環状電極(12×120cm)および分極補正により0.6MHzの細胞培養モードで動作している標準のリモートFutura機器を用いて、細胞の誘電率および培地の伝導率を同時に測定した。バイオマスセンサーは、Futuraソフトウェアで制御した。培養プロセスでは、実際のプロセス値を5秒間隔の誘電率セットポイントと比較した。プロセス制御のために、PIDコントローラを用いた。P、IおよびDパラメータの具体的設定は、P−ゲイン=20、I−時間=0およびD−時間=0であった。アクチュエータは、コントローラアウトプットをアクチュエータアウトプットに変換した。誘電率シグナルがセットポイントを超えたとき、4mMのL−グルタミンを追加した新しい無菌のPowerCHO−2 CDを培地貯蔵槽からバイオリアクターに加え、このように、誘電率がセットポイントに到達するまで培養を希釈するようにポンプを制御した。
本出願全体を通して引用されている、参考文献、公布特許および公開特許出願を含む全ての引用文献の内容は、これにより参照により明示的に組み込まれる。
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Claims (15)
- 真核細胞および/または真核細胞由来の生産物の生産のための細胞密度調節細胞培養プロセスであって、細胞培養の間の細胞密度は、培養容器内の、細胞および栄養培地を含む細胞培養の体積を調整することによって調節され、
a)可変細胞培養体積を有する細胞培養で前記細胞を増殖させるステップであって、前記培養体積は前記細胞培養プロセス全体で一定であるように調節されない、ステップ、
b)前記細胞培養中の細胞密度を密度センサーで測定するステップ、
c)前記細胞を増殖相に保つために適当な体積の前記栄養培地を前記細胞培養に加えることによって前記細胞培養中の細胞密度を調節するステップ、
d)所望の細胞密度で前記細胞培養の一分画を収集するステップであって、収集される前記分画は細胞および/または細胞由来の生産物を含み、かつ前記容器中の前記細胞培養体積は、前記分画を収集した後に前記容器に栄養培地を加えることによって連続的に一定に保たれず、かつ/または収集される前記分画の体積は前記容器に栄養培地を加えることによって直ちに補充されない、ステップ;
e)細胞培養分画の反復収集を可能にするために、示した順序で前記のステップの1つまたは全てを繰り返すステップ、ならびに
f)収集される前記細胞および/または細胞由来の生産物を任意選択で処理するステップ
を含む細胞密度調節細胞培養プロセス。 - 前記細胞培養中の細胞密度が連続的に測定される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記細胞密度が、前記細胞密度(インプットシグナル)を連続測定するセンサーを含むコントロールループ、およびポンプもしくはバルブを始動させるアウトプットシグナルを生成するかまたは前記細胞培養に適当な体積の前記栄養培地を加えるコントローラを用いて調節される、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記細胞培養中の細胞密度が経時的に一定であるように、または前記細胞密度についての、特定の時間依存関数であるように調節される、請求項1から3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記培養容器が最小および最大細胞培養充填レベルの間の体積範囲で操作される、請求項1から4のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記発酵培養の、最小/最大範囲内の任意の体積分画が前記培養容器から収集される、請求項1から5のいずれか一項に記載のプロセス。
- (i)前記培養体積を増加させるために少なくとも1つの追加の培養容器が第1の培養容器に連結され、(ii)連結した各培養容器中の細胞密度が同じであり、(iii)前記培養容器の間で前記細胞培養が交換される、請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 収集される前記細胞培養分画に含まれる細胞が以降の発酵プロセスに接種するために用いられる、請求項1から7のいずれか一項に記載のプロセス。
- 収集される前記細胞が以降の培養ステップを実施するために用いられ、それによって(i)前記細胞がトランスフェクト/形質転換され、(ii)遺伝子発現がインデューサーの添加によって誘導され、(iii)前記細胞は感染させられ、(iv)細胞由来の生産物の蓄積を有利にする条件下で前記細胞が培養され、(v)核酸が前記細胞にトランスフェクトされ、および/または(vi)前記細胞が分析アッセイのために用いられる、請求項1から8のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記細胞が無細胞抽出物を調製するために用いられる、請求項1から9のいずれか一項に記載のプロセス。
- in vitro翻訳のための無細胞抽出物の調製のための方法であって、
i)請求項1から10のいずれか一項のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集される前記細胞を、使用する抽出処理にかけることによって前記培養細胞の無細胞抽出物を得るステップ
を含む方法。 - 収集される前記細胞が指数関数的増殖相にある、請求項11に記載の方法。
- 抽出処理が酵素処理を含む、請求項11または12に記載の方法。
- 安定した細胞株を生成するための方法であって、
i)請求項1から10のいずれか一項のプロセスによって細胞を培養、収集するステップ、
ii)収集される前記細胞を核酸で形質転換して安定した細胞株を得るステップ
を含む方法。 - 培地が取り除かれた、多孔構造の、組織ではない多層細胞パックの形態の植物細胞材料の生成のための、および前記細胞パックの以降の維持のための方法であって、
(i)植物細胞懸濁培養から細胞を分離することによって多孔構造を有する細胞パックを用意するステップであって、請求項1から10のいずれか一項に記載のプロセスによって前記細胞が培養され、前記細胞パックに含まれる液体の含有量が低減されて、1cm3あたり0.1から0.9gの湿細胞重量の細胞パック密度に相当するように調整され、それによって、前記細胞パックにおいて、培地が取り除かれた、多孔構造の性質を確立するステップ、および
(ii)前記の、培地が取り除かれた、多孔構造の細胞パックを50〜100%の相対湿度の下の非液状環境でインキュベートするステップ
を含む方法。
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