CN105087529A

CN105087529A - 基因工程改造蛋白酶k及其生产方法

Info

Publication number: CN105087529A
Application number: CN201410190299.1A
Authority: CN
Inventors: 赵旭
Original assignee: Tianjin Xuchen Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Xuchen Technology Co Ltd
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了提供一种基因工程改造的蛋白酶K，其酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上，能够将生产周期缩短至3～4天，极大的提高了生产效率。通过合成与扩增获得蛋白酶K基因，然后通过克隆，转化，将蛋白酶K基因整合到酵母染色体上，通过酵母的筛选，选出能够高效表达目标蛋白的优质菌株，利用高密度发酵技术，进行高密度发酵表达蛋白酶K，然后经过蛋白质的分离纯化，获得高纯度高活性蛋白酶K。

Description

基因工程改造蛋白酶K及其生产方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种基因工程改造蛋白酶K及其生产方法。

背景技术

目前，蛋白酶K的生产主要有两条路径，一是直接从真菌中直接提取，二是通过基因重组后表达。国内蛋白酶K产品主要依靠进口和真菌中直接提取，直接提取所需周期较长，以现有科技水平大概需要20天左右；而基因重组表达需要前期进行大量的研发，如果能够表达成功则可以将生产周期缩短至3～4天。从长远发展和大规模生产的角度考虑，优选进行基因重组后表达。因此，有必要采用基因重组技术并通过基因的合成与突变改造，构建了高效表达载体，通过高密度发酵实现了重组蛋白酶K的工业化生产，进而取代进口产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程改造的蛋白酶K，其酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上，能够将生产周期缩短至3～4天，极大的提高了生产效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案进行实施：

基因工程改造蛋白酶K，其特征在于：将如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列在如下位点进行相应的突变：

N95C,P97S,S107D,S123A,I132V,E138A,M145F,Y151A,V167I,L180I,Y194S,A199S,K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R,S337N和P355S。

通过合成与扩增获得蛋白酶K基因，然后通过克隆，转化，将蛋白酶K基因整合到酵母染色体上，通过酵母的筛选，选出能够高效表达目标蛋白的优质菌株，利用高密度发酵技术，进行高密度发酵表达蛋白酶K，然后经过蛋白质的分离纯化，获得高纯度高活性蛋白酶K。

附图说明

图1为目的基因检测结果；

图2为检测蛋白水平结果；

图3为酶活测定Sigma-Aldrich结果；

图4为酶纯度测定(SDS-PAGE)结果；

图5为酶稳定性实验结果；

图6为蛋白电泳比较实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、目的基因的获取

采用基因重组技术并通过基因的合成与突变改造，构建了高效表达载体；

氨基酸突变点包括：N95C,P97S,S107D,S123A,I132V,E138A,M145F,Y151A,V167I,L180I,Y194S,A199S,K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R,S337NandP355S；

其中：N95C中N为原始氨基酸，95为蛋白序列中该氨基酸位置，C为突变后的氨基酸)；

蛋白酶K氨基酸序列，亦即SEQIDNO.1为：

MRLSVLLSLLPLALGAPAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

二、高效表达载体的构建

合成后利用SalI酶切后线性化连接到pPIC3载体上，通过电转化到毕赤酵母细胞中，为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。利用PCR方法鉴定高拷贝的菌株，如附图1所示；

三、高效表达载体的诱导表达

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白适宜的温度为30℃，温度达到32℃时所有的蛋白表达都会停止。在酵母生长或高量表达时会释放出大量的热量，因此，整个发酵过程中进行温度的调节，热交换，加热、冷却装置等都是必不可少的。将种子菌株在YPD液体培养基中，1％甲醇诱导4天，收集菌体检测蛋白水平。

四、活性检测；

使用Sigma-Aldrich方法进行酶活测定，结果如表1及附图2所示。

表1酶活性测定结果

五、小规模的高密度发酵

种子培养：接种-80℃保存甘油菌到40mLYPD液体培养基中，30℃，280rpm震荡培养过夜后得一级种子。将一级种子按10％分别接种到装有200mLYPD液体培养基的两个1L摇瓶中，30℃，220rpm振荡培养20h后，得到二级种子。

甘油分批培养阶段扩增菌体：将上述400mL二级种子按5％加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，设定参数：搅拌转速、通气和温度30℃，pH5.0，开始发酵培养。通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右，当DO陡然上升接近100％时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，开始转入短时间甘油补料分批阶段培养菌体(菌体浓度达到90～150g/L)。

上述培养阶段每2h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度和菌体湿重。

甘油补料分批培养阶段扩增菌体：以12ml/h/L初始发酵液的速率流加50％甘油到发酵罐中，维持4h，同时提高搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右。停止补加甘油后，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态1h，然后转入甲醇诱导表达阶段，诱导过程中流加氨水维持pH恒定，同时氨水也用作氮源。(菌体浓度达到180～220g/L)。

甲醇补料分批诱导表达阶段：“饥饿”期结束后甲醇流加速率先以1ml/h/L维持低速流加4h，以使工程菌适应以甲醇为唯一碳源的环境，再以每半小时增加10％的流速增到3ml/h/L至诱导结束，通过调节搅拌速度、通气量、罐压和甲醇流加速率等措施使DO值维持在20％～35％左右(菌体浓度达到350～450g/L)。

开始诱导表达后，每4h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD₆₀₀和菌体湿重，并留上清用于蛋白分析。

所用培养基为：

种子培养基：YPD液体培养基

发酵培养基：无机盐培养基及4.35ml/LPTM₁微量元素溶液，初始发酵pH5.0。

PTM₁微量元素溶液(g/L)：CuSO₄·5H₂O6.0，KI0.08，MnSO₄·H₂O3.0，Na₂MoO₄·2H₂O0.2，H₃BO₃0.02，CoCl₂0.5，ZnCl₂20.0，FeSO₄7H₂O65.0，Biotin0.2，H₂SO₄5.0ml/L，混匀过滤除菌，4℃避光保存。

甘油补料培养基：甘油50％，4.35ml/LPTM₁微量元素溶液。

甲醇补料培养基：甲醇100％，4.35ml/LPTM₁微量元素溶液。

六、高密度发酵产品的检测及产率活性分析

蛋白酶K纯度比较实验(SDS-PAGE)，如图3所示，结果：蛋白酶K纯度超过99.2％(扫描SDS-PAGE胶)；

酶稳定性实验：(-20℃冷冻条件下，12个月的数据)，如图4所示，结果：干粉状态正确储存，一年内酶活保持不变；溶解状态酶活一年内降低小于2％。

七、发酵规模放大至中试规模；

种子培养：一级种子培养：将50ml种子培养基装入500ml的三角瓶中，用8层纱布包扎瓶口，灭菌后将平板上的菌落接种于三角瓶内，摇床转速200r/min，28℃培养36h。二级种子培养：将500ml种子培养基装入5L的三角瓶中，用8层纱布包扎瓶口，灭菌后将一级种子液接种于三角瓶内，摇床转速200r/min，28℃培养24h。

发酵培养：50L发酵罐培养：在50L发酵罐的发酵培养基初始装液量为330L，按照8％的接种量接入种子液，通气量控制在40L/min，搅拌转速500L/min。培养温度28℃，罐压0.04MPa，PH控制在5.8。200L发酵罐培养：在200L发酵罐的发酵培养基初始装液量为120L，按照6％的接种量接入种子液，搅拌转速400r/min将通气量控制在160L/min。培养温度28℃，罐压0.04MPa，PH控制在5.8。

补料组成：50％甘油，1.2％PTM1，加水至1L，116℃灭菌25min。发酵过程中补料速率如下所示。

补料液流加速度变化规律

八、酶的分离纯化和少量产品的分离纯化

1、缓冲液的配制

平衡缓冲液：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH7.8；

洗脱液缓冲液：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH7.8；

介质再生缓冲液：100mMNiSO₄；100mMEDTA；1MNaOH。

2、操作步骤

1)平衡柱子：先用分子级的水将柱子里的乙醇冲洗干净，然后用3-4倍柱体积的平衡缓冲液(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH7.8)平衡柱子，其中体积流量为1ml/min。

2)上样：将上清液用0.45um滤膜过滤去。除大分子杂质后，用泵抽取上样，体积流量为1ml/min。上样结束后，继续用平衡缓冲液冲洗色谱柱，直至基线走平。

3)洗脱：基线走平后，用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，500mM咪唑，pH7.8)以体积流量1mL/min的速度恒定洗脱，将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来，收集样品。

4)再生：收集样品后用100mMEDTA缓冲液作为流动相剥落镍离子，等颜色变白后，用五倍柱体积的分子级水冲洗，然后用五倍柱体积的1MNaOH清洗介质，再用水冲洗五倍柱体积；最后通入五个柱体积的NiSO₄溶液修饰介质，用水清洗未吸附的Ni²⁺至基线走平，最后用三倍柱体积的20％乙醇冲洗色谱柱并保存备用。

5)将收集到的样品电泳鉴定，结果如图5所示。

九、产品的生产

目前本公司已经实现了对蛋白酶K的中试化生产，其产品性能已达到甚至超过国外相关产品，具体结果如表2所示。

表2国内外厂家技术指标对照表

注：星号标注为未突变碱基。

2.优化后氨基酸序列与原始氨基酸序列比对：

注：*为氨基酸未经过突变，：.为突变后氨基酸性质较为相近

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

说明书核苷酸和氨基酸序列表

蛋白酶K氨基酸序列，亦即SEQIDNO.1为：

MRLSVLLSLLPLALGAPAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA。

Claims

1.基因工程改造蛋白酶K，其特征在于：将如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列在如下位点进行相应的突变：

2.一种如权利要求1所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，包括如下操作步骤：

S1:目的基因的获取；

S2:高效表达载体的构建；

S3:高效表达载体的诱导表达；

S4:活性检测；

S5:小规模的高密度发酵；

S6:高密度发酵产品的检测及产率活性分析；

S7:发酵规模放大至中试规模；

S8:酶的分离纯化；

S9:少量产品的分离纯化；

S10:发酵规模扩大；

S11:产品的生产。

3.如权利要求2所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：

步骤S1中合成目的基因后利用SalI酶切后线性化，通过电转化到毕赤酵母细胞中，配制四个G418浓度梯度的YPD筛选平板；进行培养的MD平板，用无菌牙签各挑取70个酵母单菌落，点在上述四个G418浓度梯度的YPD筛选平板中，并作相应编号；每个克隆均做4个梯度的筛选，利用PCR方法确定拷贝数。

4.如权利要求2所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：发酵过程中所用的各培养基为：

种子培养基：YPD液体培养基；

发酵培养基：无机盐培养基及4.35ml/LPTM₁微量元素溶液，初始发酵pH5.0；PTM₁微量元素溶液的组分为：CuSO₄·5H₂O6.0g/L，KI0.08g/L，MnSO₄·H₂O3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L，FeSO₄7H₂O65.0g/L，Biotin0.2g/L，H₂SO₄5.0ml/L，混匀过滤除菌，4℃避光保存；

甘油补料培养基：甘油50％，4.35ml/LPTM₁微量元素溶液；

甲醇补料培养基：甲醇100％，4.35ml/LPTM₁微量元素溶液。

5.如权利要求2所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：发酵培养包括：

种子培养：接种-80℃保存甘油菌到40mLYPD液体培养基中，30℃，280rpm震荡培养过夜后得一级种子，将一级种子按10％分别接种到装有200mLYPD液体培养基的两个1L摇瓶中，30℃，220rpm振荡培养20h后，得到二级种子；

甘油分批培养阶段扩增菌体：将上述400mL二级种子按5％加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，30℃，pH5.0，开始发酵培养，通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右，当DO陡然上升接近100％时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，开始转入短时间甘油补料分批阶段培养菌体；

甘油补料分批培养阶段扩增菌体：以12ml/h/L初始发酵液的速率流加50％甘油到发酵罐中，维持4h，同时提高搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右；停止补加甘油后，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态1h，然后转入甲醇诱导表达阶段，诱导过程中流加氨水维持pH恒定；

甲醇补料分批诱导表达阶段：“饥饿”期结束后甲醇流加速率先以1ml/h/L维持低速流加4h，以使工程菌适应以甲醇为唯一碳源的环境，再以每半小时增加10％的流速增到3ml/h/L至诱导结束，通过调节搅拌速度、通气量、罐压和甲醇流加速率等措施使DO值维持在20％～35％左右，开始诱导表达后，每4h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD₆₀₀和菌体湿重，并留上清用于蛋白分析。

6.如权利要求2所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：蛋白酶K纯化的具体操作为：

平衡柱子：先用分子级的水将柱子里的乙醇冲洗干净，然后用3-4倍柱体积的平衡缓冲液(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH7.8)平衡柱子，其中体积流量为1ml/min；

上样：将上清液用0.45um滤膜过滤去，除大分子杂质后，用泵抽取上样，体积流量为1ml/min，上样结束后，继续用平衡缓冲液冲洗色谱柱，直至基线走平；

洗脱：基线走平后，用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，500mM咪唑，pH7.8)以体积流量1mL/min的速度恒定洗脱，将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来，收集样品；

再生：收集样品后用100mMEDTA缓冲液作为流动相剥落镍离子，等颜色变白后，用五倍柱体积的分子级水冲洗，然后用五倍柱体积的1MNaOH清洗介质，再用水冲洗五倍柱体积；最后通入五个柱体积的NiSO₄溶液修饰介质，用水清洗未吸附的Ni²⁺至基线走平，最后用三倍柱体积的20％乙醇冲洗色谱柱并保存备用，将收集到的样品电泳鉴定。

7.如权利要求4所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：蛋白酶K纯化过程中所用的个缓冲液为：

平衡缓冲液：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH7.8；

洗脱液缓冲液：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH7.8；

介质再生缓冲液：100mMNiSO₄；100mMEDTA；1MNaOH。