CN112592931A - 一种生产重组蛋白酶k的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白酶K的重组表达载体、具有所述重组表达载体的宿主细胞以及生产重组蛋白酶K的方法。本发明通过设计表达载体，实现重蛋白酶K的高效表达，再采用优化的纯化方法对目标蛋白进行提纯，大幅缩短了目标蛋白的纯化流程与纯化时间，同时提高了目标蛋白的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。本发明为研发与生产蛋白酶K类似的或者其他蛋白类工具酶奠定了基础。

Description

一种生产重组蛋白酶K的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种生产重组蛋白酶K的方法。
背景技术
蛋白酶K(EC 3.4.21.14)来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium albumLimber)，是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶,由于它能降解角蛋白(keratin)，因此被命名为蛋白酶K。蛋白酶K由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，相对分子质量为28930,活性部位由D39、H69和S224组成，底物识别位点主要为G100-Y104和S132-G136两个片段。蛋白酶K包含两个二硫键(C34-C124，C179-C248)，两个色氨酸残基(W8，W212)和一个游离半胱氨酸(C73)。X射线晶体学研究表明，蛋白酶K的三维结构为一个明确的球形折叠。蛋白酶K属于α/β类蛋白质，包含6个α-螺旋，15个β-折叠和一个3/10螺旋。
蛋白酶K是一种高活性的广谱蛋白酶，蛋白酶K对天然蛋白质和非天然蛋白质都有较高的蛋白水解活性，并且这种酶在含有尿素或十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfonate，SDS)的环境中仍有较高的活性，正是由于蛋白酶的这一重要性质，蛋白酶K已在生物实验、洗漆行业及污水处理等方面得到广泛应用。
目前，常见的PK生产方法，主要从产PK的微生物中提取，该方法步骤繁琐，蛋白获取量低。因此，研发一种重组PK在毕赤酵母中的生产方法，实现高纯度重组PK的制备，从而节省实验步骤并减少成本，是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供蛋白酶K的重组表达载体，具有所述重组表达载体的宿主细胞以及生产重组蛋白酶K的方法。
第一方面，本发明提供一种蛋白酶K的重组表达载体，所述重组表达载体是在pPICZαA载体质粒中插入了编码蛋白酶K的核苷酸序列。本发明可用pPICZαA-PK表示该重组表达载体。
本发明通过大量实践发现，利用pPICZαA载体质粒获得的蛋白酶K的重组表达载体，可以实现蛋白酶K的高效表达。
在一些实施方式中，所述蛋白酶K为林伯氏白色念球菌的蛋白酶K。
在一些实施方式中，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列经过密码子优化，以利于在宿主细胞中表达。
在一些实施方式中，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：
GCCCCAGCTGTTGAACAAAGATCTGAAGCTGCTCCATTGATTGAAGCTAGAGGTGAAATGGTTGCTAACAAGTACATTGTTAAGTTTAAGGAAGGTTCAGCTTTGTCTGCTTTGGATGCTGCTATGGAAAAGATTTCTGGTAAACCAGATCATGTTTACAAGAACGTGTTTTCAGGTTTTGCTGCTACTTTGGATGAAAATATGGTTAGAGTTTTGAGAGCTCATCCTGATGTTGAATATATTGAACAAGATGCTGTTGTTACTATTAACGCAGCTCAAACTAACGCTCCTTGGGGTTTGGCTAGAATTTCTTCTACTTCTCCAGGTACTTCTACTTACTATTACGATGAATCTGCTGGTCAAGGATCTTGTGTTTACGTTATTGATACTGGAATTGAAGCTTCTCATCCAGAATTTGAAGGTAGAGCTCAAATGGTTAAGACTTACTACTACTCTTCTAGAGATGGTAATGGACATGGAACTCATTGTGCTGGTACTGTTGGATCTAGAACTTACGGAGTTGCTAAGAAAACACAATTGTTCGGTGTTAAGGTTTTGGATGATAACGGTTCTGGTCAATACTCAACTATTATTGCTGGTATGGATTTTGTTGCTTCTGACAAGAATAACAGAAATTGTCCTAAAGGAGTTGTTGCTTCTTTGTCTTTGGGTGGTGGTTACTCTTCATCAGTTAATTCTGCTGCTGCTAGATTGCAATCATCCGGTGTTATGGTTGCTGTTGCTGCTGGTAATAATAATGCTGATGCTAGAAATTACTCTCCAGCTTCAGAACCATCTGTTTGTACTGTTGGTGCTTCTGATAGATATGATAGAAGATCTTCTTTCTCTAACTACGGTTCTGTTTTGGATATTTTCGGTCCTGGTACTTCTATTTTGTCCACCTGGATTGGTGGTTCTACTAGATCTATTTCTGGTACTTCTATGGCTACTCCACATGTTGCTGGTTTAGCTGCCTATCTGATGACTTTGGGAAAAACTACTGCCGCTTCTGCTTGTAGATACATTGCTGATACTGCTAATAAGGGTGACTTGTCCAACATTCCTTTTGGTACTGTTAACTTGTTGGCTTACAACAATTACCAAGCTTAA
在一些实施方式中，所述重组表达载体中还插入了编码蛋白标签的核苷酸序列。本发明优选所述蛋白标签优选为His标签，以便于生产过程中进行蛋白纯化。
在一些实施方式中，所述重组表达载体采用包括如下步骤的方法制备而成：根据密码子优化后的核苷酸序列对蛋白酶K基因进行合成；将pPICZαA载体质粒通过酶切进行线性化，将线性化产物与合成蛋白酶K基因进行无缝构建，形成重组表达载体。
本发明还需要对重组表达载体进行验证，以便于筛选得到阳性克隆。所述验证可以采用本领域已知的方法。
在一些实施方式中，所述验证包括如下步骤：取10ul重组产物加入DH5α感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置3min，再加入400ulLB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养1h，涂布于含25ug/mL博莱霉素的LLB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含博莱霉素抗性的LLB培养基中；37℃、180rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并测序。所述测序可采用本领域已知的测序方法，如Sanger法等。
第二方面，本发明提供具有所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选为酵母。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母。
本发明提供的方法可以实现pPICZαA-PK重组表达载体在毕赤酵母中的高效表达。
第三方面，本发明提供利用所述重组表达载体或所述宿主细胞生产重组蛋白酶K的方法。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)将转入了所述重组表达载体的宿主细胞，涂布于博来霉素抗性的平板培养基上，培养过夜；
(2)挑取单菌落置于博来霉素抗性的液体培养基中培养，加入诱导剂诱导蛋白表达，得发酵液；
(3)对所述发酵液进行过滤，去除菌体，收集上清，纯化。
在一些实施方式中，步骤(1)所述培养过夜在30℃下进行，平板培养皿应倒置。
在一些实施方式中，步骤(2)中对单菌落在液体培养基中培养具体为：刮取菌落接入YPD液体培养基中，待OD600达到4.0～8.0时直接将种液接入酵母发酵培养基中培养。
在一些实施方式中，所述步骤(2)中发酵期间氨水控制pH值为4.5～5.5，溶氧维持在20％-35％之间。
在一些实施方式中，所述步骤(2)中发酵期间当溶氧回升至80％以上时开始补加甘油培养基，当菌浓达180-220g/L时，停止补加甘油培养基。
在一些实施方式中，所述甘油培养基包含质量百分比为45～55％的甘油以及浓度为3.5～5ml/L的微量元素PTM1。
在一些实施方式中，所述步骤(2)中发酵期间当溶氧回升至100％时，饥饿半小时后，开始补加甲醇诱导培养基，诱导表达40～55小时后放罐。
在一些实施方式中，所述甲醇诱导培养基为包含3.5～5ml/L微量元素PTM1的甲醇溶液。
本发明提供的方法还可以对诱导表达之前和之后的菌体进行检测，以确保诱导成功。所述检测可以采用本领域已知的方法。
在一些实施方式中，所述检测包括如下步骤：挑取平板上单菌落置于含博来霉素抗性的YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于100ml含博来霉素的BMGY培养基中，继续培养24h，离心收集菌体转入BMMY培养基中，于30℃培养120h诱导蛋白表达；分别取诱导表达之前和之后的菌液，分别在8000rpm条件下离心20min收集上清，加入5×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm条件下离心5min，取20ul处理好样品进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化。
在一些实施方式中，步骤(3)所述过滤包括：先采用孔径小于1微米的滤膜过滤(如陶瓷膜)，再采用孔径小于25KDa的滤膜(如超滤膜)过滤。
在一些实施方式中，步骤(3)所述纯化包括将所述上清过亲和层析柱，优选为镍离子金属螯合亲和层析柱Ni2+-NTA。
在一些实施方式中，所述亲和层析柱在使用前应重复洗涤，然后用缓冲液平衡亲和层析柱。
在一些实施方式中，所述纯化包括：将所述上清加入到所述亲和层析柱中，用含有70～90mM咪唑的缓冲液洗涤以去除杂蛋白,然后用含有400～600mM咪唑的缓冲液洗脱，得到含有目的蛋白的溶液。
在一些实施方式中，所述纯化使用的缓冲液为NAT缓冲液，具体组成为：20mMTris-HCl pH7.9，0.5M NaCl。
本发明采用优化的方法对蛋白酶K进行提纯，整个纯化过程操作简便，大幅缩短了蛋白酶K的纯化流程与纯化时间，同时提高了蛋白酶K的纯度、得率和酶活，并且融合有His标签的蛋白酶K可对带有His标签的靶蛋白进行酶切后纯化，收集酶切后Ni柱流出液即可得到浓度及纯度较高的天然蛋白，与其他的酶切纯化方式相比节省实验步骤并减少成本。
本发明对于纯化所得的蛋白溶液，可以采用SDS-PAGE进行检测。
附图说明
图1为重组蛋白酶K诱导前和诱导后电泳结果对比图；其中，泳道1代表诱导前的上清液；泳道2代表诱导后的上清液。
图2为蛋白酶K超滤浓缩前后结果对比图；其中，泳道1代表超滤前的样品；泳道2代表超滤后的样品。
图3为蛋白酶K亲和层析纯化后电泳检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：pPICZαA-PK重组载体的构建
根据林伯氏白色念球菌蛋白酶K基因密码子优化后的基因序列，蛋白酶K直接进行基因合成；将pPICZαA载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物。
取20ul重组产物转移到DH5α感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入400ul LLB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养1h，涂布于含博来霉素的LLB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；使用灭菌牙签从LLB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含博来霉素抗性的LLB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。
实施例2:蛋白酶K的诱导表达与鉴定
将经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的pPICZαA-PK质粒酶切线性化后转入感受态毕赤酵母中，涂布于含博来霉素抗性的YPD平板上，30℃倒置培养72h。
使用灭菌牙签挑取YPD平板上单菌落置于含博来霉素抗性的YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于BMGY培养基中，继续培养24h；将BMGY培养好菌液离心收集菌体，弃上清后将菌体转入等体积BMMY培养基中，诱导培养120h。
取诱导表达的菌液，在8000rpm条件下离心20min收集上清，加入5×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm条件下离心5min，取20ul电泳缓液样品进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化。
结果如图1所示。该结果显示，在诱导表达后的菌体中出现与PK理论分子量一致的表达条带，而诱导前的菌体中没有该条带存在，证明了PK表达正常。
实施例3：蛋白酶K发酵
将阳性PK毕赤酵母菌液涂YPD平板，YPD平板30℃培养20小时，刮取菌落接入YPD液体培养基中，待OD600达到6.0时直接将种液接入酵母发酵培养基中。发酵期间氨水控pH5.0，溶氧维持在20％-35％之间。发酵溶氧回升至80％以上时开始补加甘油培养基，当菌浓达180-220g/L时，停止补加甘油培养基。当溶氧回升至100％时饥饿半小时后开始补加甲醇诱导培养基，诱导48小时后放罐。
其中，甘油培养基为甘油50％(质量百分比)，加入PTMI4.35ml/L；甲醇诱导培养基为甲醇100％，加入PTMI 4.35ml/L。
实施例4：蛋白酶K纯化
取实施例3发酵所得的发酵液，使用陶瓷膜(孔径小于1微米)过滤除去菌体，收集上清；将陶瓷膜过滤收集的上清使用超滤膜(孔径小于25KDa)浓缩除去部分溶液(浓缩前后样品的SDS-PAGE结果如图2所示)。
使用5倍柱体积纯水洗涤层析柱，重复洗涤两次，接着用5倍柱体积的NAT-0缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)平衡层析柱。
将超滤膜浓缩获得的上清加入到Ni2+-NTA层析柱中，反复加入2-3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白,最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱目的蛋白，从而制得纯化的PK。
纯化后蛋白溶液的SDS-PAGE结果如图3所示。由该图结果可知，目标蛋白在溶液中富集。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
<120> 一种生产重组蛋白酶K的方法
<130> RYP2011024.0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 蛋白酶K
<400> 1
gccccagctg ttgaacaaag atctgaagct gctccattga ttgaagctag aggtgaaatg 60
gttgctaaca agtacattgt taagtttaag gaaggttcag ctttgtctgc tttggatgct 120
gctatggaaa agatttctgg taaaccagat catgtttaca agaacgtgtt ttcaggtttt 180
gctgctactt tggatgaaaa tatggttaga gttttgagag ctcatcctga tgttgaatat 240
attgaacaag atgctgttgt tactattaac gcagctcaaa ctaacgctcc ttggggtttg 300
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tacattgctg atactgctaa taagggtgac ttgtccaaca ttccttttgg tactgttaac 1080
ttgttggctt acaacaatta ccaagcttaa 1110

Claims (10)

1.蛋白酶K的重组表达载体，其特征在于，在pPICZαA载体质粒中插入了编码蛋白酶K的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述蛋白酶K为林伯氏白色念球菌的蛋白酶K；
优选地，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列经过密码子优化；
优选地，所述编码蛋白酶K的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中还插入了编码蛋白标签的核苷酸序列，所述蛋白标签优选为His标签。
4.具有权利要求1～3任意一项所述重组表达载体的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞为酵母，优选为毕赤酵母。
5.利用权利要求1～3任意一项所述重组表达载体或权利要求4所述宿主细胞生产重组蛋白酶K的方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将转入了所述重组表达载体的宿主细胞，涂布于博来霉素抗性的平板培养基上，培养过夜；
(2)挑取单菌落置于博来霉素抗性的液体培养基中培养，加入诱导剂诱导蛋白表达，得发酵液；
(3)对所述发酵液进行过滤，去除菌体，收集上清，纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，发酵期间氨水控制pH值为4.5～5.5，溶氧维持在20％-35％之间；
和/或，发酵期间当溶氧回升至80％以上时开始补加甘油培养基，当菌浓达180-220g/L时，停止补加甘油培养基；
和/或，发酵期间当溶氧回升至100％时，饥饿半小时后，开始补加甲醇诱导培养基，诱导表达40～55小时后放罐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甘油培养基包含质量百分比为45～55％的甘油以及浓度为3.5～5ml/L的微量元素PTM1；
和/或，所述甲醇诱导培养基为包含3.5～5ml/L微量元素PTM1的甲醇溶液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过滤包括：先采用孔径小于1微米的滤膜过滤，再采用孔径小于25KDa的滤膜过滤。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化包括将所述上清过亲和层析柱，优选为镍离子金属螯合亲和层析柱Ni2+-NTA；
优选地，所述纯化包括：将所述上清加入到所述亲和层析柱中，用含有70～90mM咪唑的缓冲液洗涤以去除杂蛋白,然后用含有400～600mM咪唑的缓冲液洗脱，得到含有目的蛋白的溶液。
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