CN110642921A - 一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法 - Google Patents

一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纯化重组人源细胞株蛋白(rhCygb)的方法，涉及蛋白纯化技术领域。本发明所述方法，将含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液依次经过除盐柱、阴离子层析柱、复合阴离子层析柱和疏水柱，再重复经过除盐柱、阴离子层析柱和复合阴离子层析柱，最后再经过凝胶过滤柱。本发明所述方法，可有效去除绝大多数带有负电荷的宿主蛋白质和核酸，使其对后续的纯化步骤的影响降到最低；去除与目的蛋白质电荷性质、疏水性相近的杂蛋白；去除绝大多数色素类物质，最后去除痕量杂蛋白及相关物质，最终使产品纯度达到95％以上。本发明所述方法所采用的层析方法容易放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。

Description

一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法。
背景技术
细胞株蛋白最早于2001年在大鼠星状细胞发现。该蛋白在正常内脏器官中均有表达，但是在肝星状细胞活化的过程中或缺氧的情况下表达明显的上调。通过同源比对，在人的肝脏基因组中又发现了类似蛋白，其核苷酸序列与鼠源的核苷酸序列有97％的同源性，该基因(GenBank AB057769)位于17号染色体，编码190个氨基酸残基。其后证实，Cygb在各种组织中广泛表达，尤其以心脏、胃、膀胱和小肠显著，由此正式被命名为Cygb。
近十余年来已有研究发现Cygb具有以下重要生物学功能：1)携氧与贮氧功能；2)氧感受器功能；3)氧传递系统；4)基因转录调控功能；5)参与胶原合成。由于Cygb主要在结缔组织的成纤维细胞和相关细胞中表达，表明它与胶原代谢有关，因此拓宽了Cygb在医学及生物学研究领域的应用，尤其是在肝纤维化研究方面。已有学者使用Cygb对肝纤维化患者肝细胞进行免疫组化标记从而有助于肝纤维化的诊断。还有学者根据缺氧可诱导Cygb在胰岛β细胞表达的特性，认为诱导Cygb过表达可以通过防止缺血细胞死亡从而改善胰岛移植的细胞存活率和功能。
目前已有研究证实了重组人细胞株蛋白具有预防和逆转肺纤维化(发明专利公开号：201710685009.4)，以及治疗高血脂及动脉粥样硬化(发明专利公开号：ZL201410247879.X)等效果。重组人细胞株蛋白的纯度直接影响着临床疗效，以及工业化生产的成本，因此本领域存在着获得高纯度、高活性，经济性好、易于商业化获得和线性比放大的重组人细胞株蛋白的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法，得到的重组人细胞株蛋白纯度高，对于未来的药物制备应用具有重要的意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液过除盐柱后，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第一洗脱液；
(2)将所述第一洗脱液流过阴离子交换层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第二洗脱液；
(3)将所述第二洗脱液流过复合阴离子层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第三洗脱液；
(4)将所述第三洗脱液流过疏水层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第四洗脱液；
(5)将所述第四洗脱液重复步骤(1)～(4)的过柱和洗脱步骤，得含有重组人源细胞株蛋白的培养液；
(6)将所述含有重组人源细胞株蛋白的培养液流过凝胶过滤柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，置换于缓冲液中，得纯化重组人源细胞株蛋白。
优选的，步骤(1)所述除盐柱为G25层析柱，洗脱液为50mM TE溶液。
优选的，步骤(2)所述阴离子交换层析柱为Q FF层析柱，洗脱液为包含10mM TE和0.1M NaCl的水溶液。
优选的，步骤(3)所述复合阴离子层析柱为MIXA层析柱，洗脱液包括洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C，所述洗脱缓冲液A为包含10mM TE和0.1M NaCl的水溶液；所述洗脱缓冲液B为包含10mM TE和0.5M NaCl的水溶液；所述洗脱缓冲液C为包含10mM TE和2MNaCl的水溶液。
优选的，步骤(4)所述疏水层析柱为丁基硫疏水层析柱或Butyl-s Bedtarose FF层析柱，洗脱液包括洗脱缓冲液1、洗脱缓冲液2和洗脱缓冲液3；所述洗脱缓冲液1为包含10mM TE和质量体积比为15％(NH4)2SO4的水溶液；所述洗脱缓冲液2为包含10mM TE和质量体积比为10％(NH4)2SO4的水溶液；所述洗脱缓冲液3为包含10mM TE和质量体积比为2％(NH4)2SO4的水溶液。
优选的，步骤(6)所述凝胶过滤柱为GE sepharycl S100 Rustion层析柱，洗脱液为10mM PBS溶液。
优选的，步骤(1)所述含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液的制备方法，包括：1)将表达CYGB蛋白的基因连接到质粒pet-28a中，转化大肠杆菌，得PET28a-rhCygb-BL21表达体系，利用IPTG诱导蛋白产生，菌液离心后，收集菌体沉淀；
2)将所述菌体沉淀破碎后，离心收集上清；
3)向所述上清中加入饱和度为65％的的(NH4)2SO4，静置，离心后弃上清收集沉淀；
4)利用10mM的TE溶液复溶所述沉淀，离心后收集上清，得含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液。
优选的，步骤1)所述连接时的基因扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法，将含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液依次经过除盐柱、阴离子层析柱、复合阴离子层析柱和疏水柱，再重复经过除盐柱、阴离子层析柱和复合阴离子层析柱，最后再经过凝胶过滤柱。本发明所述方法中采用阴离子层析，可有效去除绝大多数带有负电荷的宿主蛋白质和核酸，使其对后续的纯化步骤的影响降到最低；接下来利用复合阴离子结合模式去除了与目的蛋白质电荷性质、疏水性相近的杂蛋白；后续疏水层析富集蛋白的同时去除了绝大多数色素类物质，最后经过凝胶过滤纯化，去除痕量杂蛋白及相关物质，最终使产品纯度达到95％以上。本发明所述方法所采用的层析方法容易放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。
附图说明
图1为将表达rhCygb蛋白的基因连接到pet-28a后的质粒图谱；
图2为rhCygb表达载体测序鉴定结果；
图3为PCR扩增后产物验证结果；
图4为诱导表达系统评估结果图；
图5为(NH4)2SO4沉淀后上清过G25电泳图；
图6为Q阴离子交换柱洗脱电泳图；
图7为经过Q柱洗脱样品上MIX-A柱洗脱电泳图；
图8为MIX-A柱洗脱样品上C4柱洗脱电泳图；
图9为C4洗脱样品上MIX-A柱洗脱电泳图；
图10为经纯化后的CYGB蛋白质量检测电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液过除盐柱后，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第一洗脱液；
(2)将所述第一洗脱液流过阴离子交换层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第二洗脱液；
(3)将所述第二洗脱液流过复合阴离子层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第三洗脱液；
(4)将所述第三洗脱液流过疏水层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第四洗脱液；
(5)将所述第四洗脱液重复步骤(1)～(4)的过柱和洗脱步骤，得含有重组人源细胞株蛋白的培养液；
(6)将所述含有重组人源细胞株蛋白的培养液流过凝胶过滤柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，置换于缓冲液中，得纯化重组人源细胞株蛋白。
在本发明所述方法中，将含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液过除盐柱后，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第一洗脱液。本发明所述含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液的制备方法，优选包括：1)将表达CYGB蛋白的基因连接到质粒pet-28a中，转化大肠杆菌，得PET28a-rhCygb-BL21表达体系，利用IPTG诱导蛋白产生，菌液离心后，收集菌体沉淀；
2)将所述菌体沉淀破碎后，离心收集上清；
3)向所述上清中加入饱和度为65％的的(NH4)2SO4，静置，离心后弃上清收集沉淀；
4)利用10mM的TE溶液复溶所述沉淀，离心后收集上清，得含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液。
本发明步骤1)所述连接时的基因扩增引物优选包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(28a-F-NcoI：CATGCCATGGAGAAAGTGCCAGGCGA)，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(28a-R-XhoI：GGGCTCGAGTTACGGCCCCGAAGAGGGCA)。利用所述引物进行扩增时的序列，以为50μL体系计，优选包括：
Figure BDA0002242618730000051
本发明所述扩增的程序优选包括：94℃预变形2min；95℃变性15s，52℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸5min，16℃保存。
本发明将所述基因连接到质粒pet-28a中后，其质粒图谱如图1所示，将所示的质粒转化大肠杆菌，得PET28a-rhCygb-BL21表达体系，如图2所示，Cygb表达载体测序鉴定结果完全正确，没有发生碱基突变，然后利用IPTG诱导蛋白产生。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。本发明所述利用IPTG诱导蛋白产生优选的包括以下步骤：将PET28a-rhCygb-BL21菌涂Kan(+)的LB培养平板，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落接种于20mL Kan(+)LB培养液中，16℃、180rpm振荡培养过夜。将20mL菌液按1:100比转接到2L新鲜Kan(+)LB液体液，摇菌培养至OD590达到0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L，诱导表达4h即可。本发明将上述低温诱导表达后的菌液进行离心，收集菌体沉淀，所述离心的转速优选为5000rpm，所述离心的时间优选为10min。
本发明将所述菌体沉淀破碎后，离心收集上清。本发明对所述破碎的方法并没有特殊限定，优选在高压匀质机中进行，并将破碎后的菌体离心，所述离心优选在4℃下进行，转速优选为12000rmp，所述离心的时间优选为45min。
得上清后，本发明向所述上清中加入饱和度为65％的的(NH4)2SO4，静置，离心后弃上清收集沉淀。本发明所述静置的时间优选为45min。本发明在静置后离心，所述离心的转速优选为12000rmp，所述离心的时间优选为30min。
得沉淀后，本发明利用10mM的TE溶液复溶所述沉淀，离心后收集上清，得含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液。本发明所述TE溶液的体积优选为所述上清体积的1/2，所述TE溶液的pH值优选为8.0。本发明在所述复溶后离心，所述离心的转速优选为12000rmp，所述离心的时间优选为10min。本发明所述细菌培养液的获得过程也是目的蛋白的初步纯化过程。
本发明将所述含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液过除盐柱，所述除盐柱优选为G25层析柱，洗脱液优选为50mM TE溶液。本发明所述过除盐柱时的上样流速优选为10mL/min。
得第一洗脱液后，本发明将所述第一洗脱液流过阴离子交换层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第二洗脱液。本发明所述阴离子交换层析柱优选为Q FF层析柱，洗脱液优选为包含10mM TE和0.1M NaCl的水溶液。本发明所述过阴离子交换层析柱时的上样流速优选为2mL/min；洗脱流速优选为3mL/min。
得第二洗脱液后，本发明将所述第二洗脱液流过复合阴离子层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第三洗脱液。本发明所述复合阴离子层析柱优选为MIXA层析柱，洗脱液优选包括洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C，所述洗脱缓冲液A优选为包含10mMTE和0.1M NaCl的水溶液；所述洗脱缓冲液B优选为包含10mM TE和0.5M NaCl的水溶液；所述洗脱缓冲液C优选为包含10mM TE和2MNaCl的水溶液。本发明所述过复合阴离子层析柱的上样流速优选为2mL/min；洗脱流速优选为3mL/min。
得第三洗脱液后，本发明将所述第三洗脱液流过疏水层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第四洗脱液。本发明所述疏水层析柱优选为丁基硫疏水层析柱或Butyl-sBedtarose FF层析柱，洗脱液包括洗脱缓冲液1、洗脱缓冲液2和洗脱缓冲液3；所述洗脱缓冲液1为包含10mM TE和质量体积比为15％(NH4)2SO4的水溶液；所述洗脱缓冲液2为包含10mM TE和质量体积比为10％(NH4)2SO4的水溶液；所述洗脱缓冲液3为包含10mM TE和质量体积比为2％(NH4)2SO4的水溶液。本发明在过疏水层析柱时的上样流速优选为2mL/min；洗脱流速优选为3mL/min。本发明在所述洗脱时，优选先用洗脱缓冲液2洗涤杂蛋白，用洗脱缓冲液3洗脱目的蛋白。
得第四洗脱液后，本发明将所述第四洗脱液重复步骤(1)～(4)的过柱和洗脱步骤，得含有重组人源细胞株蛋白的培养液。
得含有重组人源细胞株蛋白的培养液，本发明将所述含有重组人源细胞株蛋白的培养液流过凝胶过滤柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，置换于缓冲液中，得纯化重组人源细胞株蛋白。本发明所述凝胶过滤柱优选为GE sepharycl S100 Rustion层析柱，洗脱液为10mM PBS溶液。本发明在过所述凝胶过滤柱时的流速优选为1mL/min。
下面结合实施例对本发明提供的一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)载体构建
将CYGB基因连接质粒pet-28a中(如图1所示)
反应体系：
引物：
28a-F-NcoI：CATGCCATGGAGAAAGTGCCAGGCGA(SEQ ID No.1)
28a-R-XhoI：GGGCTCGAGTTACGGCCCCGAAGAGGGCA(SEQ ID No.2)
50μl反应体系：
Figure BDA0002242618730000081
扩增程序：94℃预变形2min；95℃变性15s，52℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸5min，16℃保存。对表达载体测序鉴定结果完全正确，没有发生碱基突变，结果如图2，其中query为本实施例中克隆得到的CYGB基因，如SEQ ID NO.3所示，sbjct为NCBI中登录的CYGB基因序列(NM-134268.4)。对PCR产物进行验证，结果如图3所示，在581bp处有清晰条带。
重组蛋白的诱导表达
将PET28a-rhCygb-BL21(DE3)菌涂Kan(+)的LB培养平板，37℃恒温培养过夜。挑取单菌落接种于20mlKan(+)LB培养液中，16℃、180rpm振荡培养过夜。将20ml菌液按1:100比转接到2L新鲜Kan(+)LB液体液，摇菌培养至OD590达到0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L，诱导表达4h后，将菌液以5000rpm离心10min收取沉淀。
对上述诱导表达系统进行评估，结果如图4所示，经诱导后可在菌中表达目的蛋白。
(2)纯化工艺：
2.1试剂配制：
1M TE缓冲液：Tris 121g，乙二胺四乙酸二钠，HCl调pH值到8.0，定容至1L。
PB:NaH2PO40.3g，Na2HPO41.5g，定容至1L。
10mM TE:10mL 1M TE，加水定容至1L。
Q柱缓冲液：
10mM TE+0.1M NaCl
MIX-A柱缓冲液：
缓冲液A:10mM TE+0.1M NaCl
缓冲液B:10mM TE+0.5M NaCl
缓冲液C:10mM TE+2M NaCl
C4柱缓冲液：
缓冲液1:10mM TE+15％(NH4)2SO4
缓冲液2:10mM TE+10％(NH4)2SO4
缓冲液3:10mM TE+2％(NH4)2SO4
2.2初纯工艺：
2.2.1菌体破碎：
菌体高压匀质机破碎，经破碎后菌体，4℃，12000rmp离心45min，取上清。
2.2.2硫酸铵沉淀：
上清中加入65％(饱和度)硫酸铵溶液，充分溶解。静置45min，12000rmp离心30min，弃上清留沉淀。取原上清体积的1/2的10mM pH 8.0 TE将沉淀复溶，12000rmp离心10min后弃沉淀，上清即为初纯液。
2.2精纯工艺：
2.2.1 G25除盐
层析填料：博格隆层析柱BXK26/100，博格隆Bestdex G-25 M。
层析柱处理：10mL/min流速用10mM TE处理5CV，用0.5M NaOH处理5CV，用10mM TE平衡至流出液pH值与平衡液相同。
样品上样：以10mL/min流速上样，上样体积为40mL。
对过G25除盐柱后的上清液进行验证，结果如图5所示，在21KDa处为rhCygb条带，但任含有大量杂质。
2.2.2 Q阴离子交换层析
层析填料：Hi trap 5mL Q FF。
层析柱处理：3mL/min流速用10mM TE处理10CV，用0.5M NaOH处理5CV，用10mM TE平衡至流出液pH值与平衡液相同。
上样样品：G25除盐后样品。
上样流速：2mL/min
上样量：约60mg
洗脱流速：3mL/min
洗脱方式：等度洗脱
洗脱缓冲液：10mM TE+0.1M NaCl
对过柱后的上清液进行验证，结果如图6所示，其中泳道1为利用0.1M NaCl进行洗脱，泳道2为利用2MNaCl进行洗脱，可见在21KDa处均有rhCygb条带，并且用0.1M NaCl洗脱液能更好的洗脱rhCygb。
2.2.3 MIX-A复合阴离子层析
层析填料：Diamond MIX-A 5mL
层析柱处理：3mL/min流速用10mM TE处理10CV，用0.5M NaOH处理5CV，用10mM TE平衡至流出液pH值与平衡液相同。
上样样品：Q柱0.1M NaCl洗脱样品。
上样流速：2mL/min
上样量：约40mg
洗脱流速：3mL/min
洗脱方式：等度洗脱
洗脱缓冲液A：10mM TE+0.1M NaCl
洗脱缓冲液B：10mM TE+0.5M NaCl
洗脱缓冲液C：10mM TE+2M NaCl
对过Q柱洗脱样品上MIX-A柱洗脱后进行电泳，结果如图7所示，其中泳道1为利用0.1M NaCl洗脱，泳道2为利用0.5M NaCl洗脱，泳道3为利用2M NaCl洗脱，泳道4为利用0.5MNaCl洗脱，可见在21KDa处均有rhCygb条带，并且用2M NaCl洗脱液效果最好。
2.2.4 C4疏水层析
层析填料：Butyl-s Bedtarose FF 5mL
层析柱处理：3mL/min流速用10mM TE处理10CV，用0.5M NaOH处理5CV，用10mM TE+15％(NH4)2SO4平衡至流出液pH值与平衡液相同。
上样样品：MIX-A柱洗脱缓冲液1、2、3洗脱样品。
上样流速：2mL/min
上样量：约30mg
洗脱流速：3mL/min
洗脱方式：等度洗脱，先用洗涤缓冲液2洗涤杂蛋白，用洗脱缓冲液3洗脱目的蛋白。
平衡缓冲液1:10mM TE+15％(NH4)2SO4
洗涤缓冲液2:10mM TE+10％(NH4)2SO4
洗脱缓冲液3:10mM TE+2％(NH4)2SO4
对MIX-A柱洗脱样品上C4柱洗脱进行电泳，结果如图8所示，其中泳道1为利用10％(NH4)2SO4进行洗脱的结果，泳道2为利用2％(NH4)2SO4进行洗脱的结果，可见在21KDa处均有rhCygb条带，并且用2％(NH4)2SO4洗脱液效果最好。
2.2.5G25除盐
层析柱、填料：博格隆层析柱BXK26/100，博格隆Bestdex G25。
层析柱处理：10mL/min流速用10mM TE处理5CV，用0.5M NaOH处理5CV，用10mM TE平衡至流出液pH值与平衡液相同。
上样样品：C4柱在10mM TE+2％(NH4)2SO4洗脱下的蛋白。
样品要求：10mL/min流速
上样体积＜40mL。
2.2.6 MIX-A复合阴离子层析
层析填料：Diamond MIX-A 5mL
层析柱处理：3mL/min流速用10mM TE处理10CV，用0.5M NaOH处理5CV，用10mM TE平衡至流出液pH值与平衡液相同。
上样样品：C4柱2％(NH4)2SO4洗脱后过G25的蛋白。
上样流速：2mL/min
上样量：约20mg
洗脱流速：3mL/min
洗脱方式：梯度洗脱，B液经20CV由0％变为100％，弃去峰前约一半(约整个峰1/4)，收集峰前后一半和整个峰后(约整个峰3/4)。
洗脱缓冲液A：10mM TE+0.1M NaCl
洗脱缓冲液B：10mM TE+2M NaCl
对C4洗脱样品上MIX-A柱洗脱后进行电泳，结果如图9所示，在21KDa处为rhCygb条带，未见其他明显杂质。
2.2.7S100凝胶过滤
层析填料：博格隆层析柱BXK16/100，GE sepharycl S100 Rustion。
层析柱处理：1mL/min流速用PB处理5CV，用0.5M NaOH处理1CV，用PB平衡至流出液pH值与平衡液相同。
上样样品：MIX-A梯度洗脱洗下来样品。
样品要求：1mL/min流速，上样体积1mL。
实施例2
对利用实施例1中的纯化方法得到的重组人细胞株蛋白进行了以下质量研究：
(1)纯度
利用Image J软件分析，SDS-PAGE纯度>95％(见图10)。图中中间泳道为Maker，泳道1(上样量5μg)和泳道3(上样量10μg)为重组人细胞株蛋白。
(2)内毒素分析
采用内毒素检测试剂盒检测，残留<5EU/m，符合中国药典(2015年版)要求。
本发明提供了一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法，可获得纯度大于95％的重组人细胞株蛋白，适合于制备纯度高的重组人细胞株蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgccatgg agaaagtgcc aggcga 26
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggctcgagt tacggccccg aagagggca 29
<210> 3
<211> 979
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaactaagc ttcctttcgg gctttgttag cagccggatc tcagtggtgg tggtggtggt 60
gctcgagtta cggccccgaa gagggcagtg tggccggtgg ggtggtggcg ttggggacct 120
gctgcaccca gcccacttcc ttgtaggcag cggtcacgtg gctgtagatg aggccacgca 180
gcttggccca ggctctctgc gtctcaggtg ggaagtcact ggcaaattcc tcggcgacca 240
cctccagaat gaccccagag aggatcttga agtacaccgg ttccaccttg tgcttgaggg 300
cgtgggcttt ccccacaagg gcgagcacag aggacacctt gtcggggtca tgcaggttct 360
ccacgacagt gttgagggcc cccatgactc ggcaggcgtg cttccgcagc tgggggctcc 420
gctccatctc caggggatcc tccatgtgct tgaactggct gaagtactgc ttggccgagg 480
ggaagttcac aaagaacctc accaggatgg ccacccccac gtcctcgcag ttggcataga 540
gccgggccca catagcctgc accgccttcc tctccgcctc ggacagctcc tcgctccgct 600
ccctgcgctc gatctccatc tcgcctggca ctttctccat ggtatatctc cttcttaaag 660
ttaaacaaaa ttatttctag aggggaattg ttatccgctc acaattcccc tatagtgagt 720
cgtattaatt tcgcgggatc gagatctcga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca 780
tcaccggcgc cacaggtggc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgaaggggga 840
agatcgggct cgccacttcg ggctcatgaa cgcttgtttc ggcgggggaa tgggggcagg 900
ccccggggcc gggggaatgg tgggcgccat ctccttggat ggcccattcc ttgggggggg 960
ggggtcaacg gctcaacca 979

Claims (8)

1.一种纯化重组人源细胞株蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液过除盐柱后，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第一洗脱液；
(2)将所述第一洗脱液流过阴离子交换层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第二洗脱液；
(3)将所述第二洗脱液流过复合阴离子层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第三洗脱液；
(4)将所述第三洗脱液流过疏水层析柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，得第四洗脱液；
(5)将所述第四洗脱液重复步骤(1)～(4)的过柱和洗脱步骤，得含有重组人源细胞株蛋白的培养液；
(6)将所述含有重组人源细胞株蛋白的培养液流过凝胶过滤柱，采用等度洗脱方法收集洗脱峰，置换于缓冲液中，得纯化重组人源细胞株蛋白。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述除盐柱为G25层析柱，洗脱液为50mM TE溶液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述阴离子交换层析柱为Q FF层析柱，洗脱液为包含10mM TE和0.1M NaCl的水溶液。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述复合阴离子层析柱为MIXA层析柱，洗脱液包括洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C，所述洗脱缓冲液A为包含10mMTE和0.1M NaCl的水溶液；所述洗脱缓冲液B为包含10mM TE和0.5M NaCl的水溶液；所述洗脱缓冲液C为包含10mM TE和2M NaCl的水溶液。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述疏水层析柱为丁基硫疏水层析柱或Butyl-s Bedtarose FF层析柱，洗脱液包括洗脱缓冲液1、洗脱缓冲液2和洗脱缓冲液3；所述洗脱缓冲液1为包含10mM TE和质量体积比为15％(NH4)2SO4的水溶液；所述洗脱缓冲液2为包含10mM TE和质量体积比为10％(NH4)2SO4的水溶液；所述洗脱缓冲液3为包含10mMTE和质量体积比为2％(NH4)2SO4的水溶液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(6)所述凝胶过滤柱为GE sepharyclS100 Rustion层析柱，洗脱液为10mM PBS溶液。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液的制备方法，包括：
1)将表达CYGB蛋白的基因连接到质粒pet-28a中，转化大肠杆菌，得PET28a-rhCygb-BL21表达体系，利用IPTG诱导蛋白产生，菌液离心后，收集菌体沉淀；
2)将所述菌体沉淀破碎后，离心收集上清；
3)向所述上清中加入饱和度为65％的的硫酸铵，静置，离心后弃上清收集沉淀；
4)利用10mM的TE溶液复溶所述沉淀，离心后收集上清，得含有重组人源细胞株蛋白的细菌培养液。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤1)所述连接时的基因扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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