CN112745385A - 重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用 - Google Patents

重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用。本发明提供了一种衍生自人I型胶原蛋白的人源化胶原蛋白(rHLC)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列可以作为核心单元进行3‑25个重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子。本发明的人源化胶原蛋白设计的rHLC分子序列来自于人I型胶原蛋白，具有极大的水溶性和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且促增殖作用显著；设计的rHLC分子在大肠杆菌宿主内可以高效的表达，产量达到0.5g/L～1.5g/L；rHLC的发酵工艺培养基成本低廉成分明确，发酵周期较短，控制简单，易于工艺放大；开发的rHLC纯化方法操作简单，成本低，效果好，工艺稳定，纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准，生产工艺可满足产业化生产需求，可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品。

Description

重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用
技术领域
本发明属于基因工程、蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白分子(recombinant human like collagen，简称rHLC)的表达及纯化制备方法。
背景技术
胶原蛋白是人体中含量最为丰富的蛋白质，占人体总蛋白质的25-30％，主要存在于人体的皮肤、骨骼、软骨、牙齿、肌腱、韧带，是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，起着支撑器官，保护机体的功能。胶原蛋白种类很多，常见的类型包括：I型、II型、III型、V型和XI型，其中I型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱等组织中，是含量最多的胶原蛋白类型。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性(促进伤口恢复、凝血等)，因此在食品、医疗、组织工程、化妆品中有着非常广泛的应用。目前应用最为广泛的胶原蛋白是I型胶原蛋白。
目前应用的胶原蛋白主要来自于动物组织的提取或人胶原(胎盘组织提取、骨骼等)，其中通过动物组织提取胶原是最主要的手段，成本也较低，但是通过该方法获得的胶原蛋白一般水溶性较差、具有潜在的病毒传染性风险、免疫原性较高、胶原产品质量控制难度高等缺点。通过基因工程的手段制备人源化胶原蛋白分子则可以规避这些缺点，但是天然的胶原蛋白分子过大，无法或很难通过基因工程手段直接生产，而通过生产与天然胶原蛋白序列相似、分子量更小的人源化胶原蛋白分子则是在技术上更为可行。市场上已有一些重组胶原蛋白产品，而现有的产品都是针对各自产品特点需要，在人胶原蛋白序列的基础上进行重新构建设计的，但这些设计并不能满足极大的水溶性和亲水性、良好的保湿性和吸湿性等特殊性能需求，同时还需要满足产业化制备的需要。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种全新设计的重组人源化胶原蛋白分子(recombinant human like collagen，简称rHLC)的表达及纯化制备方法。具体涉及到：1、rHLC的分子设计以及重组大肠杆菌表达菌株的构建；2、rHLC发酵工艺开发；3、rHLC纯化工艺开发。本发明所设计的人源化胶原蛋白分子在大肠杆菌宿主内具有较高的产量，并且确定了简单方法获得高品质纯品的工艺。
本发明目的之一在于提供一种衍生自人I型胶原蛋白的人源化胶原蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为RepA。该序列可以作为核心单元进行重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子，优选的重复个数包括3-25个，更优选为10-20，最优选10-15个。不同重复个数的部分信息如下表：
Figure BDA0002727246870000021
本发明目的之二在于提供一种用于携带和表达所述重组人源化胶原蛋白基因的表达载体，所述载体应具备较强的转录启动子、较高的拷贝数等特点，如常见的pET载体等。
本发明目的之三在于提供一种用于所述rHLC重组表达质粒表达的宿主，如BL21(DE3)、BL21 AI、Rosetta(DE3)、Transetta(DE3)等。
本发明之四在于提供一种表达rHLC大肠杆菌的发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：
将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；
设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；
发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到30左右时，开始进行补料培养；
待菌体生长至0D600≈20-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。
本发明目的之五在于提供一种rHLC蛋白粗纯方法，该方法可以有效的将rHLC从大肠杆菌胞内释放，经过简单的纯化步骤即可获得纯度70％以上的蛋白粗品。包括：发酵菌体使用TE缓冲液(20mM Tris HCl 1mM EDTA pH8.0)重悬至100-150g/L→悬浮物使用高压均质机裂解，离心收集裂解物上清，上清过滤去除不溶物杂质→上清中加入终浓度为30-150mM硫酸锰，搅拌均匀后离心收集上清→上一步硫酸锰处理后上清使用柠檬酸调节pH至4.5，搅拌均匀后离心收集上清，上清过滤→将pH处理后上清加入硫酸铵颗粒盐析至终浓度达到0.8-1.2M，离心收集盐析沉淀→盐析沉淀使用纯化水溶解(1L水对1kg初始湿菌体)2h以上，离心收集上清并过滤除去颗粒或絮状杂质，将该上清放入到0-8℃内维持12h以上，此时蛋白析出，低温离心收集沉淀即可获得粗品。
本发明的目的之六在于提供一种rHLC粗蛋白的层析精制纯化方法，具体包括：将rHLC粗品使用pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解至浓度1-50mg/ml，过滤去除杂质获得粗品溶液→将粗纯液使用SP FF纯化。通过该方法可制备高纯度的rHLC。
本发明的目的之七在于提供上述rHLC在制备医美类化妆品或者功能性化妆品中的应用。
本发明的主要优点在于：
1、设计的rHLC分子序列来自于人I型胶原蛋白，具有极大的水溶性(溶解度达20％以上)和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且促增殖作用显著。可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品。
2、设计的rHLC分子在大肠杆菌宿主内可以高效的表达，产量达到0.5g/L～1.5g/L，易于进行放大。
3、rHLC的发酵工艺培养基成本低廉成分明确，发酵周期较短，控制简单。
4、开发的rHLC纯化方法操作简单，成本低，效果好，易于放大和重复，纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准，整个生产工艺可满足产业化生产需求。
附图说明
图1中：
图1-a：M：分子量标准，lane1-3：RepA3表达鉴定
图1-b：M：分子量标准，lane1：RepA5表达鉴定
图1-c：M：分子量标准，lane1：RepA10表达鉴定
图1-d：M：分子量标准，lane1：RepA15表达鉴定
图1-e：M：分子量标准，lane1：RepA20表达鉴定
图1-f：M：分子量标准，lane1-2：RepA25表达鉴定
图2中：
图2-a(RepA3)：M：分子量标准，lane1-6：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、硫酸锰处理后沉淀、pH4.5处理后上清、pH4.5处理后沉淀、盐析沉淀
图2-b(RepA5)：M：分子量标准，lane1-8：裂解物上清、裂解物沉淀、硫酸锰处理后上清、硫酸锰处理后沉淀、pH4.5处理后上清、pH4.5处理后沉淀、盐析上清、盐析沉淀
图2-c(RepA10)：M：分子量标准，lane1-4：硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、盐析上清、盐析沉淀
图2-d(RepA15)：M：分子量标准，lane1-7：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、盐析上清、盐析沉淀、盐析沉淀纯水复溶上清、盐析沉淀纯水复溶后不溶物
图2-e(RepA20)：M：分子量标准，lane1-6：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、pH4.5处理后沉淀、盐析上清、盐析沉淀
图2-f(RepA25)：M：分子量标准，lane1-5：裂解物上清、硫酸锰处理后上清、pH4.5处理后上清、盐析上清、盐析沉淀
图3：
图3-a(RepA3)：M：分子量标准，lane1-3：纯化前、穿透、洗脱峰
图3-b(RepA5)：M：分子量标准，lane1-4：穿透、洗脱峰1、洗脱峰2、1M氯化钠洗脱
图3-c(RepA10)：M：分子量标准，lane1-2：洗脱纯化样品
图3-d(RepA15)：M：分子量标准，lane1-4：纯化前、穿透、洗脱峰1、洗脱峰2
图3-e(RepA20)：M：分子量标准，lane1：纯化样品
图3-f(RepA25)：M：分子量标准，lane1-4：纯化前、穿透、洗脱峰1、洗脱峰2
图4：吸湿性能检测结果
图5：保湿性能检测结果
图6：促小鼠成纤维细胞(L929)增殖实验结果
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明进行进一步的阐述，需理解，这些实施例仅用于对本发明加以说明而不用于限制本发明。
实施例1rHLC大肠杆菌菌株的构建
1、不同重复数目rHLC基因获得
含有不同重复单位数目的rHLC通过对氨基酸序列进行反向翻译，并针对大肠杆菌优化，委托金斯瑞生物科技有限公司合成其对应的DNA序列，合成时在其DNA的5’端引入NcoI及3’端引入XhoI酶切位点。合成的基因被分别克隆至pUC57-T-simple载体，以重组质粒形式交付。
2、重组表达菌株构建
使用《分子克隆》中双酶切、酶连方式，分别将rHLC基因克隆至pET28a载体形成重组表达载体，然后将重组表达载体使用热激转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
3、重组表达菌株表达鉴定
从转化平板上挑取单菌落，培养后(37℃、220rpm摇床培养)，取少量菌液，测序正确的阳性重组子即为目标菌株。将测序正确的阳性重组子表达鉴定：接种到500ml培养基中培养(37℃、220rpm摇床培养)至OD600＝0.8-1.0，然后加入终浓度0.5mM IPTG诱导表达，诱导表达4h后收集菌体。表达后菌体使用PBS重悬，然后使用探针式超声波破碎仪破碎，离心收集裂解物上清和沉淀，使用SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，鉴于目标蛋白的蛋白质序列特殊所以电泳图表现出来的分子量偏大，下同。
实施例2 rHLC小试发酵(培养基体积10L)
本实施例主要阐述了rHLC的10L发酵工艺，发酵工艺中使用成分明确的甘油作为菌体代谢的碳源，使用氨水(发酵过程中既用于pH调节也用做氮源用于菌体代谢)和磷酸氢二铵作为菌体代谢的氮源；同时为了促进菌体生长，缩短发酵周期，提高发酵产量，培养基中还加入了酵母粉和蛋白胨等复合营养素。所使用发酵罐为Sartouris cplus发酵罐，发酵初始体积为10L。
具体步骤如下：
1、发酵种子液的制备：将实施例1中构建好的rHLC大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化。
2、从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8h，此为一级种子液。
3、将步骤2中的一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液制备。
4、分批发酵培养基的成分：一水合柠檬酸1.5g/L，磷酸二氢钾13.3g/L，磷酸氢二铵4g/L，甘油30g/L，七水合硫酸镁1.5g/L；按照分批发酵培养基的成分称取20L量的试剂，使用15L单蒸水溶解后，调节pH至6.5，定容至19L。将配好的分批发酵培养基倒入发酵罐进行灭菌，冷却后，通过注射器向发酵罐中打入200ml上文中提到的微量元素母液(过滤除菌)和终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(过滤除菌)抗生素。按照补料培养基的成分称取2000ml量的相关试剂(甘油500g/L，七水合硫酸镁12g/L，酵母粉40g/L，蛋白胨40g/L)，定容至2000ml后121℃，20min灭菌处理作为补料培养基，使用前还要向补料培养基中加入1/1000(V/V)的前述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。
所述微量元素母液成分包括：FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 2.25g/L、CuSO4·5H2O 15g/L、MnSO4·5H2O 5g/L、CaCl2·7H2O 1g/L、CoCl·6H2O 1g/L、Na2MoO4·2H2O1.125g/L、H3BO3 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L。
5、将制备好的二级种子液按照2.5％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基的发酵罐中开始补料-分批高密度发酵培养，设定发酵温度为37℃、pH为7.0、DO 40％，pH使用氨水和磷酸(20％)进行关联调节，DO通过关联转速、通气量和高纯氧控制在30-50％之间。发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到30左右时，开始进行补料培养(补料培养基的流加速度维持在20-30g/h范围)。待菌体生长至0D600≈20-50之间向发酵罐中加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达4h结束培养。使用离心法收集发酵液中的菌体，所收集得到菌体可以进行进一步破碎处理也可冻存于-20℃冰箱中备用。
申请人通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制，具体来说通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.3-1VVM，然后通过逐渐提高转速以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在设定值时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。
实施例3 rHLC中试放大发酵(150L)
本实施例阐述了rHLC的发酵工艺放大，在小试发酵工艺(实施例2)基础上实施中试放大发酵工艺研究和验证。具体如下：
1、同实施例2方法获得二级种子液。
2、按照实施例2中的方法和分批培养基成分制备15L基础培养基于50L的种子罐中原位灭菌，然后将步骤1中的二级种子液接种到种子罐中进行培养，培养条件为：罐压＝0.3MPa T＝37℃D0＝40％pH＝7.0，使用氨水控制pH不低于7.0，培养过程中不加入抗生素。培养至OD＝15-30之间均可移种至工作罐。作为三级种子液。
3、按照实施例2中的方法和分批培养基成分制备150L基础培养基于500L的种子罐中原位灭菌，然后将步骤2中的三级种子液移种到工作罐中进行培养，培养条件为：罐压＝0.3MPa T＝37℃D0＝40％pH＝7.0，使用氨水控制pH不低于7.0，培养过程中不加入抗生素。当出现补料信号的时候开始补料(补料培养基同实施例2)，补料速度为1L/h至发酵结束。培养至OD＝40-50的时候向发酵罐中打入终浓度为0.5mM IPTG诱导表达，诱导表达4-6h结束培养，收集发酵菌体。
实施例4 rHLC蛋白纯化
1、取实施例2或3中发酵产生的表达后rHLC菌体使用缓冲液重悬(20mM Tris+1mMEDTA，pH8.0)至100g/L，然后使用高压均质机破碎获得菌体裂解物，将裂解物使用离心法分离细胞碎片等不溶物，然后获得裂解物上清。
2、将步骤1中的裂解物上清加入终浓度为0.1M硫酸锰，静置1h，离心进行固液分离，获得上清。
3、将步骤2中的上清使用柠檬酸调节pH至4.5，静置1h后，离心进行固液分离，获得上清。
4、向步骤3中的上清加入硫酸铵颗粒至其浓度达到1M进行盐析，离心收集盐析沉淀，丢弃盐析上清。
5、将盐析沉淀使用纯化水溶解(1L/1kg起始菌体)，溶解2h以上，然后离心收集上清，上清使用0.45μm膜过滤，使用氢氧化钠调节pH至6.5。将粗纯样品使用还原型SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示。图2表现的是粗纯工艺的有效性。
6、将步骤5中的粗纯液使用SP FF纯化(柱床体积：30ml柱子内径为26mm)，使用20mM柠檬酸-柠檬酸钠1M氯化钠pH6.5缓冲液进行线性洗脱，梯度为10CVs经过柱床的氯化钠浓度达到0.3M，收集洗脱样品。将纯化所得样品使用还原型SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示。
7、将步骤6中纯化的纯度较好样品使用超滤浓缩换液为纯化水，然后使用真空冷冻干燥法进行干燥保存，干燥后测定干品质量计算纯品收率，如下表：
Figure BDA0002727246870000071
本发明的纯化过程包括粗纯化和精制纯化,良好的粗纯化是精制纯化的必要基础。附图2、3表明粗纯化以后的样品使用层析法进行精制纯化可以获得纯度较高的目的蛋白。
实施例5：rHLC蛋白溶解性实验
取纯化以后rHLC蛋白质冻干粉使用分析天平进行称定0.2g放入到干净的西林瓶中，然后西林瓶中补加常温纯化水至不同质量/体积分数，室温缓慢震荡溶解，观察冻干粉溶解速度和溶解后溶液透明度，结果如下表所示：
Figure BDA0002727246870000072
Figure BDA0002727246870000081
从上表可以看出，随着分子量增大，蛋白质溶解难度逐渐增大，并且同样质量分数情况下大分子溶液较小分子溶液具有更低的流动性。该趋势与一般性的大分子溶解趋势具有相似性。从上表还可以看出在非常高的蛋白浓度下(30％以上)，在10min之内rHLC均可以有效溶解，表明其具有较高的溶解度。
实施例6人源化胶原蛋白吸湿、保湿性能试验方案(一)吸湿性试验：
模拟湿度环境并监测：饱和硫酸铵水溶液(RH 81％)；饱和氯化钙水溶液(RH32％)
步骤一：样品干燥恒重；
步骤二：称取各组0.05g试样分别置于RH 81％和RH 32％的干燥器内吸湿，24h、48h、60h后称各试样的质量；
步骤三：吸湿率(Ra)＝(Wn-W0)/W0×100％
W0——放置前样品质量；Wn——放置后样品质量
结果分析：
吸湿性能检测见图4，结果表明，RepA10比牛Ⅰ型胶原具有更好的吸湿性能。吸湿60h后，在RH 81％湿度环境下，RepA10吸水由粉末状变成水珠状，而RH 32％湿度环境下无明显变化。
(二)保湿性试验：
模拟湿度环境并监测：饱和硫酸铵水溶液(RH 81％)；饱和氯化钙水溶液(RH32％)；硅胶干燥器(RH≤5％)
步骤一：样品干燥恒重；
步骤二：称取干燥恒重后的样品0.05g，加入等质量的水，分别置于RH 81％、RH32％和硅胶干燥器内，24h、48h、60h后称各试样的质量；
步骤三：保湿率(Rr)＝Hn/H0×100％
H0——放置前水分质量；Hn——放置后水分质量
结果分析：
保湿性能检测见图5，结果表明，RepA10比牛Ⅰ型胶原具有更好的保湿性能。
此外，RepA5、15、20保湿性能与RepA10相当。
实施例7 RepA10促小鼠成纤维细胞(L929)增殖实验方案
实验方案：
小鼠成纤维细胞，96孔板、接种密度5000个/孔，培养6h贴壁后，配置含有不同浓度梯度的胶原蛋白培养基换液，培养1d后cck8测增殖率
结果分析：
CCK-8检测结果见图6，培养1d RepA10具有比牛Ⅰ型胶原更好的促增殖能力，整体来说样品组要比空白组具有更好的促增殖效果，随着浓度升高，样品组促增殖效果逐渐下降。RepA5、15、20促增殖作用与RepA10相当。
序列表
<110> 江苏京森生物医药新材料科技有限公司
<120> 重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用
<130> 重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly
1 5 10 15
Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln
20 25 30
<210> 2
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
1 5 10 15
Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly
20 25 30
Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val
35 40 45
Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg
50 55 60
Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly
65 70 75 80
Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln His His His His His
85 90 95
His
<210> 3
<211> 161
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gly Ile Arg Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly
1 5 10 15
Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val
20 25 30
Gln Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
35 40 45
Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly
50 55 60
Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val
65 70 75 80
Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg
85 90 95
Gly Asp Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly
100 105 110
Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Asp
115 120 125
Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg
130 135 140
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Arg Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 4
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Gly Ile Arg Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Thr Ser Ile Ala Ala
1 5 10 15
Gln Arg Gly Val Val Ala Ser Val Ala Ser Leu Val Ser Val Ala Cys
20 25 30
Lys Ala Ser Val Ala Ile Trp Ala Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
35 40 45
Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Asp
115 120 125
Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg
130 135 140
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Arg Ser Gly Glu Arg Gly Asp
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Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg
165 170 175
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val
20 25 30
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Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly
50 55 60
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Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly
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Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly
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Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val
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275 280 285
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Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly
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Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg
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370 375 380
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
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Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Phe
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195 200 205
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<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
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cactaataa 489
<210> 11
<211> 945
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
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ctgggcccac aaggcattgc cggccagcgt ggcgtggtcg gcgagcgtgg cttccctggt 540
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gagcgtggcg tgcaaggcga gcgtggcgat ctgggaccgc agggcattgc aggccagcgt 780
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gaacgtggtg tgcagagatc tcaccaccat catcatcact aataa 945
<210> 12
<211> 1401
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
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caacgtggcg tggtcggcga acgtggcttc cccggagagc gtggcgtgca aggcgagcgt 1200
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cctggcgagc gtggcgttca gggggaacgt ggtgacctgg gtccgcaggg tatcgcgggt 1320
caacgtggtg tggttggcga gcgtggtttc ccgggtgaac gtggtgtgca gagatctcac 1380
caccatcatc atcactaata a 1401
<210> 13
<211> 1857
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
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ggcgttcagg gagagcgtgg cgacctgggt cctcaaggca ttgccggcca acgtggcgtg 240
gtcggcgaac gtggcttccc cggagagcgt ggcgtgcaag gcgagcgtgg cgatctggga 300
ccgcagggca ttgcaggcca gcgtggcgtg gtaggtgaac gtggctttcc tggcgagcgt 360
ggcgttcagg gggaacgtgg tgacctgggt ccgcagggta tcgcgggtca acgtggtgtg 420
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ctgggcccac aaggcattgc cggccagcgt ggcgtggtcg gcgagcgtgg cttccctggt 540
gagcgtggcg tgcaaggcga gcgtggcgat ctgggccctc agggcatcgc tggacagcgt 600
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ctgggtcctc aaggcattgc cggccaacgt ggcgtggtcg gcgaacgtgg cttccccgga 720
gagcgtggcg tgcaaggcga gcgtggcgat ctgggaccgc agggcattgc aggccagcgt 780
ggcgtggtag gtgaacgtgg ctttcctggc gagcgtggcg ttcaggggga acgtggtgac 840
ctgggtccgc agggtatcgc gggtcaacgt ggtgtggttg gcgagcgtgg tttcccgggt 900
gaacgtggtg tgcagagatc cggtgagcgt ggcgacctgg gcccacaagg cattgccggc 960
cagcgtggcg tggtcggcga gcgtggcttc cctggtgagc gtggcgtgca aggcgagcgt 1020
ggcgatctgg gccctcaggg catcgctgga cagcgtggcg tggtgggaga acgtggcttt 1080
cctggcgagc gtggcgttca gggagagcgt ggcgacctgg gtcctcaagg cattgccggc 1140
caacgtggcg tggtcggcga acgtggcttc cccggagagc gtggcgtgca aggcgagcgt 1200
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caacgtggtg tggttggcga gcgtggtttc ccgggtgaac gtggtgtgca gagatccggt 1380
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gagcgtggcg acctgggtcc tcaaggcatt gccggccaac gtggcgtggt cggcgaacgt 1620
ggcttccccg gagagcgtgg cgtgcaaggc gagcgtggcg atctgggacc gcagggcatt 1680
gcaggccagc gtggcgtggt aggtgaacgt ggctttcctg gcgagcgtgg cgttcagggg 1740
gaacgtggtg acctgggtcc gcagggtatc gcgggtcaac gtggtgtggt tggcgagcgt 1800
ggtttcccgg gtgaacgtgg tgtgcagaga tctcaccacc atcatcatca ctaataa 1857
<210> 14
<211> 2313
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
atggggatcc gtgagcgtgg cgacctgggc ccacaaggca ttgccggcca gcgtggcgtg 60
gtcggcgagc gtggcttccc tggtgagcgt ggcgtgcaag gcgagcgtgg cgatctgggc 120
cctcagggca tcgctggaca gcgtggcgtg gtgggagaac gtggctttcc tggcgagcgt 180
ggcgttcagg gagagcgtgg cgacctgggt cctcaaggca ttgccggcca acgtggcgtg 240
gtcggcgaac gtggcttccc cggagagcgt ggcgtgcaag gcgagcgtgg cgatctggga 300
ccgcagggca ttgcaggcca gcgtggcgtg gtaggtgaac gtggctttcc tggcgagcgt 360
ggcgttcagg gggaacgtgg tgacctgggt ccgcagggta tcgcgggtca acgtggtgtg 420
gttggcgagc gtggtttccc gggtgaacgt ggtgtgcaga gatccggtga gcgtggcgac 480
ctgggcccac aaggcattgc cggccagcgt ggcgtggtcg gcgagcgtgg cttccctggt 540
gagcgtggcg tgcaaggcga gcgtggcgat ctgggccctc agggcatcgc tggacagcgt 600
ggcgtggtgg gagaacgtgg ctttcctggc gagcgtggcg ttcagggaga gcgtggcgac 660
ctgggtcctc aaggcattgc cggccaacgt ggcgtggtcg gcgaacgtgg cttccccgga 720
gagcgtggcg tgcaaggcga gcgtggcgat ctgggaccgc agggcattgc aggccagcgt 780
ggcgtggtag gtgaacgtgg ctttcctggc gagcgtggcg ttcaggggga acgtggtgac 840
ctgggtccgc agggtatcgc gggtcaacgt ggtgtggttg gcgagcgtgg tttcccgggt 900
gaacgtggtg tgcagagatc cggtgagcgt ggcgacctgg gcccacaagg cattgccggc 960
cagcgtggcg tggtcggcga gcgtggcttc cctggtgagc gtggcgtgca aggcgagcgt 1020
ggcgatctgg gccctcaggg catcgctgga cagcgtggcg tggtgggaga acgtggcttt 1080
cctggcgagc gtggcgttca gggagagcgt ggcgacctgg gtcctcaagg cattgccggc 1140
caacgtggcg tggtcggcga acgtggcttc cccggagagc gtggcgtgca aggcgagcgt 1200
ggcgatctgg gaccgcaggg cattgcaggc cagcgtggcg tggtaggtga acgtggcttt 1260
cctggcgagc gtggcgttca gggggaacgt ggtgacctgg gtccgcaggg tatcgcgggt 1320
caacgtggtg tggttggcga gcgtggtttc ccgggtgaac gtggtgtgca gagatccggt 1380
gagcgtggcg acctgggccc acaaggcatt gccggccagc gtggcgtggt cggcgagcgt 1440
ggcttccctg gtgagcgtgg cgtgcaaggc gagcgtggcg atctgggccc tcagggcatc 1500
gctggacagc gtggcgtggt gggagaacgt ggctttcctg gcgagcgtgg cgttcaggga 1560
gagcgtggcg acctgggtcc tcaaggcatt gccggccaac gtggcgtggt cggcgaacgt 1620
ggcttccccg gagagcgtgg cgtgcaaggc gagcgtggcg atctgggacc gcagggcatt 1680
gcaggccagc gtggcgtggt aggtgaacgt ggctttcctg gcgagcgtgg cgttcagggg 1740
gaacgtggtg acctgggtcc gcagggtatc gcgggtcaac gtggtgtggt tggcgagcgt 1800
ggtttcccgg gtgaacgtgg tgtgcagaga tccggtgagc gtggcgacct gggcccacaa 1860
ggcattgccg gccagcgtgg cgtggtcggc gagcgtggct tccctggtga gcgtggcgtg 1920
caaggcgagc gtggcgatct gggccctcag ggcatcgctg gacagcgtgg cgtggtggga 1980
gaacgtggct ttcctggcga gcgtggcgtt cagggagagc gtggcgacct gggtcctcaa 2040
ggcattgccg gccaacgtgg cgtggtcggc gaacgtggct tccccggaga gcgtggcgtg 2100
caaggcgagc gtggcgatct gggaccgcag ggcattgcag gccagcgtgg cgtggtaggt 2160
gaacgtggct ttcctggcga gcgtggcgtt cagggggaac gtggtgacct gggtccgcag 2220
ggtatcgcgg gtcaacgtgg tgtggttggc gagcgtggtt tcccgggtga acgtggtgtg 2280
cagagatctc accaccatca tcatcactaa taa 2313

Claims (8)

1.一种人源化胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种人源化胶原蛋白，其氨基酸序列由3-25个核心单元进行重复串联形成，所述核心单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求2所述的人源化胶原蛋白，其氨基酸序列由10-20个核心单元进行重复串联形成，所述核心单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求2所述的人源化胶原蛋白，其氨基酸序列由10-15个核心单元进行重复串联形成，所述核心单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
5.一种用于携带和表达如权利要求1至4中任一项的人源化胶原蛋白基因的表达载体或菌株，所述载体为pET载体，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种表达人源化胶原蛋白的方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：
将如权利要求5所述菌株的种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；
设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；
发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到30左右时，开始进行补料培养；
待菌体生长至0D600≈20-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。
7.一种纯化人源化胶原蛋白的方法，该方法包括：将如权利要求6所述的发酵菌体使用TE缓冲液(20mM Tris HCl 1mM EDTA pH8.0)重悬至100-150g/L→悬浮物使用高压均质机裂解，离心收集裂解物上清，上清过滤去除不溶物杂质→上清中加入终浓度为30-150mM硫酸锰，搅拌均匀后离心收集上清→上一步硫酸锰处理后上清使用柠檬酸调节pH至4.5，搅拌均匀后离心收集上清，上清过滤→将pH处理后上清加入硫酸铵颗粒盐析至终浓度达到0.8-1.2M，离心收集盐析沉淀→盐析沉淀使用纯化水溶解(1L水对1kg初始湿菌体)2h以上，离心收集上清并过滤除去颗粒或絮状杂质，将该上清放入到0-8℃内维持12h以上，此时蛋白析出，低温离心收集沉淀即可获得粗品。将rHLC粗品使用pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解至浓度1-50mg/ml，过滤去除杂质获得粗品溶液→将粗纯液使用SP FF纯化。
8.如权利要求1至4中任一项的人源化胶原蛋白在制备功能性化妆品或医美类化妆品中的应用。
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