CN115975004A

CN115975004A - 一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115975004A
Application number: CN202211373780.5A
Authority: CN
Inventors: 周晗; 陈宁; 赖云; 颜福霞; 杨蒙蒙; 邹衡芳; 陈玉容
Original assignee: Guangzhou Yuanxiang Medical Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yuanxiang Medical Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用。本发明的重组人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明重组人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，构建重组质粒后采用大肠杆菌表达系统表达，表达的重组人纤连蛋白表达量高达33.6％，具有完整的纤连蛋白结构与功能，能有效促进细胞粘附、增殖和迁移；可在食品、化妆品、保健品、药械等领域应用。本发明的提供的重组人纤连蛋白的制备方法基因序列稳定，表达量高，且制备的重组人纤连蛋白生物学活性高、纯度高。

Description

一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用。

背景技术

纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种在血液、间质外基质和细胞周基质中发现的关键黏附蛋白，是一种大分子糖蛋白，其分子量大约是440KD，由几乎两个相同的单体通过C末端二硫键相连。主要包括三种类型：I型、II型、III型。其中I型和II型含有链内二硫键，III型不含二硫键，使其在外力作用下可以部分展开。纤连蛋白的主要功能是增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连，在调节细胞粘附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。

目前，纤连蛋白大多数是动物的血液或组织中提取的天然的纤连蛋白，其产量有限、成本昂贵，限制了纤连蛋白的生产和其在医疗、美容方面的应用。由于纤连蛋白的分子量太大(由2000多个氨基酸组成)，难以被皮肤吸收。

因此，利用基因工程技术构建出与天然纤连蛋白在功能上相似的小分子重组纤连蛋白，以克服天然纤连蛋白分子过大难以生产的缺点，同时还兼顾纤连蛋白活性，降低生产成本，成为研发的重要方向之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种重组人纤连蛋白，所述人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明重组人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，构建重组质粒后采用大肠杆菌表达系统表达，表达的重组人纤连蛋白为可溶性表达，表达量高达33.6％，无蛋白纯化标签，对蛋白功能和结构无影响，具有完整的纤连蛋白结构与功能，能有效促进细胞粘附、增殖和迁移。重组人纤连蛋白具有较高生物学活性。可在食品、化妆品、保健品、药械等领域应用。

第二方面，本发明提供了一种人纤连蛋白的重组质粒，所述质粒包含所述的重组人纤连蛋白的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种重组人纤连蛋白的高产宿主菌，所述高产宿主菌包含所述的重组质粒。

本发明的组人纤连蛋白的高产宿主菌表达量高达50％～70％。

作为本发明所述的高产宿主菌的优选实施方式，所述高产宿主菌为大肠杆菌。

第四方面，本发明提供了一种重组人纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)取所述的高产宿主菌发酵培养，得发酵液；

(2)离心所得发酵液收集菌体，用裂解液重悬菌体，得菌悬液；

(3)破碎所得菌悬液，0℃～4℃条件下离心收集上清；

(4)过滤收集的上清，得重组人纤连蛋白。

本发明的制备方法制备方便、纯化过程简单、成本较低，生产周期较短。蛋白纯度到达99％，且内毒素含量小于等于1EU/μg。制备方法基因序列稳定，表达量高，且制备的重组人纤连蛋白生物学活性高、纯度高。

作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述发酵的基础培养基包括：蛋白胨15g/L～30g/L，酵母粉10g/L～15g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，磷酸二氢钾2.0g/L～2.5g/L，磷酸氢二钾15g/L～16g/L，硫酸镁1.5g/L～2.5g/L，氯化锌0.08g/L～0.12g/L，硫酸锰0.08mg/L～0.12mg/L，钼酸钠0.08mg/L～0.12mg/L，氯化钙0.08mg/L～0.12mg/L。

作为本发明所述的的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述发酵的补料培养基包括补料A和补料B；所述补料A包括：蛋白胨100g/L～220g/L和酵母粉80g/L～120g/L；所述补料B包括：葡萄糖450g/L～650g/L和硫酸镁8g/L～12g/L；所述补料采用非反馈指数流加补料，起始补料速度为8mL/h～12mL/h，按指数梯度增加，每小时增加8mL～12mL。

作为本发明所述的的制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述裂解液包括15mM～25mM的tris和15mM～25mM的pbs；所述菌体和裂解液的质量体积比为1:(8～10)。

第五方面，本发明提供了一种美容组合物，包含所述的制备方法制备的重组人纤连蛋白。

第六方面，本发明将所述重组人纤连蛋白、所述重组质粒、所述高产宿主菌、所述制备方法、所述组合物在食品、化妆品、保健品或药械领域中应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明重组人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，构建重组质粒后采用大肠杆菌表达系统表达，表达的重组人纤连蛋白为可溶性表达，表达量高，无蛋白纯化标签，对蛋白功能和结构无影响。重组人纤连蛋白具有较高生物学活性，当细胞加入纤维连接蛋白包被板37℃下培养35分钟后，约35％～60％的细胞具有特异性粘附。

本发明的制备方法制备方便、纯化过程简单、成本较低，生产周期较短。蛋白纯度到达99％，且内毒素含量小于等于1EU/μg。

附图说明

图1为重组质粒pET-32a-rHuFn的质粒图谱。

图2为重组质粒pET-32a-rHuFn的酶切验证电泳图；

图2中，Lane M:DNA Marker；Lane 1:Plasmid digested by EcoR I and Apa I；Lane 2:Uncut plasmid DNA。

图3为重组质粒pET-32a-rHuFn-2的质粒图谱。

图4为重组质粒pET-32a-rHuFn-2的酶切验证电泳图；

图4中，Lane M:DNA Marker；Lane 1:Plasmid digested by Bgl II and Xho I；Lane 2:Uncut plasmid DNA。

图5为实施例3样品的SDS-PAGE电泳图；

图5中，M：Marker；1：pET-32a-rHuFn诱导前；2：pET-32a-rHuFn诱导全菌；3：pET-32a-rHuFn诱导上清；4：pET-32a-rHuFn诱导沉淀；5：pET-32a-rHuFn-2诱导前；6：pET-32a-rHuFn-2诱导全菌；7：pET-32a-rHuFn-2诱导上清；8：pET-32a-rHuFn-2诱导沉淀。

图6为重组质粒pGEX-6P-1-FN的质粒图谱。

图7为重组质粒pGEX-6P-1-FN酶切验证电泳图；

图7中，Lane M:DNA Marker；Lane 1:Plasmid digested by BamH I and Xho I；Lane 2:Uncut plasmid DNA。

图8为实施例4样品的SDS-PAGE电泳图；

图8中，M：Marker；1：pGEX-6P-1-FN诱导前；2：pGEX-6P-1-FN诱导全菌；3：pGEX-6P-1-FN诱导上清；4：pGEX-6P-1-FN诱导沉淀。5：pET-32a-rHuFn诱导前；6：pET-32a-rHuFn诱导全菌；7：pET-32a-rHuFn诱导上清；8：pET-32a-rHuFn诱导沉淀。

图9为不同发酵工艺菌体密度对比图。

图10为实施例6纯化后重组人纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图10中，M：marker；1：纯化后样品；2：酶切后样品。

图11为实施例7中蛋白含量的对比统计图。

图12为实施例7中蛋白纯度的对比统计图。

图13为实施例8中重组纤连蛋白划痕修复实验电镜图。

图14为实施例8中对表皮细胞增殖影响的对比统计图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：一种重组人纤连蛋白的基因序列

蛋白的表达水平与基因序列，表达载体具有密切的联系，合适的基因序列和表达载体可促进蛋白的高表达，提高产量。而不同的密码子优化方法对蛋白的表达水平也起到重要的影响。通过避免稀有密码子，利用偏爱密码子、简化mRNA的二级结构、优化重复序列、消除限制酶切位点、调整GC含量等方法对人纤连蛋白(rhFN)的氨基酸序列进行优化。分别得到两条基因序列SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

人纤连蛋白(rhFN)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

MPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSGGGGSGGGGSGGGGSAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSYTITGLQPGTDYKIYLYTLNDNARSSPVVIDASTAIDAPSNLRFLATTPNSLLVSWQPPRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGVTEATITGLEPGTEYTIYVIALKNNQKSEPLIGRKKTDELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST

将人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，在序列前段增加Nco I酶切位点CCATGC，序列后端增加终止密码子TAA和XhoⅠ酶切位点CTCGAG，得到优化的人纤连蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

CCATGCCGACCGACCTGCGTTTCACCAACATCGGTCCGGACACCATGCGTGTTACCTGGGCTCCGCCGCCGTCTATCGACCTGACCAACTTCCTGGTTCGTTACTCTCCGGTTAAAAACGAAGAAGACGTTGCTGAACTGTCTATCTCTCCGTCTGACAACGCTGTTGTTCTGACCAACCTGCTGCCGGGTACCGAATACGTTGTTTCTGTTTCTTCTGTTTACGAACAGCACGAATCTACCCCGCTGCGTGGTCGTCAGAAAACCGGTCTGGACTCTCCGACCGGTATCGACTTCTCTGACATCACCGCTAACTCTTTCACCGTTCACTGGATCGCTCCGCGTGCTACCATCACCGGTTACCGTATCCGTCACCACCCGGAACACTTCTCTGGTCGTCCGCGTGAAGACCGTGTTCCGCACTCTCGTAACTCTATCACCCTGACCAACCTGACCCCGGGTACCGAATACGTTGTTTCTATCGTTGCTCTGAACGGTCGTGAAGAATCTCCGCTGCTGATCGGTCAGCAGTCGACCGTAAGCGACGTTCCGCGTGACCTGGAAGTTGTTGCTGCTACCCCGACCTCTCTGCTGATCTCTTGGGACGCTCCGGCTGTTACCGTTCGTTACTACCGTATCACCTACGGTGAAACCGGTGGTAACTCTCCGGTTCAGGAATTCACCGTTCCGGGTTCTAAATCTACCGCTACCATCTCTGGTCTGAAACCGGGTGTTGACTACACTATCACCGTATACGCAGTTACCGGTCGTGGTGACTCTCCGGCTTCTTCTAAACCGATCTCTATCAACTACCGTACCGAAATCGACAAACCGTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTATCCCGGCTCCGACCGACCTGAAATTCACCCAGGTTACCCCGACCTCTCTGTCTGCTCAGTGGACCCCGCCGAACGTTCAGCTGACCGGTTACCGTGTTCGTGTTACCCCGAAAGAAAAAACCGGTCCGATGAAAGAAATCAACCTGGCTCCGGACTCTTCTTCTGTTGTTGTTTCTGGTCTGATGGTTGCTACCAAATACGAAGTTTCTGTTTACGCTCTGAAAGACACCCTGACCTCTCGTCCGGCTCAGGGTGTTGTTACCACCCTGGAAAACGTTTCTCCGCCGCGTCGTGCTCGTGTTACCGACGCTACCGAAACCACCATCACCATCTCTTGGCGTACCAAAACCGAAACCATCACCGGTTTCCAGGTTGACGCTGTTCCGGCTAACGGTCAGACCCCGATCCAGCGTACCATCAAACCGGACGTTCGTTCTTACACCATCACCGGTCTGCAGCCGGGTACCGACTACAAAATCTACCTGTACACCCTGAACGACAACGCTCGTTCTTCTCCGGTTGTTATCGACGCTTCTACCGCTATCGACGCTCCGTCTAACCTGCGTTTCCTGGCTACCACCCCGAACTCTCTGCTGGTTTCTTGGCAGCCGCCGCGTGCTCGTATCACCGGTTACATCATCAAATACGAAAAACCGGGTTCTCCGCCGCGTGAAGTTGTTCCGCGTCCGCGTCCGGGTGTTACCGAAGCTACCATCACCGGTCTGGAACCGGGTACCGAATACACCATCTACGTTATCGCTCTGAAAAACAACCAGAAATCTGAACCGCTGATCGGTCGTAAAAAAACCGACGAACTGCCGCAGCTGGTTACCCTGCCGCACCCGAACCTGCACGGTCCGGAAATCCTGGACGTTCCGTCTACCTAACTCGAG。

序列SEQ ID No.3的核苷酸序列如下所示：

CCATGCCGACCGACCTGCGTTTCACCAACATCGGTCCGGACACCATGCGTGTTACCTGGGCTCCGCCGCCGTCTATCGACCTGACCAACTTCCTGGTTCGTTACTCTCCGGTTAAAAACGAAGAAGACGTTGCTGAACTGTCTATCTCTCCGTCTGACAACGCTGTTGTTCTGACCAACCTGCTGCCGGGTACCGAATACGTTGTTTCTGTTTCTTCTGTTTACGAACAGCACGAATCTACCCCGCTGCGTGGTCGTCAGAAAACCGGTCTGGACTCTCCGACCGGTATCGACTTCTCTGACATCACCGCTAACTCTTTCACCGTTCACTGGATCGCTCCGCGTGCTACCATCACCGGTTACCGTATCCGTCACCACCCGGAACACTTCTCTGGTCGTCCGCGTGAAGACCGTGTTCCGCACTCTCGTAACTCTATCACCCTGACCAACCTGACCCCGGGTACCGAATACGTTGTTTCTATCGTTGCTCTGAACGGTCGTGAAGAATCTCCGCTGCTGATCGGTCAGCAGTCTACCGTTTCTGACGTTCCGCGTGACCTGGAAGTTGTTGCTGCTACCCCGACCTCTCTGCTGATCTCTTGGGACGCTCCGGCTGTTACCGTTCGTTACTACCGTATCACCTACGGTGAAACCGGTGGTAACTCTCCGGTTCAGGAATTCACCGTTCCGGGTTCTAAATCTACCGCTACCATCTCTGGTCTGAAACCGGGTGTTGACTACACCATCACCGTTTACGCTGTTACCGGTCGTGGTGACTCTCCGGCTTCTTCTAAACCGATCTCTATCAACTACCGTACCGAAATCGACAAACCGTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTATCCCGGCTCCGACCGACCTGAAATTCACCCAGGTTACCCCGACCTCTCTGTCTGCTCAGTGGACCCCGCCGAACGTTCAGCTGACCGGTTACCGTGTTCGTGTTACCCCGAAAGAAAAAACCGGTCCGATGAAAGAAATCAACCTGGCTCCGGACTCTTCTTCTGTTGTTGTTTCTGGTCTGATGGTTGCTACCAAATACGAAGTTTCTGTTTACGCTCTGAAAGACACCCTGACCTCTCGTCCGGCTCAGGGTGTTGTTACCACCCTGGAAAACGTTTCTCCGCCGCGTCGTGCTCGTGTTACCGACGCTACCGAAACCACCATCACCATCTCTTGGCGTACCAAAACCGAAACCATCACCGGTTTCCAGGTTGACGCTGTTCCGGCTAACGGTCAGACCCCGATCCAGCGTACCATCAAACCGGACGTTCGTTCTTACACCATCACCGGTCTGCAGCCGGGTACCGACTACAAAATCTACCTGTACACCCTGAACGACAACGCTCGTTCTTCTCCGGTTGTTATCGACGCTTCTACCGCTATCGACGCTCCGTCTAACCTGCGTTTCCTGGCTACCACCCCGAACTCTCTGCTGGTTTCTTGGCAGCCGCCGCGTGCTCGTATCACCGGTTACATCATCAAATACGAAAAACCGGGTTCTCCGCCGCGTGAAGTTGTTCCGCGTCCGCGTCCGGGTGTTACCGAAGCTACCATCACCGGTCTGGAACCGGGTACCGAATACACCATCTACGTTATCGCTCTGAAAAACAACCAGAAATCTGAACCGCTGATCGGTCGTAAAAAAACCGACGAACTGCCGCAGCTGGTTACCCTGCCGCACCCGAACCTGCACGGTCCGGAAATCCTGGACGTTCCGTCTACCTAACTCGAG。

实施例2：构建人纤连蛋白重组质粒

(1)构建重组质粒pET-32a-rHuFn

将表达载体pET-32a(+)用限制性核酸内切酶XhoⅠ和Nco I进行双酶切；将实施例1中的优化的人纤连蛋白的合成基因克隆至双酶切后的PET-32a(+)载体，得到重组质粒pET-32a-rHuFn；质粒图谱如图1所示。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过基因测序、质粒酶切图谱鉴定如图2所示，筛选阳性菌株。

质粒酶切体系如表1所示：

表1酶切体系

组分	20μL体系
		EcoR I	1μL
Apa I	1μL
		Cutsmaret buffer	2μL
质粒pET-32a-rHuFn	10μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	6μL
TOTAL	20.0μL

酶切反应条件为：25℃反应30min。65℃，20min热失活。

(2)构建重组质粒pET-32a-rHuFn-2

SEQ ID No.3序列采用全基因合成，表达载体pET-32a(+)用限制性核酸内切酶XhoⅠ和Nco I进行双酶切；将SEQ ID No.3序列克隆至双酶切后的PET-32a(+)载体得到重组质粒pET-32a-rHuFn-2，图谱如图3所示。将质粒转化至BL21(DE3)菌株，采用双酶切和基因测序鉴定阳性菌株。双酶切电泳图如图4所示。

质粒酶切体系如表2所示：

表2酶切体系

组分	20μL体系
		Bgl II	1μL
Xho I	1μL
		Cutsmaret buffer	2μL
质粒pET-32a-rHuFn-2	10μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	6μL
TOTAL	20.0μL

酶切反应条件为：25℃反应30min；65℃，20min热失活。

实施例3：不同基因序列的蛋白表达水平的影响

分别将实施例2中构建的含重组质粒pET-32a-rHuFn、pET-32a-rHuFn-2的菌株在LB固体培养基(加100ug/ml氨苄青霉素Ampicillin)上划线，37℃培养12h。挑取单克隆至30mL LB液体培养基中，37℃、220rpm培养，OD600值达到0.6～0.8时，加入1mM IPTG进行诱导4h表达。分别取未诱导菌液、诱导完成的菌液取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mL PBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；电泳图如图5所示。采用图像处理软件Image J对表达量进行分析，pET-32a-rHuFn表达量为33.6％，pET-32a-rHuFn-2表达量为12.7％。

实施例4：不同表达载体对表达量的影响

表达载体是蛋白质的表达量具有至关重要的因素，选择合适的表达载体，对提高蛋白的表达量具有重要意义。分别对比表达载体pET-32a(+)和pGEX-6P-1对纤连蛋白表达量的影响。将SEQ ID No.2序列克隆至pGEX-6P-1表达载体，酶切位点为BamH I/Xho I，得到重组质粒pGEX-6P-1-FN，图谱如图6所示。将质粒转化至BL21(DE3)菌株，采用双酶切和基因测序鉴定阳性菌株。双酶切电泳图如图7所示。

质粒酶切体系如表3所示：

表3酶切体系

组分	20μL体系
		BamH I	1μL
Xho I	1μL
		Cutsmaret buffer	2μL
质粒pGEX-6P-1-FN	10μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	6μL
TOTAL	20.0μL

酶切反应条件为：25℃反应30min；65℃，20min热失活。

诱导表达条件以及SDS-PAGE样品制备与实施例3相同。实验结果如图8所示。pGEX-6P-1-FN菌种表达量约为23.5％。pET-32a-rHuFn菌株表达量为33.6％。表达载体pET-32a(+)具有更高的表达量。

实施例5：重组人纤连蛋白的发酵

取实施例3中筛选得到含重组质粒pET-32a-rHuFn的人纤连蛋白高表达菌种发酵培养。

设置实验组：发酵基础培养基为：蛋白胨24g/L，酵母粉12g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，磷酸氢二钾15.6g/L，硫酸镁2g/L，氯化锌0.1g/L，硫酸锰0.1mg/L，钼酸钠0.1mg/L，氯化钙0.1mg/L，补料培养基分为补料A为蛋白胨200g/L，酵母粉100g/L，补料B葡萄糖500g/L，硫酸镁10g/L。补料方式采用非反馈指数流加补料，起始补料10mL/h，按指数梯度增加，每小时增加10mL，得发酵菌液。

设置对照组1：所述发酵基础培养基与实验组相同，其中补料方式采用DO(溶氧)反馈调节，DO设置为25％，上限30％，下限20％，与搅拌联动控制，当溶氧开始上升时，开启补料，其中补料培养基分为补料A为蛋白胨200g/L，酵母粉100g/L，补料B葡萄糖500g/L，硫酸镁10g/L。

设置对照组2：所述发酵基础培养基与实验组相同，补料方式采用非反馈指数流加补料，起始补料10mL/h，按指数梯度增加，每小时增加10mL，其中补料培养基分为补料A为蛋白胨200g/L，酵母粉100g/L，补料B甘油500g/L，硫酸镁10g/L。

发酵结束时采用分光光度计检测菌液在600nm处吸光值，分析菌体密度。结果如图9所示，实验组的发酵工艺具有较高的菌体密度。

实施例6：重组纤连蛋白纯化

取实施例3中筛选得到含重组质粒pET-32a-rHuFn的人纤连蛋白高表达菌种发酵液，使用蛋白纯化仪，经离子交换、肝素亲和、G25脱盐，纯化得到重组人纤连蛋白，具体为：

1)离心发酵菌液收集菌体，按照菌株：裂解液为1:10的质量体积比重悬菌体；所述裂解液包括20mMTris、20mM PBS、10mM DTT；

2)重悬后使用高压均质仪破碎菌悬液；其中，高压均质机先用200bas压力破碎，再用800bas破碎两次；

3)将破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、12000rpm、30min，离心收集上清；

4)取离心后的上清使用抽滤装置进行过滤，经0.22μm滤膜过滤，得重组人纤连蛋白原液；

5)采用Ni柱亲和层析的方法对重组人纤连蛋白进行纯化，选用层析填料为NiSeplife FF(TED)，平衡缓冲液A：(20mM Tris、500mM NaCl、20mM imidazole)，洗脱缓冲液B：(20mM Tris、500mM NaCl、500mM imidazole)。采用阶段梯度洗脱。洗脱梯度如表4所示：

表4酶切体系

流速	比例	柱体积	备注
				1ml/min	0％B	5	平衡
1ml/min	5％B	3	洗杂
				1ml/min	12％B	4	洗杂
1ml/min	50％B	4	目的产物
				1ml/min	100％B	4	-

6)将上一步收集的目的产物，按1:1000比例加入凝血酶(thrombin)(购于索莱宝)，25℃，反应16h。将反应后产物进行Ni柱纯化，第一步：平衡柱子：流速1ml/min，平衡柱子，其中平衡缓冲液A：(20mM Tris、500mM NaCl、20mM imidazole)，第二步：上样，上样流速0.5ml/min。第三步：收集样品，收集Ni柱流程，即为纯化后重组人纤连蛋白。

取纯化后重组人纤连蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测纯化后重组人纤连蛋白的蛋白浓度、纯度、内毒素含量和生物学活性。结果如下：

1)样品进行SDS-PAGE电泳的结果如图10所示。

2)BCA法测蛋白浓度：参考《中国药典》2020年版0731蛋白质含量测定法第四法2，2'-联喹啉-4，4'-二羧酸法(BCA法)测定纯化后重组人纤连蛋白浓度，浓度为4.5mg/ml。

3)纯度检测：参考《中国药典》2020年版。色谱柱为C18填料；流动相为0.25mol/L磷酸盐缓冲液(含0.15mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L磷酸二氢钠溶液)-乙腈(85∶15)；上样量为20μg，在波长280nm处检测，以重组纤连蛋白色谱峰按面积归一化法计算，检测其纯度为99％。

4)内毒素检测：参考《中国药典》2020年版1143细菌内毒素检查法。内毒素含量小于等于1EU/μg。

5)生物学活性检测：用固定化蛋白支持NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞粘附的能力进行测定。当细胞分别加入不同浓度(0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml)纤维连接蛋白包被板100μL/孔，37℃下35分钟后，1μg/ml纤维连接蛋白包被板约35％～60％的细胞具有特异性粘附。

实施例7：层析填料对重组纤连蛋白纯化的影响

取实施例3中筛选得到含重组质粒pET-32a-rHuFn的人纤连蛋白高表达菌种发酵液，纯化得到重组人纤连蛋白，实验组重组纤连蛋白纯化，步骤同实施6(实验组)；设置对照组1：与实施例6中步骤相比，其中第5)步采用的层析填料为Ni Seplife FF(IDA)。其余方法一致。设置对照组2：与实施例6中步骤相比，其中第5)步采用的层析填料为Ni Seplife 6FF(NTA)。其余方法一致。设置对照组3：与施例6中步骤相比，其中第5)步采用的层析填料为IMAC Seplife FF(IDA)。其余方法一致。

BCA法测检测纯化人纤连蛋白的蛋白浓度，参考《中国药典》2020年版检测蛋白纯度，结果如图11和图12所示。

实施例8：细胞划痕修复实验

取实施例6纯化的重组人纤连蛋白进行细胞划痕修复实验，通过人皮肤成纤维细胞划痕试验检测了重组人纤连蛋白对划痕修复的作用。具体如下：

将人皮肤成纤维细胞以2×10⁵个/mL的细胞密度接种于6孔板中，在培养箱中培养24h。用枪头笔直的划一条横线，用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清培养基。

分别设立空白对照组、0.05mg/mL实施例6纯化的重组人纤连蛋白测试组，0.05mg/mL MCE Fibronectin蛋白(Human目录号:HY-P70593)对照组。放入37℃、5％ CO₂培养箱培养，在0h，16h，30h时间点观察拍照。

结果如图13所示，重组人纤连蛋白测试组与对照组相比，实施例6纯化的重组人纤连蛋白具有更好的划痕修复能力。

实施例9：细胞增殖实验

取实施例6纯化的重组人纤连蛋白进行细胞增殖CCK-8实验，检测重组人纤连蛋白对细胞增殖的影响。

将状态良好的人永生化表皮细胞HaCaT均匀铺到96孔板中，待细胞贴壁之后，分别在孔里加入0、0.0125mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml重组人纤连蛋白。并用0.05mg/ml的MCEFibronectin蛋白(Human目录号:HY-P70593)作对比，空白对照组无处理。48h后加入10μLCCK8试剂，37℃孵育2h后用酶标仪检测450nm波长处的吸光度。

结果如图14所示，实施例6纯化重组人纤连蛋白处理后的人永生化表皮细胞增殖速度与空白对照组的人永生化表皮细胞增殖速度有显著性差异，重组人纤连蛋白能显著促进表皮细胞的增殖。本发明提供的0.05mg/ml重组纤连蛋白与市售0.05mg/ml的重组纤连蛋白相比，具有更好的促进增殖的生物活性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种重组人纤连蛋白，其特征在于，所述人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种人纤连蛋白的重组质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求1所述的重组人纤连蛋白的核苷酸序列。

3.一种重组人纤连蛋白的高产宿主菌，其特征在于，所述高产宿主菌包含权利要求2所述的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的高产宿主菌，其特征在于，所述高产宿主菌为大肠杆菌。

5.一种重组人纤连蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取权利要求3所述的高产宿主菌发酵培养，得发酵液；

(3)破碎所得菌悬液，0℃～4℃条件下离心收集上清；

(4)过滤收集的上清，得重组人纤连蛋白。

6.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述发酵的基础培养基包括：蛋白胨15g/L～30g/L，酵母粉10g/L～15g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，磷酸二氢钾2.0g/L～2.5g/L，磷酸氢二钾15g/L～16g/L，硫酸镁1.5g/L～2.5g/L，氯化锌0.08g/L～0.12g/L，硫酸锰0.08mg/L～0.12mg/L，钼酸钠0.08mg/L～0.12mg/L，氯化钙0.08mg/L～0.12mg/L。

7.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述发酵的补料培养基包括补料A和补料B；所述补料A包括：蛋白胨100g/L～220g/L和酵母粉80g/L～120g/L；所述补料B包括：葡萄糖450g/L～650g/L和硫酸镁8g/L～12g/L；所述补料采用非反馈指数流加补料，起始补料速度为8mL/h～12mL/h，按指数梯度增加，每小时增加8mL～12mL。。

8.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述裂解液包括15mM～25mM的tris和15mM～25mM的pbs；所述菌体和裂解液的质量体积比为1:(8～10)。

9.一种美容组合物，其特征在于，包含权利要求5～8任一项权利要求所述的制备方法制备的重组人纤连蛋白。

10.权利要求1所述的重组人纤连蛋白、权利要求2所述的重组质粒、权利要求3或4所述的高产宿主菌、权利要求5～8任一项权利要求所述的制备方法、权利要求9所述的组合物在食品、化妆品、保健品或药械领域中的应用。