CN117645664A - 重组人纤连蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了重组人纤连蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用，涉及基因工程技术领域，旨在解决现有方法中缺乏人纤连蛋白标准品的技术问题。所述重组人纤连蛋白标准品，所述重组人纤连蛋白标准品核苷酸序列是通过酵母密码子优化人源纤连蛋白的核苷酸序列获得的；所述重组人纤连蛋白标准品的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，所述重组人纤连蛋白标准品所编码的FNIII1C蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。本申请利用酿酒酵母分泌表达系统，将纤连蛋白通过基因重组分泌表达，从而提供了一种高纯度、高活性的重组人纤连蛋白标准品，可用于纤连蛋白标准物质的建立。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，特别涉及重组人纤连蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用。
背景技术
纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种重要的结构蛋白，存在于人体的结缔组织中。它是由三个亚单位（α链）组成的三股螺旋共享链。纤连蛋白在结缔组织中起着连接和支持细胞的作用，对于细胞外基质的形成和细胞间的相互作用至关重要。纤连蛋白是由FBN1基因编码的，FN高度保守且具有相同的组织结构。FN以二聚体形式存在，由两条分子量约为250kDa的多肽链通过C端的二硫键结合组成。每条链包含一连串的重复单元：12个I型、2个II型和7个重复单元。这些重复单元组成与纤维蛋白、纤连蛋白、明胶、细菌和细胞结合的功能域以发挥多种生物学功能，纤连蛋白的主要功能是形成弹性纤维，将不同类型的细胞和组织连接在一起。除了其结构特点，纤连蛋白还具有许多生理功能。它参与了细胞外基质的形成与重塑、细胞迁移和组织发育等过程。此外，纤连蛋白在血管系统的稳定性和弹性、皮肤弹性以及肌肉和韧带的功能性等方面也起到了重要的作用。纤连蛋白作为一种重要的结构蛋白，在人体的结缔组织中发挥着重要的结构支持和功能调控作用。还在许多病理过程起重要作用，如多发性关节炎和肿瘤。目前FN已经用于新兴生物医学领域，如肿瘤、创伤愈合、抑菌及组织工程材料等，也开始应用于美容护肤领域。
但目前国内市场上缺少纤连蛋白标准品，由此可能会引发一系列问题；如，传统的纤连蛋白通常来自动物结缔组织中，如皮肤、血管壁、肌腱等，因此来源限制导致了供应的不稳定性和可持续性的问题，以及动物源性纤连蛋白还存在批次差异和质量不一致的问题。因此在实际应用时，由于缺乏统一的标准化，会导致不同批次和不同品牌之间的成品存在差异；尽管成品都是经过质量控制的，但是其仍可能会存在功能限制和功能差异，因此，在一些特殊实验场景下，可能存在误差或局限性。如在细胞培养和组织工程等领域，动物源性纤连蛋白由于存在免疫原性、批次差异和生物活性不稳定等问题且难以进行定制化设计，以满足特定应用的需求，这限制了纤连蛋白在组织工程、再生医学和生物材料领域的进一步开发和应用。
发明内容
本申请的主要目的是提供重组人纤连蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用，旨在解决现有方法中缺乏纤连蛋白标准品的技术问题。
为实现上述目的，本申请第一种实施例提出了：重组人纤连蛋白标准品，所述重组人纤连蛋白标准品核苷酸序列是通过酵母密码子优化人源纤连蛋白的核苷酸序列获得的；
所述重组人纤连蛋白标准品的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，所述重组人纤连蛋白标准品所编码的FNIII1C蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。
作为本申请一些可选实施方式，所述重组人纤连蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
为实现上述目的，本申请第二种实施例还提出了：一种如上所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：
基于pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计FN基因的核苷酸序列；基于所述FN基因的核苷酸序列，构建表达质粒；
将所述表达质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，经过诱导表达后，收集诱导上清液；
将所述诱导上清液纯化后，获得重组人纤连蛋白原液；
基于所述重组人纤连蛋白原液，制备获得重组人纤连蛋白标准品。
作为本申请一些可选实施方式，所述基于所述FN基因的核苷酸序列，构建表达质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段通过Not I 和Xba I的酶切位点插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα中，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-C23-FNp质粒。
作为本申请一些可选实施方式，所述将所述表达质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞的步骤，包括：
取10μL的表达质粒加到80μL酿酒酵母INVSc1感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置5min；将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将所述电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；
电击转化结束后，向所述电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h；
孵育结束后，进行离心处理，并在离心后弃去400-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U选择培养基；将所述SC-U选择培养基倒置于30 ℃恒温培养，直至长出单克隆菌落；
挑取所述SC-U选择培养基上生长的单克隆菌落，接入到装有500μL YPD液体培养基离心管中，在30℃和180r/min的培养条件下进行过夜培养；过夜培养结束后，挑选10株克隆，分别提取基因组DNA；
利用引物对基因组DNA进行PCR处理，获得PCR产物；所述PCR条件为：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min。
作为本申请一些可选实施方式，所述引物上游引物F为5'-GCGGCCGCGGGACCAATGG-3'；
下游引物R为5'-TCTAGATTATGGTGTTGAAGTA-3'。
作为本申请一些可选实施方式，所述YPD液体培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L；
所述SC-U选择培养基为YNB无氨基酸氮源6.7g/L、氨基酸混合物I1g/L、氨基酸混合物Ⅱ 0.5g/L和葡萄糖20g/L；其中，所述氨基酸混合物I包括精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤；所述氨基酸混合物Ⅱ包括天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。
作为本申请一些可选实施方式，所述经过诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
挑取单菌落接种于20 mL SC-U选择培养基，经30℃、220 rpm振荡培养过夜，获得菌液；测定其OD600吸光值，将菌液转接至于100 mL SC-U诱导培养基中，使得初始OD600≈0.4继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至诱导完成；诱导完成后分别取菌液进行离心，离心后收集诱导上清液。
作为本申请一些可选实施方式，所述SC-U诱导培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L。
作为本申请一些可选实施方式，所述将所述诱导上清液纯化后，获得重组人纤连蛋白原液的步骤，包括：
使用阳离子交换介质，以25Mm pH 4.0 的NaH2PO4缓冲液平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；所述样品为诱导上清液；
待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样；
再以含1M NaCl的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后得到重组人FN蛋白原液。
作为本申请一些可选实施方式，所述基于所述重组人纤连蛋白原液，制备获得重组人纤连蛋白标准品的步骤，包括：
将所述重组人FN蛋白原液以2.5倍体积10mmol/L PBS稀释后加入冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2mL/瓶，获得半成品；其中，所述冻干保护剂由甘油、甘露醇和葡萄糖组成；
将所述半成品在-35℃的条件下冷冻真空干燥，首先将搁架温度降温到-12℃，保持45min，继续降温至-20℃保持45min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持4h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至28℃，维持4h，将西林瓶压塞封口，铝塑盖压盖，获得重组人纤连蛋白标准品。
为实现上述目的，本申请第三种实施例还提出了：一种重组人纤连蛋白标准品的鉴定方法，包括以下步骤：
将重组人纤连蛋白标准品用2mL PBS溶解，得到重组人纤连蛋白标准品溶液，采用Braford法检测蛋白质含量，获得蛋白质含量检验结果；
采用SDS-PAGE凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对重组人纤连蛋白标准品的纯度进行鉴定，获得纯度及鉴别检验结果；
采用Edman降解法对重组人纤连蛋白标准品进行N端氨基酸测序，获得N端测序检验结果；
对所述重组人纤连蛋白标准品生物学活性检测和均匀性评价检验，获得生物学活性检测结果和均匀性评价检验结果；
基于所述蛋白质含量检验结果、所述纯度及鉴别检验结果、所述N端测序检验结果、所述生物学活性检测结果和所述均匀性评价检验结果，对重组人纤连蛋白标准品进行鉴定。
为实现上述目的，本申请第四种实施例还提出了：一种如上所述重组人纤连蛋白标准品的应用，将所述重组人纤连蛋白标准品应用于制备医用材料和生物护肤。
相较于现有技术，本申请提供了一种通过酵母密码子优化人源纤连蛋白的核苷酸序列获得的重组人纤连蛋白标准品，所述纤连蛋白的氨基酸序列中包含多个重复结构域，如谷氨酸-丝氨酸-甘氨酸-天冬酰胺（EDGS）和丝氨酸-甘氨酸-丙氨酸（SGP）等。这些重复结构域赋予了纤连蛋白特殊的结构和功能。纤连蛋白含有胶原结合位点，这些结合位点使得纤连蛋白能够与胶原等其他结构蛋白相互作用，参与细胞外基质的形成和细胞间的相互作用。纤连蛋白的氨基酸序列中含有多个粘附位点，这些位点使得纤连蛋白能够与细胞表面受体进行特异性结合，介导细胞与基质之间的粘附和信号传导。基于此，本申请利用酿酒酵母分泌表达系统，将纤连蛋白通过基因重组分泌表达，从而提供了一种高纯度、高活性的重组人纤连蛋白标准品，可用于纤连蛋白标准物质的建立。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述阳性菌落鉴定电泳图谱；
图2为本申请实施例所述pYES2/CT-MFα-C23-FNp工程菌诱导表达SDS-PAGE检测结果示意图；
图3为本申请实施例所述纯化后蛋白原液的SDS-PAGE检测结果示意图；
图4为本申请实施例所述重组人纤连蛋白纯度HPLC检测结果示意图；
图5为本申请实施例所述重组人FN标准品和商品化FN的促细胞粘附活性对比图；
图6为本申请实施例所述重组人FN标准品和商品化FN的促角质细胞增殖活性对比图；
图7为本申请实施例所述重组人FN标准品和商品化FN的促角质细胞迁移活性对比图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
纤连蛋白被认为是制备医用材料和生物护肤的理想原料，但因其蛋白质序列疏水性氨基酸占比重较大，水溶性较差，蛋白表达过程中表达不稳定、易形成包涵体，并且纯化得到蛋白稳定性和生物学活性均不可控，造成纤连蛋白生产过程和质量控制无法溯源。
因此，本申请提供了一种通过酵母密码子优化人源纤连蛋白的核苷酸序列获得的重组人纤连蛋白标准品，所述纤连蛋白的氨基酸序列中包含多个重复结构域，如谷氨酸-丝氨酸-甘氨酸-天冬酰胺（EDGS）和丝氨酸-甘氨酸-丙氨酸（SGP）等。这些重复结构域赋予了纤连蛋白特殊的结构和功能。纤连蛋白含有胶原结合位点，这些结合位点使得纤连蛋白能够与胶原等其他结构蛋白相互作用，参与细胞外基质的形成和细胞间的相互作用。纤连蛋白的氨基酸序列中含有多个粘附位点，这些位点使得纤连蛋白能够与细胞表面受体进行特异性结合，介导细胞与基质之间的粘附和信号传导。基于此，本申请提供的重组人纤连蛋白通过串联重复的FNIII1C氨基酸序列得到，它们由三段重复的序列组成，呈现了更多的正向结合位点，有利于提高纤连蛋白的生物学活性；同时通过重复串联表达提高纤连蛋白的分子量，使纤连蛋白更为长效。再者，本申请利用酿酒酵母分泌表达系统，将纤连蛋白通过基因重组分泌表达，酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体，其为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。
即本申请实施例提供了一种重组人纤连蛋白标准品，所述重组人纤连蛋白标准品核苷酸序列是通过酵母密码子优化人源纤连蛋白的核苷酸序列获得的；所述重组人纤连蛋白标准品的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示；所述重组人纤连蛋白标准品所编码的FNIII1C蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。
具体地，所述重组人纤连蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列；其中，所述Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；所述Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；所述起始密码子的核苷酸序列为ATG；所述终止密码子的核苷酸序列为TAA。
为便于本领域技术人员理解本申请技术方案，本申请还提供了一种如上所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10、基于pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计FN基因的核苷酸序列；基于所述FN基因的核苷酸序列，构建表达质粒。
具体地，所述基于所述FN基因的核苷酸序列，构建表达质粒的步骤，包括：基于如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段通过Not I 和XbaI的酶切位点插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα中，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-C23-FNp质粒。
所述将所述表达质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞的步骤，包括：取10μL的表达质粒加到80μL酿酒酵母INVSc1感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置5min；将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将所述电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；电击转化结束后，向所述电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h；孵育结束后，进行离心处理，并在离心后弃去400-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U选择培养基；将所述SC-U选择培养基倒置于30 ℃恒温培养，直至长出单克隆菌落；挑取所述SC-U选择培养基上生长的单克隆菌落，接入到装有500μL YPD液体培养基离心管中，在30℃和180r/min的培养条件下进行过夜培养；过夜培养结束后，挑选10株克隆，分别提取基因组DNA；利用引物对基因组DNA进行PCR处理，获得PCR产物；所述PCR条件为：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min。其中，所述引物上游引物F为5'-GCGGCCGCGGGACCAATGG-3'，下游引物R为5'-TCTAGATTATGGTGTTGAAGTA-3'。
需要说明的是，所述YPD液体培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L；所述SC-U选择培养基为YNB无氨基酸氮源6.7g/L、氨基酸混合物I1g/L、氨基酸混合物Ⅱ 0.5g/L和葡萄糖20g/L；其中，所述氨基酸混合物I包括精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤；所述氨基酸混合物Ⅱ包括天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。
步骤S20、将所述表达质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，经过诱导表达后，收集诱导上清液。
具体地，所述经过诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：挑取单菌落接种于20 mL SC-U选择培养基，经30℃、220 rpm振荡培养过夜，获得菌液；测定其OD600吸光值，将菌液转接至于100 mL SC-U诱导培养基中，使得初始OD600≈0.4继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至诱导完成；诱导完成后分别取菌液进行离心，离心后收集诱导上清液。
需要说明的是，所述SC-U诱导培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L。
步骤S30、将所述诱导上清液纯化后，获得重组人纤连蛋白原液。
具体地，所述将所述诱导上清液纯化后，获得重组人纤连蛋白原液的步骤，包括：使用阳离子交换介质，以25Mm pH 4.0 的NaH2PO4缓冲液平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；所述样品为诱导上清液；待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样；再以含1M NaCl的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后得到重组人FN蛋白原液。
步骤S40、基于所述重组人纤连蛋白原液，制备获得重组人纤连蛋白标准品。
具体地，所述基于所述重组人纤连蛋白原液，制备获得重组人纤连蛋白标准品的步骤，包括：将所述重组人FN蛋白原液以2.5倍体积10mmol/L PBS稀释后加入冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2mL/瓶，获得半成品；其中，所述冻干保护剂由甘油、甘露醇和葡萄糖组成；将所述半成品在-35℃的条件下冷冻真空干燥，首先将搁架温度降温到-12℃，保持45min，继续降温至-20℃保持45min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持4h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至28℃，维持4h，将西林瓶压塞封口，铝塑盖压盖，获得重组人纤连蛋白标准品。
为了对通过上述方法制备获得的产品进行成分分析，本申请实施例还提供了一种重组人纤连蛋白标准品的鉴定方法，包括以下步骤：将重组人纤连蛋白标准品用2mL PBS溶解，得到重组人纤连蛋白标准品溶液，采用Braford法检测蛋白质含量，获得蛋白质含量检验结果；采用SDS-PAGE凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对重组人纤连蛋白标准品的纯度进行鉴定，获得纯度及鉴别检验结果；采用Edman降解法对重组人纤连蛋白标准品进行N端氨基酸测序，获得N端测序检验结果；对所述重组人纤连蛋白标准品生物学活性检测和均匀性评价检验，获得生物学活性检测结果和均匀性评价检验结果；基于所述蛋白质含量检验结果、所述纯度及鉴别检验结果、所述N端测序检验结果、所述生物学活性检测结果和所述均匀性评价检验结果，对重组人纤连蛋白标准品进行鉴定。
下面结合具体实施方式对本申请的技术方案进行解释：
实施例1
步骤1：蛋白序列选择
本申请所述重组人纤连蛋白序列，源于人源纤连蛋白（UniProt：P02751）；该纤连蛋白的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；重组人纤连蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；起始密码子的核苷酸序列为ATG；终止密码子的核苷酸序列为TAA。
所述长效重组人纤连蛋白的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人纤连的核苷酸序列获得的，所述优化包括减少重复序列的重复频率对所述人纤连的核苷酸序列进行人工设计。经酵母密码子优化后的核苷酸序列为：
1)根据pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计FN基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，具体为：
GCGGCCGCCCTACTGATTTGCGATTCACCAATATCGGACCCGACACTATGAGAGTGACATGGGCACCGCCACCTTCAATAGATCTAACGAATTTTTTAGTCAGATACAGTCCGGTAAAAAACGAGGAGGACGTTGCGGAGCTGAGCATCAGCCCTTCGGATAATGCTGTTGTCTTGACTAATCTTCTGCCGGGAACTGAGTACGTCGTCTCTGTTTCATCAGTATACGAACAGCATGAATCGACTCCTCTCCGCGGTAGGCAGAAGACCGGTCTTGACTCCCCTACTGGTATTGATTTCAGTGACATAACCGCAAACAGCTTCACGGTACACTGGATCGCACCCCGCGCCACGATAACAGGTTATCGGATCCGTCATCATCCTGAACACTTTTCTGGGCGTCCGCGGGAAGACCGTGTACCACACTCACGCAATAGTATTACTTTAACCAATCTGACGCCAGGAACAGAATACGTTGTGAGTATCGTAGCCCTCAACGGGCGAGAGGAATCTCCCCTTCTCATAGGCCAGCAAAGCACGGTTTCCGACGTGCCCAGGGACCTAGAAGTGGTTGCCGCAACGCCAACTTCGCTATTGATATCCTGGGATGCTCCTGCGGTGACCGTGAGATATTACAGGATTACTTATGGGGAAACAGGAGGAAACTCTCCAGTCCAAGAGTTTACAGTACCCGGCTCGAAATCTACAGCTACAATTTCGGGCTTAAAGCCGGGGGTGGACTATACCATCACGGTCTATGCCGTCACAGGCCGAGGGGATTCACCCGCTTCTTCTAAACCAATTTCCATTAACTATCGGACCGAGATAGATAAGCCGAGTTGACATCACCATCACCATCACTAATCTAGA；
上述基因所编码的FNIII1C蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，具体为：
MPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSHHHHHH；
本实施例提供的重组人纤连蛋白具有良好的生物相容性、良好的细胞黏附性、能促进新细胞形成，而且其促进上皮细胞生长功能更强。且本实施例提供的重组人纤连蛋白与从动物组织和异体中提取的纤连蛋白相比的优势在于其可溶性、无病毒隐患和排异反应低。
步骤2：表达质粒的构建及电转酵母细胞
将重组人纤连蛋白优化后的碱基序列（SEQ ID No.1），委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过Not I 和Xba I的酶切位点插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组pYES2/CT-MFα-C23-FNp质粒。
将该构建成功的表达质粒转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞。具体过程为：取10μL的该质粒加到80μL酿酒酵母INVSc1感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置5min。Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化。电击结束后迅速向电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h。离心后弃去400-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U选择培养基。将平板倒置于30 ℃恒温培养，直至长出单克隆菌落。PCR鉴定阳性克隆株：挑取平板上生长的单菌落，接入到装有500μL YPD液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA。利用引物（上游引物F：5'-GCGGCCGCGGGACCAATGG-3'，下游引物R：5'-TCTAGATTATGGTGTTGAAGTA-3'）扩增目的基因。PCR条件：98℃预变性，5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min。预计条带大小约820bp，如图1所示，其中图1中泳道M：DL2000 DNAMarker；泳道1：阴性对照；泳道1-3：单菌落PCR产物。
步骤3：重组酵母菌的诱导表达
所用培养基配方如下：
1）YPD液体培养基：
酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；
2）SC-U选择培养基：
YNB无氨基酸氮源6.7g/L，0.01%氨基酸混合物I（精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤）1g/L，氨基酸混合物Ⅱ（天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸）0.5g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；
3）SC-U诱导培养基：
酵母提取物10g/L，蛋白胨（Peptone）20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；
具体操作为：挑取单菌落接种于20 mL SC-U选择培养基，经30℃、220 rpm振荡培养过夜。测定其OD600吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100 mL SC-U诱导培养基中，使得初始OD600≈0.4继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至诱导完成。诱导后分别取菌液离心收集表达上清。经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果如图2所示，其中图2中泳道M：蛋白Marker；泳道1：诱导前；泳道2~4：分别为挑取的不同菌落诱导表达上清。
步骤4：纯化
离心收集培养液上清。使用阳离子交换介质（层析填料为千纯产SP Purose 6High Performance，装载于GE Akta层析系统），以NaH2PO4缓冲液（25Mm，pH 4.0）平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。再以含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后得到重组人FN蛋白原液，如图3所示。
步骤5：重组人纤连蛋白标准品制备
将上步所得的重组人纤连蛋白原液2.5倍体积10mmol/L PBS稀释后加入终浓度5％甘油、0.12g/mL甘露醇和0.025g/mL葡萄糖冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2mL/瓶。
将制得的半成品分装后，在-35℃的条件下冷冻真空干燥：首先将搁架温度降温到-12℃，保持45min，继续降温至-20℃保持45min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持4h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至28℃，维持4h，将西林瓶压塞封口，铝塑盖压盖。制得的成品进行蛋白质含量检验、纯度及鉴别检验、N端测序检验、生物学活性检测和均匀性评价检验。
以下实验例是指对上述实施例1所获得的重组人纤连蛋白进行生物学标准品评价的实验。
实验例1重组人纤连蛋白标准品的蛋白质含量鉴定
将重组人纤连蛋白标准品用2mL PBS溶解，得到重组人纤连蛋白标准品溶液，采用Braford法检测蛋白质含量。检测过程如下：
1）取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每1mL中含1mg的溶液。
2）按照如表1所示的各品种项下规定的方法制备（蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
3）精密量取对照品溶液0.0mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL，分别置具塞试管中，各加水至0.1mL，再分别加入考马斯亮蓝G250染色液5.0mL，立即混匀，用紫外分光光度计立即在595nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得蛋白质含量。
表1 重组人纤连蛋白蛋白质含量检测
实验例2 重组人纤连蛋白标准品的蛋白质纯度鉴定
采用SDS-PAGE凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对标准品的纯度进行鉴定。
SDS-PAGE凝胶电泳法操作步骤如下：取40μL重组人纤连蛋白溶液与160μL的5×电泳上样缓冲液混合，沸水浴5min，上样10μL，采用预制胶进行分离，电泳电压为80V 30min，120V电泳1h。电泳完成后，考马斯亮蓝进行染色，染色完成后，甲醇-乙酸溶液进行脱色成像。经GIS软件分析标准品纯度为97%，相对分子量约为26kDa。
反相高效液相色谱操作步骤如下：重组人纤连蛋白溶于PBS水溶液中，配置样品浓度为1mg/mL，经0.22µm滤膜过滤，经HPLC分析。
色谱条件：XBridge BEH 300 C4色谱柱（柱体积12.5mL）。流速：1.0mL/min；柱温：25℃；样品池温度4℃；进样量：20μL；流动相A：乙腈，流动相B：PBS，pH7.2；检测器为DAD检测器，检测波长：280nm，按面积归一法测定样品纯度。通过计算峰面积得出重组人纤连蛋白主峰面积占总面积的98.95%，结果如图4所示。
实验例3 重组人纤连蛋白标准品的蛋白质N端氨基酸
采用Edman降解法进行N端氨基酸测序。N端氨基酸序列测定操作步骤如下：
(a)SDS-PAGE电泳：将溶解后蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min；
(b)转膜：将蛋白电转到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液；
(c)丽春红染色：将PVDF膜放到丽春红染液中染色30min，用水洗去背景颜色；
(d)将目的条带剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法进行N端氨基酸测序；
(e)N-端二十个氨基酸序列为PTDLRFTNIGPDTMRVTWAP，说明溶解后的标准品候选物就是重组人纤连蛋白。
实验例4 重组人纤连蛋白标准品的蛋白质生物学活性测试
1）促细胞黏附活性检测：将纤连蛋白用PBS预稀释至0.5μg/mL，预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做8个稀释度，每孔50μL不同稀释度的纤连蛋白样本，并设立阴性对照（不加纤连蛋白），加入50μL PBS作为对照，4℃过夜孵育。孵育完成后，弃去板中液体，每孔加入100μL PBS洗涤，共洗涤3次；洗涤结束后，每孔加入100μL 30μg/μL BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；孵育完成后，弃去板中液体，每孔加入100μL PBS洗涤3次，再加入纤维细胞悬液，细胞接种密度为1.0×105cells/mL，每孔接种100μL，温箱孵育5h。将孵育完成的细胞板PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果拟合曲线得出效价。结果如图5所示，结果证明商品化纤连蛋白和重组人纤连蛋白均具有促人成纤维细胞粘附活性，且重组人纤连蛋白黏附活性更优异。
2）促角质细胞增殖：人角质细胞株用10%小牛血清的DMEM培养液于37℃、5%二氧化碳培养，制备控制细胞浓度为每1mL含1.0×104~5.0×104个细胞，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100 μL， 于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成0.4%小牛血清的DMEM培养液。培养24h后，制备的细胞培养板弃去培养液，加入2倍系列稀释的纤连蛋白溶液，同时设置阴性对照（只接种细胞），每组各2个重复孔。每孔100 μL。置37℃、5%二氧化碳培养68~72小时。MTT法进行终止，每孔加入MTT溶液20μL于37℃、5%二氧化碳培养5小时，弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL，充分溶解混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果，数据处理，结果如图6所示，结果数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。
3）促角质细胞迁移试验：先用Marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。向6孔板孔中加入浓度为5×105个/mL的人角质细胞悬液2 mL。第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。根据分组往孔中加入1.8mL无血清DMEM培养液，之后加入200μL的重组人纤连蛋白，细胞对照孔加入等量的PBS溶液。放入37度5%CO2培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续24h时对固定位置进行观察、拍照，计算细胞迁移率，结果如图7所示。
实验例5 标准物质的瓶内均匀性评价
标准物质的瓶内均匀性评价是评价标准品的特性在瓶内的变异差。使用标准物质时通常需要从单元中取一部分子样进行测定。为了控制每一部分子样测定结果的偏差，标准物质需要进行瓶内均匀性的评价。
对重组人纤连蛋白标准品的瓶内均匀性评价的过程如下：
取样：随机取出一支重组人纤连蛋白标准品，加2mL PBS溶解，用移液器分十次吸取标准品至1.5mL的离心管中，每次取20μL。之后，在每个离心管中加入80μL的PBS，混匀。
按照上述促细胞黏附，对重组人纤连蛋白标准品活性进行检测，每个样本测量三次。
评价结果的处理，首先，用格布拉斯法检测所得数据之中是否有异常值，如有异常值将异常值剔除，其次，求得十次取样所的样本测量结果的变异系数，变异系数的公式如下：
式中：—测量结果的平均值；s—标准差；CV—变异系数。
根据变异系数判断标准品的瓶内均匀性。
重组人纤连蛋白标准品的瓶内均匀性评价结果：十次取样所的样本中重组人纤连蛋白标准品活性见表2，通过格布拉斯法检测，数据中无可疑值，通过计算得出重组人纤连蛋白瓶内取样的变异系数CV=1.13%，由此可得出重组人纤连蛋白标准品的瓶内均匀性良好。
表2 十次取样重组人纤连蛋白标准品测定活性
实验例6 标准物质的瓶间均匀性评价
标准物质的瓶间均匀性评价是指标准物质的特性在瓶与瓶之间的变差。重组人纤连蛋白标准品制备的最后一步是将混合好的重组人纤连蛋白标准品溶液分装至7mL的西林瓶中冻干，为了对每一瓶重组人纤连蛋白标准物质的测量结果的偏差进行控制，所以要进行重组人纤连蛋白标准品的瓶间均匀性评价。对重组人纤连蛋白标准品的瓶间稳定性评价的过程如下：
取样：采用随机抽样的方法进行抽样。按照一级标准物质技术规范（JJG1006-1994）的有关规定，对于均匀性良好的样品，分装量单元数少于500个，抽取样本数不应少于10个。本申请抽取10个样本，每个样本用移液器吸取200μL，进行检测。
按照上述促细胞黏附试验方法，对重组人纤连蛋白标准品活性进行检测，每个样本测量三次。评价结果的处理包括：首先，用格布拉斯法检测所得数据之中是否有异常值，如有异常值将异常值剔除，之后，用单因素方差分析的方法对所得数据进行处理。根据处理结果判断重组人纤连蛋白标准品的瓶间均匀性。
标准品的瓶间均匀性评价结果：重组人纤连蛋白瓶间均匀性评价试验测定活性大小见表3，单因素方差分析结果见表4。通过单因素方差分析表可以看出重组人纤连蛋白瓶间活性值的单因素方差分析P值在为0.3393，P值均大于0.05，由此得出重组人纤连蛋白标准品的瓶间均匀性良好。
表3 重组人纤连蛋白瓶间均匀性评价试验测定活性大小
表4 重组人纤连蛋白瓶间均匀性评价试验数据单因素方差分析结果
由此可见，纤连蛋白被认为是制备医用材料和生物护肤的理想原料，但因其蛋白质序列疏水性氨基酸占比重较大，水溶性较差，蛋白表达过程中表达不稳定、易形成包涵体，并且纯化得到蛋白稳定性和生物学活性均不可控，造成纤连蛋白生产过程和质量控制无法溯源。本申请利用酵母分泌表达重组人纤连蛋白疏水区短肽重复序列，能够高水平表达蛋白质分泌至培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性，经过体外细胞验证，有明显促细胞粘附活性和促成纤维细胞纤连生成活性；制备了检测标准品，冻干重组人纤连蛋白标准品稳定性好：纤连蛋白标准品通常经过特殊处理，具有较高的稳定性，可以长期保存，并能够稳定地维持其生物活性和定量特性。精度高，纤连蛋白标准品经过仔细选取并严格检验，其含量和生物活性得到了准确控制和确认，因此能够提供高精度的定量数据。重现性好，纤连蛋白标准品在不同时间、不同实验操作者以及不同实验条件下的重复性较好，能够提供可靠的实验结果。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (13)
1.重组人纤连蛋白标准品，其特征在于，所述重组人纤连蛋白标准品核苷酸序列是通过酵母密码子优化人源纤连蛋白的核苷酸序列获得的；
所述重组人纤连蛋白标准品的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，所述重组人纤连蛋白标准品所编码的FNIII1C蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述重组人纤连蛋白标准品，其特征在于，所述重组人纤连蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
3.一种如权利要求1-2任一项所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
设计FN基因的核苷酸序列；基于所述FN基因的核苷酸序列，构建表达质粒；
将所述表达质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，经过诱导表达后，收集诱导上清液；
将所述诱导上清液纯化后，获得重组人纤连蛋白原液；
基于所述重组人纤连蛋白原液，制备获得重组人纤连蛋白标准品。
4.根据权利要求3所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述基于所述FN基因的核苷酸序列，构建表达质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段通过Not I 和Xba I的酶切位点插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα中，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-C23-FNp质粒。
5.根据权利要求3所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述将所述表达质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞的步骤，包括：
取10μL的表达质粒加到80μL酿酒酵母INVSc1感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置5min；将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将所述电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；
电击转化结束后，向所述电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h；
孵育结束后，进行离心处理，并在离心后弃去400-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U选择培养基；将所述SC-U选择培养基倒置于30 ℃恒温培养，直至长出单克隆菌落；
挑取所述SC-U选择培养基上生长的单克隆菌落，接入到装有500μL YPD液体培养基离心管中，在30℃和180r/min的培养条件下进行过夜培养；过夜培养结束后，挑选10株克隆，分别提取基因组DNA；
利用引物对基因组DNA进行PCR处理，获得PCR产物；所述PCR条件为：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min。
6.根据权利要求5所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述引物上游引物F为5'-GCGGCCGCGGGACCAATGG-3'，下游引物R为5'-TCTAGATTATGGTGTTGAAGTA-3'。
7.根据权利要求5所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述YPD液体培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L；
所述SC-U选择培养基为YNB无氨基酸氮源6.7g/L、氨基酸混合物I1g/L、氨基酸混合物Ⅱ 0.5g/L和葡萄糖20g/L；其中，所述氨基酸混合物I包括精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤；所述氨基酸混合物Ⅱ包括天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。
8.根据权利要求3所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述经过诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
挑取单菌落接种于20 mL SC-U选择培养基，经30℃、220 rpm振荡培养过夜，获得菌液；测定其OD600吸光值，将菌液转接至于100 mL SC-U诱导培养基中，使得初始OD600≈0.4继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至诱导完成；诱导完成后分别取菌液进行离心，离心后收集诱导上清液。
9.根据权利要求8所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述SC-U诱导培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L。
10.根据权利要求3所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导上清液纯化后，获得重组人纤连蛋白原液的步骤，包括：
使用阳离子交换介质，以25Mm pH 4.0 的NaH2PO4缓冲液平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；所述样品为诱导上清液；
待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样；
再以含1M NaCl的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后得到重组人FN蛋白原液。
11.根据权利要求3所述重组人纤连蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述基于所述重组人纤连蛋白原液，制备获得重组人纤连蛋白标准品的步骤，包括：
将所述重组人FN蛋白原液以2.5倍体积10mmol/L PBS稀释后加入冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2mL/瓶，获得半成品；其中，所述冻干保护剂由甘油、甘露醇和葡萄糖组成；
将所述半成品在-35℃的条件下冷冻真空干燥，首先将搁架温度降温到-12℃，保持45min，继续降温至-20℃保持45min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持4h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至28℃，维持4h，将西林瓶压塞封口，铝塑盖压盖，获得重组人纤连蛋白标准品。
12.一种如权利要求1-2任一项所述重组人纤连蛋白标准品的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组人纤连蛋白标准品用2mL PBS溶解，得到重组人纤连蛋白标准品溶液，采用Braford法检测蛋白质含量，获得蛋白质含量检验结果；
采用SDS-PAGE凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对重组人纤连蛋白标准品的纯度进行鉴定，获得纯度及鉴别检验结果；
采用Edman降解法对重组人纤连蛋白标准品进行N端氨基酸测序，获得N端测序检验结果；
对所述重组人纤连蛋白标准品生物学活性检测和均匀性评价检验，获得生物学活性检测结果和均匀性评价检验结果；
基于所述蛋白质含量检验结果、所述纯度及鉴别检验结果、所述N端测序检验结果、所述生物学活性检测结果和所述均匀性评价检验结果，对重组人纤连蛋白标准品进行鉴定。
13.一种如权利要求1-2任一项所述重组人纤连蛋白标准品的应用，其特征在于，将所述重组人纤连蛋白标准品应用于制备医用材料和生物护肤。
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