CN117069864B - 一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种具有修复活性的重组纤连‑胶原融合蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种具有修复活性的重组纤连‑胶原融合蛋白，所述重组纤连‑胶原融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组纤连‑胶原融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。本申请的重组纤连‑胶原融合蛋白同时具有的胶原蛋白和纤连蛋白的功效，经过体外细胞验证和动物试验验证，该重组纤连‑胶原融合蛋白具有比商品化纤连蛋白更明显的促细胞增殖、促细胞粘附活性和促细胞迁移活性，修复活性较高，可在生物护肤中用于保湿和修复。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，特别涉及一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
纤连蛋白（Fibronectin，FN），也称纤维连接蛋白，具有多种生物学功能。纤连蛋白广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，分子量约为450kDa，具有多种生物活性。纤连蛋白可以结合细胞表面和各种化合物，包括胶原、纤维蛋白、肝素、DNA和肌动蛋白，参与细胞粘附、细胞运动、调理作用、伤口愈合和细胞形状的维持。纤连蛋白可以与细胞表面的整合素αvβ3结合，增强血小板附着、吞噬细胞和成纤维细胞迁移以及细胞增殖，增强其粘附力。纤连蛋白是成纤维细胞的重要趋化因子，可通过帮助维持细胞骨架结构来增强细胞的粘附和趋化。纤连蛋白还通过刺激内皮细胞迁移增强新生血管的形成。故纤连蛋白在皮肤中起到的是维护皮肤屏障的功效，外源补充纤连蛋白可以修复皮肤屏障。而胶原蛋白也是与美容护肤、组织再生关系最为紧密的成分，一方面胶原蛋白组成纤维，从而构成细胞外基质的三维结构，为细胞提供生存空间，支撑组织的生理形态；另一方面，其所构建的三维结构可以通过生物力转导从而调控细胞的粘附、增殖和分化以及免疫细胞的免疫应答等行为，从而调控组织再生。目前，市场上销售的相关蛋白产品大多为动物组织中提取而非人源，可能无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。而重组人源蛋白大多为表达单一的胶原蛋白或者纤连蛋白，暂无表达胶原蛋白融合纤连蛋白的相关产品；且无论是胶原蛋白还是纤连蛋白，其修复活性都有待提高。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的蛋白产品表达单一的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白，所述重组纤连-胶原融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组纤连-胶原融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
可选地，所述重组纤连-胶原融合蛋白是经酿酒酵母表达的类人胶原蛋白与类人纤连蛋白的融合蛋白。
可选地，所述重组纤连-胶原融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白功能区片段和纤连蛋白功能区片段所得。
可选地，所述连接肽片段为（G4S）3。
可选地，所述人源化Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白功能区片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。
可选地，所述纤连蛋白功能区片段为人源纤连蛋白中第Ⅲ型结构域中重复单元C端的一个功能片段，所述纤连蛋白功能区片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
本申请还提出了一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒；
将所述pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌；
对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清；
将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连-胶原融合蛋白。
可选地，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pYES2/CT-Mfα质粒上的酶切位点Not Ⅰ和Xba Ⅰ之间，获得pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒。
可选地，所述将所述pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-C23-FNp加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
经菌液PCR筛选阳性克隆株，获得重组酵母工程菌。
可选地，所述对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h向所述SC-U诱导培养基中添加半乳糖至所述半乳糖终浓度为2.0%，诱导后，离心收集诱导上清。
可选地，所述将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连-胶原融合蛋白的步骤，包括：
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组纤连-胶原融合蛋白。
本申请还提出了一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白在护肤品中的应用，采用上述重组纤连-胶原融合蛋白作为护肤品中的修复成分。
本发明的有益效果为：
本申请基于人胶原蛋白与人纤连蛋白序列优化，利用基因重组技术，异源表达后获得重组纤连-胶原融合蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该重组纤连-胶原融合蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示，使该融合蛋白更易在表达系统中表达。不仅解决了天然纤连蛋白分子量较大，难以从动物组织中异源提取，加工性较差，且蛋白纯度较低，成本较高，蛋白作用半衰期太短，相关蛋白产品功效性有限的问题，而且能够减少对人体的排斥反应，规避潜在的携带病原体的风险，同时保留了天然纤连蛋白和天然胶原蛋白的优良生物学性能，使得本申请的重组纤连-胶原融合蛋白同时具有的胶原蛋白和纤连蛋白功效，经过体外细胞验证和动物试验验证，该重组纤连-胶原融合蛋白具有比商品化纤连蛋白更明显的促细胞增殖、促细胞粘附活性和促细胞迁移活性，修复活性较高，可在生物护肤中用于保湿和修复。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的阳性克隆株鉴定的电泳结果示意图；
图2为本申请实施例所述的诱导上清的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图3为本申请实施例所述的重组纤连-胶原融合蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图4为本申请实验例所述的重组纤连-胶原融合蛋白的相对细胞存活率曲线示意图；
图5为本申请实验例所述的重组纤连-胶原融合蛋白促细胞迁移活性镜下观察结果的示意图；
图6为本申请实验例所述的重组纤连-胶原融合蛋白促细胞迁移活性示意图；
图7为本申请实验例所述的重组纤连-胶原融合蛋白促细胞粘附活性示意图；
图8为本申请实验例所述的使用重组纤连-胶原融合蛋白精华液后皮肤角质层水分含量均值示意图；
图9为本申请实验例所述的使用重组纤连-胶原融合蛋白精华液后皮肤经表皮水分流失TEWL均值示意图。
序列表说明（序列表内容单独提供）：
Seq ID NO.1所示为本申请实施例中人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.2所示为本申请实施例中人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.3所示为本申请实施例中胶原蛋白融合肽的氨基酸序列；
Seq ID NO.4所示为本申请实施例中纤连蛋白功能区片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.5所示为本申请实施例中重组纤连-胶原融合蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.6所示为本申请实施例中重组纤连-胶原融合蛋白的核苷酸序列。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
针对上述现有的蛋白所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白，所述重组纤连-胶原融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组纤连-胶原融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
本申请基于人胶原蛋白与人纤连蛋白序列优化，利用基因重组技术，异源表达后获得重组纤连-胶原融合蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该重组纤连-胶原融合蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示，使该融合蛋白更易在表达系统中表达。不仅解决了天然纤连蛋白分子量较大，难以从动物组织中异源提取，加工性较差，且蛋白纯度较低，成本较高，蛋白作用半衰期太短，相关蛋白产品功效性有限的问题，而且能够减少对人体的排斥反应，规避潜在的携带病原体的风险，同时保留了天然纤连蛋白和天然胶原蛋白的优良生物学性能，使得本申请的重组纤连-胶原融合蛋白同时具有的胶原蛋白和纤连蛋白功效，经过体外细胞验证和动物试验验证，该重组纤连-胶原融合蛋白具有比商品化纤连蛋白更明显的促细胞增殖、促细胞粘附活性和促细胞迁移活性，修复活性较高，可在生物护肤中用于保湿和修复。
作为本申请的一种可实施方式，所述重组纤连-胶原融合蛋白是经酿酒酵母表达的类人胶原蛋白与类人纤连蛋白的融合蛋白。
由于微生物表达系统有着产量高、生产周期短、培养简单、成本低、易获取高密度发酵等优点，目前应用于重组蛋白表达的宿主主要有毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、大肠杆菌等。本申请利用酿酒酵母表达系统，其无内毒素、产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化，同时具有将异源蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，且酿酒酵母含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分，使用酿酒酵母表达异源蛋白具有较大优势。
作为本申请的一种可实施方式，所述重组纤连-胶原融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白功能区片段和纤连蛋白功能区片段所得。
本申请通过酿酒酵母表达类人纤连蛋白与类人胶原蛋白的融合蛋白序列，通过对胶原蛋白成熟肽功能结构域序列进行疏水性分析，选择评分较低的氨基酸序列片段，并以连接肽片段连接人源化Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白功能区片段和纤连蛋白功能区片段，使其整合成融合蛋白，即得到具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白。
作为本申请的一种可实施方式，所述连接肽片段为（G4S）3。具体的，连接肽片段的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，通过一段柔性连接肽即可将人源化Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白功能区片段和纤连蛋白功能区片段进行连接，整合成融合蛋白。
作为本申请的一种可实施方式，所述人源化Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白功能区片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如SeqID NO.3所示。
在具体应用中，人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅱ型胶原蛋白序列，人源Ⅱ型胶原蛋白序列参考：UniProt P02458序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02458），人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅲ型胶原蛋白序列，人源Ⅲ型胶原蛋白序列参考：UniProt P02461序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02461）。通过对人源Ⅱ型胶原蛋白和人源Ⅲ型胶原蛋白功能结构域序列进行疏水性分析，选择评分较低的氨基酸片段，分别为如Seq ID NO.1所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段以及如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段，并将人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连构成新的胶原蛋白融合肽，如Seq ID NO.3所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述纤连蛋白功能区片段为人源纤连蛋白中第Ⅲ型结构域中重复单元C端的一个功能片段。
在具体应用中，纤连蛋白功能区片段源于人源纤连蛋白序列，人源纤连蛋白序列参考：UniProt P02751序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02751），选择人源纤连蛋白中第Ⅲ型结构域中重复单元C端的一个功能片段，所选择的纤连蛋白功能区片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
本申请的实施例还提供了一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S10、依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒。
在具体应用中，委托通用生物（安徽）股份有限公司依据如Seq ID NO.6所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pYES2/CT-Mfα质粒上的酶切位点NotⅠ和XbaⅠ之间，获得pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒。
S20、将所述pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌。
在具体实施过程中，取10μL的pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒加入80μL酿酒酵母INVScl感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置5min；Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；电击结束后迅速向电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h；离心后弃去400μL-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U固体平板，并将SC-U固体平板于30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
挑取SC-U固体平板上生长的单菌落，并接入到装有500μL YPD液体培养基的离心管，在30℃、180r/min的条件下过夜培养。
通过PCR鉴定阳性克隆株，挑选10株阳性克隆株，分别提取基因组DNA，利用引物扩增目的基因。
其中，检测引物为：
上游引物F：5'-GCGGCCGCGGGACCAATGG-3'
下游引物R：5'-TCTAGATTATGGTGTTGAAGTA-3'
PCR条件为：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min；
对扩增的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果显示扩增出预期大小的基因片段（约830bp），如图1所示，表明为阳性克隆株。其中，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-10：单菌落PCR产物。
具体的，在这一步中，YPD液体培养基的配方包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
S30、对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清。
在具体实施过程中，挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30°C、220rpm震荡培养过夜，测定其OD600nm吸光值，计算相应体积的菌液并转接至100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h向所述SC-U诱导培养基中添加半乳糖至所述半乳糖终浓度为2.0%，诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集诱导上清。
具体的，在这一步中，SC-U选择培养基的配置包括：YNB无氨基酸氮源6.7g/L，0.01%氨基酸混合物Ⅰ（精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤）1g/L，0.005%氨基酸混合物Ⅱ（天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸）0.5g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％的琼脂；
SC-U诱导培养基的配置包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％的琼脂。
在具体应用中，对诱导上清进行鉴定，将诱导上清经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，可观察到30kDa左右有明显的特异性条带出现，如图2所示，与预测分子量基本一致，表明目的蛋白成功表达并分泌到胞外。其中，泳道M：蛋白Marker。
S40、将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连-胶原融合蛋白。
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组纤连-胶原融合蛋白。
具体的，在这一步中，离心收集上述诱导上清用以上样，使用阳离子交换介质（层析填料为千纯产SP Purose 6 High Performance，装载于GE Akta层析系统），以NaH2PO4缓冲液（25Mm，pH 4.0）平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速为5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外A280吸光值和导电电导率值降至最低且不再变化，停止接样；再以含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后，即得到重组纤连-胶原融合蛋白。
通过SDS-PAGE检测，含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液可明显洗脱目的蛋白，检测结果如图3所示，其中，泳道M：蛋白Marker。
本申请的实施例还提供了一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白在护肤品中的应用，采用上述重组纤连-胶原融合蛋白作为护肤品中的修复成分。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
委托通用生物（安徽）股份有限公司依据如Seq ID NO.6所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pYES2/CT-Mfα质粒上的酶切位点Not Ⅰ和Xba Ⅰ之间，获得pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒；
将重组质粒pYES2/CT-MFα-C23-FNp加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
经菌液PCR筛选阳性克隆株，获得重组酵母工程菌；
挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h向所述SC-U诱导培养基中添加半乳糖至所述半乳糖终浓度为2.0%，诱导后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组纤连-胶原融合蛋白。
实验例1
对本申请实施例1制备的重组纤连-胶原融合蛋白进行体外细胞毒性试验。
参考医疗器械生物学评价第5部分: 体外细胞毒性试验 GB/T 16886.5-2017。通过细胞形态学观察和MTT法测量细胞毒性，通过量化样品中活细胞与死细胞的数量，测量细胞代谢活性来评估细胞毒性。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的DMEM培养液（含双抗），4℃保存；
无血清培养基：1640培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；
噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；
HaCat细胞（购自中科院昆明细胞库）；
样本：重组纤连-胶原融合蛋白、商品化纤连蛋白。
1.2具体实施方法：
HaCat细胞用完全细胞培养液于37℃、5% CO2的条件下培养，控制细胞浓度在1.0×105cells/mL，传代后24h-36h后弃去培养瓶中的培养液；消化处理后用完全细胞培养液收集细胞并配成5.0×105cells/mL细胞悬液；接种细胞悬液于96孔细胞板中，每孔100 μL，培养24h；待细胞长成单层后，吸出原培养基，分别加入100μL不同浓度的试验样品稀释液（100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%）、空白对照（培养基）、和阴性对照（PBS缓冲液），每组做6个复孔，置于37℃、5%CO2的条件下培养；24h后，取出96孔细胞板，在显微镜下做细胞形态学观察，然后吸除液体，每孔加入50μL MTT（1 mg/ml），置CO2培养箱中培养2h，弃去MTT溶液，每孔加入100μL DMSO溶液；振荡平板，在酶标仪上以570 nm测量吸光度（参比波长650nm）。
1.3数据处理：
计算细胞存活率，与细胞对照组相比，当细胞存活率低于空白对照组时，样品具有细胞毒性。反之，则无细胞毒性。统计方法：均数±标准差（）；存活率（%）=（实验组OD570均值/空白对照组OD570均值）×100%。得到相对细胞存活率曲线如图4所示。
由图4可见，与阴性对照组相比，相对细胞存活率＞90%，且无显著性差异（P>0.05）；细胞形态与阴性对照组相比无明显变化；所有给药浓度下细胞存活率均高于90%以上，表明重组纤连-胶原融合蛋白无明显细胞毒性。
实验例2
对本申请实施例1制备的重组纤连-胶原融合蛋白进行促细胞迁移活性测试。
参考“YY/T 1849-2022”行业标准附录C“细胞划痕法”。当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
1.1具体实施方法：
用黑色记号笔在6孔细胞培养板背后，用直尺对齐，均匀划横线，大约每隔0.5cm-1cm一道，横穿过孔；向上述6孔细胞板中加入浓度为5×105/ml的HaCaT角质化细胞悬液2ml，放置37℃、5%二氧化碳培养箱培养24h，待细胞长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道横线，用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞，然后向6孔内加入1.8ml无血清DMEM培养基，最后向孔内添加待检样品，重组纤连-胶原融合蛋白用20mM pH7.4 的PBS溶液稀释至0.5μg/ml加入上述6孔内，同时设置商品化纤连蛋白作为阳性对照和PBS空白对照。将上述6孔细胞板放置37℃、5%二氧化碳培养箱培养24h，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。加入待检样品处理的HaCaT角质化细胞培养24h后，对固定位置进行观察、拍照。
1.2数据处理：
使用Image J软件对细胞迁移的图片进行处理，获得初始划痕面积和无细胞空白区域面积数据，计算迁移率，迁移率=无细胞空白区域面积/初始划痕面积×100％。
细胞对照孔与各个样品孔0h与24h观察结果如图5所示，并且计算各个处理组对HaCaT细胞促迁移效果，计算结果如图6所示。
由图5和图6可见，本申请的重组纤连-胶原融合蛋白相比于商品化纤连蛋白，其促细胞迁移率更高，说明该重组纤连-胶原融合蛋白具有较好的促细胞迁移活性。
实验例3
对本申请的重组纤连-胶原融合蛋白进行促细胞粘附试验。
纤连蛋白存在于多种动物细胞表面的大分子细胞外膜蛋白，是细胞外基质和基底膜中的主要非胶原性糖蛋白，促进纤维细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的DMEM培养液（含双抗），4℃保存；
无血清培养基：1640培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；
BALB/c 3T3细胞（购自武汉普诺赛）；
BSA（购自Sigma）；
样本：重组纤连-胶原融合蛋白、商品化纤连蛋白。
1.2具体实施方法：
将重组纤连-胶原融合蛋白用PBS缓冲液预稀释至0.5μg/mL，预稀释完成后在96孔细胞培养板中进行2倍梯度稀释，共做8个稀释度，每孔50μL不同稀释度的重组纤连-胶原融合蛋白样本，并设立阴性对照（不加重组纤连-胶原融合蛋白），加入50μL的PBS缓冲液作为对照，4℃过夜孵育；孵育完成后，弃去细胞培养板中液体，每孔加入100μL的PBS缓冲液洗涤，共洗涤3次；洗涤结束后，每孔加入100μL的 30μg/μL BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；孵育完成后，弃去细胞培养板中液体，每孔加入100μL的PBS缓冲液洗涤3次，再加入纤维细胞悬液，细胞接种密度为1.0×105cells/ml，每孔接种100uL，温箱孵育5h；将孵育完成的细胞培养板用PBS缓冲液洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况。
1.3数据处理：
选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果拟合曲线得出结论。测定结果如图7所示。
由图7可见，本申请的重组纤连-胶原融合蛋白和商品化纤连蛋白均具有促BALB/c3T3细胞粘附活性，本申请的重组纤连-胶原融合蛋白促细胞粘附活性明显优于商品化纤连蛋白。
实验例4
对本申请的重组纤连-胶原融合蛋白进行人体皮肤功效评价。
将本申请实施例1制备的重组纤连-胶原融合蛋白制备成重组纤连-胶原融合蛋白精华液，通过亚洲成年受试者在正常情况下连续使用该重组纤连-胶原融合蛋白精华液28天，以仪器探头测量皮肤角质层水分含量和皮肤经表皮水分流失TEWL值，评估测试样品的保湿和修复的功效。
1.1受试者入选标准：
受试者筛选自CPCH功效实验室受试者信息数据库，共计30人；
年龄18至55岁亚洲成年健康受试者，性别不限；
受试者自我评估面部皮肤为敏感皮肤；
一侧面颊区域的皮肤角质层水分含量基础值<60.C.U；
一侧面颊区域的皮肤经表皮失水率TEWL值基础值>12g/h/m2；
测试区域的皮肤无明显皮损、伤疤、毛发等情况；
能很好按试验方案的要求配合测试，在研究期间能保持生活的规律性。
1.2受试者排除标准：
不能够阅读和理解知情同意书的所有内容的受试者；
不同意签署知情同意书的受试者；
不愿遵守方案要求的受试者；
同时参加任何其他的临床研究的受试者；
测试当天使用化妆品或/和护肤品；
自述处于怀孕期，哺乳期及备孕期的受试者；
患有传染性皮肤病或特应性皮炎的受试者；
测试部位有痣、毛细血管扩张、痴痕等皮肤异常现象的受试者；
在参加测试前3个月内接受过皮肤脱皮或皮肤治疗的受试者；
在参加测试前3个月内接受过免疫抑制剂治疗的受试者；
在参加测试前1个月内接受过全身性类固醇治疗或光疗的受试者；
在参加测试前1周内在涉及部位使用外用药物或/和特殊功效类（如美白类、修护类）化妆品；
在参加测试前1周内暴晒太阳或过度暴露于紫外线（如进行爬山，光疗，使用晒黑沙龙）的受试者；
在测试区域有病变的受试者，因此难以测量；
对化妆品，药物或一般光线照射有严重反应或过敏的受试者；
除上述事项外，根据测试负责人的判断认为不适合进行测试时。
退出标准：因在研究期间有并发症、不良事件或其他原因可退出临床研究，但应写明退出原因。
1.3评判依据：
Courage+ Khazaka皮肤水分测试仪，Corneometer CM825用于检测皮肤角质层水分含量，测量值越大，说明皮肤角质层水分含量越高；
Courage+Khazaka皮肤水分流失测试探头，Tewameter@TM300用于检测皮肤经表皮水分流失TEWL值，测量值越小，说明单位时间、单位横截面积的经表皮水分流失量越少。
1.4数据处理：
经过统计学软件分析，比较在使用重组纤连-胶原融合蛋白精华液第14d和28d与使用前皮肤角质层水分含量和皮肤经表皮水分流失的差异性。结果如图8和图9所示。
由图8和图9可见，使用重组纤连-胶原融合蛋白精华液28d后，皮肤角质层水分含量较使用前差异显著（p<0.050），且使用重组纤连-胶原融合蛋白精华液14d后，皮肤经表皮水分流失TEWL值较使用前显著减少，且使用重组纤连-胶原融合蛋白精华液后测试值结果均优于使用前，表明重组纤连-胶原融合蛋白具有较好的保湿、修复效果。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白，其特征在于，所述重组纤连-胶原融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组纤连-胶原融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
2.一种如权利要求1所述的具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒；
将所述pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌；
对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清；
将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连-胶原融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pYES2/CT-Mfα质粒上的酶切位点Not Ⅰ和Xba Ⅰ之间，获得pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒。
4.根据权利要求2所述的具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述pYES2/CT-MFα-C23-FNp重组质粒转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-C23-FNp加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
经菌液PCR筛选阳性克隆株，获得重组酵母工程菌。
5.根据权利要求2所述的具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h向所述SC-U诱导培养基中添加半乳糖至所述半乳糖终浓度为2.0%，诱导后，离心收集诱导上清。
6.根据权利要求2所述的具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连-胶原融合蛋白的步骤，包括：
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组纤连-胶原融合蛋白。
7.一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白在制备保湿修复类护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1所述的重组纤连-胶原融合蛋白作为保湿修复类护肤品中的修复成分。
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| Collagen as a Biomaterial for Skin and Corneal Wound Healing;Renáta Sklenáˇrová;《Journal of Functional Biomaterials》;第13卷(第4期);第1-18页 * |
| 纤连蛋白的研究进展及在化妆品中的应用;邹 洁;《日用化学品科学》;第44卷(第11期);第48-51页 * |
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