CN116535520A - 一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用，通过连接肽基因片段依次连接人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、纤连蛋白基因、弹性蛋白基因，然后克隆至pYES2/CT‑MFα表达载体并转化至酿酒酵母细胞中，经培养后诱导表达；对表达后的重组菌体进行纯化，进而制备得到了细胞外基质蛋白融合蛋白，其具有较好的促细胞贴壁、促细胞迁移、促细胞增殖、促胶原蛋白分泌、抗氧化的功效，且各功效均优于单一蛋白，且与复配型组合差异不明显，可作为化妆品或者护肤品中的原料进行应用，相对于单独表达人源化Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白的复配蛋白组，不需要单独重组表达单一型蛋白，生产工艺更加简便，生产成本降低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
多细胞有机体中，细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，称作细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)。ECM主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，其在上皮或内皮细胞的基底部者为基底膜，而在细胞间黏附结构者为间质结缔组织。ECM的形成需要细胞分泌细胞外基质蛋白(ECMP)。大量研究表明，ECM可以针对生物体内的微环境的变化而产生动态响应，影响细胞的行为，并维持着生物体内各组织的稳态。最新研究发现，在创面恢复的过程中，ECM不仅起到单纯的支撑、粘附作用，对于细胞增殖分化、细胞间信号传导、代谢以及迁移活动，也有着重要作用。
胶原蛋白是ECM中最主要的蛋白质，也是与美容护肤、组织再生关系最为紧密的成分。一方面胶原蛋白组成纤维，从而构成细胞外基质的三维结构，为细胞提供生存空间，支撑组织的生理形态；另一方面，其所构建的三维结构可以通过生物力转导从而调控细胞的黏附、增殖和分化以及免疫细胞的免疫应答等行为，从而调控组织再生。
弹性蛋白是ECM中弹性纤维的主要成分。含有弹性蛋白的纤维可以在需要重复扩张和松弛的组织中提供弹性反冲，通常存在于皮肤、肺、韧带、肌腱和血管组织中。弹性蛋白也可以在细胞黏附、迁移中发挥重要作用，并参与细胞内的信号通路。在组织的发育过程中，弹性蛋白组装成弹性纤维，并随着组织成熟和衰老而发生变化。纤连蛋白则是一种广泛分布的多结构域糖蛋白，存在于大多数细胞外基质中。
纤连蛋白的多结构使其能够同时与细胞表面受体(如整合素)以及胶原蛋白、蛋白多糖和其他黏附分子结合。在皮肤上，纤连蛋白可以促进细胞粘连、增殖、分化、生长、迁移等，还可以刺激细胞分泌其他功能蛋白；在伤口愈合中，还参与到凝血、抗炎、肉芽组织产生和组织重建，起到重要作用。目前，在难愈合的严重创面上，还采用了大规模添加外源性纤连蛋白以帮助创面愈合。
除了上述基质成分，细胞外基质中还有多种其他重要成分。比如蛋白多糖、层粘连蛋白、透明质酸钠等，这些成分含量或多或少，但各自起到不可或缺的作用，并相互协作，营造最适于细胞和机体生存的环境。不同于单一的组分，细胞外基质是一个复杂的系统，由细胞工厂加工产生，内部含有多种成分，彼此协同、共同营造出最适合机体的微环境。因此，细胞外基质目前也是最佳的再生材料，能够高度还原人体正常的结构和功能，起到最理想的修护和再生功效。
目前，大多数化妆品只添加单一的天然提取蛋白成分，如提取的胶原蛋白、纤连蛋白等，尚无商品化细胞外基质蛋白融合产品。而且，天然提取纯度较低，成本较高，导致相关产品的功效性单一。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。本发明通过连接肽基因片段依次连接人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、纤连蛋白基因、弹性蛋白基因，然后克隆至pYES2/CT-MFα表达载体并转化至酿酒酵母细胞中，经培养后诱导表达；对表达后的重组菌体进行纯化，进而制备得到了细胞外基质蛋白融合蛋白，体外生物学活性结果显示，本发明的融合蛋白具有较好的促细胞贴壁、促细胞迁移、促细胞增殖、促胶原蛋白分泌、抗氧化的功效，且各功效均优于单一蛋白，可作为化妆品或者护肤品中的原料进行应用。相对于单独表达人源化Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白的复配蛋白组，不需要单独重组表达单一型蛋白，生产工艺更加简便，生产成本降低。
为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
一种细胞外基质蛋白融合蛋白(ECMP4融合蛋白)，所述细胞外基质蛋白融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示。
本发明还提供了编码所述细胞外基质蛋白融合蛋白的基因，编码所述细胞外基质蛋白融合蛋白的基因的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
本发明还提供了所述细胞外基质蛋白融合蛋白的基因的构建方法，将如Seq IDNO.3所示的人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、如Seq ID NO.4所示的人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、如Seq IDNO.5所示的纤连蛋白基因、如Seq ID NO.6所示的弹性蛋白基因依次通过连接肽基因片段连接得到。
进一步地，所述连接肽基因片段如Seq ID NO.7所示。
本发明还提供了含有所述细胞外基质蛋白融合蛋白基因的表达载体。
本发明还提供了含有所述表达载体的细胞。
本发明还提供了所述细胞外基质蛋白融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将如权利要求2所述的基因亚克隆至pYES2/CT-MFα表达载体中，并电转化至酿酒酵母INVScl感受态细胞中，挑取转化子接种到SC-U液体培养基中培养，得到重组菌；
(2)将重组菌进行放大培养，并经SC-U诱导培养基诱导表达，然后收集诱导表达的上清液；
(3)将步骤(2)收集的诱导表达的上清液经微孔滤膜过滤后，经镍离子螯合亲和层析柱纯化，即可得到细胞外基质蛋白融合蛋白。
步骤(2)中，诱导表达时间为70～72h，至初始OD600nm达到0.4。
本发明还提供了所述细胞外基质蛋白融合蛋白在护肤品或化妆品中的应用。
本发明通过研究细胞外基质中含量最高的4种蛋白，利用基因工程技术串联表达人源化Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白得到ECMP4融合蛋白，相对于单独表达人源化Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白的复配蛋白组，不需要单独重组表达单一型蛋白，生产工艺更加简便，生产成本降低。经过体外细胞试验结果验证，本发明提供的ECMP4融合蛋白具有较好的促细胞贴壁、促细胞迁移、促细胞增殖、促胶原蛋白分泌、抗氧化的功效，且各功效均优于单一蛋白，可以应用于生物护肤应用，包括皮肤修复、医美术后修护、抗衰应用等。
本发明具有以下优点：
1、通过连接肽基因片段依次连接人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、纤连蛋白基因、弹性蛋白基因，然后克隆至pYES2/CT-MFα表达载体并转化至酿酒酵母细胞中，经培养后诱导表达；对表达后的重组菌体进行纯化，进而制备得到了细胞外基质蛋白融合蛋白，其是一种自然界不存在的均质纯净重组蛋白，具有成分、结构和理化性状明确，且可大量制备生产的生物制品，其能够将人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、纤连蛋白基因、弹性蛋白的功效集合在一起。
2、本发明制备得到的细胞外基质蛋白融合蛋白具有较好的促细胞贴壁、促细胞迁移、促细胞增殖、促胶原蛋白分泌、抗氧化的功效。
附图说明
图1为pYES2/CT-MFα载体图谱；
图2为质粒pUC57-ECMP4的酶切结果；
图3为pYES2/CT-MFα-ECMP4载体的菌液PCR鉴定结果，M-Marker；NC-阴性对照；PC-阳性对照；1-8-单菌落PCR扩增结果；
图4为INVSc1/pYES2/CT-MFα-ECMP4诱导表达的上清液的PCR鉴定结果，M-Marker，1-诱导上清蛋白，2-质粒空载诱导上清；
图5为INVSc1/pYES2/CT-MFα-ECMP4原液电泳检测结果，M-Marker；1-蛋白纯化样品；
图6为测试例1中孵育5h后细胞镜下观察的细胞贴壁状态，A为细胞对照组，B为纤连蛋白处理组，C为ECMP4处理组；
图7为测试例2中镜下观察试验细胞结果；
图8为测试例4中HFF-1细胞(a)、软骨细胞(b)的形态观察结果；
图9为测试例4中ELISA检测体外细胞胶原分泌结果。
具体实施方式
实施例中所使用的各培养基的组成如下：
(1)YPD完全培养基，成分如表1所示：
表1
| 成分 | 含量 |
| 酵母提取物 | 10g |
| 蛋白胨(Peptone) | 20g |
| 纯化水 | 至900ml |
121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml 10×葡萄糖。固体培养基另加琼脂粉2.0％。
(2)SC-U选择培养基，成分如表2所示：
表2
| 成分 | 含量 |
| YNB无氨基酸氮源 | 6.7g |
| 0.01％氨基酸混合物I | 1g |
| 0.005％氨基酸混合物II | 0.5g |
| 蒸馏水 | 至900ml |
0.01％氨基酸混合物I为精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤，0.005％氨基酸混合物II为天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、撷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml 20％葡萄糖。固体培养基另加琼脂粉2.0％。
(3)SC-U诱导培养基，成分如表3所示：
表3
121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml 20％半乳糖。固体培养基另加琼脂粉2.0％。
(4)PBS缓冲液，成分如表4所示：
表4
| 成分 | 含量 |
| NaCl | 8g |
| KCl | 0.2g |
| Na2HPO4 | 1.44g |
| KH2PO4 | 0.24 |
称上述成分加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1L。
(5)含500mM咪唑PBS缓冲液，成分如表5所示：
表5
| 成分 | 含量 |
| NaCl | 8g |
| KCl | 0.2g |
| Na2HPO4 | 1.44g |
| KH2PO4 | 0.24 |
| 咪唑 | 34.04g |
称上述成分加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1L。
下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。
各测试例中所涉及的人源化Ⅰ型胶原蛋白、人源化Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白分别参照CN113621052、CN113185612、CN114557908中的方法进行制备。
实施例1
一种细胞外基质蛋白融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用一段如Seq ID NO.7所示的连接肽基因片段依次将如Seq ID NO.3所示的人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、如Seq ID NO.4所示的人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、如Seq ID NO.5所示的纤连蛋白基因、如Seq ID NO.6所示的弹性蛋白基因连接起来，并根据pYES2/CT-MFα载体的性质(图1)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性设计出的基因序列为如Seq ID NO.2所示的序列，其编码的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示。具体为：
连接肽基因片段：如Seq ID NO.7所示；其编码的氨基酸残基片段为GGGGSGGGGSGGGGS，如Seq ID NO.8所示。
人源化Ⅰ型胶原蛋白基因：
如Seq ID NO.3所示；其编码的氨基酸序列为：
如Seq ID NO.9所示。
人源化Ⅲ型胶原蛋白基因：
如Seq ID NO.4所示；其编码的氨基酸序列为：
如Seq ID NO.10所示。
纤连蛋白基因：
如Seq ID NO.5所示；其编码的氨基酸序列为：
如Seq ID NO.11所示。
弹性蛋白基因：
如Seq ID NO.6所示；其编码的氨基酸序列为：
如Seq ID NO.12所示。
细胞外基质蛋白融合蛋白的核苷酸序列，如Seq ID NO.2所示：
其中，GCGGCCGCA为Not I酶切位点，TCTAGA为Xba I酶切位点；TAA为终止密码子。
细胞外基质蛋白融合蛋白的氨基酸序列，如Seq ID NO.1所示：
(2)将优化后ECMP融合蛋白基因序列发送通用生物公司进行人工合成，同时合成检测引物：
ECM-F：5'-GGTCCAATGGGACCATCCGGTCCAA-3'，如Seq ID NO.13所示；
ECM-R：5'-GGAACCAACGCCTGGGGCAACA-3'，如Seq ID NO.14所示。
(3)将步骤(1)所得的优化后的基因序列送公司(通用生物)合成并连接通用载体得到pUC57-ECMP4质粒(其中5’端添加NotⅠ酶切位点序列)，将pYES2/CT-Mfα质粒和人工合成的pUC57-ECMP4质粒分别用Not I和Xba I进行双酶切。酶切体系(50μl)：QuickCut HindⅢ、QuickCut EcoR I和10×QuickCut Green Buffer各5μL、pYES2或PCR产物35μL。在37℃金属浴中酶切3 h。酶切后以1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，如图2所示，并胶回收双酶切的PCR产物和质粒。
将双酶切回收的目的基因产物与pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1-5 h。连接体系(10μl)：目的基因5μl、载体片段3μl、T4 DNA ligase和10×ligasebuffer各1μl。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，菌液PCR鉴定结果如图3所示，PCR鉴定后送公司进行测序。测序结果无误，则pYES2/CT-MFα-ECMP4载体构建成功。
(4)pYES2/CT-MFα-ECMP4电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞
将10μl pYES2/CT-MFα-ECMP4质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。挑取转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200rpm恒温培养。以菌液为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆。选取鉴定无误的转化子进行下一步试验，由此获得工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ECMP4。
(5)INVSc1/pYES2/CT-MFα-ECMP4工程菌的诱导表达
挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-ECMP4单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm振荡培养过夜。测定其OD600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4，诱导时间为72h。
INVSc1/pYES2/CT-MFα-ECMP4诱导表达的上清液浓缩后经SDS-PAGE电泳可观察到62kDa左右的特异性条带，而含有pYES2/CT-MFα空载质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液则无特异性条带，如图4所示。
(6)纯化
离心收集培养液上清，用0.22μm滤膜过滤用以上样。使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min。再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定。再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到ECMP4融合蛋白原液，经考马斯亮蓝法测得蛋白含量约为0.3mg/mL，如图5所示。
测试例1
ECMP4融合蛋白在体外作用效果试验
1促细胞贴壁试验
1.1试验原理
细胞的黏连和粘附是细胞修复、细胞生长完成的必要条件，而纤连蛋白(Fibronectin，FN)具有促细胞修复的功效。FN重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。本实验通过对比FN和ECMP4融合蛋白促3T3细胞的粘附试验结果，统计不同浓度下各孔内细胞数，经四参数拟合得出两种蛋白的促细胞贴壁活性。
1.2试验材料
1.2.1主要仪器超净工作台、细胞培养箱。
1.2.2试剂配制
完全细胞培养液：量取胎牛血清10ml，双抗1ml，加入DMEM培养液90ml，4℃保存。
无血清培养基：量取双抗1ml，加入1640培养液99ml，4℃保存。
消化液：0.25％胰蛋白酶。
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌。
1.2.3细胞
Balb/c 3T3细胞在完全细胞培养液中呈单层、贴壁生长，每4～5天传代一次，1︰2消化传代，于完全培养液中生长繁殖。
1.2.4供试品：ECMP4原液、纤连蛋白原液；对照组：PBS缓冲液。
1.3试验操作
1.3.1样品稀释及孵育
溶解冻干粉，用PBS预稀释至0.5μg/ml，预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μl不同稀释度的样本，并设立阴性对照，加入50μl PBS作为对照，4℃过夜孵育。
1.3.2促细胞贴壁试验
孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μl 30g/L BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；取出弃去板中液体，加入3T3细胞悬液(用无血清培养基重悬)，细胞接种密度为1.0×105个/ml，每孔接种100μl，温箱孵育5h。
1.4试验结果
将孵育完成的细胞板用PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，如图7所示，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果使用四参数拟合曲线得出效价，如表6所示。
表6促细胞贴壁效价统计结果
实验结果证明，ECMP4融合蛋白与纤连蛋白都具有促细胞粘附效果，差异不显著。
测试例2
ECMP4融合蛋白的促细胞迁移试验
3.1试验原理
当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
3.2试验步骤
3.2.1先用marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。
3.2.2向6孔板孔中加入浓度为5×105个/ml的3T3细胞悬液2ml。
3.2.3第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。
3.2.4用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。
3.2.5根据分组往孔中加入1.8ml无血清培养液，之后加入200μl的样品，细胞对照孔加入等量的PBS溶液。
3.2.6放入37度5％ CO2培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。
3.3试验结果
细胞对照孔与各个样品孔0h与18h观察结果，如图8所示。
表7促细胞迁移率
测试例3
ECMP4融合蛋白的促细胞增殖活性测定
胶原蛋白体外功效模型中，成纤维细胞增殖实验属于较成熟且有效的体外评测手段。基于体外细胞皮肤抗皱紧致功效模型，比较ECMP4融合蛋白和胶原蛋白能否增强皮肤细胞的活力从而促进皮肤成纤维细胞的分裂具备抗皱紧致的效果。
4.1包括以下步骤：
(1)将小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3细胞)用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105～5.0×105个细胞，传代后24-36h用于生物学活性测定；
(2)弃去步骤(1)培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×104～8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养；
(3)步骤(2)中完全培养液培养24h后，换成维持培养液，置37℃、5％二氧化碳培养24h；
(4)待步骤(3)培养24h后，将制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，置37℃、5％二氧化碳培养64-72h；
(5)采用MTT比色法检测结果：每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳培养5h。
以上操作均在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。
4.2试验结果
采用MTT法检测不同蛋白组对Balb/c 3T3细胞的促细胞生长效果，结果建下表8。
表8促细胞增殖效价统计结果
实验结果表明，胶原蛋白和ECMP4融合蛋白均可以促进3T3细胞增殖。其中，Ⅲ型胶原蛋白促增殖活性高于Ⅰ型胶原蛋白。ECMP4融合蛋白促增殖活性显著高于两种胶原蛋白，差异显著。这证明ECMP4融合蛋白可以更好的增强皮肤细胞的活力从而促进皮肤成纤维细胞的分裂具备抗皱紧致的效果。
测试例4
ECMP4融合蛋白的在体外促胶原蛋白分泌效果
1试验材料与方法:
1.1材料
细胞株：HFF-1细胞(试验室保存，购自ATCC)、大鼠软骨细胞由实验室分离保存；人Ⅰ型胶原ELISA试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司；大鼠Ⅱ型胶原ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；各类蛋白均由芜湖英特菲尔生物制品产业研究院生产制备。
1.2方法
(1)HFF-1细胞的培养与传代：由安徽医科大学中央与地方共建生物医学工程中心惠赠，用含10％ FBS的DMEM培养基，置于37℃、5％ CO2的培养基培养。
(2)大鼠关节软骨细胞的分离与培养：简要步骤如下：无菌条件下分离关节软骨，经胰酶处理，200目筛网过滤并收集细胞悬液，置于37℃、5％ CO2的培养基培养。
(3)对HFF-1细胞和软骨细胞进行毒性预实验，将不同蛋白分别稀释不同倍数加入细胞，最终确定蛋白浓度在1-10μg/mL范围内可以进行细胞试验。因此，将Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和ECMP4融合蛋白分别稀释至10μg/mL加入96孔板细胞处理，分别收集6h、12h、24h和48h的细胞上清液。
(4)ELISA酶免检测：分别使用人Ⅰ型、Ⅱ型胶原ELISA试剂盒，检测培养液上清中胶原蛋白分泌情况(试验步骤参考说明书)。
2 实验结果
2.1 细胞形态学观察
显微镜下观察，如图8所示，HFF-1细胞(图8a)呈梭形，软骨细胞(图8b)呈卵圆形，细胞生长状态良好。
2.2细胞上清胶原含量检测
收集不同分组处理48h的细胞上清液，通过ELISA试剂盒分别检测两种细胞体外分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原含量。
由上述试验结果可知，ECMP4融合蛋白组促胶原分泌效果均优于单一蛋白组。相较于单一蛋白组分可以有效的形成协同作用，共同促进细胞体外分泌胶原含量，可以进一步提高皮肤修复效果。同时，ECMP4融合蛋白相对于复配蛋白，生产工艺、成本更低，各蛋白含量更加可控。
测试例5
ECMP4融合蛋白抗氧化试验
1.实验原理
超氧阴离子自由基清除能力，AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2-，NO2-与对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。
本发明前期研究结果证明，重组人源弹性蛋白具有超氧自由基清除活性。
2.实验材料与方法
自由基清除能力检测试剂盒，购自索莱宝生物公司；蛋白样品，均由芜湖英特菲尔生物制品产业研究院生产制备。
具体方法参照试剂盒说明书操作。
3.实验结果
实验结果表明，弹性蛋白在浓度为0.1mg/ml时，自由基清除率为35％。ECMP4融合蛋白在0.1mg/ml时，自由基清除率可达50％。说明ECMP4融合蛋白具有显著的抗氧化功效，可以用于护肤抗衰。
表9.超氧自由基检测结果
上述参照实施例对一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种细胞外基质蛋白融合蛋白，其特征在于，所述细胞外基质蛋白融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的细胞外基质蛋白融合蛋白的基因，其特征在于，编码所述细胞外基质蛋白融合蛋白的基因的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
3.如权利要求2所述的细胞外基质蛋白融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于：将如SeqID NO.3所示的人源化Ⅰ型胶原蛋白基因、如Seq ID NO.4所示的人源化Ⅲ型胶原蛋白基因、如Seq ID NO.5所示的纤连蛋白基因、如Seq ID NO.6所示的弹性蛋白基因依次通过连接肽基因片段连接得到。
4.根据权利要求3所述的细胞外基质蛋白融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于：所述连接肽基因片段如Seq ID NO.7所示。
5.含有如权利要求2所述的基因的表达载体。
6.含有如权利要求5所述的表达载体的细胞。
7.如权利要求1所述的细胞外基质蛋白融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将如权利要求2所述的基因亚克隆至pYES2/CT-MFα表达载体中，并电转化至酿酒酵母INVScl感受态细胞中，挑取转化子接种到SC-U液体培养基中培养，得到重组菌；
(2)将重组菌进行放大培养，并经SC-U诱导培养基诱导表达，然后收集诱导表达的上清液；
(3)将步骤(2)收集的诱导表达的上清液经微孔滤膜过滤后，经镍离子螯合亲和层析柱纯化，即可得到细胞外基质蛋白融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，诱导表达时间为70～72h，至初始OD600nm达到0.4。
9.如权利要求1所述的细胞外基质蛋白融合蛋白在护肤品或化妆品中的应用。
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