CN117143256B - 一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的细胞外基质蛋白，编码所述细胞外基质蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。该细胞外基质蛋白能显著促进因化学试剂造成的毛发及周围皮肤损伤的恢复愈合，并促进毛发生长，并能在动物模型上体现功效。且由于该重组细胞外基质蛋白属于生物蛋白，具有易分解无残留的优点，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。

Description

一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，特别涉及一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，烫发和染发的人数以及频度在迅速增加。头发的主要成分是蛋白质，与其他蛋白质相比，毛发蛋白质的性质不太活泼。但毛发对沸水、酸、碱、氧化剂与还原剂比较敏感，在烫发和染发的过程中要使用一些氧化剂和还原剂，均为一些酸性或碱性的化学制剂，在此过程中头发还可能长时间接触水蒸气，导致在烫发和染发的过程中损伤头发，甚至伤及头皮。但普通化工品类化妆品或激素类药物在修护毛发时都容易产生副作用。而细胞外基质蛋白具有多种生物学功能，且安全可靠，不具有副作用，有望应用于毛发修护当中，但细胞外基质蛋白类型多，全基因表达可行性低，天然提取的细胞外基质蛋白免疫原性高、纯度低，功能单一。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的蛋白产品难以用于修护毛发和皮肤的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的细胞外基质蛋白，编码所述细胞外基质蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
可选地，所述用于毛发修护的细胞外基质蛋白还包括对所述细胞外基质蛋白进行修饰的脂质体。
可选地，所述细胞外基质蛋白是经酿酒酵母表达的纤连蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白与胰岛素样生长因子的融合蛋白。
可选地，所述细胞外基质蛋白的氨基酸序列是将纤连蛋白功能域片段、Ⅲ型胶原蛋白功能域片段、弹性蛋白功能域片段与胰岛素样生长因子功能域片段通过连接肽片段依次串联连接后所得。
可选地，所述纤连蛋白功能域片段的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。
可选地，所述Ⅲ型胶原蛋白功能域片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
可选地，所述弹性蛋白功能域片段的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示。
可选地，所述胰岛素样生长因子功能域片段的氨基酸序列如Seq ID NO.6所示。
本申请还提出了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF；
将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF；
对所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF进行诱导表达，并收集诱导产物；
将所述诱导产物纯化后，获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液；
对所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液进行脂质体修饰，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白。
可选地，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF。
可选地，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF。
可选地，所述对所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF进行诱导表达，并收集诱导产物的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF接种于SC-U选择培养基中，在30ºC、220rpm的条件下振荡培养，测定OD600nm吸光值，再转接于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
可选地，所述将所述诱导产物纯化后，获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液的步骤，包括：
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液。
可选地，所述对所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液进行脂质体修饰，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白的步骤，包括：
将磷脂酰乙醇胺和岩藻甾醇溶于正丁醇，再冷冻干燥，得到冻干粉末；
将所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液与三乙醇胺混合，得到溶剂；
将所述冻干粉末溶于所述溶剂中，再经超声、微滤、浓缩，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白。
本申请还提出了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白在护肤品中的应用，采用上述用于毛发修护的细胞外基质蛋白作为护肤品中的活性成分。
本申请通过基因重组及生物工程技术来表达外源基因，获取细胞外基质蛋白，从而获得了结构稳定、具有修护毛发和皮肤的生物学功能的重组蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该细胞外基质蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，使该细胞外基质蛋白更易在表达系统中表达。经过体外试验验证，该细胞外基质蛋白能显著促进因化学试剂造成的毛发及周围皮肤损伤的恢复愈合，并促进毛发生长，并能在动物模型上体现功效。且由于该重组细胞外基质蛋白属于生物蛋白，具有易分解无残留的优点，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的诱导上清的SDS-PAGE电泳结果图；
图2为本申请实验例所述的脂质体的粒径分布图；
图3为本申请实验例所述的小鼠皮损模型建立结果图；
图3中A为小鼠背部处理后肉眼观察结果图；
图3中B为CBS皮肤镜偏振光观察结果图；
图3中C为CBS皮肤镜普通光观察结果图；
图4为本申请实验例所述的实验组小鼠各时间段皮肤修复及毛发变化图；
图5为本申请实验例所述的对照组小鼠各时间段皮肤修复及毛发变化图；
图6为本申请实验例所述的各组小鼠不同时间段脱毛区域新生毛发对比图；
图7为本申请实验例所述的各组小鼠不同时间段毛发镜下观察结果图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
序列表说明（序列表内容单独提供）：
Seq ID NO.1所示为本申请实施例中细胞外基质蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.2所示为本申请实施例中细胞外基质蛋白的核苷酸序列；
Seq ID NO.3所示为本申请实施例中纤连蛋白功能域片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.4所示为本申请实施例中Ⅲ型胶原蛋白功能域片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.5所示为本申请实施例中弹性蛋白功能域片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.6所示为本申请实施例中胰岛素样生长因子功能域片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.7所示为本申请实施例中连接肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.8所示为本申请实施例中6×His标签核苷酸序列；
Seq ID NO.9所示为本申请实施例中6×His标签氨基酸序列。
针对现有技术所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的细胞外基质蛋白，编码所述细胞外基质蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
本申请通过基因重组及生物工程技术来表达外源基因，获取细胞外基质蛋白，从而获得了结构稳定、具有修护毛发和皮肤的生物学功能的重组蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该细胞外基质蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，使该细胞外基质蛋白更易在表达系统中表达。经过体外试验验证，该细胞外基质蛋白能显著促进因化学试剂造成的毛发及周围皮肤损伤的恢复愈合，并促进毛发生长，并能在动物模型上体现功效。且由于该重组细胞外基质蛋白属于生物蛋白，具有易分解无残留的优点，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。
作为本申请的一种可实施方式，所述用于毛发修护的细胞外基质蛋白还包括对所述细胞外基质蛋白进行修饰的脂质体。
为提高皮肤对细胞外基质蛋白的吸收，本申请通过脂质体对细胞外基质蛋白进行修饰，脂质体是皮肤中含有的生物成分卵磷脂等磷脂类物质所组成的0.1μm-0.2μm的微囊，由于脂质体与细胞膜有很强的相似性，故脂质体很容易和细胞融合，且脂质体特殊的结构可以携带亲水亲油功效成分进入细胞发挥作用，让有效成分更容易渗透进皮肤细胞内，同时脂质体是一种微小且空心的球状物质，直径非常小，一般不会超过千分之一毫米，可以轻易地穿透毛孔和角质层细胞的间隙，把有效成分送到真皮层和基底层，因而可以通过脂质体将细胞外基质蛋白封存在由卵磷脂等磷脂构成的非常小且构造独特的胶囊中，并将其传递给身体和皮肤，以提高毛发和皮肤修护的效果。
作为本申请的一种可实施方式，所述细胞外基质蛋白是经酿酒酵母表达的纤连蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白与胰岛素样生长因子的融合蛋白。
由于天然蛋白分子量大，全序列表达可行性低，因而本申请主要是选取蛋白不同功能的结构域进行表达或组合表达，以获得具有相应功能的重组蛋白，纤连蛋白是胞外基质中最为主要的组分之一，以二聚体形式存在，由两条分子量约为250kDa的多肽链通过C端的二硫键结合组成，每条链包含一连串的重复单元：12个I型、2个II型和7个III型重复单元，这些重复单元可与纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、细菌和细胞的功能域结合以发挥多种生物学功能；Ⅲ型胶原蛋白可用于支撑皮肤柔嫩度，使皮肤细腻和富有弹性，修复纤维组织；弹性蛋白是细胞外基质中最稳定的蛋白质，可与微原纤维结合形成弹性纤维，其主要功能是被动伸缩，给予组织和器官伸缩性和可逆的变形能力，胰岛素样生长因子是一组具有促生长作用的多肽类物质，能显著刺激毛囊生长。通过选取纤连蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白与胰岛素样生长因子不同功能的片段进行重组表达，从而获得了具有修护毛发和皮肤的生物学功能的细胞外基质蛋白。
在具体实施过程中，本申请采用酿酒酵母分泌表达系统，相较于原核表达系统，其为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质并分泌到培养基中，产物均一、无免疫原性，不易形成包涵体，进行外源表达能够获得较高活性的目的蛋白。
作为本申请的一种可实施方式，所述细胞外基质蛋白的氨基酸序列是将纤连蛋白功能域片段、Ⅲ型胶原蛋白功能域片段、弹性蛋白功能域片段与胰岛素样生长因子功能域片段通过连接肽片段依次串联连接后所得。
本申请为防止融合蛋白的错误折叠，对不同蛋白的目的基因序列之间通过连接肽片段进行串联表达以保证不同蛋白能够完成各自独立的功能，确保重组细胞外基质蛋白能够具有相关蛋白的生物学活性。
具体的，连接肽片段的氨基酸序列如Seq ID NO.7所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述纤连蛋白功能域片段的氨基酸序列如Seq IDNO.3所示。纤连蛋白的氨基酸序列参考：UniProt P02751序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02751），所选择的纤连蛋白功能域片段如Seq ID NO.3所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述Ⅲ型胶原蛋白功能域片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列参考：Uniprot AGL34959.1序列（https://www.uniprot.org/uniprot/ AGL34959.1），本申请所选择的Ⅲ型胶原蛋白功能域片段为Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域片段，如Seq ID NO.4所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述弹性蛋白功能域片段的氨基酸序列如Seq IDNO.5所示。弹性蛋白氨基酸序列参考：UniProt P02751序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02751），本申请所选择的弹性蛋白功能域片段如Seq ID NO.5所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述胰岛素样生长因子功能域片段的氨基酸序列如Seq ID NO.6所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述细胞外基质蛋白的核苷酸序列还包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
具体的，如Seq ID NO.2所示，Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；
Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；
起始密码子的核苷酸序列为ATG；
终止密码子的核苷酸序列为TAA；
6×His标签核苷酸序列为：CATCACCACCATCACCAC，如Seq ID NO.8所示，所对应的6×His标签氨基酸序列为：HHHHHH，如Seq ID NO.9所示。
本申请的实施例还提供了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S10、依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF。
在具体应用中，委托通用生物（安徽）股份有限公司依据如Seq ID NO.2所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF。
具体的，在这一步中，同时合成检测引物：
T7：5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'；
CYC1 Terminator：5' GTGACATAACTAATTACATGATG 3'；
将酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα和人工合成的重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF分别用Not I和Xba I进行双酶切，酶切体系（50μL）包括QuickCut HindⅢ、QuickCut EcoR I和10×QuickCut Green Buffer各5μL、pYES2或PCR产物35μL。在37℃金属浴中酶切3 h，酶切后以1.2％琼脂糖凝胶进行电泳；再胶回收双酶切的PCR产物和pYES2/CT-MFα质粒；
将双酶切回收的PCR产物与pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1h-5h，连接体系（10μL）包括目的基因5μL、载体片段3μL、T4 DNA 连接酶1μL和10×连接酶缓冲液1μL，将重组质粒转化到E. coliDH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，再经菌液PCR鉴定后送公司进行测序，测序结果无误，则重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF构建成功。
S20、将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF。
在具体实施过程中，取10μL的重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF加入80μL酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min；Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；电击结束后迅速向电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
挑取SC-U固体平板上生长的单克隆菌落，并接种到SC-U液体培养基中，在30°C、200rpm的条件下恒温培养，以菌液为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆子，选取鉴定无误的阳性克隆子进行下一步试验，由此获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF。
具体的，在这一步中，SC-U液体培养基的配方包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；在121 °C下高压灭菌20 min，冷却至60 °C以下，在超净台中加入无菌100ml 10×葡萄糖。
S30、对所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF进行诱导表达，并收集诱导产物。
在具体实施过程中，挑取所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF接种于20ml SC-U选择培养基，经30°C、220rpm振荡培养过夜，测定其OD600nm吸光值，计算相应体积的菌液并转接至100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
具体的，在这一步中，SC-U选择培养基的配置包括：YNB无氨基酸氮源6.7g/L，0.01%氨基酸混合物Ⅰ（精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤）1g/L，0.005%氨基酸混合物Ⅱ（天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸）0.5g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％的琼脂；
SC-U诱导培养基的配置包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％的琼脂。
在具体应用中，对诱导上清进行鉴定，将诱导上清经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，可观察到23kDa左右有明显的特异性条带出现，如图1所示（其中，泳道M：蛋白Marker；1：空载质粒诱导上清；2：诱导上清），与预测分子量基本一致，表明目的蛋白成功表达并分泌到胞外，而含有pYES2/CT-MFα空载质粒的酿酒酵母菌株的诱导上清则无特异性条带。
S40、将所述诱导产物纯化后，获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液。
在具体实施过程中，将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液。
具体的，在这一步中，将诱导产物用以上样；并使用GE Healthcare公司ChelatingSepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS缓冲液平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5mL/min；再用PBS缓冲液过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定；再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液。
其中，PBS缓冲液的配置包括：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1 L；
500mM咪唑PBS缓冲液的配置包括：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g和咪唑34.04g加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1 L。
S50、对所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液进行脂质体修饰，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白。
在具体实施过程中，将磷脂酰乙醇胺和岩藻甾醇溶于正丁醇，再冷冻至-10℃后，真空干燥，得到冻干粉末；
将所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液与三乙醇胺混合，得到溶剂；
将所述冻干粉末溶于所述溶剂中，再经超声10min、微滤、浓缩，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白。
具体的，在这一步中，磷脂酰乙醇胺、岩藻甾醇、rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液与三乙醇胺的质量比为3:1:1:0.3。
本申请的实施例还提供了一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白在护肤品中的应用，采用上述用于毛发修护的细胞外基质蛋白作为护肤品中的活性成分。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF；
将重组质粒pYES2/CT-MFα-FN-Col-ELA-IGF加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF；
挑取所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF接种于SC-U选择培养基中，在30ºC、220rpm的条件下振荡培养，测定OD600nm吸光值，再转接于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物；
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液。
实施例2
一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将磷脂酰乙醇胺30g和岩藻甾醇10g溶于正丁醇，再冷冻至-10℃后，真空干燥，得到冻干粉末；
将实施例1制备的rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液10g与三乙醇胺3g混合，得到溶剂；
将所述冻干粉末溶于所述溶剂中，再经超声10min、微滤、浓缩，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白。
采用Nano S900激光粒度仪测定所获得的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体粒径，结果如图2所示，可见脂质体分散且大小均匀。
实验例
1、测定本申请所制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白对皮肤损伤修复护理和促毛发生长的效果。
1.1试验目的：
在本试验中，通过在小鼠背皮涂抹一次高浓度硫化钠使其皮肤表皮层受损后，皮下注射本申请所制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白，通过皮肤镜下观察，对毛周皮肤破损修复时间和脱毛区域毛发再生情况进行评价，来衡量实验样品对毛周皮肤损伤修复护理和促毛发生长的效果。
1.2试验材料：
1.2.1 试验动物：选择健康的成年黑色雌性C57小鼠12只，按照清洁级环境饲养，给予充分饲料和水自由喂养，每天喂料喂水，检查动物生理活动情况。
1.2.2 试验试剂：实施例2制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白，浓度0.1mg/mL；8%硫化钠。
1.2.3 试验仪器及器材：CBS皮肤镜；毛发电推；注射器；无菌棉签；酒精棉球；碘伏等。
1.3试验方法：
1.3.1 试验分组：将12只成年小鼠随机等分为2组，每组6只，具体分组情况见表1。
表1
1.3.2 建立小鼠皮损模型：小鼠用宠物毛发电推剃掉背部的毛发，所有剃光毛发的小鼠都用8%硫化钠涂抹背部进行脱毛处理，5min后用纯化水洗去硫化钠残留，人为造成背部皮肤区域脱毛和表皮层破损。分别对两组小鼠肋部皮下注射相应溶液0.2ml，每2d注射一次，连续注射7次。
1.3.3 毛周皮肤及毛发观察：每天观察小鼠皮肤破损修复状态、毛发生长状态、皮肤颜色变化，每隔1天分别拍照，统计皮肤变化及毛发发生时间直至毛发全部出现。
1.4 试验结果：
1.4.1 小鼠皮损模型建立：按照试验方法对小鼠进行处理后使用CBS皮肤镜分别进行普通光皮肤表面和偏振光皮下观察。小鼠皮损模型建立结果如图3所示，其中，A为小鼠背部处理后肉眼观察结果，B为CBS皮肤镜偏振光观察结果，C为CBS皮肤镜普通光观察结果。从B中偏振光观察结果来看，更易观察到小鼠毛周皮肤皮下是否恢复，是否存在毛细血管充血等情况，并且可以看到小鼠皮损模型对毛周皮肤形成损伤，其下仍可见毛囊的存在。
1.4.2 毛周皮肤及毛发观察：分别对实验组和对照组每隔1天进行拍照，统计皮肤修复情况变化及毛发发生时间，实验组各时间段在50倍CBS偏振光下的皮肤修复及毛发变化情况如图4所示，对照组各时间段在50倍CBS偏振光下的皮肤修复及毛发变化情况如图5所示。
1.4.3 脱毛区域毛发生长评价：
从试验开始的第3天，每2日对每只小鼠脱毛区新生毛发进行测量，得到实验组和对照组小鼠不同时间段脱毛区域新生毛发对比测量图如图6所示，并根据图6按照评分标准进行评分并记录在表3中，评分标准如下表2所示。
表2
各组小鼠毛发生长状态评分表如下表3所示。
表3
1.4.4 试验结果分析：
由图4和图5对比可见，在皮肤损伤恢复方面，实验组小鼠在第5d时，皮下已基本无明显出血，瘢痕区域已变小，至第9d皮下已无法看到存在破损恢复的瘢痕区域；而对照组小鼠至第7d皮下才无明显充血，同时至第11d仍可在皮下（中心区域）看到红色的瘢痕恢复区域。
由图6和表3可见，实验组小鼠在皮肤修复阶段毛发生长较为快速，在第5d皮损部分区域已出现毛发生长，至第13d皮损区域已基本全部出现毛发，脱毛区域能达到80%毛发生长；而对照组小鼠主要在脱毛区域周边存在毛发恢复生长，皮损区域毛发仅少量恢复，脱毛区域有50%左右毛发恢复生长，并且多为绒毛。
1.5 结论：
根据本试验可以说明本申请实施例2所制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白对小鼠毛周皮肤损伤有显著的修复护理效果，并对脱毛区域毛发的重新生长有促进作用。
2、测定本申请所制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白对毛发损伤的修复功效。
2.1 试验目的：
在本试验中，通过在小鼠背部毛发涂抹低浓度硫化钠，模拟烫发等使用的化学试剂使毛发表皮层至皮质层受损，涂抹毛囊修护组合蛋白，通过显微镜镜下观察不同时期毛发，对毛发修复和再生情况进行评价，来衡量实验样品对毛发损伤的修复效果。
2.2 试验材料：
2.2.1试验动物：选择健康的成年黑色雌性C57小鼠10只，按照清洁级环境饲养，给予充分饲料和水自由喂养，每天喂料喂水，检查动物生理活动情况。
2.2.2 试验试剂：实施例2制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白，浓度0.1mg/mL；4%硫化钠。
2.2.3 试验仪器及器材：OLYMPUS显微镜；无菌棉签；酒精棉球；碘伏等。
2.3试验方法：
2.3.1试验分组：将10只成年小鼠随机等分为2组，每组5只，具体分组情况见表4。
表4
2.3.2 建立小鼠毛发损伤模型：小鼠乙醚吸入麻醉后，在背部正中2cm×2cm区域使用4%硫化钠涂抹，5min后用纯化水洗去硫化钠残留，人为造成背部区域毛发损伤。分别对两组小鼠背部涂抹相应溶液0.2mL，每2d涂抹一次，连续10次。
2.3.3 毛发观察：每天观察小鼠毛发生长状态，每隔7天剪取背部实验区域少量毛发，显微镜下观察毛发状态。
2.4试验结果：
显微镜下毛发状态图如图7所示，由图7可见，第0d实验组和对照组镜下部分毛发可见表皮层已因硫化钠水解，毛发中段萎缩（见黑色方框内），实验组小鼠毛发在7d后，可见毛发外表面均有透明表皮层，彼此重叠如屋瓦，同时已开始出现新生毛发；而对照组小鼠在7d时仍有大量毛发表皮层缺失，整体毛发仍有间断萎缩部位，至第14d时出现较多新生毛发，第21d时仍有少量萎缩毛发，其内皮质层有缺损（见对照组21d黑色方框内）。
2.5结论：
根据本试验可以说明本申请实施例2所制备的用于毛发修护的细胞外基质蛋白外用涂抹后对小鼠毛发表皮层损伤有显著的修复护理效果，并对损伤区域毛发的重新生长有促进作用。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白，其特征在于，所述细胞外基质蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，编码所述细胞外基质蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF；
将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF；
对所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF进行诱导表达，并收集诱导产物；
将所述诱导产物纯化后，获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液；
对所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液进行脂质体修饰，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体。
3.根据权利要求2所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF。
4.根据权利要求2所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF。
5.根据权利要求2所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，所述对所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF进行诱导表达，并收集诱导产物的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhFN-Col-ELA-IGF接种于SC-U选择培养基中，在30ºC、220rpm的条件下振荡培养，测定OD600nm吸光值，再转接于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
6.根据权利要求2所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导产物纯化后，获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液的步骤，包括：
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液。
7.根据权利要求2所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，所述对所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液进行脂质体修饰，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体的步骤，包括：
将磷脂酰乙醇胺和岩藻甾醇溶于正丁醇，再冷冻至-10℃后，真空干燥，得到冻干粉末；
将所述rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液与三乙醇胺混合，得到溶剂；
将所述冻干粉末溶于所述溶剂中，再经超声10min、微滤、浓缩，获得用于毛发修护的细胞外基质蛋白的脂质体；
其中，磷脂酰乙醇胺、岩藻甾醇、rhFN-Col-ELA-IGF蛋白原液与三乙醇胺的质量比为3:1:1:0.3。
8.一种用于毛发修护的细胞外基质蛋白在制备毛周皮肤损伤修复、促毛发生长以及毛发损伤修复护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1所述的用于毛发修护的细胞外基质蛋白作为毛周皮肤损伤修复、促毛发生长以及毛发损伤修复护肤品中的活性成分。
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