PT948538E - Análise e separação de proteínas do factor de crescimento derivado de plaquetas - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

"ANÁLISE E SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DO FACTOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DE PLAQUETAS"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presente situa-se no domínio da análise e separação de proteínas, em especial dizendo respeito à preparação de isoformas purificadas de proteínas heterólogas que apresentam heterogeneidade estrutural.

ESTADO DOS CONHECIMENTOS À DATA DA INVENÇÃO 0 factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), mitogénio principal do soro das células provenientes· do mesênquima, está armazenado nos grânulos alfa das plaquetas. As lesões em vasos sanguíneos activam a libertação do PDGF a partir destes grânulos na vizinhança dos vasos lesionados. Este mitogénio actua como um atractor químico potente para os fibroblastos e para as células de músculo, liso, bem como para monócítos e para neutrófilos. A actividade mitogénica do PDGF localizado resulta numa proliferação destas células no local da lesão, contribuindo para o processo da reparação das feridas. 0 factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), uma glicoproteína com cerca de 30.000 dalton, é composto por duas cadeias polipeptídicas ligadas por dissulfuretos. Foram identificadas duas formas destas 2 cadeias, designadas A e B. A proteína nativa ocorre sob a forma de homodímeros. AA ou BB, ou do heterodímero AB, ou sob a forma de uma mistura destas. Foi identificada uma sequência parcial para a cadeia da PDGF-A (Johnsson et al. (1984) EMBO J. 3:921-928) e foram descritos cADN codificando para precursores de cadeias A de PDGF (Patente U.S. No. 5.219.759). A cadeia A madura, é constituída por um polípéptido com 104 aminoácidos que é derivado por um tratamento proteolítico de um precursor polipeptídico com 211 aminoácidos. O cADN que codifica para a cadeia B de PDGF também já foi descrito (Nature (1985) 316:748-750). A cadeia B madura é constituída por um polípéptido com 109 aminoácidos que é derivado por tratamento proteolítico a partir de um precursor com 241 aminoácidos. As cadeias A e B maduras da PDGF evidenciam uma identidade de sequências de 51 %, sendo conservados oito dos resíduos de cisteína em cada uma das cadeias (Johnsson et al. (1984) EMBO J. 3:921-928) .

Para além do tratamento proteolítico dos polipéptidos precursores para darem as cadeias maduras PDGF-A e PDGF-B, o PDGF recombinante (rPDGF) produzido numa levedura hospedeira sofre além dele um tratamento pós-translacional de que resulta uma proteína madura segregada que apresenta uma heterogeneidade estrutural considerável. Isto é verdade para o heterodímero rPDGF-AB, e mais especialmente para o homodímero rPDGF-BB.

Quando é expresso numa levedura hospedeira para a produção de uma substância farmacêutica a granel, o PDGF 3 sofre uma clivagem endoproteolítica, 'também denominada corte, da cadeia B, entre os resíduo Arg-32 e Thr-33, da qual resulta uma substância farmacológica a granel contendo uma mistura do rPDGF não cortado, também designado intacto, com ó rPDGF cortado que foi clivado na sua cadeia B entre os resíduos de Arg-32 e de Thr-33. No caso do rPDGF-BB, uma ou ambas as cadeias B podem ser cortados, obtendo-se respectivamente PDGF-BB com um corte único ou com um duplo corte. Incluem-se em outras modificações pós-translacionais interessantes para a invenção presente a remoção exOproteolítica dos aminoácidos do terminal de C, também denominada truncagem, que pode remover a Arg-32 das cadeias B cortados e/ou a Thr-109 das cadeias B cortados ou das intactos. Estas modificações pós-translacionais levam a uma série de formas estruturais, que se denominam isoformas, de rPDGF-BB, presentes no produto segregado. Os métodos da invenção presente têm como objectivo a separação e a purificação das isoformas de rPDGF, mais especificamente de rPDGF-BB intacto, com um corte único ou com um duplo corte.

As três formas diméricas de PDGF exibem afinidades de ligação diferentes para os dois produtos genéticos receptores de PDGF, α e β. 0 receptor β reconhece a cadeia B de PDGF e dimeriza na presença de PDGF-BB.. 0 receptor alfa reconhece as cadeias A e B de PDGF e pode ser dimerizado por PDGF-BB, PDGF-AA, e' PDGF-AB (veja-se, por exemplo, Abboud et al. (1994) J. Cell. Phys. 158:140-150). a região de resíduos de aminoácidos de PDGF-BB envolvida na ligação ou na activação do receptor foi localizada na região dos resíduos Ile25 - Phe37 (Giese et al. (1990) Mol. 4

Cell. Biol. 10:5496-5501). Inclui-se nestes resíduos o local Arg-32./Thr-33 clivado pelo tratamento proteolítico durante a produção do PDGF-BB por uma levedura hospedeira. ' Já foram identificados mutantes resistentes a proteinase de PDGF-BB recombinante, que exibem uma actividade biológica melhorada {Cook et al. (1992) Biochem. J. 281:57-65; veja-se também o Pedido de Patente Europeia No. 0 547.064 Bl). Estes mutantes impedem a clivagem endoproteolitica das cadeias B na.Arg-32. Desta forma a eliminação da clivagem endoproteolitica neste local leva aparentemente a uma actividade biológica melhorada do PDGF-BB produzido numa levedura hospedeira, durante o processo de fermentação. Este aumento da actividade biológica está presumivelmente associado a um aumento da quantidade relativa de PDGF-BB não cortado', ou ' como se denomina habitualmente., intacto, e uma diminuição da· quantidade relativa de PDGF-BB cortado, no produto PDGF-BB recombinante. De uma forma semelhante, deve esperar-se que a clivagem endoproteolitica nesta região de uma ou ambas as cadeias B numa proteína de rPDGF-BB origine uma substância farmacológica a granel com uma actividade biológica diferente daquela que se verifica existir numa substância farmacológica a granel constituída unicamente pelo rPDGF-BB intacto.

Antes da invenção presente, os métodos habitualmente utilizados na técnica para purificar PDGF produzido de forma recombinante não distinguiam entre as diversas isoformas de PDGF provenientes do processamento 5 pós-translacional, incluindo a clivagem endoproteolitica da cadeia B de PDGF entre a Arg-32 e a Thr-33. A técnica anterior ensinava que as isoformas estruturais provenientes da clivagem endoproteolitica pós-translacional podiam apresentar diversos graus de actividade biológica, que portanto podiam afectar a actividade biológica global da substância farmacológica a granel que era produzida por fermentação. São necessários métodos para separar e para quantificar as isoformas estruturais de PDGF produzido recombinantemente, de tal forma que as suas actividades biológicas' possam ser comparadas. Estes métodos seriam úteis para a preparação de substâncias farmacológicas a granel, constituídas pelas isoformas puras.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO São proporcionados métodos para melhorar a purificação e a quantificação de proteínas de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) apresentando heterogeneidade estrutural. A preparação, de isoformas destas proteínas, substancialmente puras, é conseguida utilizando cromatografia de permuta de catião TSK sulfopropilo e cromatografia liquida de alta eficiência em fase reversa. Estes métodos são especialmente úteis para a separação das isoformas que provêm de processamento proteolítico pós-translacional das PDGF recombinantes (rPDGF) segregadas, mais especificamente da rPDGF-BB. 0 método de electroforese de zona capilar de carga invertida 6 da invenção é útil para quantificar as modificações endoproteolíticas pós-translacionais.

As composições da invenção são isoformas substancialmente purificadas de proteínas PDGF segregadas que apresentam heterogeneidade estrutural, mais em especial isoformas de PDGF-BB purificada intacta, com corte único, e com corte duplo. São também proporcionadas composições farmacêuticas contendo pelo menos uma destas isoformas substancialmente purificadas de PDGF, e métodos para a sua utilização na promoção da cicatrização de feridas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação esquemática das isoformas intactas de rhPDGF-BB (grupo A) com ou sem truncagem na Thr-109. As linhas singelas representam cadeias B; as linhas emparelhadas representam a rhPDGF-BB. A Figura 2 é uma representação esquemática das isoformas som corte único da rhPDGF-BB com ou sem truncagem na Arg-32 e na Thr-109. As linhas emparelhadas representam rhPDGF-BB com corte único. 0 corte numa das cadeias B é representado por uma quebra na linha. As isoformas das espécies com corte único estão' separadas nos grupos B e com base na diferença entre a carga total das proteínas. A truncagem na Arg-32 no local de corte (grupo C) produz uma isoforma mais ácida, enquanto a truncagem apenas na Thr-109 (grupo B) não altera a carga da molécula. 7 A Figura 3 é uma representação esquemática das isoformas com duplo corte da rhPDGF-BB, com ou sem truncagem na Arg-32 e na Thr-109. As .linhas quebradas emparelhadas representam hPDGF-BB com duplo corte. 0 corte em cada uma das cadeias B está representado por uma quebra em cada uma das linhas. A isoforma com duplo corte está separada nos grupos D, E, e F com base nas diferentes cargas totais da proteína. A truncagem na Arg-32 num dos locais de corte {grupo E) torna a isoforma. mais ácida, enquanto a truncagem na Arg-32 em ambos os locais de corte (grupo F) remove dois resíduos básicos de aminoácido. A truncagem apenas na Thr-109 (grupo D) não altera a carga molecular, semelhante à da espécie com corte único (grupo B) . A Figura 4 é um perfil em HPLC de fase reversa (RP) de rhPDGF-BB utilizando um gradiente linear . na eluição. As isoformas com duplo corte e truncada com duplo corte (A), as isoformas com corte único e as truncadas com corte único (B) , e as isoformas intactas e as truncadas intactas (C) de rhPDGF-BB,. são resolvidas sob a forma de três grupos com diversos picos cada um. A Figura 5 é um perfil de HPLC em RP a alta temperatura de rhPDGF-BB, utilizando um gradiente de eluição em andares. As isoformas com duplo corte e as truncadas com duplo (A) , as isoformas com corte único e as truncadas com corte único (B) , as isoformas intactas e as truncadas intactas (C) , bem como um dímero/dimero (D) de rhPDGF-BB são resolvidos sob a forma de picos individuais. 8 A Figura 6 é um electroferograma obtido por electroforese de zona capilar com carga invertida (RC CZE) de PDFG-BB tratada com carboxipeptidase B (em baixo), em comparação com rhPDGF-BB não tratada (em cima). As letras correspondem aos grupos identificados nas Figuras 1-3.

DESCRIÇÃO· PORMENORIZADA DAS CONCRETIZAÇÕES

PREFERIDAS A invenção presente diz respeito a composições com actividade de PDGF que são úteis a título de agentes terapêuticos no .tratamento de feridas. Mais especificamente, estas composições incluem pelo menos uma isoforma purificada de uma proteína de PDGF recombinante (rPDGF) biologicamente activa, substancialmente purificada. Pretende-se com o qualificativo "recombinante" significar que a proteína é produzida sob a forma de uma proteína heteróloga ou estranha, nas células de um organismo hospedeiro transformado de um modo estável com uma sequência de. nucleótidos que codifica para a proteína de PDGF estranha que é de interesse.

Os métodos da invenção proporcionam a separação de isoformas biologicamente activas de rPDGF a partir de uma substância farmacológica a granel que contém uma mistura destas isoformas. Os métodos são especialmente úteis para separar isoformas que provêm de processamento proteolítico pós-translacional de rPDGF segregada, mais especificamente de rPDGF-BB. Uma vez separadas, as isoformas podem ser substancialmente purificadas e 9 incorporadas numa composição farmacêutica para ser utilizada no tratamento de· feridas.

Uma isoforma de uma proteína de rPDGF é "biologicamente activa" quando tem a capacidade de levar a cabo uma ou mais actuações biológicas, ou um conjunto de actividades normalmente atribuídas ao PDGF num contexto biológico·. Estas actividades biológicas incluem induzir a quimiotaxia e/ou a mitogénese dos tipos de células que lhe respondam a seguir à ligação do PDGF a um receptor específico da superfície celular. Podem incluir-se em outras actividades biológicas do PDGF, sem que a estas elas se limitem, a activação da fosfolipase, um aumento da rotatividade do fosfatidilinositol e do metabolismo .de prostaglandinas, a estimulação tanto da síntese do colagéneo como da. colagenase pelas células que respondem, uma resposta indirecta de proliferação das células que não dispõem de receptores de PDGF, uma actividade vasoconstritora potente. Pode determinar-se a actividade biológica utilizando um de entre uma série de ensaios disponíveis na técnica para o PDGF, incluindo mas não se limitando à determinação da mitogénese que se descreve neste documento. A expressão "isoforma substancialmente purificada" pretende significar que pelo menos cerca de 80 %, preferivelmente pelo menos cerca de 90 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % da composição contendo rPDGF é a isoforma pretendida. As isoformas substancialmente purificadas de uma proteína são obtidas 10 métodos da invenção presente que proporcionam a separação da isoforma pretendida a partir de uma cultura de células que inclua uma mistura das isoformas de rPDGF. A,expressão "separação da isoforma de interesse" pretende significar a remoção de quaisquer isoformas indesejáveis ou de outras componentes na cultura de células, de tal modo que a isoforma remanescente esteja substancialmente purificada. A proteína de rPDGF cujas' isoformas são separadas utilizando métodos da invenção presente será uma forma dimérica biologicamente activa, mais em especial o homodímero de rPDGF-AA e PDGF-BB ou o heterodímero de rPDGF-AB, bem como quais quer suas variantes substancialmente homólogas e funcionalmente equivalentes.. Por "variante" pretende-se significar uma proteína derivada da proteína nativa por deleção ou por adição de um ou de mais aminoácidos ao terminal de N ou ao terminal de C da proteína nativa; a deleção ou a adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa; ou a substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa. Podem ser preferidas as substituições conservadoras, que preservem a carga geral, hídrofobicidade, hídrofilia, e ou volume estereoquímico do aminoácido que for substituído. Essas substituições podem ser feitas, por exemplo, entre os membros dos seguintes grupos: Gly^Ala, Val^Ile^Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn^Gln, e PheOTrp^Tyr. Podem fazer-se . outras substituições para se eliminarem resíduos de aminoácidos não- essenciais, por exemplo para alterar um local de glicosilação, um local de fosforilação, um local de 11 acetilação, ou para alterar o padrão de dobragem pela alteração da posição de um resíduo de cisteína que não seja necessário para a . função... . Os métodos para estas manipulações são em geral conhecidos na técnica.

Por -exemplo', podem preparar-se variantes da sequência de aminoácidos da proteína de PDGF de interesse por mutações na sequência de ' ADN que codifica ara a proteína de PDGF nativa. São bem conhecidos na técnica os métodos para a mutagénese e para as alterações na cadeia de nucleótidos. Veja-se, por exemplo, · Kunkel (1985) . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382; Patente U. S. No. 4.873.192; Walker e Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), e as referências citadas neste documento.

Estas variantes continuarão a possuir a actividade biológica pretendida. As mutações que serão feitas no ADN que codifica para a variante da proteína de PDGF terão obviamente eu não.colocar a sequência fora do quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiões complementares de que possa resultar uma estrutura secundária de mARN. Veja-se a Publicação do Pedido de EP No.. 75.444.

Deste modo as proteínas rPDGF cujas isoformas são separadas utilizando os métodos da invenção presente incluem as proteínas PDGF que ocorrem naturalmente bem como as suas variantes. Estas variantes serão substancialmente 12 homólogas e funcionalmente equivalentes á correspondente proteina de PDGF nativa. Uma variante de proteína de PDGF nativa é "substancialmente homóloga" em relação à proteína nativa quando pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 %, e de preferência pelo menos cerca de 95 % ' da sua sequência de aminoácidos f.or idêntica à sequência de aminoácidos da proteína de PDGF nativa. As variantes podem diferir em cerca de 1, 2, 3, ou 4 aminoácidos. A expressão "funcionalmente equivalente" pretende significar que a sequência da variante define uma cadeia de que resulta uma proteína que tem substancialmente a mesma actividade biológica do que- a proteína nativa de interesse. Incluem-se nestas variantes funcionalmente equivalentes as que incluem variações substanciais da sequência e também estão abrangidas pela invenção. Deste modo, uma variante funcionalmente equivalente da proteina nativa terá uma actividade biológica suficiente para ser terapeuticamente útil. A expressão "terapeuticamente útil" pretende significar eficaz para conseguir um objectivo terapêutico, tal como, por exemplo, curar uma ferida.

Estão disponíveis métodos, na técnica, para determinar a equivalência funcional. Pode medir-se a actividade biológica ensaios especificamente concebidos para medir a actividade da proteína nativa. Para além disto, podem testar-se anticorpos cultivados contra a proteína nativa biologicamente activa quanto à sua capacidade de se ligarem ao análogo funcionalmente equivalente, em.que uma ligação eficaz é indicativa de a proteína possuir uma conformação similar à da proteína 13 nativa.

Os métodos da invenção presente proporcionam uma melhor separação e purificação de isoformas de proteínas rPDGF, mais em especial daquelas isoformas que provêm de processamento endoproteolítico pós-translacional de rPDGF. A rPDGF cujas isoformas. são separadas pode ser o homodímero PDGF-BB. ou o heterodímero PDGF-AB. Numa concretização preferida, as isoformas da proteína do PDGF recombinante humano (rhPDGF) são separadas e purificadas utilizando métodos da invenção. A sequência de nucleótidos que codifica para a proteína de rPDGF cujas.isoformas são separadas utilizando métodos da invenção presente pode ser uma sequência genómica, de cADN, ou de ADN sintético.. Os genes que codificam para a forma nativa de PDGF já foram sequenciados, e são bem conhecidos na técnica diversos análogos. A expressão dos homodímeros e dos heterodímeros de PDGF está descrita, por exemplo, nas Patentes U.S Nos. 4.766.073; 4.769.328; 4,.01.542,- 4.. 845.075; 4.849.407; 5.045.633; 5.128.321; e 5.187.263. Com base nas sequências de aminoácidos conhecidas para os polipéptidos das cadeias A e B, podem produzir-se sequências sintéticas de polinucleótidos in vitro utilizando métodos disponíveis na técnica. Veja-se em especial Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York). Quando a proteína recombinante de PDGF de interesse for o heterodímero rhPDGF-AB, as sequências de nucleótidos que codificam para os polipéptidos híbridos 14 precursores que incluem ao polipéptidos das cadeias A e B podem ser assembladas como parte de uma cassette de expressão, ou podem ser assembladas em . cassetes de expressão separadas para uma co-transformação na célula hospedeira. A sequência de nucleótidos que codifica para a proteina PDGF recombinante .de. interesse pode ser expressa num sistema de expressão adequado para uma separação e uma purificação subsequente das isoformas de interesse, de acordo· com métodos da invenção presente. Estão disponíveis na técnica métodos para expressar proteínas heterólogas, mais especialmente para expressar homodímeros. e heterodímeros de PDGF recombinante em bactérias (veja-se, por exemplo, Hoppe et aí. (1990) Eur. J. Biochem. 187: 207-214; Fretto et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3625-3631) , em levedura (Kelly et al. (1984) EMBO JY 4: 3399-3405;

Ostman et al. (1989) Growth Factors 1:271-281), e em células de mamíferos (veja-se, por exemplo, Ostman et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 16202-16208). Veja-se também o pedido de patente EP 177,957; a Patente U.S. N°. 5.219.759,. Podem levar-se a cabo os métodos da invenção presente com rPDGF produzida em qualquer sistema hospedeiro era que o processamento proteolitico pós-translacional leve à segregação de um produto de rPDGF que inclua uma mistura de isoformas.

Ocorrem frequentemente problemas no processamento proteolitico pós-translacional e a génese de isoformas, em rPDGF produzido numa levedura hospedeira. O termo 15 "levedura" pretende significar leveduras capazes de gerar ascosporos (Endomycetales} , leveduras capazes de gerar basidiosporos, e leveduras que pertençam aos Fungi Imperfecti (Blastomicetos) . Os fungos capazes de gerar ascosporos dividem-se em . duas famílias, os Spermophthoraceae e os Saccharomycetaceae. Esta última inclui quatro sub-famílias, Schizosaccharomycoideae {por exemplo o género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae, Lipomycoideae, e Saccharomycoideae (por exemplo os géneros Píchia, Kluyveromyces, e . Saccharomyces) . Incluem-se nas leveduras capazes de gerar basidiosporos os géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Fílobasidium, e Filobasidiella. As leveduras que pertencem aos Fungi Imperfecti estão divididas em duas famílias, Sporobolomycetaceae (por exemplo os géneros Sporobolomyces, Bullera) e os Cryptococcaceae (por exemplo o género Candida) . São de um interesse, especial para a invenção presente as espécies dos géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, e Candida. São particularmente interessantes as espécies de Saccharomyces S. cerevisíae, S. carlsbergensis, S. diastaticus., S. douglasii, S. kluyveriS, norbensis, e S. oviformis. No género Kluyveromyces incluem-se como espécies de interesse especial os K. lactis. Uma vez . que a classificação dos fungos pode mudar no futuro, para os propósitos' desta invenção, definir-se-á levedura tal como foi descrito em Skinner et al., editores., (1980) Biology and Activities of Yeast (Soc. App.· Bacteriol. Symp. Series No. 9). Para além dos que se citaram acima, os indivíduos com conhecimentos médios da técnica estão presumivelmente familiarizados com 16 a biologia das leveduras e com a manipulação da genética de leveduras. Veja-se, por exemplo, Bacila et al., editores. (1978) Biochemistry and Genetics of Yeast; Rose e Harrison, editores, (1987) The Yeasts (2a edição); Strathern et al.r editores, (1981) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Δ selecção de leveduras e de outros micro-organismos como hospedeiros para a expressão de proteínas heterólogas está ao alcance da técnica. Quando se seleccionam leveduras como hospedeiras para a expressão, podem incluir-se como hospedeiras adequadas as que' se demonstrou possuírem, entre outras, uma boa capacidade de expressão, uma actividade proteolítica reduzida, e que sejam globalmente robustas. As leveduras e outros micro-organismos estão em geral disponíveis junto de uma série de entidades, incluindo o Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medicai Physics, Universidade da Califórnia, Berkeley, Califórnia; e na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Os métodos para a expressão de rPDGF numa levedura hospedeira estão disponíveis na técnica. Um desses métodos inclui transformar-se uma célula de levedura hospedeira com um vector de expressão plasmídica que inclua uma sequência de nucleótidos codificando para PDGF-BB humana. Este método está sumariamente descrito no Exemplo 1 neste documento.

Quando está expresso numa célula de uma levedura 17 hospedeira, a rPDGF é segregada sob a forma de uma mistura complexa de isoformas estruturais que provêm de um processamento proteolítico pós-translacional da proteína durante o processo de produção por fermentação. 0 processamento pós-translacional é francamente dominante na expressão de rPDGF-BB. Estas isoformas estruturais possuem graus variáveis de actividade biológica, tal como se demonstra utilizando ensaios padrão para determinação da actividade de PDGF. Os métodos da invenção dizem respeito à separação destas isoformas estruturais de tal modo que uma composição farmacêutica final contendo isoformas substancialmente purificadas com a maior actividade biológica possível possa ser preparada. Estes métodos são úteis para separar isoformas de rPDGF-AB, e mais especificamente isoformas de rPDGF-BB. A PD.GF-BB recombinante produzida numa célula de levedura hospedeira é segregada sob a forma de uma proteína homodiméríca completamente dobrada, biologicamente activa, çonstituida por dois pares antiparalelos altamente entrançados de cadeias B (Oefner et al. (1992) EMBO J. 11: 3921-3926) . Cada . cadeia B inclui 109 resíduos de amínoácidos. Durante a fermentação para se produzir uma substância farmacêutica em bruto, ocorrem diversas modificações pós-translacionais na rPDGF-BB . segregada. Deste processo resulta uma substância farmacêutica em bruto que inclui proteína rPDGF com uma heterogeneidade estrutural significativa. Incluem-se nestas modificações, sem que elas a estas se limitem, uma digestão endoproteolítica entre os resíduos Arg-32 e Thr-23 18 (referida como o "corte") e a remoção exoproteolítica dos aminoácidos do terminal C (referida como "trúncagem") em Arg-32 e em Thr-109, a glicosilação de resíduos Ser e/ou de resíduos Thr, e a oxidação da metionina. Estas modificações pós-translacionais levam a uma série de formas estruturais, ou as assim denominadas isoformas, de rPDGF-BB, presentes no produto segregado. A heterogeneidade estrutural da rPDGF-BB produzida em leveduras complica-se ainda mais pela presença de uma ligação Pro-Pro nos resíduos '41 e 42. A rotação desta ligação rígida tem um impedimento adicional devido à sua proximidade em relação a uma ligação dissulfureto e ao lado volumoso da cadeia de Trp-40. Este impedimento rotacional leva à formação dos isómeros cis-trans estáveis da rPDGF-BB à temperatura ambiente. Embóra existam muitas isoformas potenciais quando se consideram as combinações múltiplas de modificações pós-translacionais e a isomerização, as isoformas resultantes do corté e da trúncagem pós-translacionais têm interesse directo para a invenção presente. 0 processamento endoproteolítico pós-translacional ou o corte entre Arg-32 e Thr-33 leva a três isoformas básicas e distintas de rPDGF-BB: a intacta, com um corte único, e com duplo corte. 0 termo "intacta" pretende significar que ambas as cadeias B permaneceram intactas e não foram submetidas. a uma clivagem endoproteolítica. A expressão "com corte único" pretende significar que uma cadeia B está intacta e uma cadeia B foi 19 clivada no processo endoproteolitico entre Arg-32 e Thr-33. A expressão "com duplo corte" pretende significar que ambas as cadeias B foram clivadas no processamento endoproteolitico entre Arg-32 e Thr-33. Cada isoforma respectiva pode ser .adicionalmente modificada por uma truncagem no terminal C de Arg-32 ou deThr-109, levando a um número conhecido de espécie estruturais a partir de cada isoforma básica. Portanto, para a. isoforma Intacta, a truncagem no terminal C pode ocorrer apenas no resíduo 109, levando a três espécies estruturalmente diferentes dessa isoforma. Para a isoforma com corte único, a truncagem de ambos os resíduos 32 e 109 no terminal C pode originar espécies ligeiramente diferentes do ponto de vista estrutural, dessa isoforma. Para a isoforma com duplo corte, são possíveis dez espécies estruturalmente diferentes desta isoforma. Em conjunto, os processos pós-translacionais de corte seguidos pela truncagem opcional no terminal C de resíduos Arg-32 ou de resíduos Thr-109, leva a uma mistura complexa de vinte e uma isoformas estruturais possíveis de rPDGF-BB na substância farmacêutica em bruto, tal como se ilustra esquematicamente nas Figuras 1-3.

Os métodos da invenção dizem respeito à separação of das isoformas de base designadas como isómeros intactos, com corte único, e com duplo corte, da rPDGF-BB, cada um dos quais inclui um número conhecido de espécies estruturais suas derivadas em resultado de. truncagem dos resíduos Arg-32 ou Thr-109. Foi determinado que a isoforma Intacta possui uma actividade mitogénica de 100 %, a isoforma de corte tem uma actividade mitogénica de 120 %, e 20 a isoforma com duplo corte tem uma actividade mitogénica de 20 %. A amostra de referência exibe uma actividade de 50 %. De acordo com isto, utilizando os métodos da invenção podem obter-se composições que apresentem uma actividade de PDGF pelo menos cerca de 20 % superior, preferivelmente pelo menos cerca de 50 % superior, , mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 % superior à da cultura de células não purificada. Deste modo, para os propósitos de preparação de composições de rPDGF-BB que possam ser utilizadas como agentes terapêuticos para .o .tratamento de feridas, é claramente desejável separar estas isoformas de tal modo que as composições farmacêuticas contenham isoformas de rPDGF-BB intactas e/ou com corte único. Os métodos da invenção permitem a preparação dessas composições farmacêuticas por proporcionarem a separação das isoformas de rPDGF-BB que são intactas e com corte único, das isoformas com duplo corte, na substância farmacêutica em bruto que é produzida por fermentação.

Os métodos da invenção utilizam um enriquecimento por permuta iónica, uma cromatografia liquida de alta eficiência em fase reversa, e uma electroforese de zona capilar com carga invertida. O primeiro destes métodos diz respeito à separação dos isómeros de rPDGF intactos, com corte único, e com duplo corte, em especial dos de rPDGF-BB, em que a separação- leva a um grau de purificação apropriado para a utilização terapêutica' de rPDGF. Este método é portanto apropriado para a separação destes isómeros para utilização na produção de uma composição farmacêutica contendo rPDGF substancialmente purificada, 21 intacta, com corte único, ou intacta e com corte único, em especial rPDGF-BB. 0 segundo e o terceiro métodos, embora proporcionem um meio de separação dos isómeros intactos, com corte único, e com duplo corte, são principalmente úteis como metodologias analíticas, tal como se descreve adiante.

As isoformas de rPDGF-BB intactas e com corte único podem ser separadas por enriquecimento por permuta iónica, face à isoforma com duplo corte, até a um grau de purificação apropriado para a utilização terapêutica de rPDGF-BB. Pode enriquecer-se nas.isoformas intactas'e . com corte único de rPDGF-BB substancialmente purificadas, um produto farmacêutico em bruto que contenha rPDGF-BB biologicamente activo, separando estas isoformas da isoforma com duplo corte, utilizando cromatografia de permuta iónica catiónica· e uma coluna de TSK sulfopropilo (TSK SP). A substância em bruto Obtida por fermentação, que inclui todas as três isoformas corre através da coluna, e as isoformas pretendidas são eluídas com solução de NaCl. A isoforma com duplo corte elui nas primeiras fracções, seguida pela isoforma com corte único e pela intacta. A remoção da fracção eluída contendo a isoforma com duplo corte permite a recolha subsequente das fracções eluidas contendo' as isoformas com corte único e intacta. Podem utilizar-se estas fracções em separado, ou em conjunto, para se produzir uma composição contendo a isoforma intacta isolada, a isoforma com corte único isolada, ou uma mistura das isoformas intactas e com corte ' único, de rPDGF BB. 22 A cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP HPLC) é um método útil para separar determinadas isoformas da preparação de proteína dimérica contendo múltiplas isoformas, em que pelo menos uma isoforma tenha duas faces diferentes. 0 termo "face" pretende ser um termo utilizado no contexto da RP HPLC, em que cada cadeia polipeptídica de uma proteína dimérica seja uma "face" da molécula, Para homodímeros, tais como PDGF-BB, em que as duas cadeias são idênticas e não têm quaisquer modificações que tornem uma das faces diferente da outra face, a molécula apresenta uma única face. No entanto, quando a molécula apresenta, tal como é o caso da rPDGF-BB, uma cadeia que sofreu uma clivagem endoproteolítica de uma das cadeias, de que resulta uma isoforma com corte único, o dímero resultante apresenta duas faces: a face dá cadeia não cortada e a face da cadeia com corte, único. Um heterodímero apresenta naturalmente duas faces. Por exemplo,. no caso do heterodímeros rPDGF-AB, a cadeiaΆ é uma face e a cadeia B é outra.

Para os propósitos da invenção presente, utiliza-se uma RP PLC levada a cabo a temperatura para separar as isoformas Intacta, com corte único e com duplo corte da rPDGF-BB. De acordo com a invenção presente, leva-se a cabo o método de RP HPLC â uma temperatura de entre cerca de 75°C no mínimo e cerca de 90°C no máximo, e mais preferivelmente a uma temperatura de cerca de 85°C, para a separação das isoformas de rPDGF-BB. 0 método de .RP HPLC da invenção pode também incluir utilizar-se uma combinação de gradientes, isocrática ou em andares, de acetonitrilo. 23

Antes desta aplicação de RP HPLC a temperatura elevada para analisar e para separar isoformas de rPDGF-BB, havia sido anotado por parte dos investigadores que produziram PDGF-BB em E. coli e que o analisavam por RP HPLC, que se observavam rotineiramente pelo menos 4 picos nos cromatogramas resultantes (veja-se Watson e Kenney (1992) J. Chromatography 606:165-170). Havia sido estabelecido que estes picos eram devidos· a diferenças na hidrofobicidade exposta provocadas por uma sequência Pro-Pro nos resíduos 41 e 42 (Watson e Kenney (1992) . J. Chromatogr. 606: 165-170), e que portanto mediam a quantidade de confórmero pro-pro. Para além disto, a rPDGF-BB ·expressa na levedura Saccharomyces cerevisae exibe múltiplos confórmeros que produzem perfis cromatográficos largos e heterogéneos quando são analisados com RP HPLC a diversas temperaturas tais como a ambiente e inferiores a ela, tal como se descreve no Exemplo 3 adiante. A análise e a separação da rPDGF-BB por RP HPLC a estas temperaturas é complicada pelas isomerizações Pro-Pro dentro da molécula. Para além disto, a cromatografia de absorção nãó pode resolver em simultâneo os cortes e as truncagens em faces .opostas da proteína homodimérica, nestas condições.

Quando levada a cabo de acordo com a invenção presente, a análise por RP HPLC acelera o estabelecimento do equilíbrio na isomerização Pro-Pro tal . como acelera a velocidade de desorçâo. Em resultado disto, o fenómeno de observação de diversos isómeros conformacionais Pro-Pro deixa de se observar. 0 número de isoformas potencialmente resolvidas pode portanto ser limitado às vinte e uma 24 estruturas descritas acima como as isoformas intactas, com corte único, e com duplo corte bem como as espécies delas resultantes por exoproteólise. Para além disto, quando se leva , a cabo uma análise por RP HPLC a cerca de 85°C, a heterogeneidade que resulta das modificações pós-translacionaís devidas aos cortes e às truncagens que ocorrem em ambas as faces da molécula dimérica, podem ser resolvidas.'

Pode também empregar-se uma combinação de gradientes, isocrático e em andares, para além da temperatura alta, para melhorar a separação das isoformas, simplificando grandemente o perfil cromatográfico. Utilizando o método de RP HPLC a alta temperatura- com o gradiente isocrático/em andares consegue-se uma separação das isoformas de rPDGF-BB predominantemente baseada nos cortes, facilitando a análise e a separação das isoformas de rPDGF-BB intacta, com corte único, e com duplo corte. Estão disponíveis na técnica métodos para se levar a cabo uma eluição em gradiente isocrático/em andares.

Podem separar-se quantidades de isoformas de rPDGF-BB intactas, com corte único, e com duplo corte, a partir de uma substância farmacêutica em bruto' que contenha uma mistura de isoformas de rPDGF, utilizando o método de RP HPLC a alta temperatura e uma eluição gradiente isocrático/em passos, de acetonitrilo, de acordo com a invenção presente. Podem purificar-se estas isoformas a partir dos solventes acetonitrilo e TFA, bem como da componente tamponizante. Consegue-se a purificação 25 utilizando as metodologias habituais para se removerem proteínas desses solventes. Por exemplo, pode recorrer-se a uma diálise utilizando tubos pequenos, ou para quantidades maiores pode recorrer-se à utilização de fibras d diálise de fluxo contínuo, para se obter um produto adequado para ser utilizado como agente terapêutico.

As isoformas purificadas de rPDGF-BB obtidas de acordo com este método da invenção são úteis para se levarem a cabo testes de actividade biológica para se determinar a actividade biológica relativa das isoformas purificadas. No caso de rPDGF-BB, pode-se. levar a cabo um ensaio mitogénico para determinar a actividade biológica da substância farmacêutica em bruto contendo pelo menos uma isoforma de rPDGF-BB, tal como se descreve no Exemplo 5 contido neste documento..

Se por um lado o método de RP HPLC a alta temperatura da invenção presente é- útil para separar quantidades das isoformas de rPDGF-BB que são suficientes para se analisar a actividade biológica das isoformas individuais, este método não é adequado para se levarem a cabo análises de rotina nem a quantificação das isoformas intacta e cortadas, numa substância farmacêutica em bruto. 0 terceiro método da invenção, electroforese de zona capilar com cargas invertidas (RC CZE) foi desenvolvido para proporcionar esse tipo de quantificação e para análises de rotina. A CZE de cargas invertidas da invenção presente 26 foi desenvolvida originalmente para monitorizar a heterogeneidade dè cargas, uma vez que o ponto isoeléctrico extremamente elevado (pi = 10,5) da molécula de rPDGF-BB impedia a utilização, da análise habitual por focagem isoeléctrica (IEF). No entanto, a utilização de géis para IEF com um pi muito elevado, depositados à mão, pode ser viável. A sepáração por RC CZE é baseada na razão carga/dimensão. Assim, no que toca à rPDGF-BB da invenção presente, a truncagem do resíduo básico Arg-32 tem um maior efeito sobre a selectividade no teste de RC CZE do que a truncagem do resíduo neutro de aminoácido Thr-109. Uma vez que a truncagem do resíduo Thr-109 não altera apreciavelmente a carga nem a dimensão da proteína, não existe separação entre as três categorias possíveis de ísoformas, adentro da isoforma intacta. A separação de linha de base que se observa entre a isoforma intacta e '.a isoforma com corte único pode ser devida a um aumento da dimensão hidrodinâmica da isoforma com corte único, que pode. ocorrer por uma desnaturação parcial da sua estrutura secundária. Na isoforma com corte único, a separação das' duas espécies (uma sem a truncagem de Arg-32 no terminal C e a outra com essa truncagem) é devida à diminuição da cárga sobre a espécie da isoforma resultando da truncagem de Arg-32 no terminal C. De entre as isoformas . com duplo corte, podem distinguir-se três isoformas; a sua separação pode ser devida à diferença de cargas resultante de quer uma truncagem simples, quer dupla, no terminal C, de Arg- 32. 27 O método RC CZE que se descreveu acima é incapaz para distinguir entre, e portanto para separar, as isoformas com corte único que tenham a truncagem em Arg-32 e as isoformas com corte duplo que não tenham a truncagem em Arg-32. Para separar estas duas categorias de isoformas e para quantificar as isoformas intacta, com corte único, e com duplo corte, o método RC CZE da invenção presente inclui também tratar-se a substância farmacêutica em bruto contendo as diversas isoformas de rPDGF-BB com carboxipeptidase B antes da análise. Este enzima é especifico para os aminoácidos básicos arginina e lisina localizados no terminal carboxilo. 0 tratamento com enzima transforma as isoformas com corte único sem truncagem em Arg-32 em isoformas com corte único com truncagem em Arg-32, and transforma as isoformas com duplo corte sem nenhuma ou apenas com uma truncagem em Arg-32 em isoformas com duas truncagens em Arg-32. Deste modo, o tratamento da substância farmacêutica em bruto PDGF-BB com carboxipeptidase B simplifica o electroferograma de RC CZE e permite a quantificação das três isoformas de rPDGF-BB tal como definidas pelo corte entre Arg-32 e Thr-33 (as isoformas a que se faz referência como intacta, com corte único, e com duplo corte). 0 método RC CZE de análise da PDGF-BB, tál como modificado na invenção presente para isolar as isoformas intacta, com corte único, e com duplo corte pela utilização de carboxipeptidase B, é útil, num contexto de controlo de qualidade, para a. análise de uma ..substância farmacêutica em bruto contendo as isoformas de rPDGF-BB descritas neste 28 documento. Δ vantagem da utilização de RC CZE para analisar a' PDGF-BB num contexto de controlo de qualidade é a facilidade e a precisão conseguida com este' método, que torna o método num método adequado para actividades analíticas de rotina tais como as que são necessárias no controlo de qualidade de substâncias farmacêuticas a granel. . '

Deste modo os métodos da invenção são úteis para se analisar e para se separarem as. isoformas intacta, com-corte único, e com duplo corte da rPDGF-BB. Após a separação das isoformas intactas, e com corte único, ou da mistura de isoformas intactas e com corte único de rPDGF-BB que se pretende,, podem remover-se sempre .que tal seja necessário o.tampão contaminante ou outras impurezas,.para se obterem composições contendo as isoformas substancialmente purificadas de interesse. Podem preparar-se estas composições para utilização a título de agente terapêutico tal como se descreve adiante. A expressão "agente terapêutico" pretende significar um agente que leva a cabo um objectivo terapêutico, tal como por exemplo, curar uma ferida.

As composições que contêm as isoformas de rPDGF-BB substancialmente purificadas intactas, com corte único, ou uma mistura de intactas e com corte único, são úteis como agentes terapêuticos para o tratamento de feridas, em especial aquelas feridas que são normalmente cicatrizadas em resposta à libertação de PDGF nativo. 29 A libertação de PDGF .in vivo actua como um agente quimiotáctico para atrair monócitos, fibroblastos, e células musculares lisas ao local' da lesão, e para se iniciar a replicação celular com o objectivo de cicatrizar as feridas. Demonstrou-se que este factor de crescimento promove a cicatrização de feridas provenientes de incisões em ratos e a cicatrização em regiões do corpo tais como câmaras ou espaços subcutâneos. Deste modo o PDGF tem aplicação na cicatrização . de' feridas tais como úlceras, queimaduras, e transplantes, de. pele. Para além disto, o PDGF pode ser utilizado para cicatrizar feridas em tecido conjuntivo lesionado, cuja .reparação necessite de uma proliferação de fibroblastos eia deposição de colagéneo. Para além disto, quando a cicatrização de feridas é atrasada por um de entre uma sério de factores que inclui, mas não se limita a, idade avançada, diabetes, cancro, e tratamento com fármacos anti-inflamatórios ou com anticoagulantes, pode utilizar-se PDGF para promover a cicatrização normal das feridas em mamíferos em situações que de outra forma levariam auma cicatrização retardada das feridas. A utilidade do factor decrescimento derivado de plaquetas a ' título de agente terapêutico para a cicatrização de queimaduras de profundidade total ou parcial também foi descrita por Danilenko et al. (1995) Am. J. Pathol. 147: 1261-1277. Desta maneira, o PDGF-BB· recombinante induz uma forte produção de tecido da matriz extra celular e de granulação de tal modo que os defeitos das queimaduras são reparados. 30

No contexto da diabetes, um estado com a complicação de uma cicatrização lenta das feridas, foi postulado que as feridas diabéticas refractárias resultam de deficiências nos factores de crescimento e/ou nas citoquinas que são importantes, para, o processo de cicatrização. Alguns estudos preliminares mostraram que a aplicação de determinados factores de crescimento ou de citoquinas pode facilitar a cicatrização de feridas, tal como se descreveu em Doxey et. al. (1995) Life Sciences 57 (11}: 111-23. Neste trabalho, o PDGF de ratos diabéticos feridos foi produzido a baixos teores em comparação com os animais de controlo. Estes ratos apresentavam uma produção diferida de PDGF nas células que rodeavam as feridas, que ocorriam muitos dias depois de ter sido feita a ferida, explicando possivelmente o atraso na cicatrização das feridas .dos animais diabéticos. Existe portanto uma aplicação, potencial para a administração de PDGF-BB a diabéticos, para. induzir e normalizar a cicatrização de feridas.

Os mecanismos de actuação de PDGF-BB dos .outros dímeros de PDGF, incluindo PDGF-AA e PDGF-AB, estão descritos com generalidade em Lepisto et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 209(2): 393-9. Os dímeros PDGF-AA e PDGF-BB ambos regulam em baixa os 'teores de estado estacionário dos mARN da cadeia de- colagéneo pro-alfa 1 (I), e pro-alfa 1 (III), e a produção de colagéneo, em ambos os casos de uma forma dependente da dose.

Para além disto, as composições que incluem PDGF 31 podem facilitar a cicatrização de ossos feridos'ou gastos, pela promoção do crescimento do tecido conjuntivo, pelo crescimento do osso e do cementum, e pela estimulação da síntese de proteína e de colagéneo na região do osso ferido,, especialmente tal como no caso, por exemplo, de doenças periodontais (veja-se o WO 88/03.409).

As composições contendo PDGF podem proporcionar uma cicatrização rápida e eficaz para feridas tais como, por exemplo, feridas dos acamados, lacerações, e queimaduras, tal como se descreveu em WO 91/15.231 e na US 5.019.559, em que a PDGF numa composição com fáctor de crescimento semelhante à insulina (IGF) promove um aumento do novo tecido conjuntivo e um aumento do crescimento do tecido epitelial.

Podem administra-se as composições contendo PDGF sob a forma de formulações de géis,, e uma formulação deste tipo é. adequada para administração tópica para promover a cicatrização de feridas em condições tais como as' de úlceras, feridas superficiais . e lacerações, abrasões, feridas cirúrgicas, queimaduras, e defeitos dos ossos, tal como se' descreve no WO 93/08.825.

Para utilização ' a título de agente terapêutico para o tratamento de feridas, podem administrar-se por via tópica composições ' contendo as isoformas de PDGF-BB intactas, com corte único, ou as misturas de isoformas intactas com as de corte único que se descreveram neste documento, .com um veículo apropriado aceitável do ponto de 32 vista farmacêutico ou numa preparação de proteína

substancialmente purificada de tal modo que esteja isenta· de impurezas e de elementos que viessem a interferir com a sua utilização terapêutica. Tais preparações que são isentas de substâncias tóxicas, antigénicas, inflamatórias, ou de outras substâncias nocivas, e que sejam pelo menos cerca de 80 % puras, são- consideradas- apropriadas. A concentração da proteína pode ser de entre cerca de 1 e cerca de :25 pg/mL do volume total, ou· pode estar compreendida numa gama tão larga como entre cerca de 1. ng/mL de cerca de 50 μg/mL consoante a utilização terapêutica para o PDGF-BB. Uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico, suficiente- para . acelerar a taxa de aparecimento e para aumentar ò número de novos fibroblastos no espaço da ferida e para estimular a síntese de ADN e a deposição ' de colagéneo por esses fibroblastos estará compreendida na gama de entre cerca' de 1 e cerca de 5 mililitros da preparação, consoante as características da ferida.

Pode formular-se uma composição farmacêutica contendo isoformas de rPDGF-BB substancialmente purificadas, intactas ou com corte único ou uma mistura de essas isoformas, com um veículo adequado aceitável do ponto de vista farmacêutico, para administração ' a título de agente terapêutico para o tratamento de feridas. Os veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico pode ser macromoléculas de grandes dimensões e que são metabolizadas lentamente tais como as proteínas, os ' polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos 33 poliméricos, copolímeros de aminoácidos, vírus inactivos em partículas. Os indivíduos com conhecimentos médios na técnica conhecem estes tipos de.veículos. Podem utilizar-se também sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como os cloridratos, os bromidratos, os fosfatos, os sulfatos, e outros semelhantes; bem como os sais de ácidos orgânicos tais como os acetatos, os propionatos, os malonatos, os benzoatos, e outros semelhantes. Os veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico nas composições farmacêuticas podem conter líquidos tais como água, soro salino, glicerol, e etanol. Para além disto, podem utilizar-se substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponizantes do pH, e outras semelhantes, nos veículos apropriados.. 0 método para formular uma composição farmacêutica é em geral conhecido na técnica..· .Pode encontrar-se uma descrição extensiva da formulação e da selecção de veículos, de estabilizadores, e de isomolitos aceitáveis do ponto de vista .farmacêutico em Pharmaceutical Sciences, de Remington, 18a edição (Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania, 1990).

As composições farmacêuticas são tipicamente preparadas sob a forma de injectáveis, quer como soluções, quer como suspensões líquidas. Também se podem preparar formas sólidas adequadas para dissolução ou para suspensão em veículos líquidos antes da injecção. Estão incluídos os liposomas na definição de veículos aceitáveis do ponto de 34 vista farmacêutico. Algumas composições em liposomas estão descritas na Patente U.S. No. 5.422.120; no WO 95/13.796; no WO 94/23.697; no WO 91/14.445; e na EP 524.968 Bl.. A administração da composição farmacêutica terapêutica com PDGF-BB pode ser levada a cabo de uma forma qualquer e a um local qualquer do corpo do animal que está a ser tratado e que seja apropriada para a ferida que se está a tratar. Deste modo pode portanto administrar-se o PDGF-BB, por . exemplo, por via parentérica ou por via tópica. A administração parentérica pode incluir a injecção subcutânea, endovenosa, intra-arterial, intramuscular, ou directa, numa determinada região ou órgão do corpo.

Os exemplos seguintes estão incluídos apenas a título de ilustração e estão isentos de valor limitativo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de Substância Farmacêutica de PDGF-BB Em Bruto

Produziu-se PDGF-BB recombinante humano (rhPDGF) utilizando uma estirpe da levedura Saccháromyces cerevisíae geneticamente modificada com múltiplas cópias de um plasmídeo de expressão de leveduras que inclui um gene que codifica para a cadeia polipetídica de PDGF-B maduro humano. A estirpe MB2-1 de S. cerevisíae foi desenvolvida 35 de modo a conter o genotipo: Mata, ura3A, leu2-3, leu2-112, his3-l'l, his3-15, ρβρ4Δ, [cir°] . Ela é auxotrófica no que se refere a uracilo, leucina e histidina, necessitando destes suplementos nutricionais quando é cultivada em meio mínimo. A MB2-1 não contém um plasmídeo endógeno 2-μ, que tem tendência a. interferir com a estabilidade dos plasmídeos .introduzidos e encoraja a recombinação entre plasmídeos endógenos e introduzidos. A.estirpe não expressa protease A funcional, produto do gene PEP4, que interfere com a produção de proteínas heterólogas. A MB2-1 foi concebida para transmitir estas características favoráveis, que incluem a selecção para uma expressão elevada de proteínas heterólogas·. 0 vector seleccionado para expressar a rhPDGF-BB, pAB24, é um' vector de transporte leveduras-bactérias. 0. plasmídeo é uma quimera de sequências a partir de pBR322, derivadas a partir de diversos plasmídeos bacterianos com ocorrência na natureza, e de sequências do plasmídeo endógeno 2-μ de S. cerevísíae (Broach (1981) em Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (Cold Spring Harbor Press, New York}, 1: 445-470).

Ligou-se uma cassette de expressão incluindo uma sequência de nucleótidos que codifica para rhPDGF-BB ao vector pAB24, para se gerar o plasmídeo de expressão da levedura pYL7PPB.

Em resumo, o plasmídeo pYL7PPB inclui uma cassette de expressão com as seguintes características. A 36 iniciação e a terminação da transcrição são mediadas pelo promotor hibrido induzível de leveduras ADH/GAP e pelo terminador de transcrição Mataa. A cassette também inclui um quadro de leitura aberto que codifica para um orientador de factor alfa de levedura truncado, para mediar a secreção de proPDGF-B humana nativa. A pró-sequência incluída na construção de expressão é apenas a sequência de codificação para o polipéptido nativo do terminal N; não se incluiu a sequência polipeptidica nativa do terminal C nesta construção. A . inclusão do polipéptido do terminal N originou lima expressão máis forte de rhPDGF-BB. .

Incluíram-se locais dibásicos de processamento nas junções entre o orientador truncado de factor alfa e o propéptido do terminal N e entre o propéptido do terminal N e a PDGF-B, para facilitar a produção do polipéptido rhPDGF-B por parte da levedura. 0 isolamento do cADN que codifica para hPDGF-B foi levada a cabo utilizando uma biblioteca, de cADN preparada a partir de ARN isolado de uma linha de células clonal de glioma humano, 0 isolamento e as características deste cADN foram descritas por Westermark et al., J. Neurosci. Res., 8: 491 (1982) e em Ponten e Westermark, Med. Biol. 56: 184 (1978). Esta linha de células foi utilizada a título de fonte de ARN para o isolamento do gene de PDGF porque se havia demonstrado que produzia teores mais elevados de actividade de competição com o receptor de PDGF do que as outras linhas celulares que se testaram. 37

Exemplo 2: Utilização de Cromatografia de Permuta Catiónica em TSK Sulfopropilo para Enriquecimento da Substância Farmacêutica rhPDGF-BB em Bruto Nas Xsoformas Intacta e Com Corte Único, de rhPDGF-BB 0 fabrico da substância farmacêutica em bruto rhPDGF-BB está descrito no Exemplo 1. 0 objectivo global deste procedimento . era gerar, quantidades da ordem do miligrama de isoformas de rhPDGF-BB intactas, com corte único, e com. duplo corte, utilizando cromatografia repetitiva TSK SP 5PW (Tosoh-Haas) de rhPDGF-BB puro produzido numa célula hospedeira de uma levedura, e depois determinar a actividade biológica relativa das três isoformas utilizando o teste do mitogénio. No processo, demonstrou-se que quando, em vez do NaCl .0 a 1 M que o protocolo de manufactura diz ser necessário, se elui a coluna SP TSK 5PW com um gradiente de. NaCl de 0 M a 0,6 M, uma parte significativa da isoforma com duplo corte de rhPDGF-BB-parece eluir com a primeira porção do. gradiente, separada' do resto do material. Uma vez que a. isoforma com duplo é aquela que é menos biologicamente· activa (vejam-se os exemplos adiante), deveria ser útil incorporar esta pequena alteração (a do gradiente de 0 - 0,6 M) num processo futuro em larga escala, de segunda geração.

Preparou-se a coluna empacotando 50 mL de TSK SP 5PW (fornecido já inchado) numa coluna Pharmacia K26 (2,5 x 10 cm), vazia. Lavou-se a coluna empacotada com pelo menos 5 volumes da coluna (c.v.) de tampão, de carga (acetato de sódio 0,0 5M, pH 4,5). Carregou-se. na coluna rhPDGF-BB 38 produzido pelo método do Exemplo 1, e lavou-se a coluna com não menos de 2 c.v. de tampão de carga, e em séguida com 2 c.v. de tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7 (com NaOH). Eluiu-se o produto com 10 c.v. de um gradiente linear (de 0 a 0,6 M) de NaCl (tampão B) em fosfato de sódio 50 mM a pH 7,0. Fracc'ionou-se o pico eluido.

Nas separações ilustradas neste documento, a matéria-prima era um conjunto de amostras de rhPDGF-BB tal como se descreveu no Exemplo 1. O material estava em fosfato de sódio a pH 6, a 9,9 mg/mL; o pH foi ajustado a 4,5 com NaH3P04 1 M. Depois do ajustamento do pH a concentração de rh-PDGF-BB era de 9 mg/mL , e a condutividade da carga era de 1,62 mS/cm a 25°C. Todo o trabalho foi levado a cabo à temperatura ambiente. Carregaram-se 477 mg (53 mL) na coluna a 2 mL/minuto. Lavou-se a coluna com 2 c.v. de tampão de carga (100 mL), e depois aplicou-se o gradiente de NaCl 0-0,6 M em cerca de 10 c.v. (492 mL). Recolheram-se fracções de 15 mL cada uma, e analisaram-se as fracções por PAGE (Géis Novex Tricine a 10-20%) ,· medindo-se as absorvâncias. A proteína eluiu a partir da fracção 28 e até cerca da fracção 50. Com base nos géis, juntaram-se as fracções 28-30, diluiu-se a 1:1 com água destilada (para se diminuir a condutividade a um valor suficientemente pequeno para ser possível a ligação), voltou a aplicar-se sobre a coluna SP, e eluiu-se nas mesmas condições. Quando se analisou pelo teste mitogénico, demonstrou-se que a carga tinha 14 % da actividade do padrão de referência, indicando que estas fracções representavam uma quantidade elevada de isoforma com duplo 39 corte. No entanto, não se conseguiu fazer sobre géis SDS PAGE uma análise de uma quantidade suficiente para quantificar a forma dimérica de PDGF-BB. Uma análise destas fracções levada ' a cabo pelo método RC CZE descrito no Exemplo 4 indica a extensão da pureza das fracções e ajuda a fazer uma avaliação acerca de quais as fracções que contêm cada isoforma e em que quantidades relativas elas estão presentes. Por A280 demonstrou-se que o conteúdo.do conjunto dos tubos 28-30 era de cerca de 69 mg, ou 15 %, dos 4 77 mg que se haviam carregado para a.· separação, inicial. Os resultados do teste mitogénico conduzido com este material indicam uma baixa actividade e uma isoforma com duplo'corte. Uma análise destas fracções utilizando RC CZE seria então apropriada para uma determinação final das diversas isoformas isoladas, e para uma quantificação das suas quantidades.

Exemplo 3: Análise de rhPDGF-BB Não Reduzida por RP HPLC a Alta Temperatura com um Gradiente Linear

Analisou-se a substância a granel, rhPDGF-BB produzida em levedura hospedeira tal como se descreveu no Exemplo 1, numa coluna de 5 mícron, 300 Angstrom, Delt.a-Pak C3 (3,9 mm de Dl x 15 cm Comp.) utilizando uma bomba· de circulação de solvente Spectra Physics 8800 equipada com um auto injector WISP 71.2' e com um detector de sistema de díodos PE 135. .Controlou-se a temperatura da coluna utilizando um banho de arrefecimento com glicol Nesslab e um bloco de aquecimento da Jones Chromatography. A separação foi feita com um caudal de 1,2 mL/minuto 40 utilizando ura gradiente linear de 5 a 60 % de acetonitrilo/TFA a 0,1 % ao longo de 40 minutos.

Quando se analisou a rhPDGF-BB a 5°C, observaram-se seis picos distintos com diversos ombros mais pequenos. Ao aumentar a.temperatura (5°C, 20°C, 33°C, 60°C), o perfil torna-se menos bem definido. No entanto, a 60°C o pico torna-se mais bem resolvido embora os ombros ainda estejam presentes. O pico doblete que elui mais cedo. (24 minutos) observado no perfil a 5°C desaparece quando a temperatura aumenta. Para caracterizar os diversos picos gerados a 50°C, fraccionou-se a rhPDGF-BB a nível semi-preparativo. Analisaram-se estas fracções por RP HPLC . e voltou a submeter-se cada uma. delas a uma nova cromatografia, obtendo-se um perfil que demonstrava possuir quantidades significativas de·proteínas presentes em outras fracções. É portanto aparente que. existe um. equilíbrio, lento mas reversível entre as isoformas separadas a 50°C, resultando da interconvèrsão de. isómeros conformacionais de rhPDGF-BB. A isomerização da ligação Pro-Pro é provavelmente responsável pelo. equilíbrio lento entre os isómeros conformacionais da rhPDGF-BB. A análise por RP HPLC da rhPDGF-BB não reduzida foi levada a cabo utilizando uma coluna Zorbax 300SB-C18 de fase reversa (4,6 mm de Dl x 25 cm Comp.) mantida a 85°C, utilizando um gradiente linear de TFA/acetonitrilo. Este método resolveu as 21 isoformas cortadas e truncadas que se previam para a rhPDGF-BB, que saem agrupadas em três grupos principais (intacta, com corte único, e com duplo corte). . 41

Analisaram-se as fracções recolhidas em cada um dos grupos utilizando RP HPLC da rhPDGF-BB reduzida. Os resultados indicavam que os picos múltiplos em' cada grupo eram devidos a níveis diferentes de truncagem.no terminal C em Arg-32 e Thr-109. Mais tentativas de se melhorar a separação das isoformas intactas e cortadas nestes três grupos não foram bem sucedidas utilizando um gradiente linear. Portanto, uma temperatura elevada e um gradiente linear em RP. HPLC era capaz de resolver a heterogeneidade resultante das modificações pós-translacíonais . devidas aos cortes e às truncagens que ocorreram em ambas as faces da molécula, e não se observou o fenómeno de /. múltiplos isómeros conformacionais Pro-Pro a temperatura elevada

Empregou-sé então um gradiente combinado isocrático/em passos para além da alta temperatura, para se resolver a separação das isoformas. 0 gradiente em andares a alta temperatura resolveu a isoforma com duplo corte a 29 % de acetonitrilo, a isoforma com corte único a 30 % de acetonitrilo., e a isoforma intacta a 33 % de acetonitrilo. Ao contrário do gradiente linear acima, as isoformas devidas a truncagem não são resolvidas, e portanto o perfil está francamente simplificado. A separação das isoformas de rhPDGF-BB predominantemente com base nos cortes foi portánto conseguida pela combinação de gradiente isocrático/em passos a alta temperatura que se descreveu imediatamente, acima, simplificando deste modo o perfil cromatográfico grandemente, e facilitando a análise e a separação das isoformas funcionais chave de rhPDGF-BB. 42

Exemplo 4: Determinação da rhPDGF-BB por Electroforese de Zona Capilar com Cargas Invertidas Incluindo um Tratamento Prévio com Carboxipeptidase B

Testaram-se uma amostra de rhPDGF-BB produzida de forma recombinante em levedura tal como se descreveu no Exemplo 1 e um material de referência possuindo uma composição conhecida em PDGF-BB, utilizando electroforese de zona capilar com cargas invertidas (BC CZE). As amostras de interesse foram diluídas em tampão do teste contendo tampão Tris a pH 8,0 a uma concentração de 1,0 mg/mL tal como se determinou por espectrofotometria. Adicionaram-se 100 μΐ de carboxipeptidase B a 25 U/mL a 50 μΧ de amostra em teste. Passados 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicionou-se 25 μΧ de HC1 0,1 N. Preparou-se uma tabela de sequências num Ecrã de Sequências Turbochrom. Prepararam-se os reagentes desgasificados necessários para se levar a cabo o teste colocando 1500. μ]1 de cada um dos seguintes num, microtubo de centrífuga de 1700 μ!· em polipropileno: NaOH 1 N, solução regeneradora eCAP™, e tampão Tris 50 mM (pH 8,0). Submeteram-se os mic.rotubos a uma centrifugação durante 5 minutos escolhendo a velocidade mais alta disponível no pré-selêctor.

Levou-se a cabo a determinação num sistema de electroforese capilar (BioFocus 3000) configurado com a seguinte informação: preparação 1: injectar previamente NaOH, 180 segundos; preparação 2: injectar previamente AMREGEN, 180 segundos; preparação 3: injectar previamente AMRINSE 180 segundos; pressão: 2 psi*s; polaridade: 43 negativo a positivo; voltagem: 15,00 kV; limite da corrente: 50,00 μΔ; tampão de entrada: AMRUN; tampão de saída: AMRUN; temperatura do .cartucho: 25 graus Celsius; período do ensaio: 10 minutos; modo do detector no comprimento de onda único programável; e lambda (nm): 214.

Carregaram-se as amostras no BioFocus™ 3000. Seleccionou-se a detecção de pico antes do aumento no electroferograma antes do pico do duplo.corte e desactivou-se a detecção de pico depois da linha horizontal que se segue ao pico da rhPDGF-BB intacta. O electroferograma era aceitável quando a diferença entre medições. em duplicado relativas.à-mesma amostra era inferior a 10 % '

Os resultados de lotes clínicos de rhPDGF-BB, por RC CZE, indicaram que. as seguintes composições de isoformas intactas, com corte único, e com duplo corte estavam presentes em material que se destinava a utilização comercial: fabrico com corte com corte intacto duplo _único 1 47 % 31 % 22 % 2 44 % /33 % 23 % 3 45 % 33 % 2 .2 % 4 46 % 33 % 21 % 5 45 % . 33 % 22 % 6 45 % 32 % 23 %

Exemplo 5: Actividade mitogénica de isoformas com corte único, com duplo corte, e intactas, de rhPDGF-BB 44

Pode testar-se a capacidade do PDGF para estimular a síntese de ADN e o crescimento de culturas de células através da incorporação de 3H-timidina no ADN de células cultivadas que respondam a PDGF, resultando a demonstração da actividade biológica de PDGF e de moléculas semelhantes a PDGF. Descreve-se este tipo de teste na Patente U. S.. 4.849.407, e em Cook et al.r (1992) Biochem. J. 281: 57-65, que se incorpora neste documento por citação.

Crê-se na técnica que o teste mitogénico para detectar PDGF, um mitogénio, apresenta uma utilidade potencial a título de composição farmacêutica. Já se determinou anteriormente que as truncagens no terminal C não possuem qualquer efeito, em relação á actividade biológica. Também já se determinou que ao longo da gama estreita de eluição do pico, as componentes acetonitrilo e ácido trifluoroacético (ACN-TFA) da cromatografia tinham um efeito consistente sobre a determinação mitogénica.

Recorrendo a ciclos repetidos de RP HPLC não reduzido a alta temperatura obtiveram-se formas purificadas não reduzidas de rhPDGF-BB com corte único, com duplo corte e intactas. Testaram-se as formas com corte único, com duplo corte e intactas utilizando os testes de RP HPLC a alta temperatura, reduzidos e não reduzidos, e verificou-se que os graus de pureza obtidos eram respectivamente de 95 %, 97 %, 95 %. Testou-se para cada forma a sua actividade mitogénica usando o. teste apropriado. Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado usando o mesmo teste. 45

Recolheram-se as fracções de cada isoforma, e determinou-se que a isoforma com corte único tinha uma actividade de 120 %, a isoforma intacta tinha uma actividade de 100 %, e a isoforma com corte duplo tinha uma actividade de 20 %. A amostra de referência (uma cultura celular não purificada que incluía, uma mistura de isoformas intactas, com corte único, e com duplo, corte, da rhPDGF-BB) exibia uma actividade de 50 %. Isto indicava que podia ser desejável remover a isoforma com duplo corte de uma substância a granel de rhPDGF-BB a que se pretenda dar uma utilização terapêutica.

Exemplo 6: PDGF-BB para Tratar uma Ferida

Prepara-se uma mistura de isoformas de PDGF-BB, intactas e com corte único, num creme para aplicação tópica. A aplicação de entre cerca de 50 e cerca de .100 mM da mistura de PDGF-BB é feita sobre uma queimadura do terceiro grau entre 1 e 3 vezes, ao dia durante 1 mês, ou até a ferida estar curada. Levam-se a cabo procedimento padrão na aplicação dos pensos sobre as feridas de queimadura, para a administração do creme de PDGF-BB à ferida de queimadura.

Todas as publicações e os pedidos de patente, mencionados na especificação são indicativos do níveis dos especialistas da técnica à qual esta invenção diz respeito. Embora a invenção acimá tenha sido descrita em algum pormenor no.que toca à sua ilustração e aos exemplos, com o objective de proporcionar clareza e compreensão, será óbvio 46 que se podem levar a cabo determinadas alterações e modificações adentro do âmbito das reivindicações apensas.

Lisboa, 25 de Julho de 2008

Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição que inclua dímeros de PDGF-BB (rPDGF-BB) em que pelo menos 95 % dos dimeros rPDGF-BB sejam isoformas com corte único, e em que os polipéptidos rPDGF-B nos dímeros apresentem sequências nativas ou sejam polipéptidos de rPDGF-B que exibam pelo menos' 80 % de identidade de sequência com a sequência nativa dos polipéptidos rPDGF-B..

2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que os polipéptidos rPDGF-B exibam pelo menos 80 % de identidade com a sequência dos polipéptidos rPDGF-B nativos humanos.

3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, que os polipéptidos rPDGF-B exibam pelo menos 95 % de identidade com a sequência dos polipéptidos rPDGF-B nativos humanos.

4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, em que os que os polipéptidos rPDGF-B sejam polipéptidos rPDGF-B com sequência nativa.

5. Uma composição de acordo com a reivindicação 4, em que os que os polipéptidos rPDGF-B tenham as sequências de aminoácidos dos polipéptidos rPDGF-B humanos.

6. Uma . composição de acordo com qualquer . uma 2 das reivindicações anteriores, em que os polipéptidos rPDGF-BB sejam produtos de um sistema de expressão em leveduras.

7. Uma composição de acordo com a reivindicação 6, em que a célula de levedura seja uma célula de Saccharomyces.

8. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que seja uma composição farmacêutica contendo também um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico.

9. A utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no fabrico de um medicamento para tratar feridas.

10. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que as feridas referidas sejam lacerações, queimaduras, feridas cirúrgicas, lesões ósseas, feridas no epitélio ou feridas no endotélio.

11. Um método para se preparar uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 a partir de uma mistura de isoformas, incluindo o método referido partir da mistura referida e utilizá-la em cromatografia de permuta iónica, cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, ou electroforese de zona capilar de cargas invertidas, para diminuir a quantidade de isoformas não pretendidas na mistura referida e obter deste modo a 3 composição enriquecida mencionada.

12. Um método de acordo com a reivindicação 11, em que a composição referida seja enriquecida em isoformas intactas e com corte único de uma proteína dimérica PDGF-BB recombinante (rPDGF-BB) biologicamente activa.

13. Um método de acordo com a reivindicação 11, em que a composição referida seja enriquecida em isoformas com corte único de uma proteína dimérica recombinante rPDGF-BB biologicamente activa'..

14. Um método de acordo com a reivindicação 13, em que a composição referida contenha pelo menos cerca de 95 % de dímeros rPDGF-BB sob a forma de isoformas com corte único.

15. Um método para se preparar uma mistura de isoformas intactas e com corte único de uma proteína dimérica PDGF-BB recombinante (rPDGF-BB) biologicamente activa , a partir de uma mistura de isoformas da proteína referida que seja obtida a partir de uma cultura de células, em que os polipéptidos rPDGF-B na referida proteína rPDGF-BB exibam pelo menos uma identidade de sequencia de 80 % com os polipéptidos rPDGF-B com sequência nativa, incluindo o método referido carregar-se a mistura de isoformas referida sobre uma coluna de TSK sulfopropilo de cromatografia de permuta catiónica, lavar-se a mistura de isoformas'referidas a partir da coluna referida com um gradiente de eluição linear, descartar-se uma fracção 4 eluída que contenha uma isofcrma com duplo corte, e recolher-se uma fracção eluída que contenha as isoformas intactas e com um único corte .

16. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, em que os polipéptidos rPDGF-B exibam pelo menos uma homologia de.sequência de cerca de 80 % com os polipéptidos rPDGF-B humanos com sequência nativa.

17. Um método de acordo 1 com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, em que os polipéptidos rPDGF-B exibam1 pelo menos uma homologia de sequência de cerca de 895 % com·· os polipéptidos rPDGF-B humanos com sequência nativa.

18. Um método de acordo com a reivindicação 17 em que os polipéptidos rPDGF-B sejam polipéptidos com sequência nativa.

19. Um método de acordo com a reivindicação. 18, em que os polipéptidos rPDFG-B tenham a sequência de aminoácidos de polipéptidos humanos rPDGF-B.

.20. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 19, em que o rPDGF-BB referido seja produzido· numa célula hospedeira de uma levedura.

21. Um método de acordo com a reivindicação 20, em que a célula de levedura hospedeira referida seja uma célula de levedura hospedeira.Saccharomyces. Lisboa, 25 de Julho de 2008