JPS63188395A

JPS63188395A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPS63188395A
Application number: JP62018565A
Authority: JP
Inventors: Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎; Satoshi Nakamura; 聡中村; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Kenji Yone; 米　賢二; Kaku Katou; 加藤　革; Jun Suzuki; 純鈴木; Noriyuki Tsunekawa; 恒川　典之
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-01-30
Filing date: 1987-01-30
Publication date: 1988-08-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＬＪＰ
ＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

Ａｌａｌ−−アラニンＡｒｏＬ−アルギニンＡＳｎ　Ｌ−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸ＣｙＳ　Ｌ−システィンＧ１０　し−グルタミンＧ１υ　Ｌ−グルタミン酸ＧＩＶ　　グリシン）１ｉｓｌ−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシン１ｅｕｌ−ロイシンＬｙｓ　　Ｌ−リジン１ｙｌｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅＬ−フェニルアラニンＰｒｏＬ−プロリン８ｅｒ　　Ｌ−セリン ■ｈｒｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−トリプトファンＴｖｒ　　Ｌ−チロシンＶａｌ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キー１つ− シ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′）は
それぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示す
ものである。

（２）発明の背景ＣａｒＳＷｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌
を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、こ
の物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓｌ”ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、
　Ｐ　ｒｏｏ、Ｎ　ｅｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　ＳＡ、　７２．３６６６　＜
１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒト
等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しかも
種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待さ
れてきた。

最近になって、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ３ＩＩ伝子の発現について報告した（　０　、　　
ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　］　。その後、自弁ら［Ｔ　
、５ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ１３．　８０３（１９８５）　］　
、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０　
（１９８５）　］　、Ｗａｎ。

ら［Ａ、Ｍ、　Ｗａｎｇら、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　
２２８．　１４９（１９８５）　］及びＭ　ａｒｍｅｎ
ｏｕｔら［Ａ　０Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　５ｅｕｔｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、こ
す可能性のあることが示唆された。また、それ以外にも
、血管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

（３ａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｔ）、　Ｍｅｄ、　、　
　１６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［
Ｄ、　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　
　３１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されてい
る。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｖ　ｓｌｆ及びＣｙＳ／ａ／のいずれ
か又は両方の他のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への
置換（ＰＯＴ出願公開Ｗ　０８６１０４６０６号、特願
昭６ｌ−１０６１７２）　、ＧＩＶ膵の他のアミノ酸残
基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１
−２３８０４８号）、ＡＩａ　　の他のアミノ酸残基へ
の置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告されてい
る。

また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失についても、
６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦ
が細胞障害活性を有していること（特願昭６１−９００
８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性
を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦ
において極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　
０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活
性を有していること（特願昭６１−１１４７５４号）、
及び１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有してい
ること（特願昭６１−１７３８２２号）が報告されてい
る。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（）−１２Ｎ　＞　−Ｐｒｏ−ＬＶｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｐ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　
ａｌ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ
　−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｌ）−Ｌｅｕ−ＡＳｎ−Ａ
ｒＯ−Ａｒり一　　’Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌ
ａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ｇ　ｔｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　１３１Ｊ−Ａ
　ｒ（Ｊ−Ａ　Ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ｖａｔ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔ
ｙｒ−３ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ−ＩＬ　ｅｕ−
Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙＳ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ
　ｌｙ−ＣＶＳ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ
　−Ｉ　Ｉｅ−８ｅｒ−ＡｒＯ−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−Ｖ
ａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−’Ｇｌｎ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−８ｅｒ　
−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ　−Ｌ　ｙＳ−Ｓ　ｅｒ−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　
Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ＶＳ−Ｐ　ｒＯ−Ｔ　ｒｌｌ−Ｔ
Ｖｌ”−Ｇ　１ｕ−ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−ＴＶｒ−Ｌｅｕ
−ＧＩＶ−ＧＩＶ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　
５ｐ−Ａｒ（１−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−
Ｉ　１ｅ−ＡＳｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓ
ｔ）　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　ｈ
ｅ　−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ｇ　ｌｎ−Ｖ　ａｔ　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ
　Ｉｙ　−Ｉ　Ｉｅ　−１１ｅ　−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ
　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｙｌｅｔが結合しているポリペプチド、また
上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領
域を含む組換えプラスミドを提供することによって達成
され、更にかくして得られた組換えプラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用
いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる
方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医
薬組成物を提供することによって達成されることがわか
った。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、Ｐｅ
ｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの中
から適当なものを選び、それを化学合成することによっ
て取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえる
ように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を設
けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させ一つｎ− た形での翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有することが好ま
しく、その下流方向に読みとりフレームを一致させた形
での翻訳終止コドン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ＞を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“Ｓ　ｏｎｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎ　ｔＵ− Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆＢ　１ｏｌｏｏｉｃａｌ　
　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”　、Ｊｏｈｎ　　　Ｗｉ
ｌｅｙａｎｄ　　　５ｏｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）］。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、
Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分りで連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ、３　ｏ
ｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５（１９
７７）　］のようなベクターに一度クローン化した後、
それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好ま
しい。このようなヒトＴＮＦ　　・遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦＩＢＲ。

＋）ＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オ
ペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　＋ｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｐＹｓ３１Ｎ、又は
Ｉ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ″ｉ！
ｌ伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−
を付与することができる。このようなターミネータ−と
して、１ｐｐターミネータ−１ｔｒｐターミネータ−等
があげられるが、とりわけｔｒＤ　Ａターミネータ−が
好適であり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラス
ミドとして、好ましくは１１Ａ　Ａ　４１が用いられる
。この発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２
２由来のベクターにクローン化することにより、発現型
プラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラ
スミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＦＩ
ＴＮＦ４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
：こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはＤＴＮＦ４７３が用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるだめの微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・］す（［：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ
）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇ
ａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ＯｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”　、　　Ｐ　　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　３ｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎ
ｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば振とうによ−る通気、撹拌を加えながら、３７℃
で２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中
に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β
−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる
。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ｖ＋ｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　
］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペブチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉＣａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３′
側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれ
ぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制
限酵素ＣｆａＨによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳
開始］トン間を適切な状態に保った形でのプロモーター
との連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下
流には制限酵素ト１ｉｎｄｎ［による切断部位を設け、
ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３ｇ０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５ｍの溶出用バッファー［５００ｍＭ　
　ＮＨ４０Ａｃ　−１１１１ＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤ
Ｓ　（ｐＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とうし
た。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を
行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−ｓｏ）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１１本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ３ｉ
１仏子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ隻の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（１）Ｈ９，５＞　、　１０　ｍ
Ｍ　　Ｍｇ（Ｊｚ　。

５１１Ｍジチオスレイトール、１０１Ｍ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、す
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．θμグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０Ｍ文の６６１１Ｉ
ＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）　、　　６．６　
ｍＭ　　Ｍ（Ｉ　Ｃ１２゜１０１１１Ｍジチオスレイト
ール、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツト
のＴ４−ＤＮＡリガーリ１− 一部（宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を
行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染
色法により泳動パターンの観察を行なう。目的とする大
きさく約２２０ｂｐ）のバンド部分を切出して、実施例
２の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを
回収する。

一方、３μ９の大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｌｌ）を３０μ旦の１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
１，７ｗ＋ＭＭｇＣＩ２水溶液に溶解させ、１０ユニツ
トの制限酵素ＣｊａＩにューイングランド・バイオラブ
ズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

制限酵素（ＪａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０Ｍ文の５０１＋１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（ＥＩＨ７，４）　、　　１０Ｇ　１１Ｍ
　　Ｎａ　Ｃ１，１０ＩＲＭ　　Ｍ（＋８０４水溶液に
溶解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％〉
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部
分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバ
ンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏ
ｌ　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｌＯ４水溶液に溶解させ
た。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｇ　ｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、３　ｉｏｃｈｅｗ＋、ユ
０１．　３３９（１９８０）　］により、約３，７Ｋ　
ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＪａ　Ｉ”５ａｌＩ　）　ヲ７Ｍ
ｊｏ−ス）ｊルヨリ回収シた。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１−株の形質転換は、
通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのし培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ　
ｃｉ、　　ｐＨ７，２）にエシェリヒア−ｍｌすＣ６０
０ｒ１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養
液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ　１ｏｉｐ　）が０
．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウ
ム・バｙフｐ　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＪ、　５　ｍ
Ｍ　　ＭＯＣ第２゜５１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（
１）Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｍの冷したカ
ルシウム・バッファー［１００１Ｍｃａ　Ｃｊｚ　、　
２５０　１１Ｍ　　ＫＣｆ、　５　ＨＩＭｔｖｌｏ　Ｃ
１２，５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＥＩＨ７，６゜
０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容酋の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、　）混合する。この混合物を６０
分間。

０℃で保った後、１１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン
、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、　　０．０８％
グルコース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３１℃で１時
間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）３０Ｍｇ／Ｉｄを含むし培地プレート］に１
００μ旦／プレートの割合で接種する。プレ−トを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
ＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的
のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｌ））の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋｂ＋１）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｌ））を、それぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びＩ）ＴＮＦ
３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ！仏子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲ，ＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、
　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、
６５．　４９９（１９８０）　］によッテ確認した。

−９１一実施例４（ヒトＴＮＦ３１１伝子発現型プラスミドの作
成〉実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素Ｃ１ａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＲａ　
ｌ−８ａｌＩ　）をポリアクＩＪ　）Ｉｉアミドゲルよ
り回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドＤＴＮＦ２　１０
１ｔ（ｊを１００μ４１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−
ＨＣＲ（ＩＩＨ７，５＞　、　６０１＋１　Ｍ　　Ｎａ
　Ｃ９，７ｍＭＭＧＣｆ２水溶液に溶解させ、４０ユニ
ツトの制限酵素ｐｖＪ（宝酒造）を添加し、３７℃で１
時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準
じて制限酵素Ｓａ１■による切断、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦｌ伝子の一部を含む約１７０ｂｐノ
Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ＳａｌＩＨＰｖｕＩ［）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕｙもｉｏｏμｍの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ４
（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲ，７１
ＭＭ（ｌｃｆ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限
酵素Ｐｖｕｎ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄｌ［
［（宝酒造）を添加し、３７℃で１詩間切断反応を行な
った。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約１１０ｂＤのＤＮＡ断片（ＰＶｕ
ｌｒ４→ＨｉｎｄＤＩ）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド１
）ＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μグを、上記と同
様に制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部
分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ｃｐａ工４−
Ｉ　Ｈｉ　ｎｄ　ｍ　）をアガロースゲルより回収した
。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝、子の一部を含む約
２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤ
ＮＡＡ断片プラスミドＩ）Ｙ、８３１Ｎの大部分を含む
約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＱ　６００ｒ−ｒｎ
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ３
１伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２
Ｋ　ｂｌ））を有するクローンを選択した。第６図に、
そのプラスミドＩ）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示し
た。

また、上記プラスミド１）ＹＳ３１Ｎ５μｇを、上記の
方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さら
に制限酵素１−１　ｉｎｄ　、ｍで切断し、アガロース
ゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方
法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［Ｐ　ｖｕＩ［（２１−１−１ｉｎｄ　
ｍ　］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｌｌのＤＮＡ断片［ＰｖｕＭ　（２１４−＋Ｈｉｎｄ　
ｍ　］と混合し、エタ／−ル沈澱（７）後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＬＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−ト株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミドＤＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このようなプラスミ
ドは、プラスミドｐｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御領
域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクロー
ニング・サイトの下流に大賜菌ｔｒｐ　Ａターミネータ
−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであ
り、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミド１１ＡＡ４１　２μびを、上記と同様に
制限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドｐＡＡ４１の大部分を含む
約２．７Ｋ　ｂｌ）（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（（ＪａＩ
ＨＨｉｎｄｌ［Ｉ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ３を、上記と同様に制限酵
素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＣＲａ　ＩＨＨｉｎｄ　ｍ　）をポリアク
リルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０ｂ１１のＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１Ａ２０μりを、実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃ１ａＩ及び）−１ｉｎｄｌｌで切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）及び
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、そ
れぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つの
ＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｌ）、両方
共（Ｊａ　ｌ４−ＩＨｉｎｄ　ｍ　）をゲルより回収し
た。

ここで得られたヒトＴＮＦＩ伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μでの１０　ＩＩＩＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−Ｈ，Ｃｊ　（ｐｌ−１７，４）　、　１０ｍＭ　
　Ｍ（］　ＳＯ４、１１１１Ｍジチオスレイトール水溶
液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｏＴｌ　（
宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片
（Ｈａｐ■→Ｈｉｎｄｌｌ［）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ　ｌ
−１１−ｆｉｎｄ　ＩＩ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部
分ヲ含ム約３９０ｂｐ（７）ＤＮＡ断片（ＨａｐＩ［−
１（ｉｎｄＩ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、実
施例３の方法に準じて、Ｔｌ−ＤＮＡリガーゼによる連
結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じ
てエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１１−株に導入し
、形質転換株の中より目的のプラスミドρＴＮＦ４７３
（約３．２Ｋｂｔｕ）を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　＞　　　
Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａ
ｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ−
Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ
　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　
ｆｉＬｌ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ
−Ａ　ｒ（］−Ａ　ＰＬ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ−Ａ　
Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓ
ｎ　−Ｇ　１ｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　
ｒｏ−Ａ　Ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ｖ　ａｔ　−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　ｒｏ−８ｅｒ−Ｇ　ｌｕ
　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｉ　１ｅ
−Ｔｙｒ−８ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｌｙ−ＣＶＳ
−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａｌ−
Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−
Ｉ　ｌｅ　−Ｓｅｐ　−Ａ　ｒｏ　−１ｌｅ−Ａ　ｌａ
　−Ｖａｔ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　
ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅ
ｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａｌａ　−１１ｅ−Ｌｙ
ｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ　−Ａｒ’ＣＩ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　−
Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−
Ｔ　ｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐ　ｒｏ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｔｙｒ
　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａｌ　−Ｐ　ｈ
ｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　Ｉ
Ｖ−Ａ　５ｌ）−Ａｒｏ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ　−Ｉ　１ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒＱ−Ｐ　ｒＯ−
Ａ　Ｓ＋１−　Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅｔｌ−Ａ　５ｌ）−Ｐ
　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られた発現ベクターｐＡＡ４１゜ヒト
ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４０１ＮＮ又
は１１ＴＮＦ　４０１Ａ、又は実施例５で得られた、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１ｌ
ＴＮＦ４７３を有するエシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−
ｍ−株を、３０〜５０μｇ／Ｉｄのアンピシリン、０．
２％のグルコース及び４ＷＩ／＃１１！のカザミノ酸を
含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％
に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣオー０．１％ＮＨ４
Ｃｌ水溶液（ＤＨ７，４＞をオートクレーブ滅菌した後
に、別途にオートクレーブ滅菌したＭＣＩ　８０４水溶
液及び（：、ａｃ１２水溶液をそれぞれ最終濃度２ＩＩ
ＩＭ及び０．１１１Ｍになるように加える。］　　２５
０ｄに接種し、０Ｄａｏρが０．７に達するまで、３７
℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ
／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加
し、さらに３７℃で１２時間振どう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
ー（１５０１１１Ｍ　　Ｎａ　（Ｊを含む２０　ｍＭリ
ン酸バッファー、　　ｌ）８７．４）を用いて菌体の洗
浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ＩｄのＰＢＳバッフ
ァーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００
Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体
残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファー　（ｐＨａ、ａ）　、　ＳＤＳ、　２
−メルカプトエタノールぞれ最終濃度６０＋ｎＭ，２％．４％，１０％になるよ
うに加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［
鈴木．遺伝，耳，　４３　（１９７７）　］を行なった
。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ
，１”ｒｔｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７，　　６８０（１９７０）
　］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、
ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第
１０図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津，Ｃ
Ｓー９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白質
又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質
中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子発現型プラスミド＋１”ｒＮＦ４０１Ａを有す
る大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１１％のヒトＴ
ＮＦ蛋白質，新規抗腫瘍活性ポリフベプチド遺伝子発現
型プラスミドｐＬＴＮＦ２を有する大腸菌においては同
じく約１７％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、
それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミドＩＩＴＮＦ　４０１ＮＮを有する大腸菌におけ
るヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記ｐ王ＮＦ４０１Ａ
の場合の約４０％にすぎず、発現ベクター１）ＡＡ４１
の有用性が示された。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料１００μ文と、４　ｘ　１
０’個／ｌ１ｔｆｌの濃度のマウス上−９２９繊維芽細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μ文を、９
６穴の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で
混合した。なおこの際に、最終濃度１μｇ／ｄのアクチ
ノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく
。培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎
児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地
（日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％
炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養し
た後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／
ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたもの］
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを１００μ旦の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し
、その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライ
ザー（東洋側器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴ
ＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸
菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０
％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフ
（たとえば第１１図）によって求め、その希釈倍率をユ
ニットと定義する。第１１図より、発現型プラスミド　
１ｌＴＮＦ４０１ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を
含む大腸菌ライゼート　１００μすは１，５Ｘ　１０”
ユニット程度の活性を、そして充用型プラスミドｐＴＮ
Ｆ４７３にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は約５．７Ｘ　１０
５ユニツト程度の活性を、それぞれ有していることが明
らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
ＤＴＮＦ４７３にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量は、
プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ランド）を用
いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検稜線より計
算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白質定
量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドの比活性を計算したところ、表１のような値が得
られた。表１より、新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒト
ＴＮＦ蛋白質の約５倍の比活性を有していることがわか
る。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドＩ）
ＴＮＦＩＢＲ，ＩＩＴＮＦ２Ｎ及びｌ］ＴＮＦ３の作成
方法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮ
Ｆ遺伝子発現型プラスミド１１Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　
Ｎの作成方法を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４
１の作成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ３ｉ伝子発
現型プラスミド１）ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それ
ぞれ示したものである。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４７３の作成
方法を示したものである。第１０図はヒトＴＮＦｌ仏子
及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果
を示したものである。第１１図はヒトＴＮＦ蛋白質及び
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したも
のである。特許出願人　帝　人　株　式　会　社羊　鉢　補　壬　書　【方式）昭和６２年２月め日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４７３である
第３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする第７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。