JPS63226297A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された絹換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。 本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。 Ａｌａｌ−−アラニン Ａｒｇ　Ｌ−アルギニン ＡＳｎｌ−−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｑｌｎ　　Ｌ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ）１ｉｓｌ−ヒスチジン ＝１１− １１ｅｌ−イソロイシン １−ｅｕｌ−一ロイシン ＬＶＳ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メヂオニン ｐｈｅｌ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−プロリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒｌ−−スレオニン Ｔｒｐｔ−−ｔ−リプトファン ＴＶｒ　　Ｌ−チロシン ｖａＩ　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオヂドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。 Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ＞はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルホ
キシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。 （２）　　発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓｉｓ［ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら
、　ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ。 Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６
６６　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサ
ギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に
、しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用
が期待されてきた。 最近になッテ、ｐｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒト丁Ｎ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ１
ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　ぢ３１２．　７２４（
１９８４）　］　ｏその後、白井ら［Ｔ、　５ｈｉｒａ
ｉ　ら。 Ｎ　ａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３　（Ｉｎ５）
コ、完封ら［完封ら、癌と化学療法、　ｉ２．　１６０
＜１（１８５）　］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８
５）　　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ
　ａｒｍｅｎｏｕｔら。 Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、〜 ヒトＴＮ　Ｆａｌｌ伝了の大腸菌における発現について
相ついで報告している。 このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。 ３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果どし−Ｃ高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。 Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｌｌ、　Ｍｅｄ、、　　１
６２．２１６３（１９８５）コ、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ
，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９
．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。 一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。 このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。 ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、（：、　ｙ　ｓ　′９及びＣｙ　ｓ　／
／／のいずれか又は両方の伯のアミノ酸残基への置換（
ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６１
−１０６７７２＞　、Ｇ　１ｙ／”の他のアミノ酸残基
への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−
２３８０４８号）。 ＝１５− Ａ１ａｉ？の伯のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−
２３３３３７号）が報告されている。また、アミン末端
側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５
０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜１
０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、そ
の比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大にな
ること（ＰＣＴ出願公開Ｗ　０１１６／　０２３８１号
）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦがｍ胞障害活性を有してい
ること（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１１アミ
ノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願
昭６１ｉ７３８２２号）が報告されている。 そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。 （３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。 本発明の伯の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。 本発明の更に伯の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。 本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。 （４）　　発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　）　−Ａｒ（１−ＬＶＳ−Ａ「Ｏ−ＬＶＳ　
−Ｐ　ｒｏ−Ｖ　ａｔ　−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａ
ｌ−Ｖ　ａｔ　−Ａ　１ａ−Ａ　５ｎ−Ｈｉｓ　−Ｇ　
Ｉｎ−Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　−Ｌ　
ｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ａｓｎ−Ａ　
ｒａ　−Ａ　ｒｑ＝Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−ｌｅｕ−
１−ｅｕ−Ａｌａ　＝へ５ｎ−Ｇ１１７＝Ｖａｌ−ＧＩ
Ｕ−１−ｅｌＪ−Ａｒ（１−Ａｌｌ−ＡＳｎ−Ｇｌｎ−
１−ｅｕ−■ａｌ−Ｖａｌ−ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｇ　ｌｙ　−１−ｅｕ　−Ｔｙｒ　−１−ｅｕ　−１１
ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ　−
Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　−１１ｅ
−３ｅｒ−Ａｒｒ＋−（１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ　−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｖ　ａｌ−
Ａ　ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｃｒ　−Ａ　Ｉａ
　−Ｔ　　ｌｅ−Ｌ　ｙｓ−Ｓ　ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｃｙ
ｓ−Ｇ　１ｎ−Ａ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉ
ａ＝　Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉ
ｕ−ＰｒＯ−１１８−’ｌｒ−Ｌｅｕ−ＧＩＶ−ＧＩＶ
−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｕ−
Ｌ　ｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ＝Ａｒｉ　Ｌｅｕ−８ｅ
ｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｇ　−Ｐ
　ｒｏ−Ａ　５ｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　５ｐ−
ｐ　ｈｅ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−８ｃｒ−Ｇ　ｌｙ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔ　ｖｒ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｙ　−
１ｌｅ　−１１ｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−（ＣＯ
Ｏｌ−１） で表わされる新規抗１１！瘍活性ポリペプチドまたはそ
のアミン末端にｖｅｔが結合したポリペプチドを提供り
−ることによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラス
ミドを提供することによって達成され、更にかくして得
られた組換えプラスミドによって形質転換された組換え
微生物細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫
瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供するこ
とによって達成されることがわかった。 以下本発明について更に詳細に説明する。 （△）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦＪ伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［０、ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒト王ＮＦ！仏子の設訂に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。 また、ヒトＴＮＦ遺伝子をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みどりフレームを一致さけた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。 ＴＡＧまたはＴ△△）を有することが好ましい。 上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。 さらに、このヒトＴＮＦＩ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦＭ伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。 上記のように設計したヒトＴＮＦｍ仏子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分

【プて、
それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結
する方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの
合成　−法としｒ　ハシエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏ
ｒａｎａ。 “ｓｏｍｅ　　Ｒｃ’ｃｅｎｔ　　ｏｅｖｅ＋ｏｐｍｅ
ｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ　ｈ
ｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆＢ　１ｏ
ｌｏｏｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”　、　
　Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　　５ｏｎｓ
　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６
１）］。 トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｉｌｅｒ
ら、Ｊ。 Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）コ及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａｔ
ｔｅｕｃｃｉら。 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マ］・グラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用い
ることができる。 こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水１ｇを、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレＡヂドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｑｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックの［）ＮＡｌｌｉ片を連結す
る方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成
するブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好
ましくはｐＴＮＦｌＢＲ。 ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。 上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒＤプロモーター）。 ラクトース・オペロン・プロモーター（ＩａＣプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＩ）ＹＳ３１Ｎ、又
はＩＩＡ　Ａ　４１が用いられる。 さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮ「遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
】−ることができる。このようなターミネータ−どして
、１ｐｐターミネータ−１ｔｒｐターミネータ−等があ
げられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適
であり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミド
として、好ましくはｐＡ△４１が用いられる。この発現
型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２２由来のベ
クターにクローン化することにより、発現型プラスミド
が作成できる。ヒトＴＮＦＷ伝子発現型プラスミドとし
て、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＩ）Ｔ　Ｎ　Ｆ
　４０１Ａが用いられる。 （Ｆ３）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン
化； こうして得られたヒトＴＮＦｌ伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦｌ仏子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオヂドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４６８が用いら
れる。 （Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦｌ伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。 Ｑｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。 このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”　、　ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ−１ａｒｂＯｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅ
ＶＩ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で
２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。 培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼー１へ中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以
下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白
質を適当な方法を用いて染色する。 発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦＩ仏子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。 このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌら。 前出〉、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。 １　ｍｍｕｎｏｌ、、１２６．　２３５（１９８１）　
］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。 かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。 以下、実施例を掲げて本発明についで詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１（ヒトＴＮＦ！仏子の設計） 第１図に示した１１配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐｅｎｎ１ｃａら［Ｄ。 ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、ぢ３１２．
　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′
側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をイれ
ぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制
限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳
開始１１２間を適切な状態に保った形でのプロモーター
との連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下
流には制限酵素１−１ｉｎｄｌ［［による切断部位を設
け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにし
た。 実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮ　［遺伝子は、第２図に示したように
１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴ
ヌクレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド
・バイオシステムズ。 モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。 すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル淵２
８一 度２０％）の後、紫外線シャドウィング払により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５ｄの溶出用バッファー　［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ　
（＋１＋−１７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。 なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をは
かった。 実施例３（化学合成ヒトＴＮＦｍ伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７＞を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。 ０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮｒ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツ１〜の
Ｔ４−ポリメクレオチドキナーゼ（Ｅ。 Ｃｏ１１１３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々
にリン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μすの５０
＋１１ＭＴｒｉＳ　ＨＣＲ（ｐｌ−１９，５）　、　１
０　ｍＭ　　ＭＣ１ＣＲ２。 ５　ｍＭジチオスレイトール、ＩＯＩＩＩＭ　　ＡＴＰ
水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後
、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合
し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌ
クレオヂドキナーゼを失活、除去する。 この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μびの合成オリゴヌクレオヂドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０°Ｃで５分間加熱した後室温まで
徐冷して、アニーリングを行なう。 次に、これを減圧乾固した後に、３０μρの６６　ｍ１
ｙｊＴｒｉｓ−１−１（Ｊ　（１）Ｈ７，６）　、　　
６．６１１１Ｍ　　Ｍ（ｌ　Ｃ９２゜１０　ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００
ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、
１１℃で１５■）間連結反応を行なった。反応終了後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により泳動パターン
の観察を行なう。目的とする大きさく約２２０ｂｌ’）
　）のバンド部分を切出して、実施例２の方法に従って
ポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。 一方、３μ９の大賜菌用プラスミドＦＩＢＲ３２２（約
４．４Ｋｂｌｌ）を３０μρの１０　＋ｎＭＴｒｉｓ−
）−Ｉ　ＣＲ（１１）ｌ　７，５）　、　６０　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃｆ、　７　ｆｆ１ＭＭ（ｌｃＪｚ水溶液に溶
解させ、１０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイング
ランド・バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切
断反応を行なった。 制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。 エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ夏の５０１１１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＲ（１）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　ＣＬ　１０ｍＭ　　Ｍ（＋８０４水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、アガロ−スゲルミ気泳動（ゲル濃度０．８％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パターン
の観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部分を
含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
／Ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯ４水溶液に溶解させた。 Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。 Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｔ　、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、　　ｉ
ｔロー、３３９（１９８０）　］により、約３，７Ｋ　
ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＣＲａ　Ｉ　Ｈ８ａｌＩ　）をア
ガロースゲルより回収し１こ　。 先に得られたヒトＴＮＦｍ転子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。 エシェリヒア・コリｃ　ｅｏｏｒ−ｍ−株の形質転換は
、通常のＣａＣ９２法（Ｍ、　Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのＬ培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ　
（Ｊ、　　ｔｌＨ７，２）にエシェリヒア　−］すＣ６
Ｃ６００ｒ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む
培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｒｏ）が０．３
に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・
バッファー　［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＬ　５　　ｍＭ　
　ＭｇＣＲ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐｌ
−１７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄの冷したカル
シウム・バッファー［１００ｍＭＣａ　Ｃ１２、２５０
ｍＭ　　ＫＣＲ，５１１１ＭＭ（ｌ　ＣＲ２，５ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ｌ−１ＧＢ　（ｐｔ−＋　７．６゜０°Ｃ
）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。 次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。 ０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％Ｉｌ？母エキス、１％ＮａＣＲ２０，０８％グ
ルコース、　　１１Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時
間振とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）３０Ｈｇ／ｄを含むし培地プレート］に１０
０μ交／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃
で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたア
ンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤ
ＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的の
プラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ）の取得
を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作
成方法を示す。 以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（約
２．４Ｋ　ｂｐ＞を、それぞれ作成した。第４図及び第
５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成
方法を、それぞれ示す。 こうして得られたヒトＴＮＦｍ転子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、　
Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。 実施例４（ヒトＴＮＦ）ＩＩ伝子発現型プラスミドの作
成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及び３ａＢ
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦｍ転
子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（ｃＢａ　ｌ
−８ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。 次に、実施例３で得られたプラスミド１）ＴＮＦ２　１
０μｙを１００μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
９（ｐＨ７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　（Ｊ、　
７　ｍＭＭｏＣｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時
間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じ
て制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準
じて、ヒトＴＮＦｍ転子の一部を含む約１７０ｂｌ）の
ＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕｌＩ）をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。 また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３’ＩＯ
，ｃｚｇも１００μＪｌ！の１０　ｍ１ｖｌ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ９（ＩＩＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ
　Ｃ９，７ｍＭＭ（１（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユ
ニツトの制限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素
Ｈｉ口ｄＩ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切
断反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて
、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１ｉｏｂｐのＤＮＡ
断片（ＰｖｕｌＩ←＋１−ｆｉｎｄ　Ｉ［［）　ヲホ＋
）７’ｙ’））Ｌｔ７ミトゲルより回収した。 一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ＣＢａ■及びｌ−１ｉｎｄｌ［ｌで切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じで、プラスミド１）ＹＳ３ＩＮの大
部分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ”
Ｈｉｎｄｅｒ）をアガロースゲルより回収した。 こうして得られた、ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　ｉＷ仏子の一部を
含む約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３
つのＤＮＡ断片とプラスミドＥＩＹＳ３１Ｎの大部分を
含む約４，７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔｌ−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じて■シエリヒア・］す（：、　］６００
ｒ−ｍ−に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮ
Ｆ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５，
２Ｋｂ１１＞を有するクローンを選択した。第６図に、
そのプラスミドｌ］ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示し
た。 また、上記プラスミドｐＹｓ３ＩＮ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さらに
制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断し、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準じ
て、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮ
Ａ断片［ＰｖｕＩＩ（２）”Ｈｉｎｄ　ｍ　］　ヲアガ
ロースゲルより回収した。 次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［Ｐｖｕ■（２）→Ｈ＋ｎｄＩ［［］と
混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて
、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反
応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・］す
Ｇ　６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＩＩＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有
するクローンを選択した。このようなプラスミドは、プ
ラスミド＋１１ＹＳ３１Ｎからコピー数制御領域除去し
、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニング・ザ
イ１への下流に大腸菌ｔｒｌ’ｌ　Ａターミネータ−を
付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、
第７図にその作成方法を示した。 このプラスミドｐＡＡ４１　２μ９を、上記と同様に制
限酵素Ｃ９ａＩ及びｈｌｉｎｄｌ［［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドｌ）Ａ　Ａ　４１の大部分
ヲ含ム約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａｍ、−。 １−ｌ　ｉｎｄ　ｍ　）をアガロースゲルより回収した
。 また、先に得られたヒトＴＮＦｌ包子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵
素ＣｆａＩ及び１」１ｎｄＩ［ｌで切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦＩ伝子全域を含む約４９０
ｂ１１　（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片＜ＣＲａ　Ｉ　”Ｉ」
ｉｎｄ　ｍ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。 こうして得られた、プラスミド１１Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約１０ｂｐの［）ＮＡＡ断片を混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　遺伝子をより効率良く発現させる能力
を有しており、第８図にその作成方法を示した。 ３９一 実施例５（新規抗肝癌活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたと１−ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドＩＩＴＮＦ４０１Δ２０μグを、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣｊａＩ及び１−１ｉ同■で切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動くゲルｍ度０．８％）の後、それぞ
れ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮ
Ａ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋ　ｂｐ、両方共Ｃ
アａ　ＩＨｔ」ｉｎｄ　［１）をゲルより回収し　ｌこ
　。 ここで得られたヒト丁ＮＦ遭伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μμの１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ（ＦＩＨ７，４）、　１０ｍＭ　　ＭＯ８Ｏ４，
１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０ユニ
ツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を添加して、３７
℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実
施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含
む約３９０ｂρのＤＮＡ断片（ｔ−ｌａｐ■←Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、）をポリアクリルアミドゲルより回収した。 また、第９図記載の塩基配列を有するＡリボヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。 精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオヂドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、ＴｉＤＮＡ
リガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、得られた２重鎖オリゴヌクレオヂドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＲａ　Ｉ
　＋−＋Ｉ」ｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大
部分を含む約３９０ｂｒｌのＤＮＡ断片（ト１ａＤＩＩ
’−’Ｈｉｎｄｌ［Ｉ）と混合し、エタノール沈澱の後
、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−［）ＮＡリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法
に準じてエシェリヒア・コリＣＧＯＯｒ−ｍ−株に導入
し、形質転換株の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４
７２（約３．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した
。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（８２Ｎ　）　
　−ＡｒＯ１−ｙｓ−ＡｒＱ　−Ｉ　　ＭＳ−Ｐ　ｒｏ
　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−１−１ｉｓ　−Ｖａｔ−Ｖａ
ｌ　−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ　−Ｈ１ｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　
１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ−
Ｇ　ｌ！１−　Ｔ　ｒＬ−Ｌｅｕ−ＡＳｎ−Ａ　ｒｉ　
Ａ　ｒ（１−Ａ　Ｉａ　−Ａ　５ｎ−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ＩＶ
　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　１ｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒｏ−Δ５
ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｐｒ
ｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−
Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｖｒ−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　
ａｌ　−Ｌ　ｅｌｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　＋ｙ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ＩＶ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−８ｅｒ−’Ａ　ｒｇ−Ｉ　ｌｅ　
−Ａ　１ａ−Ｖａｔ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ
　ｅｕ−８ｅｒ　−Ａｌａ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ
−Ｐｒｏ−（、ｙｓ−Ｇｌｎ　−Ａｒ（１−Ｇｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−ＧＩＬＩ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　−Ｇ　Ｉｕ
−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ
　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−１ｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｎ−Ｌ　ｅｕ−
Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｇ−
Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　１ｕ−１１
ｅ−△５ｎ−Ａ　ｒ（１−Ｐ　ｒｏ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　
Ｖｒ　−Ｌ　ｅｕ−△５ＦＩ−Ｐｈｅ−△１ａ−Ｇ　Ｉ
ＬＩ−Ｓ　ｅｌ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　ＩＬ−Ｖ　ａｌ−Ｔ　
Ｖｒ−Ｐｈｅ　−Ｇ　ＩＶ−Ｉ　１ｅ−Ｔ　ｌｅ　−Ａ
　ｌａ　−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。 実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクター１）ＡＡ４１゜ヒ
トＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｌ’１ＴＮＦ４０１Ｎ
Ｎ又はＩＩＴＮＦ　４０１Ａ、又は実施例５で得られた
、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子弁用型プラスミド
ｐＴＮＦ４７２を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／Ｉｄのアンピシリン、０
．２％のグルコース及び４１１１ｆｆ／ｄのカザミノ酸
を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ｔｌＰＯ４−０，
３％に２１１ＰＯ，＋　−０，０５％ＮａｃＲ−０，１
％ＮＨ４ＣＲ水溶液（１）ｌ−１７，４）をオートクレ
ーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭ（
］ＳＯａ水溶液及びＣａＣＲ２水溶液をそれぞれ最終濃
度２＋ｎＭ及び０．１　ｍＭになるように加える。］　
　２００Ｉｎｌに接種し、ＯＯｉ＃ρが０．７に達する
まで、３７℃で保とう培養を行なった。次いで、最終濃
度５０μｇ／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養
液中に添加し、さらに３７℃で１２時時間上う培養を続
けた。 遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲを含む２０　ｍＭリン
酸バッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０戒のＰＢＳバッファー
に懸濁させ、超音波発生装置（久保田、２００Ｍ型）を
用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の除
去を行なった。 得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊバッファ　　（Ｄｆ（６，８）　、　ＳＤＳ、　
２−メルカプトエタノール ぞれ最終濃度６０ｍＭ，２％，４％，１０％になるよう
に加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴
木，遺伝，　３１．　４３（１９７７）　］を行なった
。 分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。 Ｔ　ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ
。 Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７，　　６８０　（　１９７０）
コを用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ラット）で染色し、ヒ
トＴＮＦｌ転子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１
０図に示した。 なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナー（島津．
ＣＳ−９３０型）にかけて、産生きれたヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗ＩＩＩ瘍活性ポリペプヂドの大腸菌細胞質
蛋白質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒ
トＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１Ａを
有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１９％のヒ
トＴＮＦ蛋白質，新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４７２を有する大腸菌におい
ては同じく約２５％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産
生が、それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦｍ伝子発
現型プラスミドｌ）ＴＮＦ　４０１ＮＮを有する大腸菌
におけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記ρＴＮ　Ｆ
４０１△の場合の約４０％にすぎず、発現ベクター　１
ＩＡＡ４１の有用性が示された。 実施例７（活性の評価） ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活
性測定は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった。すなわ
ち、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫
瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートを順次培地
で希釈した試料１００μｐと、４　Ｘ　１０６個／ｄの
濃度のマウスＬ−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−
９２９）懸濁液１００μ磨を、９６穴の組織培養用マイ
クロプレート（コースタ−）内で混合した。なおこの際
に、最終部ｌｆ１μｇ／ｄのアクチノマイシン０（コス
メケン。 萬有製薬）を添加しておく。培地としては、５％（ｖｏ
ｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニ
マム・エッセンシャル培地（日本製薬）を用いた。上記
マイクロプレートを、５％炭酸ガスを含む空気中、３７
℃で１８〜２０時間培養した後、クリスタル・バイオレ
ッｉ〜溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メタノール水溶
液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・バイ
オレットを溶解させたちの」を用いて生細胞を染色した
。余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥した
後、残ったクリスタル・バイオレットを１００μすの０
．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｍにおける
吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋側器、ＥＴＹ−
９６型）で測定する。この吸光疾は、生き残った細胞数
に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を
加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ラ
イゼートの希釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によ
って求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１１
図より、発現型プラスミドＤＴＮＦ　４０１Ａにコード
されるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１０
０／、（旦は８．９×１０４ユニツト程度の活性を、そ
して発現型プラスミドｒｌＴＮＦ４７２にコードされる
新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート　
１００μρは３．５×１０５ユニットの活性を、それぞ
れ有していることが明らかになった。 実施例６で得られた発現型プラスミドＤＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
ｌ１ｌＴＮＦ４７２にコードされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量
は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラッド）
を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線よ
り計算した。上記で得られた発現但、活性の値及び蛋白
質定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値
が得られた。表１より、新規抗腫瘍性ポリペプチドはヒ
トＴＮＦ蛋白質の約３．１倍の比活性を有していること
がわかる。 −４８＝ 表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ボリ
ペプブ十′の比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　遺伝子の一部を有するプラスミ
ドｒｌＴＮＦ１１１Ｒ，１１１’ＮＦ２Ｎ及びρＴ　Ｎ
　Ｆ　３の作成り法を、イれぞれ示したものである。第
６図はヒトＴＮＰ遺伝子発現型プラスミドＤＴ　Ｎ　Ｆ
　４０１Ｎ　Ｎの作成方法を、第７図は発現ベクター１
’ｌＡ　Ａ　４１の作成方法を、そして第８図はヒトＴ
Ｎ［遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４０１Ａの作成
方法を、それぞれ示したものである。第９図は新規抗肺
瘍活性ポリペブヂド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ
４７２の作成方法を示したものである。第１０図はヒト
ＴＮＦｍ伝了及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現結果を認定したゲル電気泳動の写真を示したもので
ある。第１１図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性
ポリペプチドの活性測定結果を示したものである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリ ペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４６８である
   第３項記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする第７項記載微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。