JPH01277488A

JPH01277488A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH01277488A
Application number: JP63104222A
Authority: JP
Inventors: Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎; Satoshi Nakamura; 聡中村; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Kenji Yone; 米　賢二; Kaku Katou; 加藤　革; Jun Suzuki; 純鈴木; Noriyuki Tsunekawa; 恒川　典之; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-04-28
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 1989-11-07
Anticipated expiration: 2010-10-25
Also published as: EP0340333A2; US5028420A; DE3875108D1; DE3875108T2; EP0340333A3; JPH0797997B2; EP0340333B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）　　産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡａｉｉｉｆｆｉを含む組換えプラスミ
ド、該プラスミドによって形質転換された粗換え微生物
細１１ａ及び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペ
プチドの製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性
を有する新規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドと略すこともある）、該ポリペプチドをコード
するＤＮｌへ領域を含む粗換えプラスミド、該プラスミ
ドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該微生
物細胞を用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法
に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａｌ−アラニンＡｒ（ＩＬ−アルギニンＡＳｎ　Ｌ−アスパラギンＡＳＤＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧ１ｎ１−−グルタミンＧＩＩＩＬ−グルタミン酸Ｇｌ’／　　グリシン１−１ｉｓｌ−−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシンＬｅｕ　　Ｌ−ロイシンＬｙｓ　　Ｌ−リジン１ｖｌｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅＬ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−プロリンＳｅｒ　　Ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｌ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを溝底する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル醒を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）ざらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）　はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカル
ホキ’ｌ　　２− シ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３′）
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。

（２１発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、
　ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＩＪ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６
６　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、ｌ揚細胞に特異的に、
しかも種な越えて瀬くことから、１ｉＩＩ癌剤としての
利用が期待されてきた。

最近になッテ、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次溝造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦｉ伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　］　。その後、白井らＣＴ、　
３ｈｉｒａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ、二、　　８０３　（１９８５）　］　、
宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０（１
９８５）　］　、Ｗａｎｑら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａら、　
３　ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８５＞
　　１及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　（ｙｉ　
ａｌ’１ｌｌｌＪＱＩＪｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２，５１５
（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ選伝子の大腸菌におけ
る発現について相ついで報告している。

このようにｍ伝子操作技術を用いることによって、耗牌
なヒトＴＮＦ蛋白質が多重に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類叡しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１ら、　　５５２（１９３５＞　］　、カケクチンが
リポプロティン・リパーゼ阻害活性を何することから、
ＴＮＦ（７）投与により旧中のトリグリセリド巾か増大
し、その結果として高脂血症のような副作用を引き起こ
す可能性のあることが示唆された。また、それ以外にも
、血管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａ１ｌｌｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　、ユ
６２．２１６３（１９８５＞　］　、骨吸収作用［Ｄ、
Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌ　ｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遭伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を池のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質をｌ！ｌ　Ｍする研究
が、数多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、ｃｙｓ’及びＣ’／Ｓ”’のいず机か又
は両方のアミノ酸残基の池のアミノ簾残Ｍ　ヘノ置換（
ＰＣＴ出願公ＩＭＩ　Ｗ　Ｏｆｌ１３／　０４６０６号
、特１頚昭６ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　ｌ’／／′の
池のアミノ酸残基への買換（特開昭６１−１０６７７２
号、特願昭６１−２３３０４８号）、Ａｌａ”の他のア
ミノ酸残基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が
報告されている。また、アミン末端側のアミノ酸残基の
欠失についても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性
を有していること（特開昭６１−５０９２３号）、７ア
ミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特
願昭６１−９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮ
Ｆが細胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８ア
ミノ遠欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願
公開Ｗ　０８Ｇ／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失
ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１−
１１４７５４号）、及び１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞
障害活性を有していること（特願昭６１−１７３８２２
号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上９反
応スペクトルの広域１ヒ、副作用の低減（ヒ等を目的と
して、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行な
い、本発明を完成するに至った。

（３）　　発明の目的本発明の目的は、新規抗暉湯活性ポリペプチド−１［’
３− を提供することにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生＊ｉ
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（Ｈ２Ｎ＞　　Ａｒ（Ｊ　　ｔ−ｙｓ　　ＡＮＩ　　Ｌ
ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　
−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｎ　　Ｐｒｏ
−Ｑｌｎ−Ａｌａ−Ｑｌｌｌ−ＧＩＶ　　Ｑｌｎ−１ｅ
ｕ−ＧＩｎ−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｑ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｎ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ　−Ａｓｎ　−Ｇ　　ｌｙ　−Ｖ　
ａｌ　−Ｇ　　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ−△　ｒｇ−△　Ｓｐ
−△　Ｓｎ−〇Ｉｎ−１ｅｕ−Ｖａｌ−１／ａｌ−Ｐｒ
ｏ−３ｅｒ−Ｇｌｌｌ　−Ｇ　ｌｙ−１ｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−■　ｌｅ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　１ｎ−Ｑ　
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−３ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−
Ｖ　ａｌ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈ
ｒ−（ｌｅ−５ｅｒ−Ａｒａ−ｒ　１ｅ−Ａ　１ａ−Ｖ
ａｔ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−Ａ　ｓｎ−１ｅｕ−１ｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｉ
　　ｌｅ−１ｙｓ−Ｓ　ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−ＣＶＳ−Ｇ　
Ｉｎ　−Ａ　ｒｑ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　口ｈ
　−Ａ　１ａ−１−ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ
ＩＩＪ−Ｐ　ｒｏ　−（ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｇ　ｌｙ　−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　−ＧＩｎ−１ａｕ
　−Ｇ　ｌｕ　−１ｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ａ　Ｓｔ）　−
Ａ　　ｒり　−Ｌ　　ｅｕ　−Ｓ　　ｅｒ　−Ａ　　ｌ
ａ　−Ｇ　　Ｉｎ　−丁　１ｅ−Ａｓｎ　−Ａｒｑ　−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｎ−
Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒ−Ｐｈｅ−ＩＢｌｙ−Ｔｌｅ−１１
ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（Ｃ○○１１　）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｖｌｅｔが結合しているポリペプチド、また
上記折規抗腫湯活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領
１或を含・む組１負えプラスミドをｌ是１共することに
よって達成され、更にかくして得られた組換えプラスミ
ドによって形質転換された組換え微生物細胞、その微生
物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を産生する方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
含有する医薬組成物を提供することによって達成される
ことがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺１云子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺
伝子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、
　Ｐ　ｅｎｎｉＣａら、前出］を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取前できる。ヒトＴＮＦｉ伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致さヒ’ｆ　　９− た形での翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有することが好ま
しく、その下流方向に読みとりフレームを一致させた形
での翻訳終止コドン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴ　Ｎ　Ｆ　ｉＨ伝子は、その上流及
び下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることによ
り、適当なベクターへのクローン化が可能になる。この
ようなヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示
した。

上記のように設計したヒトＴＮＦｉ伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［、Ｈ、Ｇ　、　Ｋ　ｈｏｒ
ａｎａ。

”　　３０ｍｅ　　　　Ｒｅｃｅｎｔ　　　　Ｄ　ｅＶ
ｅｌＯｐｍｅｎｊＳ　　　　ｉｎ−２０＝Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ
　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆＢ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　　　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　　”　、Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ
　１ｌｅｖａｎｄ　　　　３ｏｎｓ　　、　　　■　ｎ
ｃ、、　Ｎ　ｅｗ　　　Ｙｏｒｋ　　　（１９６１）　
　コ　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Δｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　１−ｅｔｔ、、　２１．　
７１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操
作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成薇を用いたホ
スファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌ
クレオチドの精製は、ゲル虜過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル゛電気泳動、逆相カラムによる高速液体
クロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用
いることができる。

こうして得ら机だ合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水醒基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
３　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　　、　　２．　９
５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化
した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方
法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成する
ブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好まし
くはρＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ選（公子を
構成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当な
プロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガー〕）配列
の下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることが
できる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファ
ン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＤＹＳ３１Ｎ、又は
ｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−９ｔｒｐターミネータ−等があげ
られるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドと
して、好ましくはＤＡ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦｉ伝子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２由来
のベクターにクローン化することにより、発現型プラス
ミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺ｆｘ子発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮＦ
４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦｉ伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で明所し、ヒトＴＮＦ還伝子内の特定な
領域を除去した後、ｊ箇当な２　＋、”）− 塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた遺伝
子の修復を行なう。かかる手法を用いることにより、ヒ
トＴＮＦ蛋白質中の任意のアミノ酸を他のアミノ酸に置
換したり、付加したり、または欠失させた形の新規抗腫
瘍活性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現型プ
ラスミドの作成が可能になる。このような新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドとして、好まし
くは１）ＴＮＦ４７１が用いられる。

Ｃ）発現確認及び活性評価；１−ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペ１、シ
ては、大腸菌、枯草菌、酵母等があげられるが、とりわ
け大腸菌［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　
Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）コを用いて、
微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００
ｒ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができる
。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎａ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎｑ
Ｈａｒｂｏｒ　　　　　１−ａｂｏｒａｊｏｒｙ　　、
　　　ＩＮｃ！Ｗ　　　Ｙｏｒｋ　　　（１９８２）参
照］があげられ、必要に応じて、たとえばアンピシリン
等を添加するのが望ましい。培養は目的の粗換え微生物
に適した条件、たとえば搬とうによる通気、撹拌を加え
ながら、３７°Ｃで２〜３６時間行なう。また、培養開
始時または培養中に、プロモーターを効率良く機能さＵ
る目的で、３−β−インドールアクリル酸等の薬剤を加
えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン醒バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生１カ細胞のライゼートを得る。得られた
ライゼート中の蛋白質を、ラウリルｌ１ｌｉｔｌナトリ
ウム（以下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアク
リルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル
中の蛋白質を３通貫な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦｉ伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

マウスに移植した１ｙ１８ｔｈＡ肉腫を壊死させる効果
を見るｉｎ　　ｖｉｖｏ活性１’ｌ定法（Ｃａｒｓｗｅ
ｌ　ｌ　ら。

前出）、マウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

Ｔ　ｍｍｕｎｏｌ、、１２６．　２３５　＜　１９８１
）　］等により行なえる。

じトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ボｌ）ペプチドの
大腸菌ライセードからの分離・精。

製は、公知の通常知られている蛋白質の分出１１・精製
法に従えばよいか、ヒトＴＮＦ蛋白質等に対する抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
有利でおる。なかでも、ヒトＴＮＦ蛋白質等に対するマ
ウス・モノクローナル抗体を用いたアフィニティー・カ
ラム・クロマトグラフィーがとりわけ好適である。こう
して得られたヒトＴＮＦ蛋白質及びｆｒ規抗腫瘍活性ポ
リペプチド精製品を用いることにより、ｉｎ　ｖｉｖｏ
抗癌活性（前出）及び副作用に関する検討が可能となる
。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ＶｉｔｒＯ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことかできる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペブチ−２７−■− ドを得ることが可能になり、この新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを用いることによって抗＠瘍のためのすぐれた医
薬組成物を提供することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［０゜ｐｅｎｎ
ｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
＜１９８４）　　コの報告したヒトＴＮＦ前駆体ｃＤＮ
△の構造遺伝子部分の塩基配グ１を基盤として、適当な
制限酵素による切断部位をｊ箇当な位置に設け、５′側
に翻訳開始コドン（△ＴＧ）を、そして３’ｆｆ１１１
に２ｇの翻訳終止コドン（ＴＧ△及びＴへへ）をそれぞ
れ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限
酵素Ｃ２ａ工による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開
始コドン間をｊＡ切な状態に１呆った形ての−２７−■
− プロモーターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳
終止二トン下流には制限酵素）−１ｉｎｄＩＩＩによる
切断部位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結で
きるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦｉ伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成に（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８〇八）を用いて、ホスファイト法により行な
った。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド・
バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。す
なわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水溶
液を５５°Ｃで一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保ｉ
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７　
ｔｖｌ　ＨＭを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル菌度２０％）の箆、紫外線シャドウィング法により
泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバン
ド部分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を
細かく破砕した後、２〜５戒の溶出用ハッ７ア−［５０
０ｍＭ　　ＮＨＪ　ＯＡｃ　−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１
％ＳＤＳ　（ＩＩＨ７，５＞　］を加え、３７℃で一晩
撮とうした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相
の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含
む溶液をゲル′ａ過カラムくセファデックスＧ−５０＞
にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品
を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル
°電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度
の向上をはかった。

実施例３（（ヒ学合成ヒトＴＮＦｉｔｉ子のクローン化
）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦｉ！
公子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０１
ＴｌｔｖｌＴｒｉｓ−日Ｃ２（ｐＨ９，５＞　　、　　
１０　ｍＭ　　ＩＶＩ（ｌ　Ｃ２２゜５　１１１Ｍジチ
オスレイトール、１０ｍＭＡＴＰ水溶液中で、３７℃で
、３０分間行なった。反応終了後、すべての合成オリゴ
ヌクレオチド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、
エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを
失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ＝１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後Ｗ　’ＩＡ
まで徐冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μすの６６ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨｆＪ　（１）８７．６）　、　　６．６　ｍ
１ｖｌ　　Ｍｏ　Ｃ２２゜ｉｏｍＭジチオスレイトール
、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトの７
４−ＤＮＡリガ一部（宝酒造）を加えて、１１℃で１５
時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウ
ムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行なう
。目的とする大きさ（約２２０ｂＯ）のバンド部分を切
出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミドゲ
ルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μ９の大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ９（１）Ｈ’７．５）　　、　　６０　　ｍ１
ＶＩ　　　Ｎａ　　ＣＬ　　７　　ｍＭＭｇＣ２２水溶
液に溶解させ、１０ユニツトの制限構製ＣｊａＩにュー
イングランド・バイオラブズ）を添加して、３７℃で１
時間切断反応を行なった。

制限酵素Ｃｊａ工による切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０．ｕｌの５０　ｍＭＴｒｉ
ｓ−Ｈ（Ｊ　　（ＤＨ７，４）　　、　　　１００　　
ｍＭ　　　　Ｎａ　　ＣＪ、　　１０ｍＭ　　ＭＯｓ○
４水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ
　（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。反応終了後、アガロ一スゲル電気泳動くゲル濃
度０．８％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法に
より切断パターンの観察を行なう。プラスミドｐＢＲ３
２２の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に
相当するバンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３
倍量（ｖｏｌ　、、’ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯ＋水
溶液に溶解させた。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［
Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　、Ａ、ｎａｌ　、３’ｉｏｃｈｅｍ、二
〇１，３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ工→５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦｉ伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に邸じて両Ｄ　ＮＡ
断片の速結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａ　ｃｓ　２法（Ｍ、Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５厩のし培地
（１％トリプトン、０．５％［ｉエキス、０．５％Ｎａ
（Ｊ、　　ＩＩＨ７，２＞にエシェリヒア・コリＣ６０
０ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培
養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｊσσ）が０３に
達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バ
ッファ［０，ＩＭ　　Ｎａ　（Ｊ、　５　　ｍ１ｖｌ　
　ＭＵ　Ｃ２ｚ　。

５　ｍｔｖｌ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（＋））−１７，
６，０℃）コ中で２回洗い、２成の冷したカルシウム・
バッファー［１００ｍ〜ＩＣａ　Ｃ２ｚ　、　２５０　
　ｍＭ　　Ｋ（Ｊ、　５　　ｍＭＭ！Ｊ　Ｃ２ｚ　、　
５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，６゜０°Ｃ
）］中に再懸濁させ、Ｏ′Ｃで２５分間放買する。

次に菌体をこの容景の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間９０′Ｃで保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプ
トン、０．５％酵阻エキス、１％ＮａＣ５，０，０８％
グルコース、　　ｐｌ−１７，２）を添加し、３７°Ｃ
で１時間系どう培養する。培養液を、選択培地［アンピ
シリン（シグマ）　３０μワ／ｍｌを含むし培地プレー
トコに　１００μ旦７／プレートの割合で１妄腫する。

プレートを３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育さ
せる。得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知
の方法を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳
動により、目的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０
Ｋｂｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂρ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦｉ伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及び１）ＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基前】］が設計
通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ
、　ｌｖｌａｘａｍら、　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓＥ　ｎｚｙ
ｍｏｌ、、６５，４９９　（１９８０）　］によって［
した。

３４一実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μｑ
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＪａ工及び３ａｌ
’Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約２２０ｂｉ）のＤＮＡ断片（Ｏ’
ａ　ニーＳ　ａｌ　工）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

次に、実施例３て得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１（
Ｊｔｌ’ｊを１００μｌの１０　ｍｆｖｌ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ２（ＩＩＨ７，５）　、　６０ｎｌ　Ｍ　　Ｎ
ａ　Ｃ２，７ｍＭＩＩＶＩＱ（Ｊ２水溶渡に溶解させ、
４０ユニツトの制限酵素ｐｖｕｌＩ（宝酒造）を添加し
、３７°Ｃで１時間切断反応を行なった。そして、実施
例３の方法に準じて制限酵素３ａｌ工による切断、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実
施例２の方法に準じて、ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　’Ｍ　１云子
の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮＡ断片（５ａｌＩ　Ｈ
ＰｖｕｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、実施例３で得られたプラスミドＤＴＮＦ３　１０
ｕｑも１００μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ２
（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ９，７ｍ
ＭＭｇ（Ｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵
素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の・後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕＩ［（へ）ＨｉｎｄＩ［［）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ　（約４．７Ｋｂｐ）　５μＪを、上記と同
様に制限酵素Ｃ２ａＩ及びｔ−１ｉｎｄｌＩ（で切断し
、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、
実施例３の方法に準じて、プラスミドｌ］Ｙｓ３ＩＮの
大部分を含む約１１．７Ｋ　ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｃ２
，ｌｌ■→Ｈｉｎｃ＋ｍ＞をアガロースゲルより回収し
た。

こうしてｊｑられた、ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　３９　ｌｘ子の
一部を含む約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０１
）　ｌ）の３つのＤＮＡｌ１Ｎ片とプラスミドｌ）Ｙ　
Ｓ　３１Ｎの大部分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断
片とを混合し、エタノール沈澱の後、実施１！１ｌ１３
の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換
株の中より目的のヒトＴＮＦｉ伝子発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４０１ＮＮ＜約５．２Ｋ　ｂｐ）を有するクロー
ンを選択した。第６図に、そのプラスミドｐＴＮＦ　４
０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドＩ）ＹＳ３ＩＮ５μ３を、上記の
方法に準じて制限酵素ＰＶＩＪＩＩで部分分解した後、
さらに制限酵素１−１ｉｎｄｌ［で切断し、アカロース
ゲルミ気泳＠（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方
法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［Ｐｖｕｌｌ（２）　ＨＨｉｎｄ　ｌ［
］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得らｈ
だ２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［Ｐｖｕ■（２３→ＨｉｎｄＩ［［］と
混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて
、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反
応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリ
Ｃｅｏｏｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有する
クローンを選択した。このようなプラスミドは、プラス
ミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御領域を除去し、
ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニング・サイ
トの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−を付与した
形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第７図に
その作成方法を示した。

このプラスミドｌ）Ａ　Ａ　４１　２ｆｉ９を、上記と
同描に制限酵素Ｃ２ａ丁及びｌ−１ｉｎｄｌｌＩで切断
し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後
、実ＦＭ例３の方法に準じて、プラスミドＩＩＡ△４１
の大部分ヲ含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ２ａ
工、−。

：３３− ＨｉｎｄＩ［Ｉ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
Ｃ５ａ工及びＨｉｎｄ［［で切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気法＠（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐの
ＤＮＡ断片（（Ｊａ　Ｉ　”Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺因
子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エ
タノールｉ、を澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

３９一実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遭伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１Ａ２０μ９を、実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃ２ａ工及び１−（ｉｎｄＩ［（で切断し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）及
びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の′櫨
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋ　ｂｐ、
両方共Ｃ２ａ　工４−４８ｉｎｄ　＠　）をゲルより回
収した。

ここで得られたヒトＴＮＦｉ伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ旦の１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ　（ＩＩＨ７，４）　、　１０　ｍＭ　　〜Ｉ（ｌ
　ＳＯ２，１ｍｆｖｌジチオスレイトール水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐｌＩ（宝酒造）を
添加して、３７°Ｃで１時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）を行ない、実施〃１２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
ｉ伝子の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａ
ｐ■に）ＨｉｎｄＩ［［）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μｑについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、＋４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ　Ｉ
”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦｉ伝子の大部分を含
む約３９０ｂｐＨ７）Ｄ　Ｎ　Ａ断片（Ｈａｌ）Ｉ［Ｈ
ＨｉｎｄｌｌＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施
か１３の方法に準じて、＋４−ＤＮＡリガーゼによる連
結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じ
てエシェリヒア・コリＣ６ＱＯｒ−ｍ−ｉに導入し、形
質転換株の中より目的のプラスミドＩ］ＴＮＦＩ１７１
（約３．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは１次のアミン潴配列（＋２　　Ｎ　＞−
Ａｒｃ　　Ｌｙｓ−Ａｒ！］　　ＬＶＳ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ　−Ａ　
Ｓｎ　−Ｐ　ｒＱ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌ
ｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｌ’ｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｓ＋１−　Ａ　
ｒｇ　−Ａｒｇ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｎ−Ａ　ｌａ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｎ　−Ｇ　
ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｑ−
八５ｐ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ　−Ｖａ
ｌ　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇ　ＩＬＬ−Ｇｉｙ−ＬｅｌＪ
−Ｔｙｒ−”ＬｅｌＪ−Ｉ　ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓ　ｅｒ−
Ｇ’ｌ’ｎ　−Ｖａｌ　−１ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｃｙｓ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ
　ａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ−Ｈ１ｓ−
Ｔｈｒ　−ｉ　１ｅ−３ｅｒ　−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ａ
ｌａ−Ｖａｔ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ　−Ｔ　ｈｒ　
−１ｙｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ａｓｎ　−１ｅｕ　−１ｅｕ
　−３ｅｒ　−Ａｌａ　−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ
ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｌａ
　−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙｒ
　−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ　１ｙ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−
Ｑｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−１ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−△
ｒｇ−１ｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−■１ｅ−Ａ
ｓｎ　−Ａ　ｒＯ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓｐ　−Ｔ　’／
ｒ　−Ｌ　ｅｌｆ−△５ｐ−ｐｈｅ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａ
ｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｙ　−Ｉ　ｌｅ　−
Ｉ　１ｅ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−（Ｃ○○Ｈ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド這伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られた発現ベクターＤＡＡ４１゜ヒト
ＴＮＦｉ伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４０１ＮＮ　
５１”６　　Ｆ−ＴＮＦ４６１八、ＰτＮ１：４１ら江
南ｅｇ６２−２４１４４６（”ｒｌｒ’ｒＦｉｔ＋−９
ｏｏｉ７ｚ　）−ＨＨ％−、Ｈ末ワアｓ４ヶ？’？ヒト
Ｔ旺（＼ゝんＴ−、ｔ、Ｉ末触ヒー丁目Ｆ９６）Ｍ１イ
ミ）４５モ見型７°ラス之ト′〕又は実ＴＭ例５で得ら
れた、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遠伝子発現型プラスミ
ド１）ＴＮＦ４７１を有するエシェリヒア・コリＣ’　
６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μ９　／　ｍＲのアン
ピシリン、０．２％のグルコース及び４　’Ｆ　／　ｒ
ｎｆ！のカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２
　ＨＰＯ４−０，３％に２ＨＰ○Ｊ　−０，０５％Ｎａ
（Ｊ−０，１％ＮＨＪＣ２水溶液（ＩＩＨ７，４）をオ
ートクレーブ滅菌した蜜に、別途にオートクレーブ滅菌
したＭｇＳＯ４水溶液及びＣａＣＪｚ水溶液をそれぞれ
最終濃度２ｍＭ及び０．１　ｍＭになるように加える。

］　　２５０ｄに接種し、ＯＤ６．、が０．７に達する
まで、３７℃で撮とう培養を行なった。次いで、最終濃
度５０μ９／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養
液中に添加し、さらに３７°Ｃで１２時間振どう培養を
続げた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
’　　（１５０ｍＭ　　ＮａＣ５を含む２０ｍＭリン酸
バッファー、　　Ｉ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファーに
＠濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）
を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体浅漬の
除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔ　ｒｉｓ
−旨Ｃ２バッファー（１））−１６，８）　、　ＳＤＳ
、　２−メルカブトエタノールル、グリセロールを、そ
？Ｌぞれ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になる
ように８ｕえ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動［銘木、還云１社、　４３　（１９７７）　ｌを行な
った。

分隋用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ
、ＴｒＩＳ−グリシン系［Ｕ　、　Ｋ　、　Ｌ　ａｅｍ
ｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒａ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺（公
子の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第
１０図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
３９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白質又
は新規抗腫瘍活四ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中
にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｔｌＴＮＦ４０１Ａを有する大
腸菌においては全細胞質蛋白質の約１１％のヒトＴＮＦ
蛋白質、新規流■ｉ′閏活性ポリフベプチド遍伝千発現
型プラスミド１）ＴＮＦ４７１　を有する大腸菌におい
ては同じく約１７％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産
生が、それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦｉ伝子発
現型プラスミドｌ］ＴＮＦ４０１１ＮＮを有する大腸菌
におけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生蚤は、上記ｐＴＮＦ４
０１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクター　ρＡ
Ａ４１の有用性が示された。

記ＲｕＨの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６
で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ラ
イゼートを、＠次培地で希釈した試料１００μ立と、４
　ｘ　１０５個／ｄの濃度のマウス上−９２９誠維芽細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μｌを、９
６穴の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で
混合した。なおこの際に、最終濃度１μσ／戒のアクチ
ノマイシンＤ（コスメゲン、萬在製薬）を添加しておく
。培地としては、５％（ｙｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎
児血清を含むイーグルのミニマム・エツレンシャル培地
（日水狭薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％
炭とガスを含む空気中、３７°Ｃで１８〜２０時間培養
した浚、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ
／ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたもの
］を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイ
オレットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バ
イオレットを１００μ旦の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出
し、その５９５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナラ
イザー（東洋測器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この
吸光度は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒト
ＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大
腸菌ライザー１〜の希釈溶液を加えない対照の吸光度の
５０％の直に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグ
ラフ（たとえば第１１図）によって求め、その希″ＦＲ
旧率をユニットと定義する。第１１図より、発現型プラ
スミドｐＴＮＦ４０１ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白
質を含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は１．５ｘ　４
０５ユニット程度の活性を、そして発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４７１にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼート　１００μすは約１．２Ｘ１
０’ユニット程度の活性を、それぞれ有していることが
明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
ＤＴＮＦ４７１にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量は、
プロティン・アラ女イ・キット（バイオ・ラット）を用
いて定吊し、ウシ血清アルブミンを用いた検問線より計
算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白質定
量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドの比活性を計算したところ、表１のような直が得
られた。表１より、新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒト
ＴＮ　Ｆ＝白質の約８培の比活性を有していることがわ
かる。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新展抗腫瘍活性ポリ
ペプチドのｉｎ　ｖ：ｔｒｏ抗癌活性の比較 −５０−〇− 活性ポリペプチドの分離・精製）実施例６で得られたライゼートからのヒトＴＮＦ蛋白質
の精製は、５ｈｉｒａｉら［Ｔ、５ｈｉｒａｉら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　３１３．８３０　（１９８５）　］の方
法に従い、ＤＥＡＥ−セファロース・カラム・クロマト
グラフィーにより行なった。本粗精製品中のヒトＴＮＦ
蛋白質含量は約３０％であった。

ヒトＴＮＦ蛋白質に対するモノクローナル抗体を産生ず
るマウス・ハイブリドーマは、にｏｈｌｅｒとＨｉ　１
ｓｔｅｉｎの方法［Ｋｏｈｌｅｒとｕ；　１ｓｔｅｉｎ
、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５　（１９７５）　
］の方法により取得した。すなわち、上記ヒトＴＮＦ粗
精製品を用いて雄Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫し、該マウ
ス牌臓細胞とマウス骨髄腫軸Ｉｌｌ　Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ＩＪ８−旧細胞［Ｄ、Ｅハ’ｅｌｔＯｎら、　　Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＨｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　８１．１（１９
７８）］とを融合させる。融合後の細胞混合物を選択培
地で培養することによりバイブリドーマ細胞のみか選択
され、その培養上清中−５Ｑ−■− は、マウスに対する致死作用で評価した。すなわち、６
〜８週令の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスプチド、　１８ｍ
ｇのβ−Ｄ−カラクトサミンを含む５００μｌの生理食
塩水を腹腔的投与し、投与２４時間後における生死を判
定する。結果は表２に示す。

表２に示したように、新規抗腫瘍活性ポリペプチドは　
　　　　　　　　　　マウスに対する致死作用が低く、
５０％のマウスを致死貿の約１／２０．Ａ／ま欠失とＬ
ＴＮＦ４自質ｑ族６Ｕ４．た。

実施例７の表１に示した比活性の値と合わせて考えると
、新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質より
も、比活性と致死作用の両面から見て、約１６０倍有利
でおることになる。

一タＯ−の− 守丘　中存山Ｏ乙４２−２牛ｇ’ｊｑＪ１５性船乙Ｎ＠
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琺しＬＴＮ“ｐ　ｊ（」弛冑よりい仁シ孟′緯　ヒ丁之
元１冨中のβる６瘍活性ポリペプチドのマウス致死作用
比較−ダＯ−■一実施例１０（新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ｖｉ
ｖｏ抗癌活性評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性
測定は、前記ＣａｒＳＷｅｌｌらの方法に準じて行なっ
た。すなわち、５Ｘ１０５個の１４ｅｔｈ△肉種細胞を
５０μ夕のＲＰ）１１１６４０培地にツスイ）に懸濁さ
せ、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（６〜８週令、雄。

静動協）側腹部皮下に移植する。移植後、腫瘍径か６〜
１０ｍｍに達した７〜１０日目にロー記実施例８て調製
した新規生理活性ポリペプチド１０μｑを尾静脈より投
与した。投与後２４時間以内に、腫瘍表面に出血壊死像
か観察され、本発明の新規抗腫瘍活性ポリペプチドが、
功■すにおいても顕著な抗癌活性を有していることか明
らかとなった。出血壊死を起した担癌マウスの一例を第
１２図及び参考写真（昭和６３年４月２８日付物件提出
書によって提出）に示した。

第１２図の黒色部１（参考写真の赤黒色部に対応）は出
血壊死部分を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦｉ伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ，１）ＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法
を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦａ
公子発現型プラスミド１）ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方
法を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の作成方
法を、そして第８図はヒトＴＮＦｉ伝子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したもの
である。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド選伝子発
現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４７１１７＞ｆｆ成方法
を示したものである。第１０図はヒトＴＮＦｉ伝子及び
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示
したものである。第１１図はヒトＴＮＦ第１２図は新規
抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ｖｉｖ。抗癌活性測定結果を示したもので必る。拓　→ ＰｖｕＸ第匁ｌＥ　Ｖ　Ｉ　ｏ−ｂ　ＪＮ（Ｊ　」 −に′ＱＬ３９つ（１０，Ｌ口（１℃１工訊Ｑ００９つ
　（＋ＣＬ２（、τ４Ｔ手続補正書（烈）昭和６３年ｑ月　タ日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４７１である
第３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
とする第７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。