JPS63164898A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

新規生理活性ポリペプチド

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JPS63164898A
JPS63164898A JP61308518A JP30851886A JPS63164898A JP S63164898 A JPS63164898 A JP S63164898A JP 61308518 A JP61308518 A JP 61308518A JP 30851886 A JP30851886 A JP 30851886A JP S63164898 A JPS63164898 A JP S63164898A
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JP
Japan
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amino acid
polypeptide
acid sequence
active polypeptide
plasmid
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Pending
Application number
JP61308518A
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English (en)
Inventor
Satoshi Nakamura
聡 中村
Tsukio Sakugi
柵木　津希夫
Kazuo Kitai
北井　一男
Kenji Yone
米　賢二
Kaku Katou
加藤　革
Jun Suzuki
純 鈴木
Yataro Ichikawa
市川　弥太郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
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  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードする［）ＮＡ領領域含む組換えプラスミド、該プ
ラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び
該微生物１１１胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの
製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する
新規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
と略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ領域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって
形質転換された組換え微生物ｍ胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。
水明ｍ書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＬＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。
Ａｌａ　　Ｌ−アラニン Ａｒ（ＩＬ−アルギニン ＡｓｎＬ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｉｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉｓＬ−ヒスチジン ＴｌｅＬ−イソロイシン しｅｕ　　Ｌ−ロイシン １ｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ｐｈｅＬ−フェニルアラニン Ｐｒ０Ｌ−プロリン ３ｅｒＬ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｌ）　　Ｌ−ｔ’リブトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（Ｃｏｏ
）−１）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカ
ルボキシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（
３′）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端
側を示すものである。
（′２Ｊ　　発明の背景 Ｑａｒｓｗｅｌｌらは、３ａｃＮＩｕｓ　　Ｃａｌｍｅ
ｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もって
刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に採
取した血清中に、移植したＭｅｔｈ　Ａ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓ
ｉｓｌ”ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、
　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫１ｉ１１１１胞に特異
的に、しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての
利用が期待されてきた。
最近になッテ、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告したＣ　Ｄ　、　　Ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　ユ旦、７２４
（１９８４）　］　、その後、０井ら［Ｔ、　３ｈｉｒ
ａｉら。
Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［塞材ら、癌と化学療ｆｆｉ、　１２．　
１６０（１９８５）　］　、Ｗａｎ（１ら［Ａ、　ｔｖ
ｊ、　Ｗａｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　
１４９（１９８５）　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［
Ａ　、　　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。
Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。
このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗ｉｉｉ活性以外の生理活性が明ら
かになりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者
に見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケク
チンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕ
ｌｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。
二、　　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影Ｄ［Ｊ、Ｒ。
Ｑａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｔ、　Ｍｅｄ、　、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、
　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。
一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。
このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ”及びｃｙｓ／＃／のいずれか又
は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願公開Ｗ
Ｏ３６／　０４６０６号、特願昭６ｌ−１０６１７２）
　、Ｑ　ｌｙ””の他のアミノ酸残基への置換（特願［
６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８号）
。
Ａ１ａ″の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−２
３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末端側
のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失ＴＮ
Ｆが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５０
９２３＠）　、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜１
０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、そ
の比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大にな
ること（ＰＣＴ出願公開Ｗ　Ｏ８６／　０２３８１号）
、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有している
こと（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１１アミノ
酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭
６１−１７３８２２号）が報告されている。
そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。
本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡｆｉｉｌｇを含む組換えプラスミドを提
供することにある。
本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。
（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （１−１２Ｎ　）　−Ｔｈｒ−Ａｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ　ｓｎ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｎ−Ａ
　ｒａ−Ａ　ｒｏ−Ａ　ｌａ７　Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ
　−Ｌ　ｃｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−
Ｇ　Ｉｙ　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｒａ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｑ　
＋ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−■　ｌｅ−Ｔｙｒ−３
ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｔ−Ｌ　ｅｕ−Ｐｈｅ−ｔ、−ｙ
ｓ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ
−Ｓ　ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−Ｉ　Ｉｅ　−
Ｓｅｒ　−Ａ　ｒｇ−Ｉ　Ｉｅ−Ａ　Ｉａ−Ｖａｌ−５
ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ＶＳ　−Ｖ
　ａｌ　−Ａ　５ｎ−１ｅｌｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ａｌａ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−ＧＩｎ　−Ａ　ｒ（１−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　
−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙＳ−Ｐｒｏ−Ｔｒｌ）−
ＴＶｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐ　ｒＯ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　＋ｙ−ｖａ＋−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ　−
Ａ　ｓｐ　−ＡｒＯ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
　−Ｉ　Ｉｅ−ＡＳｎ　−Ａ　ｒ（１−Ｐ　ｒＯ−Ａ　
＄１１−　ＴＶｒ−Ｌ　ｅｔｌ−Ａ　５ｌ）−Ｐｈｅ−
Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端に１ｙｌｅｔが結合したポリペプチドを提供す
ることによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミ
ドを提供することによって達成され、更にかくして得ら
れた組換えプラスミドによって形質転換された組換え微
生物細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫
瘍活性ポリペプチドを産生する方法及びこの新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供すること
によって達成されることがわかった。
以下本発明について更に詳細に説明する。
（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、　Ｐ
ｅｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。
また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。
ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。
上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
さらに、このヒトＴＮＦ３ｉ伝子は、その上流及び下流
に作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適
当なベクターへのクローン化が可能になる。このような
ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。
上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。
”　Ｓ　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒＳ　　　ｏｆＢ　
１ｏｌｏａｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”、
　　Ｊｏｈｎ　　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　　５ｏｎｓ　
　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１
）　　］　　。
トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　ＬｅｔＳｉｎＱｅｒら、Ｊ
。
Ａｍ、　　Ｃｈｅｎ＋、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１
（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉら。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７１
９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作の
簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスフ
ァイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロマ
トグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いるこ
とができる。
こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　０ｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦｌＢＲ。
ｐＴＮＦ２Ｎまたは１）ＴＮＦ３が用いられる。
上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。
ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ＩｐｐブＯモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくは１）ＹＳ３１Ｎ、又
はｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。
さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−２ｔｒｐターミネータ−等があげ
られるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドと
して、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２２由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドと
して、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は１）ＴＮＦ４
０１Ａが用いられる。
（Ｂ）新規抗１１瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン
化： こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４６８が用いら
れる。
（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　ＮＯｒｇａ
ｒｄら。
Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−＋＋−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することがで
きる。
このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉＳら編、“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｕ”
　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇｌ−１
ａｒｂｏｒ　　１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　”ｙ’ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必
要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望
ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たと
えば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２
〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、
プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−イ
ンドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。
培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。
発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。
このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉら。
前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　
］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。
かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉｃａら［Ｄ。
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　二３１２
．　７２４　（１９８４）　　コの報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤＮ、Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′
側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれ
ぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制
限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳
開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーター
との連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下
流には制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［による切断部位を設け、
ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした。
実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機〈アプライド・
バイオシステムズ。
モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５−の溶出用ハラ７７−　［５００ｍＭ
　　ＮＨ４０ＡＣ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ　
（１）Ｈ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とうした
。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。
実施例３（化学合成ヒトＴＮＦＷ伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。
０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。
ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ９，５）　、　１０　ｍＭ
　　ＭＯＣＩ２゜５　　ｍＭジチオスレイトール、１０
＋ＩＩＭＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間行なっ
た。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶
液をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽出によ
りＩ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。
この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１６０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷しで、アニーリングを行なう。
次に、これを減圧乾固した後に、３０ｕ文の６６１１１
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（Ｉ１８７．６）　、　　６．６
　ｆｆ１Ｍ　　Ｍ（Ｊ　Ｃ１ｚ　。
１０　ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶液に
溶解させ、３００ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく約
２２０ｂｐ）のバンド部分を切出して、実施例２の方法
に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する
。
一方、３μｇの大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｐ＞を３０μｆｌの１０１１１Ｍ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−Ｈｃｒ（ｐＨ１，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ
　Ｃ１，７ｍＭＭＱＣｆ２水溶液に溶解させ、１ｏユニ
ツトの制限酵素ＣｊａＩにューイングランド・バイオラ
ブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった
。
制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。
エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。コ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔｒ　３０ｕ　Ｉ２
　（Ｄ　５０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，４）　
、　　ｔｏｅ　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，１０１１１Ｍ　　
ＭＯ８Ｏ４水溶液に溶解させ、１ｏユニツトの制限酵素
５ａｌＩ　（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断
反応を行なった。反応終了後、アガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度０．８％）を行ない、エチジウムブロマイド
染色法により切断パターンの観察を行なう。プラスミド
１）ＢＲ３２２の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮ
Ａの部分に相当するバンドを切出し、そのアガロースゲ
ル断片を３倍量（ｖｏｌ　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｌ
Ｏ４水溶液に溶解させた。Ｃｈｅｎらのグラスフィルタ
ー法［Ｃ，Ｗ。
（：、　ｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　１３ｉｏｃｈｅｍ
、ユ０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７
Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ　Ｉ”５ａｌＩ　）をア
ガロースゲルより回収した。
先に得られたヒトＴＮＦｉ伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ１１７ｉ片について、前記の方法に準じて末
端のリン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２
２の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混
合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両Ｄ
ＮＡ断片の連結反応を行なった。
エシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−１株の形質転換
は、通常の（：、ａｃｉｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａ
ｒｔＪらの方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄ
のし培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、ｏ、
５％Ｎａ　ＣＬ　　ｐＨ７，２）　Ｉ、−エシエ＋）　
ヒフ　−：ｌＩＪ　Ｃ６００ｒ−ｉ株の１８時間培ｉ基
を接種し、菌体を含む培養液の６００μｍにおける濁度
（ＯＤＤ、、）が０．３１．：　ｍ　するまで生育させ
る。国体を冷たいマグネシウム・バッフｐ　−［０，Ｉ
Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，５ｍＭ　　Ｍ（Ｊ　Ｃ１２゜５　ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（１）Ｈ７，６，０’Ｃ）　
］中で２回洗い、２ｄの冷したカルシウム・バッファー
［１００ｍＭｃａ　Ｃ１ｚ　、　２５０　　ｍＭ　　Ｋ
（Ｊ、　５　ＨＩＭＭ（ｌ　Ｃ１ｚ　、　５１μＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ　（ｉｌＨ７，６゜０℃）］中に
再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。
次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。
０℃で保った後、１ｒｒ１１のＬＢＧ培地（１％トリプ
トン、０．５％酵母エキス、１％Ｎａ　（Ｊ、　　０．
０８　％グルコース、　　Ｉ）８７．２）を添加し、３
７℃で１時間振どう培養する。培養液を、選択培地［ア
ンピシリン（シグマ＞　３０ｕｇ／−を含むＬ培地プレ
ート］に１００μ文／プレートの割合で接種する。プレ
ートを３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる
。得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方
法を用いてＤＮＡを調製し、アガロニスゲル電気泳動に
より、目的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約４．ＯＫ　
ｂｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮ
ＦＩＢＲの作成方法を示す。
以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示す。
こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドＩ）ＴＮＦｌＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオヂド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、
　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、
６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。
実施例４（ヒトＴＮＦｍ伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦｉ
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ　
Ｉ　Ｈ８ａｌＩ　）をボＩＪ　７クリルアミドゲルより
回収した。
次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μＳＦを１ｏｏｕ　１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−Ｈ
Ｃ１（１）Ｈ７，５）　、　６０１１１　Ｍ　　Ｎａ　
Ｃ１，７ｍＭＭ！Ｉｔ（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユ
ニツトの制限酵素ｐｖＪ（宝酒造）を添加し、３７℃で
１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に
準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐ
のＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕｌＩ）をポリアクリル
アミドゲルより回収した。
また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μｙも１００μｍの１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−１−Ｉ　
Ｃオ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，
７ｎ＋ＭＭＱＣＬｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ｐｖｕ■及び４０ユニツトの制限酵素）１ｉｎ
ｄｌ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（
ＰｖｕＩＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。
一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
ＹＳ３１Ｎ　（約４．７Ｋｂｌ））　５μ９を、上記と
同様に制限酵素ＣＩａＩ及びｌ−１ｉｎｄＩ［［で切断
し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後
、実施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３１Ｎ（
７）大部分ヲ含’ｂ約４．７Ｋｂｌ）１７）　Ｄ　Ｎ　
Ａ断片（ＣｆａＩ＋ｌ−１ｉｎｄｌｌ）をアガロースゲ
ルより回収した。
こうして得られた、ヒトＴＮＦ３１１伝子の一部を含む
約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１　ｏｂｐの３つ
のＤＮＡ断片とプラスミドＩ）ＹＳ３１Ｎの大部分を含
む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ａ＋
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ３
Ｈ伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２
Ｋ　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。第６図に、そ
のプラスミドＩ）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した
。
また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μグを、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さらに
制限酵素１−１ｉｎｄＩ［Ｉで切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に
準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐの
ＤＮＡ断片［Ｐ　ｖｕＩＩ　（２］”　Ｈｉｎｄ　ｍ　
］をアガロースゲルより回収した。
次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７１（ｂ
ｐのＤＮＡ断片［Ｐｖｕｆｆ（２］４−４８　ｉｎｄ　
Ｉ［Ｉ　］と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェ
リヒア・コリＣｓｏｏｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミドｐＡ　Ａ　４１　（約２，７
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプ
ラスミドは、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎからコピー数
制御領域除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するク
ローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネ
ータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクター
であり、第７図にその作成方法を示した。
このプラスミドρＡＡ４１　２μ３を、上記と同様に制
限酵素ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌｌｉで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａニー１１
ｉｎｄｌｌｌ）をアガロースゲルより回収した。
また、先に得られたヒトＴＮＦ″ｉ１伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ３を、上記と同様に制限
酵素Ｃｊａ工及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０
ｂｐのＤＮＡ断片（ＣオａＩＨＨＩｎｄ　ｍ　）をポリ
アクリルアミドゲルより回収した。
こうして得られた、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０ｂｌ）のＤＮＡ１片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ’−ト殊に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＤＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ρ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴＮＦ″ｉ！Ｉ伝子をより効率良く発現させる能力
を有しており、第８図にその作成方法を示した。
実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μ３を、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄＩ［で切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それぞれ
実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮＡ
断片（約４９０ｂｌ）及び約２．７Ｋｂｐ、両方共Ｃｊ
ａ　Ｉ４−＠Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をゲルより回収した。
ここで得られたヒトＴＮＦｌ伝子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ（ｐＨ７，４）、　１０１１Ｍ　　ＭＩＪＳＯ
ａ　、　１　１１１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素Ｈａｔ）ＩＩ（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦＩ
伝子の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｔ
）Ｉ［＋Ｈｉｎｄｌ［）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。
また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。
精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、得られた２末鎖オリゴヌクレオチ　　ドを
、先に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａ
　ＩＨＨｉｎｄ　Ｉ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部
分を含む約３９０ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（Ｈａｐ
ｌ［＋１−１ｉｎｄｌ［［）と混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−ａ　ｔ
、：導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴ
ＮＦ４６８（約３．２Ｋｂｐ）を有するりｏ−ンを選択
した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ）
−Ｔｈｒ−Ａｒ（１−３ｅｒ−Ａｒ（］　−Ｌｙｓ−Ｐ
　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａ
ｔ　−Ｖ　ａｔ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇ
　Ｉｎ−Ａ　ｌａ−Ｑ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ
　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　
Ｓｎ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｒＱ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　
−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　ｒａ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ
−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ
ｌｙ　　ＬｅＬＩ−ＴＶｒ　　Ｌｅｕ−［１ｅ−ＴＶｒ
−８ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｔ　−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈ
ｅ−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　＋ｙ−Ｃ
ＶＳ−Ｐ　ｒＯ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−ＨｉＳ−Ｖ　ａ
ｌ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１−１ｉｓ−Ｔｈｒ　
−Ｔ　Ｉｅ−８ｅｒ　−Ａ　ｒａ−１１ｅ−Ａ　Ｉａ−
Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｖａｔ−Ａ、ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ　−Ａ　ｌ
ａ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃｙ
ｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ
　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−
Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｏ　−Ｔ
　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｒＯ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　＋ｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｉ−ＧＩＶ−ＡＳｐ−Ａ　ｒＱ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｉ
　Ｉｅ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　Ｓ＋
１−　Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　３ｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　
ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−Ｉ　１ｅ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｙｊｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドであり、第９図にその作成方法を示した。
実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクターｐＡ　Ａ　４１゜
ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ
又は１）ＴＮＦ４０１Ａ、又は実施例５で得られた、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）
ＴＮＦ４６８を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−
ｍ−株を、３０〜５０μｇ／ｄのアンピシリン、０．２
％のグルコース及び４■／ｒｄのカザミノ酸を含（ｒＭ
９培地［０４％Ｎａ　２　ＨＰＯａ　−０，３％に２　
ＨＰＯａ　−０，０５％ＮａＣ！−０，１％Ｎ　ＨａＣ
ｊ水溶液（１）Ｈ７，４）をオートクレーブ滅菌した後
に、別途にオートクレーブ滅菌したＭ９８０４水溶液及
びＣａ（Ｊｚ水溶液をそれぞれ最終濃度２ｍＭ及び０．
１　ｍＭになるように加える。］　　２００ａｉ！に接
種し、ＯＤｚ、、が０．７に達するまで、３７℃で振ど
う培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ／ｄの３
−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、さら
に３７℃で１２時間振とう培養を続けた。
遠心分離により大１菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　　（１５０１１１Ｍ　　ＮａＣ１を含む２０　ｍＭリ
ン酸バッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗
浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
渣の除去を行なった。
得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊバッファー（１）Ｈ６，８）　、　ＳＯ８，２−
メルカプ１−エタノール、グリセロールを、それぞれ最
終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように加え
、５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、遺
伝、　３１．４３（１９７７）　］を行なった。
分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＯ８゜Ｔ
　ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ。
Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１
０図に示した。
なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナー（島津、
Ｃ８−９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４０１Ａを有す
る大腸菌においては全細胞質蛋白質の約２１％のヒトＴ
ＮＦ蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリベブヂド遺伝子発現型
プラスミドｐＬＴＮＦ２を有する大腸菌においては同じ
く約３２％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、そ
れぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦｉ伝子発現型プラ
スミドＩ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎを有する大腸菌に
おけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記ｐＴＮＦ４０
１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクター　１）Ａ
Ａ４１の有用性が示された。
実施例７（活性の評価） ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗Ｉｌ！瘍活性ポリペプチド
の活性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。
すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ文と、４　Ｘ　１０５個／ｄの濃度のマウスｌ
−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液
１００μ旦を、９６穴の組織培養用マイクロプレート（
コースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１
μｇ／−のアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬
）を添加しておく。培地としては、５％（ｖｏｌ　’／
ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・
エツセンシャル培地（日永製薬）を用いた。上記マイク
ロプレートを、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１
８〜２０時間培養した後、クリスタル・バイオレット溶
液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０
．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・バイオレット
を溶解させたもの］を用いて生細胞を染色した。
余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥した後
、残ったクリスタル・バイオレットを１００μρの０．
５％ＳＤＳ＊溶液で抽出し、そノ５９５ｎｍにおける吸
光度をＥＬＩＳＡ７；ナライザー（東洋側器、ＥＴＹ−
９６型）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞数
に比例する。そこで、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含
む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度
の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率を
グラフ（たとえば第１１図）によって求め、その希釈倍
率をユニットと定義する。第１１図より、発現型プラス
ミドｐＴＮＦ４０１ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質
を含む大腸菌ライゼート　１００μ文は３．２Ｘ　１０
６ユニツト程度の活性を、そして発現型プラスミドｐＴ
ＮＦ４６８にコードされる新ｍ抗腫瘍活性ポリペプチド
を含む大腸菌ライゼート　１００μ文は６．６×１０６
ユニツトの活性を、それぞれ有していることが明らかに
なった。
実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４６８にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量は
、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ランド）を
用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線より
計算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白質
定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値が
得られた。表１より、新規抗腫瘍性ポリペプチドはヒト
ＴＮＦ蛋白質の約１．４倍の比活性を有していることが
わかる。
表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗１９１ｍ活性
ポリペプチドの比較冒
【図面の簡単な説明】
第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ″ｉＩｉ伝子の一部を有するプラスミ
ドｐＴＮＦ１ＢＲ，（ＩＴＮＦ２Ｎ及び１）ＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれ示したものである。第６図はヒト
ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ
　Ｎの作成方法を、第７図は発現ベクターｒｌＡ　Ａ　
４１の作成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ３１１伝
子発現型プラスミドｆ）ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、
それぞれ示したものである。第９図は新規抗腫瘍活性ポ
リペプチド遺伝子発現型プラスミド１１ＴＮＦ４６８の
作成方法を示したものである。第１０図はヒトＴＮＦ遺
伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認
結果を示したものである。第１１図はヒトＴＮＦ蛋白質
及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示し
たものである。 特許出願人　　帝　　人　　株　　式　　会　　社代　
　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博も　４
薗 ｖｕＭ Ｑつ　Ｕつ 晃ｒ＋邑のＢ ＰＶｕＴＬ（す 鬼　８　町 ）（ｉｈＪ　Ｎ− 兆ｃｔいの８ ｉｎｄ　ｔ ガ　ｒｒ　　瓜 廊択発牽 手続補正書 昭和６２年　２月２ｔＩ日

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
  2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
    する第１項記載のポリペプチド。
  3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
  4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
    Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
    項記載のプラスミド。
  5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
    Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
    項記載のプラスミド。
  6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４６８である
    第３項記載のプラスミド。
  7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
    れた組換え微生物細胞。
  8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
    徴とする第７項記載微生物細胞。
  9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
    するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
    された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
    活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
    ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
    る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
  10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。
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