JPH0286793A

JPH0286793A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH0286793A
Application number: JP63236497A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-09-22
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1990-03-27
Anticipated expiration: 2010-11-29
Also published as: JPH07110237B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＬＩＰ
ＡＣ−ＩＬＩ８生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方
法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用い
る。

ＡＩａＬ−アラニンＡｒａＬ−アルギニンＡｓｎＬ−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧｌｎ、Ｌ−グルタミンＧｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨ＋ｓＬ−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシン１−ｅｕ　　Ｌ−ロイシンＬｙｓＬ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンｐｈｅｌ−フェニルアラニンＰｒ０Ｌ−プロリンＳｅｒ　　１−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｌ）Ｌ−１−リブトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｔ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す、）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ｃｏｏ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、３ａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒ＋ｎ　　（ＢＣＧ＞などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓ
ｉｓｌ”ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、
　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６
６６　（１９７５）コ。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になって、ｐｅｎｎｉＣａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　ｅ
ｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　　
γ２４（１９８４）　］　。その後、自弁ら［Ｔ、　ｇ
ｈｉｒａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［塞材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、ＷａｎＯら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａ
ら、　３ｃｉｅｎｃｅ、ユ２Ｂ、　　１４９（１９８５
）］及びＭ　ａｒｌｅｒｌｏｔｌｔら［Ａ　、　Ｍ　ａ
ｒｌｌｌｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　ＢｅＬＩＩｔ
ｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｑａｌｌｌｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、、　
　１６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［
Ｄ、　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　
　３１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されてい
る。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋６り白質のアミノ酸配列において、ＣｙＳ　及びＣｙ　ｓ／
’／のいずれか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸
残基への置換（ＰＣＴ出願公開Ｗ０８Ｂ／　０４６０６
号、特願昭６ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　ｌｙ／′の他
のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号
、特願昭６１−２３８０４８号）、Ａ１ａ’の他のアミ
ノ酸残基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報
告されている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠
失についても、６アミノ酸欠失’Ｔ　Ｎ　Ｆが細胞障害
活性を有していること（特開昭６１−５０９２３号）、
７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失
ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、その比活性は６〜
８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ
出願公開Ｗ０８Ｇ／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１
−１１４７５４号）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有していること（特願昭６１−１７３８２２号
）、及び７アミノ酸欠失ＴＮＦを基盤として、ｐ　ｖｏ
”Ｓ　ｅｒｓ　Ａ　５ｐＩｏをＡ　ｒ！Ｉｆ　Ｌ　ＶＳ
Ａ　ｒＭ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇する
ことが報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡＩ域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ）　−ＡｒＯ−ＬｙＳ−Ａｒ！］　　ＬｙｓＰ
ｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅＬｌ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓ
ｎ−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｒ（１Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ
　１ａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓ
ｎ　−Ｇ　＋ｙ　−Ｖ　ａｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ
　ｒｆＪ　−Ａ　５ｌ）−Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｎ　−１ｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−１１ｅ　
−Ｔｙｒ−５ｅｒＧ　ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｔｔ−ｐｉｅ
−ｔ−ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　１ｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ　−Ｌ　ｅｕ−
Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−１１
ｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａｒａ−Ｉ　Ｉｅ＝ＡＩａ−Ｖａｌ
−８ｅｒ−Ｔｙｒ−ＧｌｎＴ　ｈｒ　−Ｌ　ＶＳ　−Ｖ
　ａｔ　−Ａ　Ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−
Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ
　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ＭＳ−Ｐ
　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐｒ
ｏ　−１１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｔ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ
−Ｇ、Ｉｙ−Ａｓｐ　−Ａ　ｒ（］　−Ｌ　ｅＬＩ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ａ、ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−１ｌｅ　−Ａ　
Ｓｎ　−Ａ　ｒｃ＋−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔ　ｙｒ−
Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａｌａ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｌ、　−Ｔ
ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−Ｉ　Ｉｅ　−１１ｅ−Ａｌ
ａ−Ｐｈｅ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質を］−ドするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ま、しい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図工水した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“Ｓ　Ｏｍｅ　　ＲｅＣｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅ＋ｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍ＋５ｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ　
ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ”５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ　１ｏ
ｌｏａｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　Ｊ
　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　
Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］　
。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｏｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして１ｑられた合成オリゴヌクレオチドの５′末端
側の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえ
ばＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴ
ヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方
法としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロ
ックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　
　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９
５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化
した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方
法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成する
ブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好まし
くはｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペ０ン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａＣプロモーター、ＰＬプロモーター　
１ｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒｐ
プロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有す
るプラスミドとして、好ましくはｐＹｓ３１Ｎ、又はｌ
）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
Ｉｔ）Ｉ）ターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があ
げられるが、とりわけｔｒｉｌ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミ
ドとして１．好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

この発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２２
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦＩ伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は１）Ｔ
ＮＦ４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくは１ｌＴＮＦ６１６が用い
られる。

＜Ｃ＞発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用イテ
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”　、　ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　３ｐｒｉｎｇ
）（ａｒｂｏｒ　　１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅ
ｗ　　”ｙ’ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ
、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するの
が望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、
たとえば撮とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃
で２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中
に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β
−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる
。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物ｍ胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅ＋　ｌら、前出）、マ
ウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　ｖｉｔｒ
ｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、、１２６．　２３５（１９８１）　］等により行なえ
る。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作用に
関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ＶｉｔｒＯ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｔｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
制限酵素Ｃ１ａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［による切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成ＩＩ（アプライド
・バイオシステムズ。

モデル３ＢＯＡ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の侵、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５Ｉｄの溶出用バッフｐ　−［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１１１ＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤ
Ｓ　（ＩＩＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０＞にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。

なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をは
かった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μびの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ−＋　９．５）　、　１０
　ｉＭ　　ＭｇＣｌ２゜５　ｍＭジチオスレイトール、
１１０ｎ１　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間
行なった。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチ
ド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽
出によりＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去
する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６１μＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，６）　、　　６．６　
ｍＭ　　Ｍｏ　Ｃｆ２゜１０　ｍＭジチオスレイトール
、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトのＴ
４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１５
時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルア
ミドゲル電気法１７１（ゲル濃度５％）を行ない、エチ
ジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行
なう。目的とする大きさ（約２２０ｂｐ　）のバンド部
分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルア
ミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μびの大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ＞を３０μ隻の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　
Ｃｊ、　７　ｍＭＭｌ：１Ｃｆ２水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素Ｃ１ａＩにューイングランド・バ
イオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。

制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５０１＋１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ　（’Ｉ）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ
　　Ｎａ　Ｃ１，１０１１１Ｍ　　Ｍ！＋８０４水溶液
に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒
造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８
％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断
パターンの観察を行なう。プラスミド１ｌＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当する
バンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖ
ｏｌ　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｆ０＜水溶液に溶解さ
せた。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　１により、約３．７Ｋｂ
ｌｌのＤＮＡ断片（ＣＪａＩ→５ａｌＩ）をアガロース
ゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａＣＪｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｒＲ１のし培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣ１，ｌ）Ｈ７，２＞にエシェリヒア−］すＣ６００
ｒ−＋ｎ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培
養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｌａρ）が０．３
に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・
バッファー［０，ＩＭ　　Ｎａ　（Ｊ、　５　ｍ１ｙｌ
　　ＭｇＣｌ２゜５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（
Ｅ）Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２−の冷したカ
ルシウム・バッファー［１００ｍＭｃａ　Ｃ１２，２５
０ｍＭ　　ＫＣｊ、　５　ｍＭＭ（Ｊ　Ｃ１２、５１１
１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐｔ−＋　７．６゜０℃
）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０°Ｃで保った後、１１！ｄｌのＬＢＧ培地（１％小リ
ブトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｆ、　　０．
０８％グルコース、　　ｌ）８　７．２）を添加し、３
７℃で１時間搬とう培養する。培養液を、選択培地［ア
ンピシリン（シグマ）３０μｇ／Ｉｄを含むし培地プレ
ート］に１００μ交／プレートの割合で接種する。プレ
ートを３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる
。得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方
法を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動に
より、目的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約４．０Ｋｂ
ｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ
ＩＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂＥ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ＞を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦＩ伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，１ｌＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、
　ＭａｘａｌＩｌら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ
、、６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した
。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｌ）のＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ
　Ｉ　Ｈ８ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２１０ｕ
ｇを１００μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１（
１））ｌ　７．５）　、　６０１１１Ｍ　　Ｎａ　Ｃｊ
、　７１ｎＭＭ！３Ｃｆ２水溶液に溶解させ、４０ユニ
ツトの制限酵素ＰＶＬＩＩＩ（宝酒造）を添加し、３７
℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方
法（準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７ｏ
ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ４−ＩＰＶＩＪＩＩ）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μｙも１００μＵの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ＤＨ７，５）、６０　ｍＭ　　　Ｎａ　ＣＬ　　７　
　ｍＭＭＱＣＩｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ｐｖＪ及び４０ユニツトの制限酵素１−（ｉｎｄ
Ｉ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行
なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲ
ル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕｌＩ→ＨｉｎｄＩ［［）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ＞　５μ９を、上記と同様
に制限酵素Ｃ１ａ■及びＨｉｎｄｎＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＩ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの大部
分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ　工４
−ＩＨｉｎｄＩ［Ｉ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドＩ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｐ
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミド１ｌＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドＩ）ＹＳ３１Ｎ５μりを、上記の
方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さら
に制限酵素１−１ｉｎｄｌｌｌで切断し、アガ０−スゲ
ルミ気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法
に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む一約２．７Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片［Ｐ　ｖｕＩＩ　（２］−Ｈｉｎｄ　ｍ　
］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＦ（２］”Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉ
　］と混合シ、エタ／−ル沈Ｒ（１）後、実施例３の方
法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行
なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドＩ）ＡＡ４１（約２，７Ｋ　ｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このようなプラスミ
ドは、プラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御
領域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクロ
ーニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｌ）　Ａターミネ
ータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクター
であり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＩ）ＡＡ４１　２μりを、上記と同様に
制限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分を
含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ−１−１ｉ
ｎｄｌＩ［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ３を、上記と同様に制限酵素
Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｎ［で切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐの
ＤＮＡ断片（Ｃｊａ　ｌ４−ＩＨｉｎｄ　ＩＩ［）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μびを、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ｃｕａｌ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の優、それぞ
れ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮ
Ａ断片（約４９０ｂ１１及び約２．７Ｋｂｐ、両方共Ｃ
ｊａ　ＩＭＨｉｎｄ　ｌ［）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ文の１０ｍＭ　　ＴｒｉｓＨＣ
ｆ　（ｐＨ７，４＞　、　１０　ｍＭ　　Ｍｇ８０４　
１　　ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を添加して、
３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行ない
、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分
を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｈａｐ■←Ｈｉｎｄ
Ｉ［［）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得ら°れた２本鎖オリゴヌクレオチドを、
先に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＪａ　
Ｉ”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を
含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｐＩＩ＋Ｈｉｎｄ
Ｉ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方
法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行
なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリＣ６００ｒ−＋ｎ−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７１（約３，２
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミ
ドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ）−Ａｒ！＋−Ｌｙｓ
　　、ＡｒＯＬｙｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉ
ａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ−Ａ　Ｉａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ＩｎＬ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｒｏ−Ａ　ｒｇ
Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ　−１ｅｕ　−１ｅ
ｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ
　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｊ’（１−Ａ　Ｓｐ
　−Ａ　５ｎＧｌｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−８ｅｒ−ＧｌｕＧ　Ｉｙ　−Ｌ　ｅＬＩ　−Ｔ　
ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−１１ｅ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　
−Ｌ　Ｖｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−８ｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ
ａＬｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ　−１１
ｅ−８ｅｒ　−Ａ　ｒｌＪ−１ｌｅ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ
　−５ｅｒ−’ｒｙｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ
　−Ｖａｌ−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ　−
Ａ　ｌａ　−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　ＩｎＡ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ
　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　
ｌａ　−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ
−Ｔ　ｒｏ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ　−１１ｅ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｖａｔ　−ｐ　ｈｅ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｒａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ａ　
ｓｎＡ　ｒａ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　
ｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　
ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−ＴＶｒＰｈｅ−
ＧＩＶ　−１１ｅ　−Ｉ　Ｉｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（
ＣＯＯＨ）で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド１）ＴＮＦ　４７１　２０μグを、実施例４の方法に
準じて制限酵素Ｈｉｎｄｌ［で切断した後、５０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｆ　（ＩＩＨ７，４）　、　１００
　ｒｇ　ＭＮａ　Ｃ１，１０ｍＭ　　Ｍ（］　８０４水
溶液中で制限酵素ＮＣ０Ｉ（宝酒造）による切断反応を
３７℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル電
気泳動くゲル濃度０．７％）及びポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法
に準じて２、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂ
ｐ　（Ｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ＮｃｏＩ”Ｈｉｎｄ　ｌ　
）をポリアクリルアミドゲルより、そして実施例３の方
法に準じて、Ｉ）ＴＮＦ４７１の大部分を含む約３．０
Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ｌ　）を
アガロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）を５０μ文の１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐ＋　７．４）　、　１０　ｍＭ　
　ＭＯ８０４、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解
させ、１ｏユニツトの制限酵素ＡｃｃＩ（宝酒造）を添
加して、３１℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８％）
を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ　ｃ。

ＩＨＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎮オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣ
ＯＩ→Ｈｉｎｄｌ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一部含
む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ）と
混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じて
、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反
応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア拳コリ
Ｃ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミド１）ＴＮＦ６１６（約３．２ＫｔｌＤ）を
有するクローンを選択した。このプラスミドは、次のア
ミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　−ＡｒＯｃｙｓ−Ａｒ（ｌ　　ＬＶＳ−
Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ　１ａ−１−１＋ｓ　−Ｖａｔ
　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒＤ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒｃＩ−Ａ　ｒ（１−Ａ　Ｉａ　
−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ＩＶ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　５ｌ）−Ａ　５ｎ−ＧＩ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｔ　−Ｖ　ａｔ　−Ｐ　ｒｏ
　−３ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ＩＶ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ　−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−しｅｕ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−Ｉ　ｌｅ
　−Ｓｅｒ　−Ａｒ（１−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖ’ａｌ−
８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ　−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ＶＳ−Ｖ　
ａｌ−Ａ　Ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　
Ｉａ　−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｃｙｓ　−Ｑ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ
　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　
Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ＶＳ−Ｐ　ｒｏ
　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−ＰｒＯ−Ｉ
　Ｉｅ−Ｔｙｒ−ＬＪｕ−ＧＩＶ−ＧＩＶ−Ｖａｌ−Ｐ
　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｙ
Ｓ−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　Ｓ＋１−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｉ　１ｅ　−Ａ
　ｓｎ　−Ａ　ｒ（１−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　５ｌ）−Ｔ　
Ｖｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ
　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−１ｌｅ　−
１１ｅ−Ａｌａ−ｐｈｅ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた発現型プ
ラスミドＤＴＮＦ４７１又は新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６１６を有するエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−１−株を、３０〜５０μ９
／ｍｌｌのアンピシリン、０．２％のグルコース及び４
　Ｉｌｌ／１ａｌｌのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，
６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ４０，
０５％ＮａＣｊ−０，１％ＮＨ４Ｃｆ水溶液（ｐＨ７，
４）をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレ
ーブ滅菌したＭＩＪ　８０４水溶液及びＣａ（Ｊｚ水溶
液をそれぞれ最終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍＭになる
ように加える。］　　２５０ｍに接種し、０Ｄｌｔｔｒ
が０．７に達するまで、３７℃で娠とう１養を行なった
。次いで、最終濃度５０μｇ／−の３−β−インドール
アクリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時
間振どう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッａｐ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１１１Ｍリ
ン酸バッファ　＋、　　ｐ）−１７，４＞を用いて菌体
の洗浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッ
ファーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２０
０Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌
体残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファ　−（＋）Ｈ６，８＞　、　ＳＤＳ、　
２−メルカブトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように加
え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、
遺伝、■、　４３　（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。

Ｔ　ｒｉｓ−グリシン系［ＬＪ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１
１図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
５−９３０型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペ
プチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行
なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１Ａを有する大腸菌においては全細胞
質蛋白質の約１９．４％の発現型プラスミド１）ＴＮＦ
４７１を有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約２
０．３％の新規抗腫瘍活性ポリフペブチド遺伝子発現型
プラスミド１）ＴＮＦ６１６を有する大腸菌においては
同じく約２４．４％の抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が
、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ文と、４　ｘ　１０５個／＃Ｉｉ！の濃度のマ
ウスＬ−９２９４１維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）
懸濁液１００μ文を、９６穴の組織培養用マイクロプレ
ート（コースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終
ａ度１μｇ／ｄのアクチクマイシンＤ（コスメゲン、萬
有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（Ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を
用いて生１ａｌｌｌａを染色した。余分なりリスタル・
バイオレットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル
・バイオレットを１００μ文の０．５％ＳＯ３水溶液で
抽出し、その５９５μｍにおける吸光度をＦＬＩＳＡア
ナライザー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現型
プラスミドｐＴＮＦ４０１△にコードされるヒトＴＮＦ
蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μ文は７．６ｘ
　１０’ユニット程度の活性を、発現型プラスミドＩ）
ＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性ポリペプチドを
含む大腸菌ライゼート　１００μ磨は約６，９Ｘ　１０
’ユニット程度の活性を、そして発現型プラスミドｐＴ
ＮＦ６１６にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を含む大腸菌ライゼート　１００μｐ、は約１．９Ｘ　
１０８ユニツト程度の活性を、それぞれ有していること
が明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・
ラッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量、活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、ｐＴＮＦ６１６にコードされる新規抗腫瘍活性
ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約１８倍の比活性を
、そしてＩ）ＴＮＦ４７１にコードされる抗ｆ１２瘍活
性ポリペプチドの約２倍の比活性有していることがわか
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４ｏＩＮ　Ｎの作成
方法を、第７図は発現ベクター１１Ａ　Ａ　４１の作成
方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示した
ものである。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
坦型プラスミドｐＴＮＦ４７１の作成方法を示したもの
である。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミド１）ＴＮＦ６１６の作成方法を示した
ものである。第１１図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したもの
である。第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活
性ポリペプチドのｔｒｏ抗癌活性測定結果を示したもの
である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二重鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二重鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６１６である
請求項３記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項
７記載の微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたは下そのア
ミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有す
る医薬組成物。