JPH03180193A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物１１Ｉ胞及
び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある〉、該ポリペプチドをフードするＤＮＡ
ｆａ域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法、該新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡｌａＬ−アラニン ＡｒａＬ−フルギニン ＡｓｎＬ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 ＧＩＶ　　グリシン 口ｉｓ　　Ｌ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １−ｅｕｌ、−ロイシン ＬｙｓＬ−リジン Ｍｅｔ　　１−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒ０Ｌ−プロリン Ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン ＴｒｐＬ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン ｖａｌ　　ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。〉Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。〉Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列の７ミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′〉
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。

（３発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈ　Ａ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｌｏｒ　　Ｎ　ｅｏｒ
Ｏ３ｉｓＦ　ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記すること
もある〉と名づけだ［Ｅ　、　Ａ　、　Ｃａｒｓｗｅｌ
ｌら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ、　７２．３６６６　
（１９７５）　１　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒ
ト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しか
も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待
されてきた。

最近になって、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ
１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
＜１９８４）　］　、その後、０井ら［Ｔ、　５ｈｉｒ
ａｉら。

ＮａｔＬＩｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）
　］　、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、　１２．　１
６０　（１９８５）　］　、Ｗａｎｌｌｌら［Ａ、Ｍ、
Ｗａｎｇら、　３ｃｉｅｎｃｅ、ユ２８．　１４９（１
９８５）　　］及びｖ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　
　Ｍ　ａｒａ＋ｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｇ＋、、　１５２．　５
１５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌に
おける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のようなａ１作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影１（Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　、　　
１６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ
、　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　
３１９．　５１６（１９８６）　１等が報告されている
。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　′７及びＣｙｓ”’のいずれ
か又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ＰＯＴ出願公開Ｗ０８Ｂ／　０４６０６号、特願昭６
ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　Ｉｌｌ”の他のアミノ酸残
塁へ（７）ｌ換（特１ｉ１１１ｉ３６１−１０６７７２
号、特願昭６１２３８０４８号）　、　ＡｌＢ１２の他
のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−２３３３３７号
）が報告されている。また、アミノ末端側のアミノ酸残
基の欠失についても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害
活性を有していること（特開昭６１−５０９２３号）、
７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−９００８７＠　）、１〜１０アミノ斂欠
失ＴＮＦがｌｌｌ胞障害活性を有しており、その比活性
は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大になること（
ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０２３８１号）、１０アミ
ノ酸欠失ＴＮ「が細胞障害活性を有していること（特願
昭６１−１１４７５４号）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが
細胞障害活性を有していること（特願昭６１−１７３８
２２号〉、及び７アミノ酸欠失ＴＮＦを基盤として、Ｐ
「０８Ｓ　ｅｒ９　Ａ　３＋）ＩｌｌをＡｒｇＬｙＳＡ
ｒｇへ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇するこ
とが報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性゛ポリペプチドを提供
することにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡｍ域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物、その組換え微生物細胞
を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法、
該新規抗腫瘍性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提
供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の、構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　）　−ＡｒｌＪ　−Ｌｙｓ　　ＡｒＯ−Ｌｙ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ−ＨＩｓ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ
　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−１ｅｕ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｔ　ｒＥｌ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒ
Ｑ　−Ａ　ｒＱ　−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｌ
　ｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ
　ａｌ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　
Ｓｐ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−ｐ　ｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｔｙｒ−８ｅｒ　−Ｇ
　Ｉｎ−ｖａ＋−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＬｖＳ−Ｇ　＋ｙ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　＋ｙ−ＣＶＳ−Ｐ　ｒＯ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ
　ｈｒ−口１ｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈ
１ｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　Ｉｅ−８ｅｒ−Δｒｇ−１１ｅ−Ａ
ｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ−１−ｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　
ｌａ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｔｈｒ−
Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−
Ａ　Ｉａ−ＬＶｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　
Ｉｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ
　Ｉｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
１ｕ−Ｌ　ｌ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ａｒａ−
Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ　−
Ａ　ｒＱ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　ＳＤ−ＴＶｒ−Ｌｅｌｌ−Ａ
　ＳＯ−Ｐｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　
Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ　−Ｇ　ｌｙ
　−１ｌｅ−１１ｅ−Ａ　ｌａ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　
−Ａｒ！ｌｌ−Ａｒｇ−（０００口〉 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮ　Ｆ３
！伝子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、
　Ｐｅｎｎ１ｃａら２．前出］を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦｍ転子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“Ｓ　Ｏｌｅ　　ＲｅｌＪｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ　１
ｏｌｏｏｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｃｒｅｓｔ″　Ｊ　ｏ
ｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　Ｉｎ
ｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］　。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、
Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅａｐ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１
（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合或合金機いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、Ｂ　
ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５（１
９７７）　］のようなベクターに一度り０−ン化した後
、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロッ
クのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは１
ＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター　ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐブ０モーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＥＩＹＳ３１Ｎ、又
はＤＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
ｌｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターくネーターが好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはＤＡ　Ａ　４１が用いられる。この発現
型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＥ）ＢＲ３２２由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドと
して、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮＦ４０
１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはＥＩＴＮＦ６５５が用い
られる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大１１！ｆｌｉ
［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型
プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎ
ｏｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３５２５）に導入することが
できる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ　、　Ｍ　ａｎ
ｉａｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏ
ｎｉｎｇ”　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５Ｅｌｒｉｎ
ｌｌｌＨａｒｂｏｒ　　（−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　
Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ
、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するの
が望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、
たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃
で２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中
に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β
−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる
。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より粗換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラス主ドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを、比較することにより、ヒト
ＴＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（ＣａｒＳＷｅｌｌら、前出）、マウ
スし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　ＶｉｔｒＯ
活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　　Ｊ、　　ｌ　ｍｍｕｎｏ
ｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　］等により行
なえる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出〉及び副作用に
関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ＶｉｔｒＯ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

（９発明の効果 かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮ「蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

（６）実施例 以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
。設計に際しては、Ｐｅｎｎ１Ｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列をＭｌ
として、適当な制限酵素によ′る切断部位を適当な位置
に設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして
３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）を
それぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流に
はυ１限酵＊Ｃｊａ工による切断部位を設け、ＳＤ配列
と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモ
ータニとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コ
ドン下流には制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩによる切断部位を
設け、ベクター・プラス互ドと容易に連結できるように
した。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成！ａ（アプライド
・・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５−の溶出用バッファー（５００１１Ｍ
　　Ｎ口４０ＡＯ−１＋１ＭＥＤＴＡ−０，１％５ＤＳ
（０口　７．５）　］を加え、３７℃で一晩振とうした
。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトの１
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＱタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｉ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　　（０口　９．５）、１０１Ｍ　
　ＭｇＣ１ｚ　　。

５　■Ｍジチオスレイトール、１０１１Ｍ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６　ｍＭ
Ｔ　ｒｉｓ−日Ｃｊ　（ｐ＋　　７．６）　、　　６．
６１Ｍ　　ＭＱ　Ｃ１ｚ　　。

１０１Ｍジチオスレイトール、１＋ａＭＡＴＰ水溶液に
溶解させ、３００ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％〉を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ（約
２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の方
法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収す
る。

一方、３μグの大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋｂｐ）を３０μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　、　Ｎａ　
Ｃ１，７ｍＭＭ（］Ｃｊｚ水溶液に溶解させ、１０ユニ
ツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオラ
ブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった
。

制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５０　ａＭＴ　ｒｔ
ｓ−口Ｃｆ　（１）口　７．４）　、　　１００１Ｍ　
　Ｎａ　Ｃ１，１０１Ｍ　ＭｇＳＯ４水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気法１１ｉ１１（ゲル濃度０．８％）
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドＤＢＲ３２２の大部分
を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ
　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｆＯ４水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０１
．　３３９（１９８０）］により、約３，７ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片（Ｃ１ａ　Ｉ　４−４ＳａｌＩ）をアガロース
ゲルよす回収シた。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
１１のＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２
の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮ
Ａ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｓ−株の形質転換は、
通常の（：、ａＣＩｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａｒｄ
らの方法）の改良法で行なった。すなわち、５＃Ｉｅの
し培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５
％Ｎａ　Ｃ１，ｐＨ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６
００「−一一株の１８時間培ｉ１基を接種し、菌体を含
む培養液の６００ｒｖにおける濁度（ＯＤｌ、ｏ）が０
．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウ
ム・バッフｙ−［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ１，５１Ｍ　　
ＭＱ　ＣＬｚ　。

５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＥＩＨ７，６，０℃
〉］中で２回洗い、２ｄの冷したカルシウム・バッフ？
−［１００１Ｍｃａ　　Ｃ１ｚ　　、　　２５０　　１
Ｍ　　　ＫＣｌ、　　５　１ＭＭｏ　Ｃ１ｚ　、　５１
Ｍ　　ＴｒｉＳ−ＨＣｊ　（ＤＨ７，６゜０℃）］中に
再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２＝１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ａ＋ｔのＬＢＧ培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｆ、　　０．０８
％グルコース、ｐロア、２）を添加し、３７℃で１時間
振とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（
シグマ）３０μ９／ｌｄを含むし培地プレート］に１０
０μ皇／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃
で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたア
ンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤ
ＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的の
プラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ）の取得
を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作
成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮ’Ｆ２
Ｎ（約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴ
ＮＦ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ
３（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びＥＩＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、Ｍ
ａｘａｍら、　ＭｅｔｈＯｄＳＥｎｚｙｇｔｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドＥ）ＴＮＦＩＢＲ１０μ
９を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａ
ｌＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％〉の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
ｍ伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ
　Ｉ　４−４ＳａｌＩ）をボＩＪ　７　りＩＪ　７Ｌ／
アミドゲルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
ｕ９を　１００μｌの１０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−口ＣＩ（
ｐＨ７，５）　　、　　６０　　ｇｉＭ　　　Ｎａ　　
Ｃ１，７ｍＭＭｇＣＩ２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ＰＶｔｌｌＩ（宝酒造）を添加し、３７℃
で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法
に単じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルア
ミドゲル糟気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋Ｐｖｕｌをポリアクリルア
ミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕ９も１００μｌのＩＯＩＭ　　Ｔｒｔｓ−日ＣＩ（ｐ
Ｈ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，７ｍＭＭ
ＱＣＩｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵素ｐ
ｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ（宝
酒造〉を添加し、３７℃で１時間切断反応を行なった。

そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ［４
−４Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　）　ヲホｌＪ　７’）　’））
Ｌｔ７ミｔ’ゲルより回収した。

一方、大１！１ｉｔｒｐプロモーターを有するプラスミ
ドＥ）ＹＳ３１Ｎ（約ａ、７Ｋｂｐ）　５μグを、上記
と同様に制限酵素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｎＩで切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３ＩＮの大部
分を含む約４．７１（ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ工＋Ｈ
ｉｎｄｎ［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ３１ｆ伝子の一部を含む
約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｌ）の３つ
のＤＮＡ断片とプラスミドＥＩＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分
を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタ
ノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実
施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−
１株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５，２Ｋ
ｂｌ））を有するクローンを選択した。第６図に、その
プラスミドＤＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹＳ３ＩＮ５μグを、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕｌｌで部分分解した後、さら
に制限酵素）１ｉｎｄ［［で切断し、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準
じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片［ＰｖｕＩＩ（２）＋口１ｎｄｌ［［］ヲアガロ
ースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μグに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ（２）４−４０ｉｎｄｌｌ
ｉと混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準
じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・
コリＣ６００ｒ−１−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドＥＩＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｌ））
を有するクローンを選択した。このようなプラスミドは
、プラスミド１）ＹＳ３１Ｎからコピー数制御領域を除
去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニング
・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−を付
与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第
７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μ９を、上記と同様に制
限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度０８８％）の後、実施例３の方
法に準じて、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分を含む
約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ−Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＥＩＴＮＦ　４０１ＮＮ５μグを、上記と同様に制限酵
素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌ［で切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐ
のＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　ｎ［）をポリア
クリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４ｏ１Ａ２ｏμ９を、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それぞ
れ実施例２及び３め方法に準じて、生成する２つのＤＮ
Ａ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｐ、両方共Ｃｌ
ａＩＯ口１ｎｄｌｌ）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０Ｎ文の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＩＪ　（１）Ｈ７，４）　、　１０ｍＭ　　ＭＩＪ　
８０４　、１　１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％〉
を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（口ａｐ１［
ＭＨｉｎｄｌ［［）をポリアクリルアミドゲル収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃｌａ　Ｉ
４−ｈＨ　ｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ３！伝子の大
部分を含む約３９０ｂｌｌノＤ　Ｎ　Ａ断片（日ａｐｌ
Ｉ＋口ｉｎｄＩ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、
実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリＣ　６ＧＯｒ−ト殊に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７１
（約３．２Ｋｂｌ））を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは、次のアミノ酸配列（８２Ｎ）−ＡｒＯ
　　Ｌｙｓ−Ａｒｇ　Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−　Ｖ　ａｌ−
　Ａ　ｌａ−口ｉｓ　−　Ｖ　ａｌ　−　Ｖ．ａｌ　−
　Ａ　ｌａ　−Ａ　ａｎ　−　Ｐ　ｒＯ−　Ｇ　Ｉｎ　
−　Ａ　Ｉａ　−　Ｇ　Ｉｕ　−　Ｇ　ＩＶ　−　Ｇ　
Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−　Ｇ　Ｉｎ　−　Ｔ　ｒｔ）　−　
Ｌ　ｅｕ　−　Ａ　Ｓｎ　−　Ａ　ｒＯ　−　Ａ　ｒｌ
）　−Ａ　ｌａ　−　Ａ　ｓｎ　−　Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅ
ｕ　−　Ｌ　ｅｕ　−　Ａ　ｌａ　−　Ａ　ｓｎ　−Ｇ
　Ｉｙ　−　Ｖ　ａｌ　−　Ｇ　Ｉｕ　−　Ｌ　ｅｕ　
−　Ａ　ｒｏ　−　Ａ　ｓｐ　−　Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｎ
　−　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−　Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ−　Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ　−　１
　１ｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−　Ｖ　ａｔ　
−　Ｌ　ｅｕ　−　Ｐ　ｈｅ　−　Ｌ　ＶＳ−　Ｇ　ｌ
ｙ　−　Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−　Ｃ　ｙＳ−　Ｐ　
ｒＯ　−　Ｓ　ｅｒ　−　Ｔ　ｈｒ　−　Ｈ　ｉｓ　−
　Ｖ　ａｔ　−Ｌ　ｅｕ　−　Ｌ　ｅｕ　−　Ｔ　ｈｒ
−口ｉｓ　−　Ｔｈｒ　−　１　ｌｅ　−　Ｓ　ｅｒ　
−Ａ　ｒｏ−　Ｉ　Ｉｅ　−　Ａ　ｌａ−　Ｖａｌ−　
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−　Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｈｒ　−　Ｌｙｓ　
−　Ｖａｔ　−　Ａ　ｓｎ　−　Ｌｅｕ　−　Ｌ　ｅｕ
　−　Ｓ　ｅｒ　−Ａｌａ　−　１　１ｅ−ＬｙＳ−Ｓ
ｅｒ−ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＱｌｎＡ　ｒｇ−　Ｇ　ｌｕ−
　Ｔ　ｈｒ−　Ｐ　ｒｏ　−　Ｇ　ｌｕ−　Ｇ　Ｉｙ　
−　Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−　Ａ　Ｉａ−　Ｌ　ｙｓ−　
Ｐ　ｒｏ−　Ｔ　ｒｐ−　Ｔ　ｙｒ−　Ｇ　Ｉｕ−Ｐ　
ｒｏ−　１　１ｅ−　Ｔｙｒ−　Ｌｅｕ−　Ｇ　Ｉｙ−
　Ｇ　ｌｙ−　Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ　−　Ｌ　ｅｕ
−Ｑｌｕ　−　ＬＶｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　−Ａｒｌ）−
　Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−　１　ｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａ　ｒｇ−　Ｐ　ｒｏ−　Ａ　ｓｏ−　Ｔｙｒ−　
Ｌｅｕ−　Ａ　ｓｐ−　Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ−　Ｇ　ｌｕ
−　Ｓ　ｅｒ−　Ｇ　Ｉｙ−　Ｇ　Ｉｎ−　Ｖａｌ−　
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＧＩＶ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ） で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス風
ドｐＴＮＦ　４７１　　２０μ９を、実施例４の方法に
準じて！ＩＩ限酵素ｔ−１ｉｎｄｌｌ［で切断した後、
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣｊ　（　　ｔ）口　７
．４）、　　１００　１ＭＮａ　（Ｊ，１０　１１Ｍ　
　Ｍｇ８０４水溶液中で制限酵素ＮｃｏＩ（宝、酒造〉
による切断反応を３７℃で１時間行なう。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．７％）及びポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％〉を行ない
、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を
含む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣＯＩ４−４Ｈ　ｉ
ｎｄ　ｍ　）をポリアクリルアミドゲルより、そして実
施例３の方法に準じて、ｌ）ＴＮＦ４７１の大部分を含
む約３，ＯＫｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　
［１）をアガロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩ［＞を５０μ旦の１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−口ＣＩ　（　　ＥＩＨ　　７．４）　、　１０
　１Ｍ　　Ｍ（１　８０４　、　　１１１１Ｍジチオス
レイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素
ＡＣＣＩ（宝酒造〉を添加して、３７℃で１時間切断反
応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ゲル濃度８％〉を行ない、実施例２の方法に準
じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（　Ｎ　（ＯＩ＋Ａｃｃ工）をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一
部含む約１ｉｏｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ
）と混合し、エタノアル沈殿の後、実施例３の方法に準
じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・
コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミド１）ＴＮＦ６５５（約３．２Ｋ　ｂｌ
））を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
次のアミノ酸配列 （口ｚ　Ｎ）　−ＡｒｌＪ−Ｌｙｓ−ＡｒＯ−Ｌｙｓ　
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＩａ−口ｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ
　ａｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｎ−
Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｌ
Ｊ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒＤ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ
　ｒＱ　−Ａ　ｒ（ｌｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ　−Ｇ　＋ｙ−Ｖ　ａｌ
−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒＱ−Ａ　５ｌ）−Ａ　５
ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−８ｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　　
Ｉｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｃｙ
ｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａｔ
　−１−ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　
１ｅ−８ｅｒ−Ａ　ｒａ−Ｉ　ｌｅ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ
−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ｙＳ−Ｖ
ａｌ−Ａ　ａｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　ｌａ
−１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ
−Ａ　ｒ＜１−　Ｇ　ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｌａ−ＬＶＳ
−Ｐ　ｒＯ−Ｔ　ｒｌ）−ＴＶｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐ　ｒｏ
−１ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ
ｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａｒａ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　Ｉａ
−Ｇｌｕ−Ｉ　　Ｉｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒＱ−Ｐ　ｒｏ−
Ａ　５ＥＩ−ＴＶｒ−Ｌ　ｅｌｌ−Ａ　Ｓｐ−Ｐｈｅ−
Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｎ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ　−Ｇ　Ｉｙ　−１ｌｅ　−Ｉ
　Ｉｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｒａ−
Ａｒａ−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例５で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６５５を有するエシェリ
ヒア・コリＣｅｏｏｒ−一一株を、３０μり／ｄのアン
ピシリン、０．２％のグルコース及び４ＦＩｌ’ｊ／ｒ
ｄのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％ＮａｚロＰＯ
４−０，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣｆｆ１
−０．１％Ｎ口４　Ｃｊ水溶液（０口　７．４）をオー
トクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌し
たＭｇＳＯ４水溶液及びＣａＣｆ２水溶液をそれぞれ最
終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍＭになるように加える。

１　２００ｄに接種し、ＯＤ／、ｌｄが０．７に達する
まで、３７℃で振とう培養を行なった。次いで、最終濃
度５０μｇ／ｒｄの３−β−インドールアクリル酸を培
養液中に添加し、さらに３７℃で１２時時間上う培養を
続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｙ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　（Ｊを含む２０　ｍＭリン
酸バッファー　ｐＨ７，４）を用いて菌体の洗浄を行な
った。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファーに懸濁
させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を用
いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の除去
を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌバッファ　−（ｔ１８６．８）　、　ＳＤＳ、　
２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように加
え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、
遺伝、　３１．４３　（１９７７）　１を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯ８゜Ｔ
　ｒｉｓ−グリシン系［Ｌｌ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ
。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］　ヲ用イタ。電気泳動翳了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシープルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、
新規抗１１！活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行
なった。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ旦と、４　ｘ　ｉｏ’個／ｄの濃度のマウスＬ
−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸濁液１
００μ文を、９も穴の組織培養用マイクロプレート（コ
ースタ−〉内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μ
ｇ／−のアクチノマイシンＤ〈コスメゲン、萬有製薬〉
を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイ−クロプレートを、５％
炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養し
た後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／
ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し
、その５９５ｎｉにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライ
ザー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１１図より、発現型
プラスミドｐＴＮ「６１９にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート１００μＡは１
０００ユニツト程度の活性を有していることが明らかに
なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオヂドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドＥ）ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法
を、第７図は発現ベクターＤＡ　Ａ　４１の作成方法を
、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＤ
ＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したもので
ある。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドＥ）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したものであ
る。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドＤＴＮＦ６５５の作成方法を示したもので
ある。第１１図は新規族ｌｌ＃Ａ活性ポリペプチドのｉ
ｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活性測定結果を示したものである。 第 ４ 図 ＮＦ−８ 廿伊−１０ Ｔ？ＪＦ−１２ ｖｕＨ 第 図 第 ７図のＡ （１１−一−−−−−−→ （５”）−ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧ
ＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３−）（３−）　−Ａ
ＴＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡ
ＡＡＡ−（５−）トー−（２）−一一一一一→ 第 図 の ｐｖｕｌ＋（１） 第 図 大断片 小断片 Ｈｉｎｄｌｌｌ 第 ９ 図 の Ｈ１ｎｄ厘 第 ０ 図 のＡ 第 １０ 図 のＢ 第 １ 図 希釈倍率

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６５５である
   請求項３記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする請求項７記載の微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
    配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。