JPH03180193A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents
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Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(1)産業上の利用分野
本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするDNA領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物11I胞及
び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド(以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある〉、該ポリペプチドをフードするDNA
fa域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法、該新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。
コードするDNA領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物11I胞及
び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド(以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある〉、該ポリペプチドをフードするDNA
fa域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法、該新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。
本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはIUPA
C−IUB生化学委員会(CBN)で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
C−IUB生化学委員会(CBN)で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
AlaL−アラニン
AraL−フルギニン
AsnL−アスパラギン
AspL−アスパラギン酸
Cys L−システィン
Gln L−グルタミン
GluL−グルタミン酸
GIV グリシン
口is L−ヒスチジン
11eL−イソロイシン
1−eul、−ロイシン
LysL−リジン
Met 1−メチオニン
Phe L−フェニルアラニン
Pr0L−プロリン
Ser L−セリン
Thr L−スレオニン
TrpL−トリプトファン
Tyr L−チロシン
val l−バリン
また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
A アデニン(デオキシアデニル酸を示す。〉Cシトシ
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。〉T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)さらに、(82N)−及び−(COO
H)はそれぞれアミノ酸配列の7ミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、(5′)−及び(3′〉
はそれぞれDNA配列の5′末端側及び3′末端側を示
すものである。
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。〉T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)さらに、(82N)−及び−(COO
H)はそれぞれアミノ酸配列の7ミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、(5′)−及び(3′〉
はそれぞれDNA配列の5′末端側及び3′末端側を示
すものである。
(3発明の背景
Carswell らは、Bacillus Cal
mette −Guerin (BCG)などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したMeth A肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子(T ulor N eor
O3isF actor 、以下TNFと略記すること
もある〉と名づけだ[E 、 A 、 Carswel
lら、 P roc、N atl。
mette −Guerin (BCG)などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したMeth A肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子(T ulor N eor
O3isF actor 、以下TNFと略記すること
もある〉と名づけだ[E 、 A 、 Carswel
lら、 P roc、N atl。
Acad、Sci、、U S A、 72.3666
(1975) 1 、このTNFはマウス、ウサギ、ヒ
ト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しか
も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待
されてきた。
(1975) 1 、このTNFはマウス、ウサギ、ヒ
ト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しか
も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待
されてきた。
最近になって、p ennicaらは、ヒトTNFのc
D N Aクローニングを行ない、ヒトTNF蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトT
NF遺伝子の発現について報告した[D、 Penn
1caら、 Nature 、 312. 724
<1984) ] 、その後、0井ら[T、 5hir
aiら。
D N Aクローニングを行ない、ヒトTNF蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトT
NF遺伝子の発現について報告した[D、 Penn
1caら、 Nature 、 312. 724
<1984) ] 、その後、0井ら[T、 5hir
aiら。
NatLIre 、 313. 803(1985)
] 、宗村ら[宗村ら、癌と化学療法、 12. 1
60 (1985) ] 、Wanlllら[A、M、
Wangら、 3cience、ユ28. 149(1
985) ]及びv armenoutら[A 、
M ara+enoutら。
] 、宗村ら[宗村ら、癌と化学療法、 12. 1
60 (1985) ] 、Wanlllら[A、M、
Wangら、 3cience、ユ28. 149(1
985) ]及びv armenoutら[A 、
M ara+enoutら。
Eur、 J、 Biocheg+、、 152. 5
15(1985) ]が、ヒトTNF遺伝子の大腸菌に
おける発現について相ついで報告している。
15(1985) ]が、ヒトTNF遺伝子の大腸菌に
おける発現について相ついで報告している。
このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトTNF蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、TNFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがTNFに非常に類似しており[B 、 B eul
terら、 Nature 。
なヒトTNF蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、TNFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがTNFに非常に類似しており[B 、 B eul
terら、 Nature 。
316、 552(1985) ] 、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、T
NFの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のようなa1作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影1(J、R。
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、T
NFの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のようなa1作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影1(J、R。
Gambleら、J、 EXI)、 Med、 、
162.2163(1985) ] 、骨吸収作用[D
、 R,Be1toliniら、Nature 、
319. 516(1986) 1等が報告されている
。
162.2163(1985) ] 、骨吸収作用[D
、 R,Be1toliniら、Nature 、
319. 516(1986) 1等が報告されている
。
方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。
このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
ヒトTNF蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第1図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸
配列において、Cy s ′7及びCys”’のいずれ
か又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
(POT出願公開W08B/ 04606号、特願昭6
l−106772) 、G Ill”の他のアミノ酸残
塁へ(7)l換(特1i111i361−106772
号、特願昭61238048号) 、 AlB12の他
のアミノ酸残基への置換(特願昭61−233337号
)が報告されている。また、アミノ末端側のアミノ酸残
基の欠失についても、6アミノ酸欠失TNFが細胞障害
活性を有していること(特開昭61−50923号)、
7アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有していること
(特願昭61−90087@ )、1〜10アミノ斂欠
失TNFがlll胞障害活性を有しており、その比活性
は6〜8アミノ酸欠失TNFにおいて極大になること(
PCT出願公開WO36/ 02381号)、10アミ
ノ酸欠失TN「が細胞障害活性を有していること(特願
昭61−114754号)、11アミノ酸欠失TNFが
細胞障害活性を有していること(特願昭61−1738
22号〉、及び7アミノ酸欠失TNFを基盤として、P
「08S er9 A 3+)IllをArgLySA
rgへ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇するこ
とが報告されている。
されており、第1図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸
配列において、Cy s ′7及びCys”’のいずれ
か又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
(POT出願公開W08B/ 04606号、特願昭6
l−106772) 、G Ill”の他のアミノ酸残
塁へ(7)l換(特1i111i361−106772
号、特願昭61238048号) 、 AlB12の他
のアミノ酸残基への置換(特願昭61−233337号
)が報告されている。また、アミノ末端側のアミノ酸残
基の欠失についても、6アミノ酸欠失TNFが細胞障害
活性を有していること(特開昭61−50923号)、
7アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有していること
(特願昭61−90087@ )、1〜10アミノ斂欠
失TNFがlll胞障害活性を有しており、その比活性
は6〜8アミノ酸欠失TNFにおいて極大になること(
PCT出願公開WO36/ 02381号)、10アミ
ノ酸欠失TN「が細胞障害活性を有していること(特願
昭61−114754号)、11アミノ酸欠失TNFが
細胞障害活性を有していること(特願昭61−1738
22号〉、及び7アミノ酸欠失TNFを基盤として、P
「08S er9 A 3+)IllをArgLySA
rgへ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇するこ
とが報告されている。
そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上2反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
(3)発明の目的
本発明の目的は、新規抗腫瘍活性゛ポリペプチドを提供
することにある。
することにある。
本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするDNAm域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。
ードするDNAm域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。
本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物、その組換え微生物細胞
を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法、
該新規抗腫瘍性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提
供することにある。
て形質転換された組換え微生物、その組換え微生物細胞
を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法、
該新規抗腫瘍性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提
供することにある。
本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。
なるであろう。
(4) 発明の、構成
本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 (82N ) −ArlJ −Lys ArO−Ly
s −P ro−Val−A la−HIs−Val−
Val−A Ia−A sn−P ro−G In−A
Ia−G Iu−G ly−G In−1eu −G
In −T rEl−L eu−A Sn −A r
Q −A rQ −A Ia−A sn−A la−L
eu−Leu−A Ia−A 5n−G ly −V
al −G Iu −L eu −A r(1−A
Sp −A sn −G In−L eu−Val−V
al−p ro−5er−G Iu−Gly −Leu
−Tyr −Leu −11e−Tyr−8er −G
In−va+−Leu−Phe−LvS−G +y−
G In−G +y−CVS−P rO−S er−T
hr−口1s−Val−Leu−Leu−Thr−H
1s−Thr−I Ie−8er−Δrg−11e−A
la−Val−8er−Tyr−Gln−Thr−Ly
s−Vat−Asn−1−eu−Leu−8er−A
la −I Ie −Lys−Ser −P ro −
Cys −G In −A rg−G lu−Thr−
P ro−G Iu−G Iy−A Ia−G lu−
A Ia−LVs−P ro−T rp−Tyr−G
Iu−Pro−11e−Tyr−Leu−G Iy−G
Iy−Val−P he−G ln−L eu−G
1u−L l −G Iy −A St) −Ara−
Leu−8er−Ala−Glu−11e−Asn −
A rQ−P rO−A SD−TVr−Lell−A
SO−Phe−A Ia−G Iu−S er−G
Iy−G In−Val−Tyr−Phe −G ly
−1le−11e−A la −Phe −Leu
−Ar!ll−Arg−(000口〉 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするDNA領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。
アミノ酸配列 (82N ) −ArlJ −Lys ArO−Ly
s −P ro−Val−A la−HIs−Val−
Val−A Ia−A sn−P ro−G In−A
Ia−G Iu−G ly−G In−1eu −G
In −T rEl−L eu−A Sn −A r
Q −A rQ −A Ia−A sn−A la−L
eu−Leu−A Ia−A 5n−G ly −V
al −G Iu −L eu −A r(1−A
Sp −A sn −G In−L eu−Val−V
al−p ro−5er−G Iu−Gly −Leu
−Tyr −Leu −11e−Tyr−8er −G
In−va+−Leu−Phe−LvS−G +y−
G In−G +y−CVS−P rO−S er−T
hr−口1s−Val−Leu−Leu−Thr−H
1s−Thr−I Ie−8er−Δrg−11e−A
la−Val−8er−Tyr−Gln−Thr−Ly
s−Vat−Asn−1−eu−Leu−8er−A
la −I Ie −Lys−Ser −P ro −
Cys −G In −A rg−G lu−Thr−
P ro−G Iu−G Iy−A Ia−G lu−
A Ia−LVs−P ro−T rp−Tyr−G
Iu−Pro−11e−Tyr−Leu−G Iy−G
Iy−Val−P he−G ln−L eu−G
1u−L l −G Iy −A St) −Ara−
Leu−8er−Ala−Glu−11e−Asn −
A rQ−P rO−A SD−TVr−Lell−A
SO−Phe−A Ia−G Iu−S er−G
Iy−G In−Val−Tyr−Phe −G ly
−1le−11e−A la −Phe −Leu
−Ar!ll−Arg−(000口〉 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするDNA領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。
以下本発明について更に詳細に説明する。
(A)ヒトTNF遺伝子のクローン化;ヒトTN F3
!伝子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸[D、
Penn1caら2.前出]を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトTNF遺伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。
!伝子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸[D、
Penn1caら2.前出]を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトTNF遺伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。
また、ヒトTNF蛋白質をコードするDNA領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン(ATG)を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン(TGA。
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン(ATG)を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン(TGA。
TAGまたはTAA)を有することが好ましい。
上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
2つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
2つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
さらに、このヒトTNFm転子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トTNF遺伝子の塩基配列の例を、第1図に示した。
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トTNF遺伝子の塩基配列の例を、第1図に示した。
上記のように設計したヒトTNF遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第2図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法[H,G、 Khorana
。
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第2図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法[H,G、 Khorana
。
“S Ole RelJnt D evelopm
ents inChea+1stry of P
hosphate E 5ters ofB 1
olooical I ntcrest″ J o
hn W 1leyand 5ons 、 In
c、、New York (1961) ] 。
ents inChea+1stry of P
hosphate E 5ters ofB 1
olooical I ntcrest″ J o
hn W 1leyand 5ons 、 In
c、、New York (1961) ] 。
トリエステル法[R、L 、 Letsingerら、
J。
J。
Am、 Cheap、 Soc、、89.4801
(1967) ]及びホスファイト法[M、 D、 M
atteucciら。
(1967) ]及びホスファイト法[M、 D、 M
atteucciら。
Tetrahedron Lett、、 21. 7
19(1980) ]があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動DNA合或合金機いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。
19(1980) ]があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動DNA合或合金機いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。
こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの5′末端側
の水酸基を、たとえばT4−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
T4−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトTNF遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばpBR322[F 、B
olivarら、 Gene 、 2. 95(1
977) ]のようなベクターに一度り0−ン化した後
、それらの各ブロックのDNA断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトTNF遺伝子を構成するブロッ
クのDNA断片を含むプラスミドとして、好ましくは1
NFIBR。
の水酸基を、たとえばT4−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
T4−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトTNF遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばpBR322[F 、B
olivarら、 Gene 、 2. 95(1
977) ]のようなベクターに一度り0−ン化した後
、それらの各ブロックのDNA断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトTNF遺伝子を構成するブロッ
クのDNA断片を含むプラスミドとして、好ましくは1
NFIBR。
pTNF2NまたはpTNF3が用いられる。
上記のようにしてクローン化したヒトTNF遺伝子を構
成する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、 SO<シャイン・ダルガーノ)配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター(trpプロモーター)。
成する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、 SO<シャイン・ダルガーノ)配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター(trpプロモーター)。
ラクトース・オペロン・プロモーター(lacプロモー
ター) 、 tacプロモーター PLプロモーター、
lppプロモーター等があげられるが、とりわけtr
pプロモーターが好適である。trpブ0モーターを有
するプラスミドとして、好ましくはEIYS31N、又
はDA A 41が用いられる。
ター) 、 tacプロモーター PLプロモーター、
lppプロモーター等があげられるが、とりわけtr
pプロモーターが好適である。trpブ0モーターを有
するプラスミドとして、好ましくはEIYS31N、又
はDA A 41が用いられる。
さらに、発現効率向上を目的として、ヒトTNF遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
lppターミネータ−trpターミネータ−等があげら
れるが、とりわけtrp Aターくネーターが好適であ
り、trp Aターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはDA A 41が用いられる。この発現
型ヒトTNF遺伝子を、たとえばE)BR322由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドと
して、好ましくはpTNF401NN又はDTNF40
1Aが用いられる。
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
lppターミネータ−trpターミネータ−等があげら
れるが、とりわけtrp Aターくネーターが好適であ
り、trp Aターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはDA A 41が用いられる。この発現
型ヒトTNF遺伝子を、たとえばE)BR322由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドと
して、好ましくはpTNF401NN又はDTNF40
1Aが用いられる。
(B)新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
; こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはEITNF655が用い
られる。
; こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはEITNF655が用い
られる。
(C)発現確認及び活性評価;
ヒトTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大11!fli
[エシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli) ]が好ましい。前記ヒトTNF遺伝子発現型
プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドは、たとえば公知の方法[M、 V、 N
orgardら。
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大11!fli
[エシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli) ]が好ましい。前記ヒトTNF遺伝子発現型
プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドは、たとえば公知の方法[M、 V、 N
orgardら。
Gene 、 3. 279(1978) ]を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリC600r
−m−株(A T CC33525)に導入することが
できる。
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリC600r
−m−株(A T CC33525)に導入することが
できる。
このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むM9培地[T 、 M an
iatisら編、 ” M olecularCIo
ning” P 440. Co1d 5Elrin
lllHarbor (−aboratory 、
New York (1982)参照]があげられ
、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するの
が望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、
たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、37℃
で2〜36時間行なう。また、培養開始時または培養中
に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、3−β
−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる
。
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むM9培地[T 、 M an
iatisら編、 ” M olecularCIo
ning” P 440. Co1d 5Elrin
lllHarbor (−aboratory 、
New York (1982)参照]があげられ
、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するの
が望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、
たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、37℃
で2〜36時間行なう。また、培養開始時または培養中
に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、3−β
−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる
。
培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より粗換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム(以下
、SDSと略すこともある)を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より粗換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム(以下
、SDSと略すこともある)を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。
発現型プラス主ドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを、比較することにより、ヒト
TNF遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現を確認する。
対照として泳動パターンを、比較することにより、ヒト
TNF遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現を確認する。
このようにして得られたヒトTNF蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したMethA肉腫を壊死させる効果を見るin v
ivo活性測定法(CarSWellら、前出)、マウ
スし細胞に対する細胞障害性を見るin VitrO
活性測定法[Ruff 、 J、 l mmuno
l、、 126. 235(1981) ]等により行
なえる。
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したMethA肉腫を壊死させる効果を見るin v
ivo活性測定法(CarSWellら、前出)、マウ
スし細胞に対する細胞障害性を見るin VitrO
活性測定法[Ruff 、 J、 l mmuno
l、、 126. 235(1981) ]等により行
なえる。
ヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトTN
F蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
TNF蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトTNF蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、in vivo抗癌活性(前出〉及び副作用に
関する検討が可能となる。
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトTN
F蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
TNF蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトTNF蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、in vivo抗癌活性(前出〉及び副作用に
関する検討が可能となる。
ヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるin
VitrO法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するin vivo法等に
より行なうことができる。
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるin
VitrO法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するin vivo法等に
より行なうことができる。
(9発明の効果
かくして本発明によれば、従来公知のヒトTN「蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
(6)実施例
以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例1(ヒトTNF遺伝子の設計)
第1図に示した塩基配列のヒトTNF遺伝子を設計した
。設計に際しては、Penn1Caら[D。
。設計に際しては、Penn1Caら[D。
p ennicaら、 Nature 、 312
. 724(1984) ] の報告したヒトTNF
前駆体cD N Aの構造遺伝子部分の塩基配列をMl
として、適当な制限酵素によ′る切断部位を適当な位置
に設け、5′側に翻訳開始コドン(ATG)を、そして
3′側に2個の翻訳終止コドン(TGA及びTAA)を
それぞれ付与した。また、5′側翻訳開始コドン上流に
はυ1限酵*Cja工による切断部位を設け、SD配列
と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモ
ータニとの連結を可能にした。更に、3′側翻訳終止コ
ドン下流には制限酵素HindllIによる切断部位を
設け、ベクター・プラス互ドと容易に連結できるように
した。
. 724(1984) ] の報告したヒトTNF
前駆体cD N Aの構造遺伝子部分の塩基配列をMl
として、適当な制限酵素によ′る切断部位を適当な位置
に設け、5′側に翻訳開始コドン(ATG)を、そして
3′側に2個の翻訳終止コドン(TGA及びTAA)を
それぞれ付与した。また、5′側翻訳開始コドン上流に
はυ1限酵*Cja工による切断部位を設け、SD配列
と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモ
ータニとの連結を可能にした。更に、3′側翻訳終止コ
ドン下流には制限酵素HindllIによる切断部位を
設け、ベクター・プラス互ドと容易に連結できるように
した。
実施例2(オリゴヌクレオチドの化学合成)実施例1で
設計したヒトTNF遺伝子は、第2図に示したように1
7本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動DNA合成!a(アプライド
・・バイオシステムズ。
設計したヒトTNF遺伝子は、第2図に示したように1
7本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動DNA合成!a(アプライド
・・バイオシステムズ。
モデル380A )を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を55℃で一晩保つことにより、DNA塩基の保護
基をはずし、セファデックスG−50フアイン・ゲル(
ファルマシア)を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、7M
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度
20%)の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、2〜5−の溶出用バッファー(50011M
N口40AO−1+1MEDTA−0,1%5DS
(0口 7.5) ]を加え、37℃で一晩振とうした
。遠心分離により、目的のDNAを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム(セファデックスG−50)にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。
溶液を55℃で一晩保つことにより、DNA塩基の保護
基をはずし、セファデックスG−50フアイン・ゲル(
ファルマシア)を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、7M
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度
20%)の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、2〜5−の溶出用バッファー(50011M
N口40AO−1+1MEDTA−0,1%5DS
(0口 7.5) ]を加え、37℃で一晩振とうした
。遠心分離により、目的のDNAを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム(セファデックスG−50)にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。
実施例3(化学合成ヒトTNF遺伝子のクローン化)
実施例2で作成した17本の合成オリゴヌクレオチド(
TNF−1〜TNF−17)を用いて、ヒトTNF遺伝
子を3つのブロックに分けてクローン化した。
TNF−1〜TNF−17)を用いて、ヒトTNF遺伝
子を3つのブロックに分けてクローン化した。
0.1〜1.0μグの合成オリゴヌクレオチドTNF−
2〜TNF−6の5′末端側を、5〜15ユニツトの1
4−ポリヌクレオチドキナーゼ(E。
2〜TNF−6の5′末端側を、5〜15ユニツトの1
4−ポリヌクレオチドキナーゼ(E。
coliQタイプ、宝酒造)を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は10〜20μ旦の50i
MTris−HCf (0口 9.5)、101M
MgC1z 。
リン酸化する。リン酸化反応は10〜20μ旦の50i
MTris−HCf (0口 9.5)、101M
MgC1z 。
5 ■Mジチオスレイトール、1011M ATP水
溶液中で、37℃で、30分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりT4−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。
溶液中で、37℃で、30分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりT4−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。
この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに0.1〜
1.0μりの合成オリゴヌクレオチドTNF−1及びT
NF−7を加え、90℃で5分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。
1.0μりの合成オリゴヌクレオチドTNF−1及びT
NF−7を加え、90℃で5分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。
次に、これを減圧乾固した後に、30μ文の66 mM
T ris−日Cj (p+ 7.6) 、 6.
61M MQ C1z 。
T ris−日Cj (p+ 7.6) 、 6.
61M MQ C1z 。
101Mジチオスレイトール、1+aMATP水溶液に
溶解させ、300ユニツトのT4−DNAリガーゼ(宝
酒造)を加えて、11℃で15時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度5%〉を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ(約
220bp )のバンド部分を切出して、実施例2の方
法に従ってポリアクリルアミドゲルよりDNAを回収す
る。
溶解させ、300ユニツトのT4−DNAリガーゼ(宝
酒造)を加えて、11℃で15時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度5%〉を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ(約
220bp )のバンド部分を切出して、実施例2の方
法に従ってポリアクリルアミドゲルよりDNAを回収す
る。
一方、3μグの大腸菌用プラスミド1)BR322(約
4.4Kbp)を30μ旦の10 mM T ris
−HC1(pH7,5) 、 60 mM 、 Na
C1,7mMM(]Cjz水溶液に溶解させ、10ユニ
ツトの制限酵素CfaIにューイングランド・バイオラ
ブズ)を添加して、37℃で1時間切断反応を行なった
。
4.4Kbp)を30μ旦の10 mM T ris
−HC1(pH7,5) 、 60 mM 、 Na
C1,7mMM(]Cjz水溶液に溶解させ、10ユニ
ツトの制限酵素CfaIにューイングランド・バイオラ
ブズ)を添加して、37℃で1時間切断反応を行なった
。
制限酵素CfaIによる切断の後、フェノール抽出。
エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりDNAを
回収する。このDNAを30μ文の50 aMT rt
s−口Cf (1)口 7.4) 、 1001M
Na C1,101M MgSO4水溶液に溶解させ
、10ユニツトの制限酵素5alI(宝酒造)を添加し
て、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気法11i11(ゲル濃度0.8%)
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドDBR322の大部分
を含む約3.7K bpのDNAの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を3倍量(vol
/wt)の8M NaCfO4水溶液に溶解させた
。Chenらのグラスフィルター法[C,W。
回収する。このDNAを30μ文の50 aMT rt
s−口Cf (1)口 7.4) 、 1001M
Na C1,101M MgSO4水溶液に溶解させ
、10ユニツトの制限酵素5alI(宝酒造)を添加し
て、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気法11i11(ゲル濃度0.8%)
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドDBR322の大部分
を含む約3.7K bpのDNAの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を3倍量(vol
/wt)の8M NaCfO4水溶液に溶解させた
。Chenらのグラスフィルター法[C,W。
Chenら、 Anal 、 Biochem、101
. 339(1980)]により、約3,7KbpのD
NA断片(C1a I 4−4SalI)をアガロース
ゲルよす回収シた。
. 339(1980)]により、約3,7KbpのD
NA断片(C1a I 4−4SalI)をアガロース
ゲルよす回収シた。
先に得られたヒトTNF遺伝子の一部を含む約220b
11のDNA断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドpB R322
の大部分を含む約3.7K bpのDNA水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両DN
A断片の連結反応を行なった。
11のDNA断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドpB R322
の大部分を含む約3.7K bpのDNA水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両DN
A断片の連結反応を行なった。
エシェリヒア・コリC600r−s−株の形質転換は、
通常の(:、aCIz法(M、 V、 Noraard
らの方法)の改良法で行なった。すなわち、5#Ieの
し培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5
%Na C1,pH7,2)にエシェリヒア・コリC6
00「−一一株の18時間培i1基を接種し、菌体を含
む培養液の600rvにおける濁度(ODl、o)が0
.3に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウ
ム・バッフy−[0,IM Na C1,51M
MQ CLz 。
通常の(:、aCIz法(M、 V、 Noraard
らの方法)の改良法で行なった。すなわち、5#Ieの
し培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5
%Na C1,pH7,2)にエシェリヒア・コリC6
00「−一一株の18時間培i1基を接種し、菌体を含
む培養液の600rvにおける濁度(ODl、o)が0
.3に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウ
ム・バッフy−[0,IM Na C1,51M
MQ CLz 。
5 mM Tris−HCf (EIH7,6,0℃
〉]中で2回洗い、2dの冷したカルシウム・バッフ?
−[1001Mca C1z 、 250 1
M KCl、 5 1MMo C1z 、 51
M TriS−HCj (DH7,6゜0℃)]中に
再懸濁させ、0℃で25分間放置する。
〉]中で2回洗い、2dの冷したカルシウム・バッフ?
−[1001Mca C1z 、 250 1
M KCl、 5 1MMo C1z 、 51
M TriS−HCj (DH7,6゜0℃)]中に
再懸濁させ、0℃で25分間放置する。
次に菌体をこの容量の1/10にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2=1 (v
ol、 : vol、)混合する。この混合物を60分
間。
ーの中で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2=1 (v
ol、 : vol、)混合する。この混合物を60分
間。
0℃で保った後、1a+tのLBG培地(1%トリプト
ン、0.5%酵母エキス、1%NaCf、 0.08
%グルコース、pロア、2)を添加し、37℃で1時間
振とう培養する。培養液を、選択培地[アンピシリン(
シグマ)30μ9/ldを含むし培地プレート]に10
0μ皇/プレートの割合で接種する。プレートを37℃
で1晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたア
ンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてD
NAを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的の
プラスミドpTNFIBR(約4.0K bp)の取得
を確認した。第3図に、プラスミドpTNFIBRの作
成方法を示す。
ン、0.5%酵母エキス、1%NaCf、 0.08
%グルコース、pロア、2)を添加し、37℃で1時間
振とう培養する。培養液を、選択培地[アンピシリン(
シグマ)30μ9/ldを含むし培地プレート]に10
0μ皇/プレートの割合で接種する。プレートを37℃
で1晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたア
ンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてD
NAを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的の
プラスミドpTNFIBR(約4.0K bp)の取得
を確認した。第3図に、プラスミドpTNFIBRの作
成方法を示す。
以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドTN
F−8〜TNF−13を用いてプラスミドpTN’F2
N(約3.IKbl))を、合成オリゴヌクレオチドT
NF−14〜TNF−17を用いてプラスミドpTNF
3(約2.4K bp)を、それぞれ作成した。第4図
及び第5図に、プラスミドpTNF2N及びpTNF3
の作成方法を、それぞれ示す。
F−8〜TNF−13を用いてプラスミドpTN’F2
N(約3.IKbl))を、合成オリゴヌクレオチドT
NF−14〜TNF−17を用いてプラスミドpTNF
3(約2.4K bp)を、それぞれ作成した。第4図
及び第5図に、プラスミドpTNF2N及びpTNF3
の作成方法を、それぞれ示す。
こうして得られたヒトTNF遺伝子の一部を含むプラス
ミドpTNFIBR,pRNF2N及びEITNF3の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法[A、M、M
axamら、 MethOdSEnzygtol、、6
5. 499(1980) ]によって確認した。
ミドpTNFIBR,pRNF2N及びEITNF3の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法[A、M、M
axamら、 MethOdSEnzygtol、、6
5. 499(1980) ]によって確認した。
実施例4(ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドの作成)
実施例3で得られたプラスミドE)TNFIBR10μ
9を、実施例3と同様にして制限酵素CfaI及び5a
lIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度5%〉の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF
m伝子の一部を含む約220bpのDNA断片(Cfa
I 4−4SalI)をボIJ 7 りIJ 7L/
アミドゲルより回収した。
9を、実施例3と同様にして制限酵素CfaI及び5a
lIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度5%〉の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF
m伝子の一部を含む約220bpのDNA断片(Cfa
I 4−4SalI)をボIJ 7 りIJ 7L/
アミドゲルより回収した。
次に、実施例3で得られたプラスミドpTNF2 10
u9を 100μlの101M Tris−口CI(
pH7,5) 、 60 giM Na
C1,7mMMgCI2水溶液に溶解させ、40ユニツ
トの制限酵素PVtllI(宝酒造)を添加し、37℃
で1時間切断反応を行なった。そして、実施例3の方法
に単じて制限酵素5alIによる切断、ポリアクリルア
ミドゲル糟気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例2の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約170b
pのDNA断片(SalI+Pvulをポリアクリルア
ミドゲルより回収した。
u9を 100μlの101M Tris−口CI(
pH7,5) 、 60 giM Na
C1,7mMMgCI2水溶液に溶解させ、40ユニツ
トの制限酵素PVtllI(宝酒造)を添加し、37℃
で1時間切断反応を行なった。そして、実施例3の方法
に単じて制限酵素5alIによる切断、ポリアクリルア
ミドゲル糟気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例2の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約170b
pのDNA断片(SalI+Pvulをポリアクリルア
ミドゲルより回収した。
また、実施例3で得られたプラスミドpTNF3 10
u9も100μlのIOIM Trts−日CI(p
H7,5) 、 60 mM Na C1,7mMM
QCIz水溶液に溶解させ、40ユニツトの制限酵素p
vu[及び40ユニツトの制限酵素HindllI(宝
酒造〉を添加し、37℃で1時間切断反応を行なった。
u9も100μlのIOIM Trts−日CI(p
H7,5) 、 60 mM Na C1,7mMM
QCIz水溶液に溶解させ、40ユニツトの制限酵素p
vu[及び40ユニツトの制限酵素HindllI(宝
酒造〉を添加し、37℃で1時間切断反応を行なった。
そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5
%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子
の一部を含む約110bpのDNA断片(PvuI[4
−4Hind III ) ヲホlJ 7’) ’))
Lt7ミt’ゲルより回収した。
%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子
の一部を含む約110bpのDNA断片(PvuI[4
−4Hind III ) ヲホlJ 7’) ’))
Lt7ミt’ゲルより回収した。
一方、大1!1itrpプロモーターを有するプラスミ
ドE)YS31N(約a、7Kbp) 5μグを、上記
と同様に制限酵素C1aI及びHindnIで切断し、
アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実
施例3の方法に準じて、プラスミドpYs3INの大部
分を含む約4.71(bpのDNA断片(Cfa工+H
indn[)をアガロースゲルより回収した。
ドE)YS31N(約a、7Kbp) 5μグを、上記
と同様に制限酵素C1aI及びHindnIで切断し、
アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実
施例3の方法に準じて、プラスミドpYs3INの大部
分を含む約4.71(bpのDNA断片(Cfa工+H
indn[)をアガロースゲルより回収した。
こうして得られた、ヒトTNF31f伝子の一部を含む
約220bp、約170bp及び約110bl)の3つ
のDNA断片とプラスミドEIY S 31Nの大部分
を含む約4,7K bpのDNA断片とを混合し、エタ
ノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実
施例3の方法に準じてエシェリヒア・コリC600r−
1株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトTNF遺
伝子発現型プラスミドpTNF401NN(約5,2K
bl))を有するクローンを選択した。第6図に、その
プラスミドDTNF 401NNの作成方法を示した。
約220bp、約170bp及び約110bl)の3つ
のDNA断片とプラスミドEIY S 31Nの大部分
を含む約4,7K bpのDNA断片とを混合し、エタ
ノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実
施例3の方法に準じてエシェリヒア・コリC600r−
1株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトTNF遺
伝子発現型プラスミドpTNF401NN(約5,2K
bl))を有するクローンを選択した。第6図に、その
プラスミドDTNF 401NNの作成方法を示した。
また、上記プラスミドpYS3IN5μグを、上記の方
法に準じて制限酵素pvullで部分分解した後、さら
に制限酵素)1ind[[で切断し、アガロースゲル電
気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方法に準
じて、trpプロモーターを含む約2.7KbpのDN
A断片[PvuII(2)+口1ndl[[]ヲアガロ
ースゲルより回収した。
法に準じて制限酵素pvullで部分分解した後、さら
に制限酵素)1ind[[で切断し、アガロースゲル電
気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方法に準
じて、trpプロモーターを含む約2.7KbpのDN
A断片[PvuII(2)+口1ndl[[]ヲアガロ
ースゲルより回収した。
次に第7図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例2の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た2本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μグに
ついて、実施例3の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約2.7K b
pのDNA断片[pvuII(2)4−40indll
iと混合し、エタノール沈澱の後、実施例3の方法に準
じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例3の方法に準じてエシェリヒア・
コリC600r−1−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドEIAA41(約2.7K bl))
を有するクローンを選択した。このようなプラスミドは
、プラスミド1)YS31Nからコピー数制御領域を除
去し、trpプロモーター下流に存在するクローニング
・サイトの下流に大腸菌trp Aターミネータ−を付
与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第
7図にその作成方法を示した。
を、実施例2の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た2本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μグに
ついて、実施例3の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約2.7K b
pのDNA断片[pvuII(2)4−40indll
iと混合し、エタノール沈澱の後、実施例3の方法に準
じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例3の方法に準じてエシェリヒア・
コリC600r−1−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドEIAA41(約2.7K bl))
を有するクローンを選択した。このようなプラスミドは
、プラスミド1)YS31Nからコピー数制御領域を除
去し、trpプロモーター下流に存在するクローニング
・サイトの下流に大腸菌trp Aターミネータ−を付
与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第
7図にその作成方法を示した。
このプラスミドpAA41 2μ9を、上記と同様に制
限酵素CjaI及びHindllで切断し、アガロース
ゲル電気泳動(ゲル濃度088%)の後、実施例3の方
法に準じて、プラスミドpA A 41の大部分を含む
約2,7K bpのDNA断片(CjaI−Hindl
ll)をアガロースゲルより回収した。
限酵素CjaI及びHindllで切断し、アガロース
ゲル電気泳動(ゲル濃度088%)の後、実施例3の方
法に準じて、プラスミドpA A 41の大部分を含む
約2,7K bpのDNA断片(CjaI−Hindl
ll)をアガロースゲルより回収した。
また、先に得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミド
EITNF 401NN5μグを、上記と同様に制限酵
素CfaI及びHindl[で切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例2の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子全域を含む約490bp
のDNA断片<C1a I”Hind n[)をポリア
クリルアミドゲルより回収した。
EITNF 401NN5μグを、上記と同様に制限酵
素CfaI及びHindl[で切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例2の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子全域を含む約490bp
のDNA断片<C1a I”Hind n[)をポリア
クリルアミドゲルより回収した。
こうして得られた、プラスミドpA A 41の大部分
を含む約2,7K bpのDNA断片とヒトTNF遺伝
子全域を含む約490bpのDNA断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4−D
NAリガーゼによる連結反応を行なった。
を含む約2,7K bpのDNA断片とヒトTNF遺伝
子全域を含む約490bpのDNA断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4−D
NAリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、実施例3の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ600r−m−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpTN F 401A (約3.2Kb
p)を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトTNF遺伝子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第8図にその作成方法を示した。
コリ600r−m−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpTN F 401A (約3.2Kb
p)を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトTNF遺伝子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第8図にその作成方法を示した。
実施例5(新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成) 実施例4で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミド
pTNF 4o1A2oμ9を、実施例4の方法に準じ
て制限酵素CfaI及びHindI[Iで切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)及びアガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、それぞ
れ実施例2及び3め方法に準じて、生成する2つのDN
A断片(約490bp及び約2.7Kbp、両方共Cl
aIO口1ndll)をゲルより回収した。
ラスミドの作成) 実施例4で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミド
pTNF 4o1A2oμ9を、実施例4の方法に準じ
て制限酵素CfaI及びHindI[Iで切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)及びアガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、それぞ
れ実施例2及び3め方法に準じて、生成する2つのDN
A断片(約490bp及び約2.7Kbp、両方共Cl
aIO口1ndll)をゲルより回収した。
ここで得られたヒトTNF遺伝子全域を含む約490b
pのDNA断片を50N文の10 mM Tris−
HIJ (1)H7,4) 、 10mM MIJ
804 、1 1Mジチオスレイトール水溶液に溶解さ
せ、10ユニツトの制限酵素HapII(宝酒造)を添
加して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度5%〉
を行ない、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子
の大部分を含む約390bpのDNA断片(口ap1[
MHindl[[)をポリアクリルアミドゲル収した。
pのDNA断片を50N文の10 mM Tris−
HIJ (1)H7,4) 、 10mM MIJ
804 、1 1Mジチオスレイトール水溶液に溶解さ
せ、10ユニツトの制限酵素HapII(宝酒造)を添
加して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度5%〉
を行ない、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子
の大部分を含む約390bpのDNA断片(口ap1[
MHindl[[)をポリアクリルアミドゲル収した。
また、第9図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例2の方法に準じて、合成。
ドを、実施例2の方法に準じて、合成。
精製した。得られた4本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ0.5μ9について、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。
ぞれ0.5μ9について、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、得られた2本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約2.7K bpのDNA断片<Cla I
4−hH ind m )及びヒトTNF3!伝子の大
部分を含む約390bllノD N A断片(日apl
I+口indI[[)と混合し、エタノール沈澱の後、
実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方法に準
じてエシェリヒア・コリC 6GOr−ト殊に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミド1)TNF471
(約3.2Kbl))を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは、次のアミノ酸配列(82N)−ArO
Lys−Arg Lys−P ro− V al−
A la−口is − V al − V.al −
A la −A an − P rO− G In
− A Ia − G Iu − G IV − G
In −L eu− G In − T rt) −
L eu − A Sn − A rO − A rl
) −A la − A sn − A Ia−L e
u − L eu − A la − A sn −G
Iy − V al − G Iu − L eu
− A ro − A sp − A sn −Gln
− Leu−Val−Val − Pro−Ser−
Glu −Gly− Leu−Tyr−Leu − 1
1e−Tyr−Ser −G In − V at
− L eu − P he − L VS− G l
y − G In −G ly − C yS− P
rO − S er − T hr − H is −
V at −L eu − L eu − T hr
−口is − Thr − 1 le − S er
−A ro− I Ie − A la− Val−
Ser−Tyr− G In −Thr − Lys
− Vat − A sn − Leu − L eu
− S er −Ala − 1 1e−LyS−S
er−pro−Cys−QlnA rg− G lu−
T hr− P ro − G lu− G Iy
− A la−G Iu− A Ia− L ys−
P ro− T rp− T yr− G Iu−P
ro− 1 1e− Tyr− Leu− G Iy−
G ly− Val−Phe−Gln − L eu
−Qlu − LVs−Gly−Asp −Arl)−
Leu−Ser−Ala−Glu− 1 le−As
n−A rg− P ro− A so− Tyr−
Leu− A sp− Phe−A la− G lu
− S er− G Iy− G In− Val−
Tyr−Phe−GIV−11e−11e−Ala−L
eu−(COOH) で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にMetが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第9図にその作成方法を示した
。
に得られた約2.7K bpのDNA断片<Cla I
4−hH ind m )及びヒトTNF3!伝子の大
部分を含む約390bllノD N A断片(日apl
I+口indI[[)と混合し、エタノール沈澱の後、
実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方法に準
じてエシェリヒア・コリC 6GOr−ト殊に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミド1)TNF471
(約3.2Kbl))を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは、次のアミノ酸配列(82N)−ArO
Lys−Arg Lys−P ro− V al−
A la−口is − V al − V.al −
A la −A an − P rO− G In
− A Ia − G Iu − G IV − G
In −L eu− G In − T rt) −
L eu − A Sn − A rO − A rl
) −A la − A sn − A Ia−L e
u − L eu − A la − A sn −G
Iy − V al − G Iu − L eu
− A ro − A sp − A sn −Gln
− Leu−Val−Val − Pro−Ser−
Glu −Gly− Leu−Tyr−Leu − 1
1e−Tyr−Ser −G In − V at
− L eu − P he − L VS− G l
y − G In −G ly − C yS− P
rO − S er − T hr − H is −
V at −L eu − L eu − T hr
−口is − Thr − 1 le − S er
−A ro− I Ie − A la− Val−
Ser−Tyr− G In −Thr − Lys
− Vat − A sn − Leu − L eu
− S er −Ala − 1 1e−LyS−S
er−pro−Cys−QlnA rg− G lu−
T hr− P ro − G lu− G Iy
− A la−G Iu− A Ia− L ys−
P ro− T rp− T yr− G Iu−P
ro− 1 1e− Tyr− Leu− G Iy−
G ly− Val−Phe−Gln − L eu
−Qlu − LVs−Gly−Asp −Arl)−
Leu−Ser−Ala−Glu− 1 le−As
n−A rg− P ro− A so− Tyr−
Leu− A sp− Phe−A la− G lu
− S er− G Iy− G In− Val−
Tyr−Phe−GIV−11e−11e−Ala−L
eu−(COOH) で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にMetが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第9図にその作成方法を示した
。
一方、上記で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラス風
ドpTNF 471 20μ9を、実施例4の方法に
準じて!II限酵素t−1indll[で切断した後、
50mM Tris −HCj ( t)口 7
.4)、 100 1MNa (J,10 11M
Mg804水溶液中で制限酵素NcoI(宝、酒造〉
による切断反応を37℃で1時間行なう。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.7%)及びポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%〉を行ない
、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を
含む約140bpのDNA断片(NCOI4−4H i
nd m )をポリアクリルアミドゲルより、そして実
施例3の方法に準じて、l)TNF471の大部分を含
む約3,OKbpのDNA断片(NcoI+Hind
[1)をアガロースゲルより、それぞれ回収した。
ドpTNF 471 20μ9を、実施例4の方法に
準じて!II限酵素t−1indll[で切断した後、
50mM Tris −HCj ( t)口 7
.4)、 100 1MNa (J,10 11M
Mg804水溶液中で制限酵素NcoI(宝、酒造〉
による切断反応を37℃で1時間行なう。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.7%)及びポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%〉を行ない
、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を
含む約140bpのDNA断片(NCOI4−4H i
nd m )をポリアクリルアミドゲルより、そして実
施例3の方法に準じて、l)TNF471の大部分を含
む約3,OKbpのDNA断片(NcoI+Hind
[1)をアガロースゲルより、それぞれ回収した。
さらに、上で得られた約140bpのDNA断片(Nc
oI+Hind II[>を50μ旦の10mM T
ris−口CI ( EIH 7.4) 、 10
1M M(1 804 、 1111Mジチオス
レイトール水溶液に溶解させ、10ユニツトの制限酵素
ACCI(宝酒造〉を添加して、37℃で1時間切断反
応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(ゲル濃度8%〉を行ない、実施例2の方法に準
じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約110bpのD
NA断片( N (OI+Acc工)をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。
oI+Hind II[>を50μ旦の10mM T
ris−口CI ( EIH 7.4) 、 10
1M M(1 804 、 1111Mジチオス
レイトール水溶液に溶解させ、10ユニツトの制限酵素
ACCI(宝酒造〉を添加して、37℃で1時間切断反
応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(ゲル濃度8%〉を行ない、実施例2の方法に準
じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約110bpのD
NA断片( N (OI+Acc工)をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。
また、第10図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例2の方法に準じて、合成。
チドを、実施例2の方法に準じて、合成。
精製した。得られた2本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ0.5μグについて、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。
ぞれ0.5μグについて、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。
アニーリングの後、得られた2本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約3.OK bpのDNA断片(Nc
oI+Hind III )及びヒトTNF遺伝子の一
部含む約1iobpのDNA断片(NcoI+AccI
)と混合し、エタノアル沈殿の後、実施例3の方法に準
じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例3の方法に準じてエシェリヒア・
コリC600r−m−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミド1)TNF655(約3.2K bl
))を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
次のアミノ酸配列 (口z N) −ArlJ−Lys−ArO−Lys
−Pro−Val−AIa−口is −V al −V
al−A la −A sn−P ro−G ln−
A Ia−G Iu−G ly−G In −L el
J−G ln−T rD−L eu −A Sn −A
rQ −A r(ll−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn −G +y−V al
−G lu−L eu−A rQ−A 5l)−A 5
n−Gln−Leu−Vat−Vat−Pro−8er
−Glu−G Iy−Leu−Tyr−Leu−I
Ie−Tyr−5er−G In−Val−Leu−P
he−Lys−G ly−G In −G ly−Cy
s−P ro−S er−T hr−His−V at
−1−eu−Leu−Thr−His−Thr−I
1e−8er−A ra−I le−A la−Val
−5er−Tyr−G In−T hr−L yS−V
al−A an−Leu−Leu−S er−A la
−11e−Lys−5er−Pro−Cys−G In
−A r<1− G lu−Thr−P ro−G l
u−G ly−A Ia−G lu−A la−LVS
−P rO−T rl)−TVr−G 1u−P ro
−1le−Tyr−Leu−G Iy−G Iy−Va
l−Phe−G In−Leu−G Iu−Lys−G
ly−A 5p−Ara−Leu−8er−A Ia
−Glu−I Ie−Asn−A rQ−P ro−
A 5EI−TVr−L ell−A Sp−Phe−
A la−G Iu−S er−G ly−G ln−
Val−Tyr−Phe −G Iy −1le −I
Ie −A Ia −Phe −Leu −Ara−
Ara−(COOH) で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第10図にその作成方法を示した。
を、先に得られた約3.OK bpのDNA断片(Nc
oI+Hind III )及びヒトTNF遺伝子の一
部含む約1iobpのDNA断片(NcoI+AccI
)と混合し、エタノアル沈殿の後、実施例3の方法に準
じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例3の方法に準じてエシェリヒア・
コリC600r−m−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミド1)TNF655(約3.2K bl
))を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
次のアミノ酸配列 (口z N) −ArlJ−Lys−ArO−Lys
−Pro−Val−AIa−口is −V al −V
al−A la −A sn−P ro−G ln−
A Ia−G Iu−G ly−G In −L el
J−G ln−T rD−L eu −A Sn −A
rQ −A r(ll−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn −G +y−V al
−G lu−L eu−A rQ−A 5l)−A 5
n−Gln−Leu−Vat−Vat−Pro−8er
−Glu−G Iy−Leu−Tyr−Leu−I
Ie−Tyr−5er−G In−Val−Leu−P
he−Lys−G ly−G In −G ly−Cy
s−P ro−S er−T hr−His−V at
−1−eu−Leu−Thr−His−Thr−I
1e−8er−A ra−I le−A la−Val
−5er−Tyr−G In−T hr−L yS−V
al−A an−Leu−Leu−S er−A la
−11e−Lys−5er−Pro−Cys−G In
−A r<1− G lu−Thr−P ro−G l
u−G ly−A Ia−G lu−A la−LVS
−P rO−T rl)−TVr−G 1u−P ro
−1le−Tyr−Leu−G Iy−G Iy−Va
l−Phe−G In−Leu−G Iu−Lys−G
ly−A 5p−Ara−Leu−8er−A Ia
−Glu−I Ie−Asn−A rQ−P ro−
A 5EI−TVr−L ell−A Sp−Phe−
A la−G Iu−S er−G ly−G ln−
Val−Tyr−Phe −G Iy −1le −I
Ie −A Ia −Phe −Leu −Ara−
Ara−(COOH) で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第10図にその作成方法を示した。
実施例6(発現の確認)
前記実施例5で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドpTNF655を有するエシェリ
ヒア・コリCeoor−一一株を、30μり/dのアン
ピシリン、0.2%のグルコース及び4FIl’j/r
dのカザミノ酸を含むM9培地[0,6%NazロPO
4−0,3%に2 HPO4−0,05%NaCff1
−0.1%N口4 Cj水溶液(0口 7.4)をオー
トクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌し
たMgSO4水溶液及びCaCf2水溶液をそれぞれ最
終濃度2 mM及び0.1 mMになるように加える。
伝子発現型プラスミドpTNF655を有するエシェリ
ヒア・コリCeoor−一一株を、30μり/dのアン
ピシリン、0.2%のグルコース及び4FIl’j/r
dのカザミノ酸を含むM9培地[0,6%NazロPO
4−0,3%に2 HPO4−0,05%NaCff1
−0.1%N口4 Cj水溶液(0口 7.4)をオー
トクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌し
たMgSO4水溶液及びCaCf2水溶液をそれぞれ最
終濃度2 mM及び0.1 mMになるように加える。
1 200dに接種し、OD/、ldが0.7に達する
まで、37℃で振とう培養を行なった。次いで、最終濃
度50μg/rdの3−β−インドールアクリル酸を培
養液中に添加し、さらに37℃で12時時間上う培養を
続けた。
まで、37℃で振とう培養を行なった。次いで、最終濃
度50μg/rdの3−β−インドールアクリル酸を培
養液中に添加し、さらに37℃で12時時間上う培養を
続けた。
遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、PBSバッフy
−(150mM Na (Jを含む20 mMリン
酸バッファー pH7,4)を用いて菌体の洗浄を行な
った。洗浄後の菌体を10dのPBSバッファーに懸濁
させ、超音波発生装置(久保田、 200M型)を用
いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の除去
を行なった。
−(150mM Na (Jを含む20 mMリン
酸バッファー pH7,4)を用いて菌体の洗浄を行な
った。洗浄後の菌体を10dのPBSバッファーに懸濁
させ、超音波発生装置(久保田、 200M型)を用
いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の除去
を行なった。
得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Tris−
HClバッファ −(t186.8) 、 SDS、
2−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度60mM、2%、4%、10%になるように加
え、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動[鈴木、
遺伝、 31.43 (1977) 1を行なった。
HClバッファ −(t186.8) 、 SDS、
2−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度60mM、2%、4%、10%になるように加
え、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動[鈴木、
遺伝、 31.43 (1977) 1を行なった。
分離用ゲルは15%とし、泳動バッファーはSO8゜T
ris−グリシン系[Ll、 K、 Laemmli
。
ris−グリシン系[Ll、 K、 Laemmli
。
Nature 、 227. 680(1970)
] ヲ用イタ。電気泳動翳了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシープルーR−250(バイオ・ラッド)で染色し、
新規抗11!活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行
なった。
] ヲ用イタ。電気泳動翳了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシープルーR−250(バイオ・ラッド)で染色し、
新規抗11!活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行
なった。
実施例7(活性の評価)
新規抗腫瘍活性ポリペプチドのin VitrO抗癌活
性測定は、前記Ruffの方法に準じて行なった。
性測定は、前記Ruffの方法に準じて行なった。
すなわち、実施例6で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
100μ旦と、4 x io’個/dの濃度のマウスL
−929繊維芽細胞(ATCCCCL929)懸濁液1
00μ文を、9も穴の組織培養用マイクロプレート(コ
ースタ−〉内で混合した。なおこの際に、最終濃度1μ
g/−のアクチノマイシンD〈コスメゲン、萬有製薬〉
を添加しておく。
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
100μ旦と、4 x io’個/dの濃度のマウスL
−929繊維芽細胞(ATCCCCL929)懸濁液1
00μ文を、9も穴の組織培養用マイクロプレート(コ
ースタ−〉内で混合した。なおこの際に、最終濃度1μ
g/−のアクチノマイシンD〈コスメゲン、萬有製薬〉
を添加しておく。
培地としては、5%(vol /vol )のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地(
日永製薬)を用いた。上記マイ−クロプレートを、5%
炭酸ガスを含む空気中、37℃で18〜20時間培養し
た後、クリスタル・バイオレット溶液[5%(vol/
vol )メタノール水溶液に、0.5%(wt/vo
l )のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの]
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを100μ文の0.5%SDS水溶液で抽出し
、その595niにおける吸光度をELISAアナライ
ザー(東洋側器。
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地(
日永製薬)を用いた。上記マイ−クロプレートを、5%
炭酸ガスを含む空気中、37℃で18〜20時間培養し
た後、クリスタル・バイオレット溶液[5%(vol/
vol )メタノール水溶液に、0.5%(wt/vo
l )のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの]
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを100μ文の0.5%SDS水溶液で抽出し
、その595niにおける吸光度をELISAアナライ
ザー(東洋側器。
ETY−96型)で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の50%の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ(たとえば第11図)によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第11図より、発現型
プラスミドpTN「619にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート100μAは1
000ユニツト程度の活性を有していることが明らかに
なった。
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の50%の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ(たとえば第11図)によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第11図より、発現型
プラスミドpTN「619にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート100μAは1
000ユニツト程度の活性を有していることが明らかに
なった。
第1図は設計したヒトTNF遺伝子の塩基配列を、第2
図は化学合成した合成オリゴヌクレオヂドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第3図、第4図及び第5
図は、ヒトTNF遺伝子の一部を有するプラスミドpT
NFIBR,pTNF2N及びpTNF3の作成方法を
、それぞれ示したものである。第6図はヒトTNF遺伝
子発現型プラスミドE)TNF 401NNの作成方法
を、第7図は発現ベクターDA A 41の作成方法を
、そして第8図はヒトTNF遺伝子発現型プラスミドD
TNF 401Aの作成方法を、それぞれ示したもので
ある。第9図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドE)TNF471の作成方法を示したものであ
る。第10図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドDTNF655の作成方法を示したもので
ある。第11図は新規族ll#A活性ポリペプチドのi
n VitrO抗癌活性測定結果を示したものである。 第 4 図 NF−8 廿伊−10 T?JF−12 vuH 第 図 第 7図のA (11−一−−−−−−→ (5”)−AGCTTAGCCCGCCTAATGAG
CGGGCTTTTTTTT−(3−)(3−) −A
TCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAA
AAA−(5−)トー−(2)−一一一一一→ 第 図 の pvul+(1) 第 図 大断片 小断片 Hindlll 第 9 図 の H1nd厘 第 0 図 のA 第 10 図 のB 第 1 図 希釈倍率
図は化学合成した合成オリゴヌクレオヂドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第3図、第4図及び第5
図は、ヒトTNF遺伝子の一部を有するプラスミドpT
NFIBR,pTNF2N及びpTNF3の作成方法を
、それぞれ示したものである。第6図はヒトTNF遺伝
子発現型プラスミドE)TNF 401NNの作成方法
を、第7図は発現ベクターDA A 41の作成方法を
、そして第8図はヒトTNF遺伝子発現型プラスミドD
TNF 401Aの作成方法を、それぞれ示したもので
ある。第9図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドE)TNF471の作成方法を示したものであ
る。第10図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドDTNF655の作成方法を示したもので
ある。第11図は新規族ll#A活性ポリペプチドのi
n VitrO抗癌活性測定結果を示したものである。 第 4 図 NF−8 廿伊−10 T?JF−12 vuH 第 図 第 7図のA (11−一−−−−−−→ (5”)−AGCTTAGCCCGCCTAATGAG
CGGGCTTTTTTTT−(3−)(3−) −A
TCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAA
AAA−(5−)トー−(2)−一一一一一→ 第 図 の pvul+(1) 第 図 大断片 小断片 Hindlll 第 9 図 の H1nd厘 第 0 図 のA 第 10 図 のB 第 1 図 希釈倍率
Claims (10)
- (1)次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
- (2)アミノ末端にMetが結合していることを特徴と
する請求項1記載のポリペプチド。 - (3)次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
るDNA領域を含む組換えプラスミド。 - (4)該DNA領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DN
Aとから成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする請求
項3記載のプラスミド。 - (5)該DNA領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DN
Aとから成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする請求
項3記載のプラスミド。 - (6)該プラスミドがプラスミドpTNF655である
請求項3記載のプラスミド。 - (7)次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
るDNA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。 - (8)該微生物細胞がエシェリヒア・コリ (Escherichia coli)であることを特
徴とする請求項7記載の微生物細胞。 - (9)次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプトチドをコード
するDNA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。 - (10)抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1316404A JPH03180193A (ja) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | 新規生理活性ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1316404A JPH03180193A (ja) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | 新規生理活性ポリペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03180193A true JPH03180193A (ja) | 1991-08-06 |
Family
ID=18076698
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1316404A Pending JPH03180193A (ja) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | 新規生理活性ポリペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03180193A (ja) |
-
1989
- 1989-12-07 JP JP1316404A patent/JPH03180193A/ja active Pending
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