JPH02177896A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポ、リペブチド
をコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プ
ラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び
該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規
ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略
すこともある）、該ポリペプチドをコードするり、Ｎ△
領領域含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形
質転換され１〔組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（Ｃ，ＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

Ａｌａｌ−−アラニン Ａｒ（ＩＬ−アルギニン ＡＳｎｌ−−アスパラギン ＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸 ＣｙｓＬ−システィン Ｇ１ｎ１−−グルタミン ＧＩＬＩ　　Ｌ−グルタミン酸 ＧＩＶ　　グリシン １−１ｉｓｌ−−ヒスチジン １１ｅｌ−イソロイシン １ｅｕｌ−一ロイシン ＬｙｓＬ−リジン Ｍｅｔ　　ｌ−−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒＯ＋−一プロリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐｌ−ｔ−リプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−ヂロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

△　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３ｒ
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓ
ｌｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある
）と名づけだ［’Ｅ　、　Ａ　、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら
、　ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になッテ、ｐｅｎｎｉＣａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ、　　ｐ　ｅｎ
ｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２
４（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、３ｈｉｒ
ａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［宗利ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇら
、　３ｃｌｅｎｃｅ、ユ２８．　１４９（１９８５）　
　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　ｌｙｊ　
ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、
　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を仙のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓｊり及びＣｙ　ｓ　／Ｄ／のいず
れか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置
換（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭
６ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　１１７θゝの他のアミノ
酸残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭
６１２３８０４８号）、Ａｌａ［＋の弛のアミノ酸残基
への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告されて
いる。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失につい
ても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有してい
ること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失
ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１９
００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害
活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６
／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有していること（特願昭６１１１４７５４号）
、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有している
こと（特願昭６１１７３８２２号）、及び７アミノ酸欠
失ＴＮＦを基盤として、Ｐ「０８Ｓ　ｅｒ９Ａ　５ＤＩ
ＯをＡ　ｒ（ＩＩ　”ｌ’ｓＡ　ｒｇへ置換ヲ行なウド
、その比活性が大きく上昇することが報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行なった
ところ、アミノ末端側の７アミノ酸を欠失させ、かつＰ
ｒｏ”　５ｅｒ９　ＡＳｐｌｏをＡ　ｒ！Ｉｔ　Ｌ　Ｖ
ＳＡ　ｒ（Ｉへ置換させた形のヒトＴＮＦ改変体を基盤
として、さらにＡｌａ’“　１　ｅｕｙｆ’７の他のア
ミノ酸残基への置換を行なうことにより、その比活性が
さらに大ぎく上昇することを見出し、本発明を完成する
に至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に伯の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ　）　−Ａｒ（］　　］ＬＶ ＳＰｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＨｉｓＶａＡ　５ｎ−Ｐ　
ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕＬ　ｅｕ　−
Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎＡ　Ｉａ−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−１ｅｕＧ　ｌｙ
　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　１ｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇＧ　
Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｌ−Ｖ　ａｌ−Ｐ　ｒ。

Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ−ＩｌｅＧ
　Ｉｎ　−Ｖ　ａｔ　−ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｖ
ｓＧ　１ｙ−ＣＶＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｐ　−Ｔ　ｈ
ｒＬ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｈ
ｒＡ　ｒａ　−１ｌｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｖ　ａｔ−８ｅ
ｒＡｒ（１−１４３ Ｖａｌ−Ａｌａ Ｇｌｙ−Ｑｌｎ Ａ　ｒ（Ｊ−Ａ　ｒ（＋ Ａｌａ−Ａｓｎ Ａｓｐ−Ａｓｎ ３ｅｒ−ＧＩＬＩ Ｔｙｒ−３ｅｒ Ｑ＋ｙ−Ｑｌｎ− Ｈｉｓ−Ｖａｌ Ｉ　Ｉｅ−３ｅｒ １”ｙｒ−Ｑｌｎ Ｔｈｒ−ＬＶＳ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ
−８ｅｒＡ　ｌａ　−（ｌｅ−１ｙｓ−、Ｓ　ｅｐ−Ｐ
　ｒｏ−Ｃｙｓ＝　Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｏ−Ｇ　１ｕ−
Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　１ｙ−Ａ　１
ａＱｌｕ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔ
ｙｒ−ＧｌｕＰ　ｒ（１−Ｉ　　ｌｅ−ＴＶｒ−Ｌｅｕ
−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　＋ｙ−ＶａＰ　ｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　＋ｕ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　＋ｙ−Ａ　ＳｌｌＡｒｇ
−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ＝Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ
Ａｒａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ−ＡＳＤ　
−ＰｈｅＡｌａ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−ＴｙｒＰｈｅ−Ｇｌｙ　−Ｉ　１ｅ−Ｔ　１ｅ−
Ｘ−Ｐｈｅ（ＣＯＯＨ） において×が任意のアミノ酸であるような新規生理活性
ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合して
いるポリペプチド、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提
供することによって達成され、更にかくして得られた組
換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物細
胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドを含有する医薬組成物を提供することによっ
て達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致さゼた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとり７レムを一致させた形での翻訳終止コドン
（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとつわり好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
１へＴＮＦＩ伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［１−１，Ｇ、　Ｋｈｏｒａ
ｎａ。

”　Ｓ　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　
Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ３ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、Ｊｏｈｎ
　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　Ｉｎｃ、、
Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］。

１〜リエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｌら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　　ｌ　　ｅｔｔ、、　　２
１　、　　７１９（１９８０）　　］　　があるが、合
成時間、収率、操作の簡便さ等の血から、全自動ＤＮＡ
合成機を用いたホスファイト法による合成が好ましい。

合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラム
による高速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もし
くは組合ゼて用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａリガゼを用い−Ｃ連結する。合成
オリゴヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦ３１］伝子を
作成する方法としては、合成オリゴヌクレオチドをいく
つかのブロックに分【プて連結し、たとえばｐＢＲ３２
２［Ｆ　、　　Ｂ　ｏｆ　１ｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ’
　、　　２　、　９５（１９７７）　］のようなベクタ
ーに一度クローン化した後、それらの各ブロックのＤＮ
Ａ断片を連結する方法が好ましい。このようなヒトＴＮ
Ｆ遺伝子を構成するブロックのＤＮＡ断片を含むプラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴ　Ｎ　Ｆ　２　ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルカー））配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、Ｐロプロモター、　
ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒｐ
プロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有す
るプラスミドとして、好ましくはｐＹ　Ｓ　３ＩＮ　、
又はＩ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大賜菌で効率良く機能するターネーターを付与す
ることができる。このようなターミネータ−として、１
ｐｐターミネータｔｒｐターミネータ−等があげられる
が、とりわけｔｒｌ）　Ａターミネータ−が好適であり
、ｔｒｌ）　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
で、好ましくはＩＩＡ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＩＩＢＲ３２２由来
のベクターにクローン化することにより、発現型プラス
ミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
として、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ４
０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクロン化； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペブヂドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくは　ｐＴＮＦ６３３又は　
ｐＴＮＦ６３４が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるだめの微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわ（プ大腸菌［エシ
ェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｔ
　ｉ　）　］が好ましい。前記ヒ１−　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝
子発現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　
Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ、β−，２７９（１９７８）　］を用いて、微
生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ
株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ”　、　　Ｐ　　４４０．　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒ＋
ｎｇ１−１ａｒｂｏｒ　　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、
　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげ
られ、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加す
るのが望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条
件、たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３
７°Ｃで２〜３６時間行なう。また、培養開始時または
培養中に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、
３−β−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることも
できる。

培養後、ＩＣとえば遠心分離により組換え微生物細胞を
集め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば
超音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離
により組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られた
ライゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以
下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白
質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦＩ白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　ら、前出〉、
マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　Ｖｉｔ
ｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ、　　Ｔｍｍｕｎｏ
ｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　］等により行
なえる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、ｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）等に関する検討
が可能となる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ＞をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
制限酵素Ｃ５ａ工による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素Ｈｉｎｄｌ［ｌによる切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子は、第２図に示したよ
うに１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オ
リゴヌクレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプラ
イド・バイオシステムズ。

モデル３８ＯＡ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわら、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５−の溶出用バック７　　［５００１１
１Ｍ　　Ｎ’Ｈａ　ＯＡＯ−１ｍＭＦＤＴＡ−０，１％
ＳＤＳ　（＋）Ｈ７，５）　］を加え、３１℃で一晩振
とうした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の
回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む
溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＣ，５０）にか
けることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得
た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上
をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−Ｌ７）を用いて、ヒトＴＮＦＩ伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μｌの５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（１）８９．５）　、　１０　ｍ
Ｍ　　Ｍ！ＩＩ　（Ｊｚ　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７°Ｃで、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μびの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ１及びＴＮ
Ｆ−７を加え、９０°Ｃで５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μρの６６　ｎ＋
ＭＴｒｌｓ−ＨＣＲ（ｐＨ７，６＞　、　　６．６　ｍ
Ｍ　　ＭＣ＋　（Ｊ２　。

１０　ｍＭジチオスレイトール、１　ｍＭ　ＡＴＰ水溶
液に溶解させ、３００ユニツトのＴｌ−ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行な
った。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度５％）を行ない、■チジウムブロマイド染色法
により泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ
（約２２０ｂｌ）　）のバンド部分を切出して、実施例
２の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを
回収する。

方、３μびの大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約４
．４Ｋｂｐ）を３０ｔｔ　磨（７）１０　ｍＭ　　Ｔ　
ｒｉｓ−ＨＣＲ（ＤＨ７，５＞　、　６０　ｍＭ　　Ｎ
ａ　ＣＪ、　７　ｍＭＭｇＣＲ２水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素Ｃｆａ工にューイングランド・バ
イオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。

制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ磨の５０　ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＪ　（ｐＨ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　Ｎ
ａ　ＣＬ　１０１１１ｙｌ　　Ｍ（］ＳＯ４水溶液に溶
解させ、１０ユニツ］・の制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造
）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％
）を行ない、エヂジウムブロマイド染色法により切断パ
ターンの観察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバ
ンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏ
ｌ　７ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣ９０４水溶液に溶解させ
た。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，ＷＣｈｅｎ
ら、　Ａｎａｌ　、　３ｉｏｃｈｅｍ、　　１０１．　
３３９（１９８０）　］により、約３．７ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片（（ＪａＩく→５ａｌＩ）をアガロースゲルより
回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ３１１仏子の一部を含む約２２
０ｂｌ）のＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末
端のリン酸化反応を行なった後、プラスミド１）ＢＲ３
２２の大部分を含む約３．７）（ｂｐのＤＮＡ水溶液と
混合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両
ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株の形質転換は、
通常のＣａｆＪｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのＬ培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ　
ＣＬ　　Ｉ）Ｈ７，２）にエシェリヒア・］すＣ６Ｃ６
００ｒ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養
液の６００μｍにおける濁度（ＯＤ、ｆ、ρ）が０．３
に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・
バッフｐ　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＪ、　　５　　ｍ
Ｍ　、　ＭＯＣＢ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ（
ＩＩＨ７，６，０℃〉］中で２回洗い、２−の冷したカ
ルシウム・バッファ［１００１１１ＭＣａ　ＣＲｚ　、
　２５０　　ｍＭ　　ＫＣＲ，５ｍＭＭｇ（Ｊ２．５　
　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（１）Ｈ７，６゜０℃）
］中に再懸濁させ、Ｏ′Ｃで２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１−のＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８％グ
ルコース、　　ｐＨ７，２＞を添加し、３７°Ｃで１時
間撮とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）３０μ９／ｄを含むし培地プレート］に１０
０μρ／プレートの割合で接種する。プレトを３７℃で
１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアン
ピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮ
Ａを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のプ
ラスミドｐＴＮＦｌＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ＞の取得を
確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作成
方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｉ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドρＴＮＦ２Ｎ
　（約３．ＩＫｂｌｌｌ）を、合成オリゴヌクレオチド
ＴＮＦ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミド１ｌＴ
ＮＦ３（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第
４図及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮ
Ｆ３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴ、ＮＦ遺伝子の一部を含むプラ
スミドＩ）ＴＮＦｌＢＲ，１）ＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ
３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設
計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　
Ｍ、、Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥ　ｎｚｙｍｏ
ｌ、、６５．　４９９　（１９８０）　］によって確認
した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素（ＪａＩ及び３ａｌ
：［で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ
　ｌ−８ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
ｕｃｉを１００μＭの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
４（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲ，７
ｍＭＭｉｌ（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ＰＶＩＪＩＩ（宝酒造）を添加し、３７°Ｃで１
時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準
じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に
準じて、ヒ１〜ＴＮ　Ｆ遺伝子の一部を含む約１７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕｌＩ）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
１１ｇも１００μ旦の１０　ｍＭＴｒｌｓ−ＨＣ１＜　
　Ｉ）Ｈ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ９，７
’ｍＭＭ（ＩＣ９２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ｐｖｕ■及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄ
ｎｌ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行
なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐ　
ｖｕ［＜−＊　ｉｆ　＋ｎｄ　ｍ　）をポリアクリルア
ミドゲルより回収し１＝　。

方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＹ
ｓ３１Ｎ＜約４，７Ｋｂｐ）　５μ９を、上記と同様に
制限酵素ＣｊａＩ及び日ｉｎｄ　ｍで切断し、アガロー
スゲル電気泳動くゲル′ａ度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＩ］ＹＳ３ＩＮの大部分を
含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＪａＩく→ｌ−
１ｉｎｄｌ［をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦｌ仏子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０１）　＋１の３つ
のＤＮＡ断片とプラスミドｐＹｓ３１Ｎの大部分を含む
約４．７ＫｂｆｌのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じで、Ｔ　／１．−　Ｄ
　ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後
、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６
００ｒ−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴ
ＮＦ遺伝子発現型プラスミドＤＴＮＦ４０１ＮＮ（約５
．２Ｋ　ｂ［ｌ）を有するクローンを選択した。第６図
に、そのプラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示
した。

また、上記プラスミドｐＹＳ３ＩＮ５μｑを、上記の方
法に準じて制限酵素ＰＶＬＩＩＩで部分分解した後、さ
らに制限酵素１−１ｉｎｄｌｌで切断し、アガロスゲル
ミ気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に
準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐの
ＤＮＡ断片［Ｐ　ｖＪ　ｆ２）”　Ｉ−１ｉｎｄ　ＩＩ
Ｉ　］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μｑに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先ニ１ＪＩＢｈり約２．７Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ　ｆ２）”　ｌ−１ｉｎ
ｄ　ＩＩ［］と混合し、エタ７−／Ｌ４［ｆ７）ｆｆｌ
、実施例３の方法に準じて、Ｔ　／ｌ−Ｄ　Ｎ　Ａリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ株に
導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４
１（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。

このようなプラスミドは、プラスミドｐＹｓ３ＩＮから
コピー数制御領域を除去し、ｊｒｐプロモーター下流に
存在するクローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　
Ａターミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発
現ベクターで゛あり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｔ’１ＡＡ４１　２μｑを、上記と同様
に制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｎ［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＤＡ　Ａ　４４の大部分ヲ
含ム約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ９ａＩ−１−ｌ
　ｉｎｄ　ＩＩＩ　）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐ”ｒ　Ｎ　Ｆ２Ｏ３Ｎ　Ｎ　５μｑを、上記と同様に
制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施
例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４
９０ｂｒｌのＤＮＡ断片（（ｌａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　ｍ　
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｔｌｌのＤＮＡ断片とを混合
し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ
４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＩＩＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を月＼　し　ｌこ　。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プフスミド
ＩＩＴＮＦ　４０１Ａ２０μ３を、実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃｊａ工及びＨｉｎｄｌで切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガロ
ースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、それぞれ
実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮＡ
断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋ　ｂｐ、両方共（ｌ
ａ　Ｉ４−＋ｌ−１ｉｎｄ　ＩＩＩ　）をゲルより回収
した。

ここで得られたヒトＴＮ　ＦＪ伝伝令全域含む約４９０
ｂｐのＤＮＡ断片を５０μすの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓｌ
−ｆｃｉＩ）ｌ−１７，４）、　　１．ＯｍＭ　　　Ｍ
（］　　ＳＯ＋　　、　　１　　ｍＭジチオスレイトー
ル水溶液に溶解させ、１０１ニツ１〜の制限酵素Ｈａｐ
Ｉ［（宝酒造）を添加して、３７°Ｃで１時間切断反応
を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約３９０ｂｌ）の
ＤＮＡ断片（Ｈａｐ］Ｉ　ＨＨｉｎｄｌｍ＞をポリアク
リルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成精製した。得られ
た４本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μｑに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、Ｔｌ−ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２，７Ｋ　ｂｔ）のＤＮＡ断片（ＣＲａ　
ニーＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大３
つ 部分を含む約３９０ｂＤのＤＮＡ断片（Ｈａｐ［−）−
１＋ｎｄｌＩＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施
例３の方法に準じて、Ｔ４．−、ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミド１’１ＴＮＦ４７
１（約３，２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。

このプラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　　
Ａｒ（ｌ　　Ｌｙｓ　　Ａｒ（］　　］ＬｙｓＰｒｏ−
Ｖａｔ−Ａｌａ−ＨｉｓＶａｌ−Ｖａｌ−ＡｌａＡ　ｓ
ｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｑ　Ｉｎ　−Ａ　１ａ−Ｇ　ＩＬＩ
　−Ｇ　ｌｙ　−Ｑ　Ｉｎ１−ｅｕ−Ｇｌｎ−ＴｒＤ　
−ＬｅＵ−ＡＳｎ−Ａｒ（］−Ａｒ（ＩＡ　ｌａ　−Ａ
　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌ
ａ　−Ａ　５ｎＧｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ　−Ｌ　ｅｕ−
Ａｒｇ−Ａｓｐ−ＡｓｎＱ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ
　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕＧ　１ｙ−
Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−１ｌｅ　−Ｔｙｒ　−５
ｅｒＧ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　
−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ＩｎＧ　１ｙ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ　−
３ｅｒ　−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ　−Ｖａしｅｕ−Ｌ　ｅｕ　
−Ｔｈｒ　−＠　１ｓ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−３ｅｒＡ　
ｒｏ−Ｉ　ｌｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｖａｌ　−３ｅｒ　−
Ｔｙｒ　−Ｇ　ＩｎＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−１ｅｕ−３ｅｒＡｌａ−Ｉ　　１ｅ−１−ｙｓ
−３ｅｒ−１〕ｒｏ−Ｃｙｓ−ＱｌｎＡ　ｒｃ＋−Ｇ　
１ｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　
ｌａＧ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−１ｙｓ−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ
　ｒＤ　−Ｔ　Ｖｒ−Ｇ　ｌｕＰ　ｒｏ−１ｌｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｐ　ｈｅ−Ｇ　
１ｎ−Ｌ　ｅｔｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　＋ｙ−Ａ
　５ｌ）＝ＡｒＱ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
１１ｅ−ＡＳｎＡ　ｒ（］−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ
Ｖｒ−Ｌｌ−Ａ　Ｓｐ−Ｐ　ｈｅＡ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−
５ｅｒ−Ｇ、ｌｙ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−ＴＶｒＰ　ｈｅ
　−Ｇ　ｌｙ　−Ｉ　　１ｅ−Ｉ　　１ｅ−Ａ　１ａ−
Ｌ　ｅｕ（ＣＯＯＨ） で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコドする発現
型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した。

方、上記で得られたヒトＴＮＦＭ伝子発坦型プラスミド
ｐＴＮＦ　４７１　２０μ９を、実施例４の方法に準じ
て制限酵素Ｈｉｎｄｌ［ｉで切断した後、５０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ　−ＨＣｆ　（ｔｌｌＨ７，４）　、　１００
　ｍ　ＭＮａ　（Ｊ、　１０　ｍＭ　　Ｍ（＋　８０４
水溶液中で制限Ｍ素ＮＣ０Ｉ（宝酒造）による切断反応
を３７℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル
電気泳動くゲル濃度０６７％）及びポリアクリルアミド
ゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦＪ伝子の一部を含む約１４０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩＨｆ−ｆｉｎｄ　ＩＩＩ）を
ポリアクリルアミドゲルより、そして実施例３の方法に
準じて、Ｉ）ＴＮＦ４７１の大部分を含む約３．０Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ｍ　）をアガロ
スゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＴ←＋Ｈｉｎｄ　［１）を５０μ磨の１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓＨ（Ｊ　　（ＤＨ７，４）　　、　　１０　　ｍ
Ｍ　　　Ｍ（＋　　８０４　　、　１ｍＭジチオスレイ
トール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＡＣ
ＣＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を
行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ゲル濃度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて
、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ
断片（Ｎ　ＣＯＩ←ＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収し　ｌこ　。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μｑについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２重鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の部含
む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ→ＡＣＣ■）と
混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じて
、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反
応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリ
Ｃ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミド１ＩＴＮＦ６３３（約３．２Ｋｂｌ））を
有するクローンを選択した。このプラスミドは、次のア
ミノ酸配列 （ｌ２　　Ｎ　）　−Ａｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−１ｙｓ
Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　
−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａＡ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｐ Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｌａ Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖａ Ｇ　ｌｙ−Ｌ　ｃｕ−Ｔ　ｙｒ Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｔ−Ｌ　ｅｕ Ｇ　１ｙ−ＣｙＳ−Ｐ　ｒ。

Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅＵ　−Ｔｈｒ Ａ　ｒ（１−Ｉ　　１ｅ−Ａ　１ａ Ｔｈｒ−Ｌ　ｙｓ　−Ｖ　ａ Ａ　ｌａ　−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ Ａ　ｒ（１−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ Ｇ　ｌｕ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｙＳ Ｐ　ｒｏ−１１ｅ−Ｔ　ｙｒ Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−３ｅｒ Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ＳＤ Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ−３ｅｒ Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｙ−１ｌｅ １ａ −ｅｕ ｌｅｕ ｌｅｕ Ｖａ ｌｅｕ ｈｅ ｅｒ ＩＳ Ｖａ Ｓｎ ｅｒ ｐｒ。

ｐｒ。

ｌｅｕ Ｇｌｕ １ａ Ｔｙｒ Ｇｌｌ／ 　Ｉｅ Ｇｌｕ Ｓｎ ｌｅｕ Ａｒ（］ ｐｒ。

　ｌｅ ＶＳ ｈｒ ｈｒ ｅｒ −ｅｕ ｐｒ。

Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ ＶＳ Ｇｌｕ −ｅｕ Ｇｌｎ ｈｅ Ｇｌｙ−Ｇｌｎ Ａ　ｒ（１−Ａ　ｒ（Ｉ Ａｌａ−Ａｓｎ Ａｓｐ−Ａｓｎ ３ｅｒ−Ｑｌｕ Ｔｙｒ−８ｅｒ ＧＩＶ−Ｇｌｎ− ｌ５−Ｖａ １１ｅ−３ｅｒ Ｔｙｒ−Ｇｌｎ ｌｅｕ−３ｅｒ Ｃｙｓ−Ｇｌｎ Ｇｌｙ−Ａｌａ Ｔｙｒ−Ｇｌｕ ＧＩＶ−Ｖａｌ− Ｑ　ｌｙ−Ａ　５ｔ） １１ｅ−Ａｓｎ Ａｓｐ−Ｐｈｅ Ｖａｌ−Ｔｙｒ ｈｅ （ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドのかわりに、第１１図記載の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオ−チドを用いることにより、プラスミドｐＴ
ＮＦ６３４（約３，２Ｋ　ｂｐ）を作成した。このプラ
スミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ）　　ＡｒＱ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒ（］　　ＬＶｓＰ　ｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａ　
ｌａ　−ｔ」１ｓ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａＡ　
ｓｎ　−ｐ　ｒｏ　−Ｑ　Ｉｎ−Ａｌａ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ＩｎＬ　ｅｕ−Ｑｌｎ　−Ｔｒｐ　−
Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒ（］−Ａｒ！＋Ａ　ｌａ　−Ａ
　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−△１ａ
−ＡｓｎＧ　ｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇ　１ｕ−Ｌ　ｅｕ　
−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｓｐ−’Ａ’５ｎＧｌｎ−Ｌ　ｅＬＩ
−Ｖａｔ−Ｖａｔ−ｐｒｏ−８ｅｒ−ＧｌｕＧ　１ｙ−
Ｌ　ｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ’−１ｌｅ　−Ｔｙｒ　−
５ｅｒＧ　Ｉｎ　−Ｖａｔ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙ
ｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ＩｎＧ　ｌｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−３ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ　−■ａしｅｕ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−１ｌｅ　−Ｓ
ｅｒＡｒｇ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｖａｌ−３ｅｒ　−Ｔ
ｙｒ−ＱｌｎＴｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａ　ｓｎ　−
１ｅｕ−Ｌ　ｅｕ　−３ｅｒＡｌａ　−Ｉ　１ｅ−１ｙ
ｓ−３ｅｒ−ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＱｌｎＡ　ｒｇ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇｌｕ　−Ｇ　１ｙ−
Ａ　ｌａＧ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　１ｕＰｒｏ−１１ｅ−
Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＶａＰｈｅ−Ｇｌ
ｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＡｓｐＡ　ｒ
ｑ　−Ｌ　ｅｕ　−３ｅｒ−Ａ　ｌａ　−Ｑ　ｌｕ　−
１１ｅ−Ａ　ｓｎＡ　ｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔ　
ｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅＡ　ｌａ　−Ｇ　
Ｉｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ
　−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｔ
ｒｐ−Ｐｈｅ（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｖｌｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドである。

実施例６（発現の確認） 前記実施例５で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６３３又はｐ丁ＮＦ６３
４を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ□ｍ−株を、
３０〜５０μｇ／戒のアンピシリン、０．２％のグルコ
ース及び４ｍ！Ｊ／ｍＡのカザミノ酸を含むＭ９培地［
０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２ＨＰＯａ　
−０，０５％ＮａｃＲ−０，１％ＮＨａ（Ｊ水溶液（ｐ
Ｈ７，４）をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオー
トクレーブ滅菌したＭ（］ＳＯ４水溶液及びＣａＣ９２
水溶液をそれぞれ最終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍＭに
なるように加える。］　　２５０ｄに接種し、ＯＤ　ｉ
ｎρが０．７に達するまで、３７℃で振どう培養を行な
った。次いで、最終濃度５０μｇ／ｄの３−βインドー
ルアクリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２
時間振どう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　　（１５０ｍＭ　　Ｎａ（Ｊを含む２０ＩＩＩＭリン
酸バッファー、　　ｔｌＨ７，４＞を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファに
懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）
を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の
除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
１−ＩＣＰバッファ　　（ｐｌ−１６，８）　、　ＳＤ
Ｓ、　２−メルカプトエタノール ぞれ最終濃度６０ｍＭ，２％，４％，１０％になるよう
に加え、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴
木，遺伝，　３１．　４３　（１９７７）コを行なった
。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

７　ｒｉｓ−グリシン系［ＬＪ．　Ｋ．　ｌ−ａｅ＋＋
＋ｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７，　　６８０（１９７０）
　］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシーブルＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。

実施例７く活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ夏と、４×１０５個／−の濃度のマウスＬ−９
２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣ　　ＣＣＬ９２９）懸濁液１
００μ磨を、９６大の組織培養用マイクロプレート（コ
ースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μ
ｇ／ｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン，萬有製薬）
を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
白水製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中，３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液１５％（　ＶＯＩ／
ＶＯＩ　）メタノール水溶液に、０．５％（　Ｗｔ／ｖ
ｏ　ｌ　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたち
の］を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バ
イオレッｉ〜を洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル
・バイオレットを１００μすの０．５％ＳＤＳ水溶液で
抽出し、その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＴＳＡア
ナライザー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大賜菌うイゼー１〜の希釈溶液を加えない対照
の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希
釈倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、そ
の希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現
型プラスミドｐＴＮＦ６３３にコードされる新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート１００μμは
約９．６×１０７ユニツト程度の活性を、そして発現型
プラスミドｐＴＮＦ６３４にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー１〜１００ｕρは
約５．９Ｘ　１０６ユニツト程度の活性を、それぞれ有
していることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の部を有するプラスミドｐＴＮ
Ｆ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を、
それぞれ示したものである。第６図はヒトＴ　Ｎ　Ｆ　
３ｉ伝子発坦型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成
方法を、第７図は発現ベクター　１）Ａ　Ａ　４１の作
成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラ
スミドｐＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示し
たものである。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発魂型プラスミドＩ）ＴＮＦ４７１の作成方法を示した
ものである。第１０図及び第１１図は新規抗腫瘍活性ポ
リペプヂド遺伝子発覗型プラスミドＩＩＴＮＦ６３３及
び１ｌＴＮＦ６３４の作成方法を示したものである。第
１２図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｎｖｉ℃ｒｏ抗
癌活性測定結果を示したものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 代　　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博（
）○ １−Ｃ （ワフ Ｑ す（〕

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 においてＸが任意のアミノ酸であ る新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）ＸがＰｈｅであることを特徴とする第１項記載の
   ポリペプチド。
3. （３）ＸがＴｒｐであることを特徴する第１項記載のポ
   リペプチド。
4. （４）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１、２又は３記載のポリペプチド。
5. （５）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 においてＸが任意のアミノ酸である新規生理活性ポリペ
   プチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラス
   ミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６３３又はｐ
   ＴＮＦ６３４である請求項５記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 においてＸが任意のアミノ酸である新規生理活性ポリペ
   プチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラス
   ミドにより形質転換された組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
   とする請求項７記載の微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 においてＸが任意のアミノ酸である新規生理活性ポリペ
   プチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポ
   リペプトチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラ
   スミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培養し
   、培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄積せし
   め、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチドを分
   離することを特徴とする、新規生理活性ポリペプチドの
   製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 においてＸが任意のアミノ酸である新規生理活性ポリペ
    プチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポ
    リペプチドを含有する医薬組成物。