JPH03180194A

JPH03180194A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH03180194A
Application number: JP1317624A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-12-08
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1991-08-06
Anticipated expiration: 2012-12-03
Also published as: JP2685608B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩｔＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ＞で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

Ａｌａｌ−−アラニンＡｒ０Ｌ−アルギニンＡＳｎＬ−アスパラギンＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸ＣＶＳ　　Ｌ−システィンＧｌｎ　　Ｌ−グルタミンＧＩＩＪＬ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨｉｓＬ−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシン１−ｅｕＬ−ロイシンＬＶＳ　　Ｌ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニンＰｒｏＬ−プロリン３ｅｒ　　Ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐＬ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンｖａｌ　　ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。〉ざらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′　
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈ　Ａ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　
Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になッテ、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ
１ｃａら、　　Ｎａｔｕｐｅ　、　　３１２．　７２４
（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、３ｈｉｒａ
ｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｏ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８
５）　］及びＭ　ａｒｌｅｎｏＩＪｔら［Ａ　、　Ｍ　
ａｒｌｅｎＯＵｔら。

１：ｕｒ、　Ｊ、　８ｉｏｃｈｅａ＋、、　１５２．　
５１５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌
における発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　Ｂｅｕｌｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロテイン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１６
２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　
Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１
９．　５１６（１９８６）　１等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く威されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が威
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓｊｆ及びＣｙ　３／′／のいずれ
か又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６
ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　１ｖ／ＪＪの他のアミノ酸
残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６
１−２３８０４８号）　、　Ａ　１６１Ｂの他のアミノ
酸残基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告
されている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失
についても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ
酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭
６１−９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが
細胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ
酸欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開
ＷＯ３６／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦ
がＩＩ胞障害活性を有していること（特願昭６１−１１
４７５４号）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性
を有していること（特Ｉｉ昭６１−１７３８２２号〉、
及び７アミノ酸欠失ＴＮＦを基盤として、ｐ　ｒｏｌｌ
Ｓ　ｅｒｓ　Ａ　ＳＤ＋＠をＡ　ｒｇＬ　ｙＳＡ　ｒｇ
へ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇することが
報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上９反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第１
図に示したヒトＴＮＦのアミノ酸配列においてアミノ末
端の７個のアミノ酸を欠失させ、８〜１０番目のＰ　ｒ
ｏＳ　ｅｒＡ　ｓｏをＡ　ｒｃｌ　Ｌ　ｙｓＡ　ｒｌｌ
ｌに置換し、　１５６番目のＡｌａをＰｈｅに置換し、
　１２８番目のＬＶＳをＧｉｎ又はＡｒｏに置換した新
屓生理活性ポリペプチドにより遠戚される。具体的な配
列を示すと、次のアミノ酸配列（Ｈｚ　Ｎ　）　−ＡｒＯ−Ｌｙｓ　　ＡｒＯＬｙ’Ｓ
　−ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ−Ｖ
ａｔ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　
ｓｎ−Ａ　ｒａ　−Ａ　ｒａ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　
−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｔ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅ
ｕ−Ａ　ｒｌ）−Ａ　５ｌ）−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｌ−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−ＣＶＳ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌｅｕ　
−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−１１ｅ　
−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒｏ　−Ｉ　１ｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｖ
ａｌ−８ｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｈｒ　−
Ｌ　Ｖｓ　−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅ
ｒ　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　
Ｉｕ−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ
　−Ａ　ｌａ　−Ｇｌｕ−Ａｌａ　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−−Ｇｌｕ　−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｖ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　
Ｉｙ　−Ａ　Ｓｐ　−ＡｒＯ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａ　１
ａ−Ｇ　ｌｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒａ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ａ　ｓｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ
　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−Ｉ　Ｉｅ−
Ｐｈｅ−１ｅｕ　−（ＣＯＯＨ）とする、新規生理活性ポリペプチドまたは次のアミノ酸
配列（８２Ｎ　）　−Ａｒ！ＩＩ　−Ｌｙｓ　　ＡｒＯＬｙ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｌ　ｅｉｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒＤ　−Ｌ　ｅＬＩ
　−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒＱ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｌａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　
Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒａ　−Ａ　ｓｐ−Ａ　ｓｎ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ　−Ｐｒｏ　
−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙ
ｒ　−ＬｅＵ−１１ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　Ｖｓ
　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐ　
ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｔ　−
１ｅ（１−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−
Ｉ　ｒｅ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒ（１−Ｉ　１ｅ−Ａ　ｌ
ａ　−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−１−ｅｕ−８
ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓｅｒ　
−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒａ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　１ａ
−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｙＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　
ｒｌ）−Ｔ　Ｖｒ　−Ｇ　ｌｕ　−ＰｒＯ−１１８−Ｔ
Ｖｒ−Ｌｅｔｊ−ＧＩＶ−ＧＩＶ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒＱ−Ｇ
　Ｉｙ　−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−
Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ａ　５ｎ−Ａ　ｒｇ−Ｐ
　ｒｏ−Ａ　５ＥＩ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉ
ｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−
１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ）とする、新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドによって達成さ
れる。また上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供することに
よって達成され、更にかくして得られた組換えプラスミ
ドによって形質転換された組換え微生物細胞、その微生
物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を産生する方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
含有する医薬組成物を提供することによって達成される
ことがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、　Ｐ
ｅｎｎ１ｃａら、ｆｔ１出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ＞を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［口、　Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎ
ａ。

“Ｓ　ｏｗｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎＧ　ｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｒＢ　ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　
Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　
　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］
。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合或合成用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　１のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はＩＩＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペ０ン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター　
１ｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒｐ
プロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有す
るプラスミドとして、好ましくはＩ）ＹＳ３１Ｎ、又は
ＤＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｌ）　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドと
して、好ましくはＩ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。この
発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＥＩＢＲ３２２由
来のベクターにクローン化することにより、発現型プラ
スミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮＦ
　４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のり０−ン化
：こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ６５３またはｐ
ＴＮＦ６５４が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価：ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大ｍ菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
くドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６ＧＯｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培・地・としては、たとえば
グルコースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編、“Ｍ　ｏ＋ｅｃｕ＋ａｒＣＩＯｎｉｎ
＜１”　　Ｐ　４４Ｇ、　Ｃｏ１ｄ　　５ｔ）ｒｉｎり
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機、能させる目的で、３−β−イン
ドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することに゛より、ヒト
ＴＮＦ、遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌら、前出）、マ
ウスし細胞に対する１１ｍ障害性を見るｉｎ　　Ｖｉｔ
ｒＯ活性測定法ＣＲｕｆｆ　、　Ｊ、　　Ｉｍｉ＋ｕｎ
ｏ１．、１２６．　２３５（１９８１）　］等により行
なえる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド１１２４品を用いる
ことにより、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作
用に関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ＶｉｔｒＯ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
。設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらＣＤ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　、３１
２．　７２４（１９８４）　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
制限酵素Ｃ１ａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素）１ｉｎｄｌｌｌによる切断部位を設
け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにし
た。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成ＩＩ（アプライド
・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ１！！基の
保護基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲ
ル（ファルマシア〉を用いたゲル濾過によって、高分子
量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、
７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度２０％〉の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、２〜５ｍの溶出用ハラ７７−［５００＋
ａＭ　　Ｎ目４０ＡＣ−１１ＭＥＤＴＡ−０，１％５Ｄ
Ｓ（１）口　７．５）　］を加え、３７℃で一晩振とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲルｍ過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。

なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をは
かった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のりＯ−ン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトの１
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造〉を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０１
１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−口Ｃ１Ｃ０口　９．５）　　、　　
１０　ｍＭ　　Ｍｏ　Ｃｊｚ　　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０１１１Ｍ　　ＡＴＰ
水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後
、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合
し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌ
クレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ旦の６６　＋１
ＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ＤＨ７，６）　、　　６．６　
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　。

１０　ｍＭジチオスレイトール、１ｉＭＡＴＰ水溶液に
溶解させ、３００ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造〉を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ（約
２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の方
法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収す
る。

一方、３μグの大Ｉ！菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ文の１０　ａ＋Ｍ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣ１（０口　７．５）　、　　６０　ｇｇＭ　
　Ｎａ　Ｃオ、７　１ＭＭｇＣ１２水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・
バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を
行なった。

制限酵素Ｃ１ａ工による切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ旦の５０ＩＩＭＴ　ｒｉ
ｓ−口Ｃオ　（０口　７．４）　　、　　１００　ｎ＋
Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，１０ｍＭ　　Ｍ口３０４水溶液に溶
解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部
分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ
　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣＪＯｓ水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　１により、約３．７Ｋ　
ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　ｌ−８ａｌＩ　）をアガロ
ースゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡｌ
１片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ト株の形質転換は、通
常の（：、ａ（Ｊ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄら
の方法）の改良法で行なったわすなわち、５−のし培地
（１％トリプトン、０，５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
　Ｃ１，ＤＨ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６０
０ｒ−株の１８時間培養基を接種し、国体を含む培養液
の６００ｎｌにおける濁ａ　（ＯＤ　／＃））が０．３
に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・
バッフｐ　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ１，５１Ｍ　　Ｍ
Ｑ　Ｃ１ｚ　。

５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，６，０℃）
］中で２回洗い、２ｄの冷したカルシウム・バッファー
［１００１ＭＣａ　Ｃ１ｚ　、　２５０　１Ｍ　　ＫＣ
ｊ、　５１ＭＭ（ｌ　Ｃｆｚ　　、　　５　　ＩＢＭ　
　”ｒｒｉｓ−口ＣＩ　（０日　７．６゜０℃）］中に
再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１７１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１＃！ｅのＬＢＧ培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８
％グルコース、　　Ｉ）８７．２）を添加し、３７℃で
１時間振とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシ
リン（シグマ）３０μ９／ｄを含むし培地プレート］に
１００μＵ／プレートの割合で接種する。プレートを３
７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドＩ）ＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドＤＴＮＦ２Ｎ及びｏＴ　Ｎ　Ｆ
　３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、　
Ｍａｘａ−ら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙａｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μり
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び３ａｌ
工で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ　
Ｉ”５ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
ｕ９をｉｏｏμｍの１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣＪ（
ＥＩＨ７，５）　、　６０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，７１１
ＭＭ０Ｃｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵
素ｐｖｕｌ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じて制限
酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｌ）のＤＮＡ
断片（ＳａｌＩ４−４ＰｖｕＩＩ）をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μｓＦもｉｏｏμｘの１０　ｉＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
１（９日　７．５）　、　　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｎ＋ＭＭ　Ｏ（４２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ＰｖｕｌＩ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ（宝酒造〉を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂＥ）のＤＮＡ
断片（ＰｖｕｌＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉｆｆ）をポリアクリル
アミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドＤ
ＹＳ３１Ｎ（約４，７Ｋｂｐ）　５μグを、上記と同様
に制限酵素ＣＩａＩ及び口ｉｎｄ　ｍで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲルａｔｉ　ｏ、ａ％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミドＥＩＹＳ３１Ｎの大部
分を含む約４．７）（ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ←→
ＨｉｎｄＩ［［＞をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｌ）、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂＯの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含
む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−計株
に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　
ｂｌ））を有するクローンを選択した。第６図に、その
プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ＰｖｕＩＩで部分分解した後、さら
にＩｌｌ限酵素）−１ｉｎｄｍテ切断し、アカロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法
に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐ
のり、ＮＡＡ断片ＰｖｕＩＩ（２）”口１ｎｄｌｌｌ］
をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μグに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２，７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩｆ　（２）”　Ｈｉｎｄ　Ｉ
Ｉ　］と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法
に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行な
った。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒ
ア・コリＱ６００ｒ−ト株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミド１）ＡＡ４１（約２．７ＫｂＥ））
を有するクローンを選択した。このようなプラスミドは
、プラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御領域
を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニ
ング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−
を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり
、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＥＩＡＡ４１　２μりを、上記と同様に
制限酵素ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄｌｌＩで切断し、アガ
ロースゲル電気法１１ｉ１１（ゲル濃度０．８％〉の後
、実施例３の方法に準じて、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４
１の大部分ヲ含ム約２．７Ｋ　ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ
断片（ＣｊａＩ”Ｈｉｎｄｌｌ）をアガロースゲルより
回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に１ｉ１１
限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄｕｌで切断し、ボＩＪ　７
クリルアミドゲル電気泳ｅ（ゲル濃度５％）の後、実施
例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４
９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａ　ＩＨＨｉｎｄ　ＩＩＩ
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｌ）のＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−１−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミド１）ＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（斬規抗１ｌ１１ｉ＋活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミドの作成〉実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４０１Ａ２０μグを、実施例４の方法に準じ
て制限酵素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｎ［で切断し、ボリア
クリルアくドゲル電気泳動くゲル濃度５％〉及びアガロ
ースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、それぞれ
実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮＡ
断片（約４９０ｂＥｌ及び約２．７Ｋｂｐ、両方共Ｃｆ
ａ　Ｉ”１−ｆｉｎｄ　ＩＩＩ）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−口Ｃｊ（＋）口　７．４）、１０　ｓＭ　　Ｍｇ　８
０４　．１　１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐｌＩ（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を
行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の
大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（１−１ａｐＩ
［＋Ｈｉｎｄｌｌ）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａ　Ｉ
”Ｈｉｎｄ　ＤＩ）及びヒトＴＮ　Ｆ３！伝子の大部分
ヲ含ム約３９０ｂｐ（７）ＤＮＡ断片（口ａｐＩ［＋口
１ｎｄｌ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例
３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反
応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエ
シェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１−株に導入し、形質
転換株の中より目的のプラスミドＥ）ＴＮＦ４７１（約
３．２Ｋ　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。このプ
ラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈｚ　Ｎ）　　ＡｒＯ
Ｌｙｓ−Ａｒｔ）　　ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　
−Ａ　ｌａ−口ｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　
Ｉａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　Ｉａ−
Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒＱ　−
Ａ　ｒｏｌｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−
Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｒＱ　−Ａ　ＳＯ−Ａ　Ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｇ　ｌｙ　−ＬｅＵ　−ＴＩ／ｒ　−Ｌｅｕ　−
Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｌ
　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　Ｌｙ−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈ
ｒ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａｔ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−８ｅｒ　−Ａｒｏ−Ｉ　Ｉ
ｅ−Ａ　１ａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ
−Ａ　ｌａ−１１ｅ−ＬｖＳ−５ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｃｙ
ｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｔＪ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈ
ｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　Ｉａ
　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙＳ−Ｐ　ｒｏ　−
Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｒＯ−Ｉ　
Ｉｅ−Ｔｙｒ　−ＬｅＬｌ　−Ｇ　ｔｙ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ｖａｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ＳＯ−ＡｒＯ−Ｌ
ｅｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ　
−Ａ　ｒり−Ｐ　ｒＯ−Ａ　Ｓ＋）−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅ
ＬＩ−Ａ　３＋）　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ−
Ｔ　Ｖｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ
−Ｌｅｕ・−（ＣＯＯＨ）とする、抗ｉ！瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末端
にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発現
型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した。

一方、上記で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ　４７
１　２０μ９を、実施例４の方法に準じて制限酵素口ｉ
ｎｄ　ＩＩＩで切断した後、５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　
−口Ｃ１（１）口　７．４）　、　　１００　　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃ１，１０ａ＋ＭＭＯ８０４水溶液中で制限酵
素ＮｃｏＩ（宝酒造〉による切断反応を３７℃で１時間
行なう。反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃
度０．７％）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲ
ル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（
ＮｃｏＩ４−４８ｉｎｄ　■）をポリアクリルアミドケ
ルより、そして実施例３の方法に準じて、ｐＴＮＦ４７
１の大部分を含む約３．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣ
ＯＩＨ口１ｎｄｎｌ）をアガロースゲルより、それぞれ
回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　［［）を５０μ皇の１０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ＤＨ７，４）　、　１０　ｍＭ　　Ｍ
ＯＳＯ４，１１１１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解
させ、１０ユニットのｔ、１１限酵素ＡＣＣＩ（宝酒造
）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反
応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル１度
８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ　ｃ
。

Ｉ４−４ＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

また、第１０図記載のＭＡＭ配列を有するオリゴヌクレ
オチドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｅ
ｏ工＋ｌ−１ｉｎｄ　ｌ［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一
部含む約１１ＱｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ
）と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準
じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・
コリＣＢｏｏｒ−１株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＩ）ＴＮＦ６１９（約３．２ＫｂＤ）を
有するクローンを選択した。このプラスミドは、次のア
ミノ酸配列（Ｈｚ　Ｎ　）　　ＡｒＯ−ＬｖＳ−ＡｒＯ−Ｌｙｓ−
Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ　−Ｈ１ｓ−Ｖａｌ　−
Ｖａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｕ−Ａ
　Ｓｎ−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｒＱ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　
−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−ＧＩｎ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｑ　ｌｙ　
−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−１ｌｅ　−Ｔｙｒ
　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ｐ　ｈｅ−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　
Ｉｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ
−口１Ｓ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ
−口ｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ
ｒ（１−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｎ　−Ｔｈｒ　−ＬＶＳ−Ｖａｌ−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ
　−Ｌｅｕ−３ｅｒ　−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−８ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　１ｙ−
Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ
−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐ　ｒｏ　−１１
ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｖａｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｌ　ｙＳ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ＳＯ−ＡｒＯ−
Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ　
−Ａ　ｒ！３−　Ｐ　ｒＯ−Ａ　ＳＤ−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　
ｅｕ−Ａ　ＳＤ−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−５
ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−
ＧＩＶ　−１１ｅ　−１１ｅ−Ｐｈｅ−ＬＩＩＩＬＩ　
−（ＣＯＯＨ）とする、抗！瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末端に
Ｍｅｔが結合しているポリペプチドをコードする抗腫瘍
活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、第１
０図にその作成方法を示した。

次に、上記で得られた発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６１
９３μグを、上記の方法に準じて制限酵素ＮｃｏＩで切
断した後、制限酵素ＢｓｔＥＩＩにッポン・ジーン）を
加えて６０℃で１時間反応させる。

反応終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．７
％〉を行ない、実施例３の方法に準じて、ｐＴＮＦ６１
９７）大部分を含む約３．１１（ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂ
ｓｔＥ　ＩＩ−ＮｃｏＩ　）をゲルより回収した。

また、第１１図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．１）（ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂｓ
ｔＥ　ＩＩ”ＮｃｏＩ　＞と混合し、エタノール沈殿の
後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法
に準じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に導入
し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ６５
３（約３．２Ｋｂｌ））を有するクローンを選択した。

このプラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈｚ　Ｎ　）　−Ａｒａ　−Ｌｙｓ−Ａｒａ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ａｌａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ
　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅＵ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒ！ｌ
ｌ−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ
　＋ｙ−Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　
ＳＤ−Ａ　５ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｔｙ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ｌ　ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇ　ｌｙ
−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　
１ｅ−８ｅｒ−Ａ　ｒｇ−Ｉ　Ｉｅ−Ａ　Ｉａ−Ｖａｌ
−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−１ｙｓ−Ｖａｔ
−Ａ　ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−１ｅｕ−５ｅｒ−Ａ　ｌａ　−
Ｉ　Ｉｅ　−Ｌｙｓ−８ｅｒ　−ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ、ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　
ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−
Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｐｒｏ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒ（１−Ｌ　
ｅＵ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−１１８−Ａ　５
ｎ−Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−
Ａ　ｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ
　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　
−１１ｅ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｐｈｅ−Ｌ　ｅｕ　−（ＣＯＯ
Ｈ）とする、新規抗ｍｖａ性ポリペプチドまたはそのアジノ
末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドで
あり、第１１図にその作成方法を示した。

また、第１１図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドのかわりに、第１２図記載の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを用いて、上記と同じ手法を用いること
により、プラスミドｐＴＮＦ６５４を作成した。このプ
ラスミドは、次のアミノ酸配列（口２　Ｎ　）　−Ａｒ（ｌ　　Ｌｙｓ−ＡｒＯＬｙｓ
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−
Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ　ｒ
ｇ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ａｎ　−Ａ　ｌａ−Ｌ　ｅｕ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎＧ　Ｉｙ−Ｖ　ａｌ
　−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒａ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５
ｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ　−Ｔｙｒ　−５
ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ
　−Ｌ　Ｖｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ＩｎＧ　Ｉｙ　−Ｃ
ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ−口１ｓ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔ
ｈｒ　−１１ｅ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒａ　−Ｉ　ｌｅ　
−Ａ　ｌａ　−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｃｙｓ−Ｑｌｎ−Ａ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ
　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ　−
Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ
　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−ＰｒＱ−１１８−１ｒ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｇ　＋ｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｒａ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　５ｐ−Ａ
　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｉ
　１ｅ−Ａ　５ｎ−Ａ　ｒＯ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　Ｓ＋）−
Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ−
Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｙ　−１１ｅ　−１１ｅ−Ａ　ｌ
ａ　−ＬｅＬＩ　−（ＣＯＯＨ）とする、抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末端に
１ｙｌｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドである。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドＥ）ＴＮＦ
６５３又はＩ）ＴＮＦ６５４を有するエシェリヒア・コ
リＣ６００ｒ−ａ＋−株を、３０μｇ／Ｉｄ、のアンピ
シリン、０．２％のグルコース及び４＊／ｄのカザミノ
酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，
３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％Ｎａｃｒ−０，１％Ｎ
Ｈ＊Ｃｊ水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌し
た後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭＯ８Ｏ４水溶
液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最終濃度２　ｍＭ及
び０．１１Ｍになるように加える。］　　２００ｄに接
種し、０Ｄｔａ、が０．７に達するまで、３７℃で振ど
う培養を行なった。次いで、最終濃度５０Ｌ１ｇ／Ｉｄ
の３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、
さらに３７℃で１２時間開銀う培養を続けた。

遠心分離により大ｍ菌国体を集めた後、ＰＢＳバッファ
ー（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０　ｍＭ　ＩＪ
　ン酸バッファー　　ｐロア、４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファー
に懸濁させ、超音波発生袋＠（久保田、　　２００Ｍ型
）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣
の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣ賃バッファー（Ｉ）８６．ｌＳ）　、　ＳＤＳ、　
２−メルカプトエタノールぞれ最終濃度６０ｍＭ，２％，４％．１０％になるよう
に加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［銘
木，遺伝，　３１，　４３（１９７７）　］を行なった
。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。

Ｔ　ｒｉｓ−グリシン系［Ｌｌ．　Ｋ．　Ｌａｅｉｍｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７，　　６８０（１９７０）
　１を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、
ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第
１３図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津．Ｃ
Ｓ−９３０型）にかけて、産生された抗ＩＩ！瘍活性ポ
リペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出
を行なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｌ）ＴＮＦ４０１Ａを有する大腸菌においては全Ｓ
脂質蛋白質の約１７．６％の、発現型プラスミドｐＴＮ
Ｆ６５３を有する大腸菌においては全Ｓ脂質蛋白質の約
１９．５％の、発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６５４を有
する大腸菌においては同じく約２０．６％の抗腫瘍活性
ポリペプチドの産生が、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒ　ｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ旦と、４　Ｘ　１０’個／ｄの濃度のマウスｌ
−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣ　　ＣＣＬ９２９〉懸濁
液１００μ交を、９６穴の組織培養用マイクロプレート
（コースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終ＩＩ
ｔ１μｇ／ＩｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン．萬
有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中，３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（　ＶＯＩ／
ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（Ｗｔ／ＶＯ
Ｉ　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの１
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを１００μ皇の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し
、その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライ
ザー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型〉で測定する。この吸光度は、生き残っ
たＩａｌ胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプ
チド等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対
照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの
希釈倍率をグラフ（たとえば第１４図〉によって求め、
その希釈倍率をユニットと定義する。第１４図より、発
現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１Ａにコードされるヒト
ＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート１００μ文は７．
ＢＸ　１０５ユニツト程度の活性を、発現型プラスミド
ｐＴＮＦ６５３にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼート　１００μ文は約４，９Ｘ
　１０’ユニット程度の活性を、そして発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ６５４にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ文は約１．３
×１０７ユニツト程度の活性を、それぞれ有しているこ
とが明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・
ランド〉を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量，活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、ＤＴＮＦ６５３にコードされる新規抗腫瘍活性
ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約６倍の比活性を、
そしてＩ）ＴＮＦ６５４にコードされる新規抗腫瘍活性
ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約１６倍の比活性を
有し′ていることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を
、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の作成方法を
、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドノＤＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したちの
である。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミド１）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したもので
ある。第１０図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドＩ）ＴＮＦ６１９の作成方法を示したもので
ある。第１１図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ６５３の作成方法を示したもの
であり、第１２図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６５４の作成に用いた合成
オリゴヌクレオチドの塩基配列を示したものである。第
１３図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子の発現確認結果を示したものである。第１４
図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫ＩＫ活性ポリペプチ
ドのｉｎ　ｖ＋ｔｒｏ抗癌活性測定結果を示したもので
ある。第４図ト装置第図第７図のＡ（１）−一−−−−−→ （５＝）　−ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣ，にＩＣＣＴＡＡＴ
ＧＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３−）（３−）
−ＡＴＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＡＡ
ＡＡＡＡＡ−（５−）（２］−一一一一一→ 第図のＰｖｕ　ＩＩ（１）第図大断片小断片ｉｎｄｌｌ第９図の）１ｉｎｄｌｌ第０図のＡ（３つ−ＴＧＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡ
ＣＴＡＴＴＣＧＡ−（５つ（２）第１０図のＢ第１図のＢＢｓｔＥＩ［第１３図ｍ− 第４図希釈倍率

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（４）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項３記載のポリペプチド。
（５）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（６）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項５記載のプラスミド。
（７）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６５３である
請求項５記載のプラスミド。
（８）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（９）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項８記載のプラスミド。
（１０）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６５４であ
る請求項８記載のプラスミド。
（１１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（１２）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請
求項１１記載の微生物細胞。
（１３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（１４）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請
求項１３記載の微生物細胞。
（１５）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１６）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１７）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。
（１８）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。