JPS63291591A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(1)産業上の利用分野
本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするDNA領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物1Irf!
及び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの
製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する
新規ポリペプチド(以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
と略すこともある)、該ポリペプチドをコードするDN
Aff1域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによ
って形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞
を用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関す
る。
コードするDNA領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物1Irf!
及び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの
製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する
新規ポリペプチド(以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
と略すこともある)、該ポリペプチドをコードするDN
Aff1域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによ
って形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞
を用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関す
る。
本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはIUPA
C−IUB生化学委員会(CBN)で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
C−IUB生化学委員会(CBN)で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
AlaL−アラニン
ArりL−アルギニン
ASnL−アスパラギン
ASI)L−アスパラギン酸
CVS L−システィン
Gln L−グルタミン
GluL−グルタミン酸
Gly グリシン
1−1iSL−ヒスチジン
11eL−イソロイシン
1euL−ロイシン
LysL−リジン
Met L−メチオニン
phe L−フェニルアラニン
prol−プロリン
38r L−セリン
Thrl−スレオニン
Trp L−トリプトファン
Tyr L−チロシン
Val L−バリン
また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
A アデニン(デオキシアデニル酸を示す。)Cシトシ
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。)T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)さらに、(82N)−及び−(COO
H)はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、(5′)−及び(3′
)はそれぞれDNA配列の5′末端側及び3′末端側を
示すものである。
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。)T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)さらに、(82N)−及び−(COO
H)はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、(5′)−及び(3′
)はそれぞれDNA配列の5′末端側及び3′末端側を
示すものである。
(2)発明の前頭
Carswell らは、BacNlus Calm
ette −Guerin (BCG)などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したMethA肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子(T tlmor N eICr
O3i3Factor 、以下TNFと略記することも
ある)と名づけだ[E、 A、 Carswellら、
P roc、N atl。
ette −Guerin (BCG)などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したMethA肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子(T tlmor N eICr
O3i3Factor 、以下TNFと略記することも
ある)と名づけだ[E、 A、 Carswellら、
P roc、N atl。
Acad、Sci、、U S A 、 72.3666
(1975) ] 、このTNFはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。
(1975) ] 、このTNFはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。
最近になって、p ennicaらは、ヒトTNFのc
D N AりO−ニングを行ない、ヒトTNF蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトT
NF遺伝子の発現について報告した[D、 Penn
1caら、 Nature 、 312. 724
(1984) ] 、その後、自弁ら[T、3hira
iら。
D N AりO−ニングを行ない、ヒトTNF蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトT
NF遺伝子の発現について報告した[D、 Penn
1caら、 Nature 、 312. 724
(1984) ] 、その後、自弁ら[T、3hira
iら。
Nature、ユ13. 803(1985) ] 、
宗村ら[塞材ら、癌と化学療法、 12. 160<1
985) ] 、WanQら[A、M、Wanoら、
5cience、 228. 149(1985)
]及びM arlllenOLItら[A 、 M
arlenoutら。
宗村ら[塞材ら、癌と化学療法、 12. 160<1
985) ] 、WanQら[A、M、Wanoら、
5cience、 228. 149(1985)
]及びM arlllenOLItら[A 、 M
arlenoutら。
E ur、 J 、B iochem、、ユ52. 5
15 (1985) ]が、ヒトTNFm伝子の大腸菌
における発現について相ついで報告している。
15 (1985) ]が、ヒトTNFm伝子の大腸菌
における発現について相ついで報告している。
このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトTNF蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、TNFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがTNFに非常に類似しており[B、 Beulte
rら、 Nature 。
なヒトTNF蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、TNFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがTNFに非常に類似しており[B、 Beulte
rら、 Nature 。
316、 552(1985) ] 、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、T
NFの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影W[J、R。
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、T
NFの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影W[J、R。
Ga1bleら、J、EXD、 Mea、、ユ62.2
163(1985) ] 、骨吸収作用[D、 R,B
e1toliniら、Nature 、 319.
516(1986) ]等が報告されている。
163(1985) ] 、骨吸収作用[D、 R,B
e1toliniら、Nature 、 319.
516(1986) ]等が報告されている。
一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。
このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
ヒトTNF蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第1図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸
配列において、CysjP及びCy s /#/のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換(PCT出願
公開WO36/ 04606号、特願昭61−1067
72号) 、G Iy”の他のアミノ酸残基への置換(
特願昭61−106772号、特願昭61−23804
8号)。
されており、第1図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸
配列において、CysjP及びCy s /#/のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換(PCT出願
公開WO36/ 04606号、特願昭61−1067
72号) 、G Iy”の他のアミノ酸残基への置換(
特願昭61−106772号、特願昭61−23804
8号)。
Ala の他のアミノ酸残基への置換(特願昭61−
233337号)が報告されている。また、アミノ末端
側のアミノ酸残基の欠失についても、6アミノ酸欠失T
NFが細胞障害活性を有していること(特開昭61−5
0923号)、7アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を
有していること(特願昭61−90087号)、1〜1
0アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有しており、そ
の比活性は6〜8アミノ酸欠失TNFにおいて極大にな
ること(PCT出願公開WO36/ (12381号)
、10アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有している
こと(特願昭61−114754号)、及び11アミノ
酸欠失TNFが細胞障害活性を有していること(特願昭
61−173822号)が報告されている。
233337号)が報告されている。また、アミノ末端
側のアミノ酸残基の欠失についても、6アミノ酸欠失T
NFが細胞障害活性を有していること(特開昭61−5
0923号)、7アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を
有していること(特願昭61−90087号)、1〜1
0アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有しており、そ
の比活性は6〜8アミノ酸欠失TNFにおいて極大にな
ること(PCT出願公開WO36/ (12381号)
、10アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有している
こと(特願昭61−114754号)、及び11アミノ
酸欠失TNFが細胞障害活性を有していること(特願昭
61−173822号)が報告されている。
そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上1反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
(3)発明の目的
本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。
ることにある。
本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするDNA領域を含む組換、えプラスミドを提供す
ることにある。
ードするDNA領域を含む組換、えプラスミドを提供す
ることにある。
本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。
なるであろう。
(4)発明の構成
本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第1
図に示した1番目のValから15757番目euまで
で表わされるアミノ酸配列において1またはそれ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなされた配列の
うち、少なくとも32番目のAr(lのGluへの置換
を含むような配列を含有する新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドまたはそのアミノ末端にMetが結合したポリペプチ
ドを提供することによって達成され、また上記新規抗腫
瘍活性ボリペプ、チドをコードするDNA領域を含む組
換えプラスミドを提供することによって達成され、更に
かくして得られた組換えプラスミドによって形質転換さ
れた組換え微生物lIl胞、その微生物細胞を用いて目
的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及
びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成
物を提供することによって達成されることがわかった。
図に示した1番目のValから15757番目euまで
で表わされるアミノ酸配列において1またはそれ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなされた配列の
うち、少なくとも32番目のAr(lのGluへの置換
を含むような配列を含有する新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドまたはそのアミノ末端にMetが結合したポリペプチ
ドを提供することによって達成され、また上記新規抗腫
瘍活性ボリペプ、チドをコードするDNA領域を含む組
換えプラスミドを提供することによって達成され、更に
かくして得られた組換えプラスミドによって形質転換さ
れた組換え微生物lIl胞、その微生物細胞を用いて目
的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及
びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成
物を提供することによって達成されることがわかった。
以下本発明について更に詳細に説明する。
(A>ヒトTNF遺伝子のクローン化;ヒトTNF遺伝
子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸[0,pe
nnicaら、前出]を指定するいくつかのコドンの中
から適当なものを選び、それを化学合成することによっ
て取得できる。ヒトTNF遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にクローン化及び遺伝“子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。
子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸[0,pe
nnicaら、前出]を指定するいくつかのコドンの中
から適当なものを選び、それを化学合成することによっ
て取得できる。ヒトTNF遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にクローン化及び遺伝“子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。
また、ヒトTNF蛋白質をコードするDNA領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コド°ン(ATG)を有することが好ましく、その下流
方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コ
ドン(TGA。
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コド°ン(ATG)を有することが好ましく、その下流
方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コ
ドン(TGA。
TAGまたはTAA)を有することが好ましい。
上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
2つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
2つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
さらに、このヒトTNF遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トTNF遺伝子の塩基配列の例を、第1図に示した。
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トTNF遺伝子の塩基配列の例を、第1図に示した。
上記のように設計したヒトTN[1伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第2図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法[H,G、 Khorana
。
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第2図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法[H,G、 Khorana
。
”Some ReCent DeVelOl)ll
ents 、inc he−istry or
p hO3phate E 5ters、 ofB
iological l nterest 、
John Wileyand 5ons 、
Inc、、New York (1961)]
。
ents 、inc he−istry or
p hO3phate E 5ters、 ofB
iological l nterest 、
John Wileyand 5ons 、
Inc、、New York (1961)]
。
トリエステル法[R,L、 Letsingerら、J
。
。
Am、 Chem、 Soc、、89.4801(
1967) ]及びホスファイト法[M、 D、 Ma
tteucciら。
1967) ]及びホスファイト法[M、 D、 Ma
tteucciら。
Tetrahedron Lett、、 21. 7
19(1980) ]があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動DNA合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。
19(1980) ]があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動DNA合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。
こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの5′末端側
の水Muを、たとえばT4−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
T4−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトTNF遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえば・pBR322[F 、
B olivarら、 Gene 、’ 2 、
95(1977) ]のようなベクターに一度クロー
ン化した後、それらの各ブロックのDNA断片を連結す
る方法が好ましい。このようなヒトTNF遺伝子を構成
するブロックのDNA断片を含むプラスミドとして、好
ましくはpTNF18R。
の水Muを、たとえばT4−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
T4−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトTNF遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえば・pBR322[F 、
B olivarら、 Gene 、’ 2 、
95(1977) ]のようなベクターに一度クロー
ン化した後、それらの各ブロックのDNA断片を連結す
る方法が好ましい。このようなヒトTNF遺伝子を構成
するブロックのDNA断片を含むプラスミドとして、好
ましくはpTNF18R。
pTNF2NまたはpTNF3が用いられる。
上記のようにしてクローン化したヒトTNF遺伝子を構
成する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、 SD (シャイン・ダルガーノ)配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター(trpプロモーター)。
成する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、 SD (シャイン・ダルガーノ)配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター(trpプロモーター)。
ラクトース・オペロン・プロモーター(Iacプロモー
ター) 、 taCプロモーターIPLプロモーター、
Ippプロモーター等があげられるが、とりわけtr
pプロモーターが好適である。trpプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはpY S 31N
1又はpA A 41が用いられる。
ター) 、 taCプロモーターIPLプロモーター、
Ippプロモーター等があげられるが、とりわけtr
pプロモーターが好適である。trpプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはpY S 31N
1又はpA A 41が用いられる。
さらに、発現効率向上を目的として、ヒトTNF311
伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を
付与することができる。このようなターミネータ−とし
て、1ppターミネータ−2trpターミネータ−等が
あげられるが、とりわけtrp Aターミネータ−が好
適であり、trp Aターミネータ−を有するプラスミ
ドとして、好ましくはDA A 41が用いられる。こ
の発現型ヒトTNF遺伝子を、たとえばI)BR322
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトTNF遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはpTNF401NN又はEIT
NF 401Aが用いられる。
伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を
付与することができる。このようなターミネータ−とし
て、1ppターミネータ−2trpターミネータ−等が
あげられるが、とりわけtrp Aターミネータ−が好
適であり、trp Aターミネータ−を有するプラスミ
ドとして、好ましくはDA A 41が用いられる。こ
の発現型ヒトTNF遺伝子を、たとえばI)BR322
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトTNF遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはpTNF401NN又はEIT
NF 401Aが用いられる。
(B)新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
: こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な
―域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子のvi復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗l瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはEITNF480が用
いられる。
: こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な
―域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子のvi復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗l瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはEITNF480が用
いられる。
(C)発現確認及び活性評価ニ
ーヒトTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子を発現させるための微生物宿主としては、大ll!
菌、枯草菌、醇母等があげられるが、とりわけ大腸菌[
エシェリヒア・コリ(Escherichia co
li) 1が好ましい。前記ヒトTNF遺伝子発現型プ
ラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドは、たとえば公知の方法[M、 V、 No
rgardら。
伝子を発現させるための微生物宿主としては、大ll!
菌、枯草菌、醇母等があげられるが、とりわけ大腸菌[
エシェリヒア・コリ(Escherichia co
li) 1が好ましい。前記ヒトTNF遺伝子発現型プ
ラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドは、たとえば公知の方法[M、 V、 No
rgardら。
Gene 、 3. 279(1978) ]を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリC,600
r−m−株(ATCC33525)に導入することがで
きる。
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリC,600
r−m−株(ATCC33525)に導入することがで
きる。
このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むM9培地[T、 Mania
tisら編、 ” M olecularCIoni
na”、 P 440. Co1d 5DrinG)
−1arbor 1aboratory 、 New
”y’ork (1982)参照]があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば撮とうによる通気、撹拌を加えながら、37℃で
2〜36時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、3−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むM9培地[T、 Mania
tisら編、 ” M olecularCIoni
na”、 P 440. Co1d 5DrinG)
−1arbor 1aboratory 、 New
”y’ork (1982)参照]があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば撮とうによる通気、撹拌を加えながら、37℃で
2〜36時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、3−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。
培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム(以下
、SDSと略すこともある)を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム(以下
、SDSと略すこともある)を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。
発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトT
NF遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトT
NF遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。
このようにして得られたヒトTNF蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
MethA肉腫を壊死させる効果を見るin viv
o活性測定法(Carswel lら。
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
MethA肉腫を壊死させる効果を見るin viv
o活性測定法(Carswel lら。
前出)、マウスL$Ill胞に対する細胞障害性を見る
in VitrO活性測定法[RuH、J。
in VitrO活性測定法[RuH、J。
In5uno1.、126. 235(1981) 1
等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便さ
等の点から、in VitrO活性測定法による評価
が好ましい。
等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便さ
等の点から、in VitrO活性測定法による評価
が好ましい。
か(して本発明によれば、従来公知のヒトTNF蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例1(ヒトTNF遺伝子の設計)
第1図に示した塩基配列のヒトTNF遺伝子を設計した
、設計に際しては、p ennicaら[0゜p en
nicaら、 Nature 、 312. 72
4(1984) ] の報告したヒトTNF前駆体c
D N Aの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、
適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、5
′側に翻訳開始コドン(ATG)を、そして3′側に2
″個の翻訳終止コドン(TGA及びTAA)をそれぞれ
付与した。また、5′側翻訳開始コドン上流には制限酵
素(JaIによる切断部位を設け、SD配列と翻訳開始
コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの
連結を可能にした。更に、3′側翻訳終止コドン下流に
は制限酵素Hindl[[による切断部位を設け、ベク
ター・プラスミドと容易に連結できるようにした。
、設計に際しては、p ennicaら[0゜p en
nicaら、 Nature 、 312. 72
4(1984) ] の報告したヒトTNF前駆体c
D N Aの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、
適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、5
′側に翻訳開始コドン(ATG)を、そして3′側に2
″個の翻訳終止コドン(TGA及びTAA)をそれぞれ
付与した。また、5′側翻訳開始コドン上流には制限酵
素(JaIによる切断部位を設け、SD配列と翻訳開始
コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの
連結を可能にした。更に、3′側翻訳終止コドン下流に
は制限酵素Hindl[[による切断部位を設け、ベク
ター・プラスミドと容易に連結できるようにした。
実施例2(オリゴヌクレオチドの化学合成)実施例1で
設計したヒトTNF遺伝子は、第2図に示したように1
7本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動DNA合成機(アプライド・
バイオシステムズ。
設計したヒトTNF遺伝子は、第2図に示したように1
7本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動DNA合成機(アプライド・
バイオシステムズ。
モデル380A >を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を55℃で一晩保つことにより、Dt’JA塩基の
保護基をはずし、セファデックスG−50フアイン・ゲ
ル(ファルマシア)を用いたゲル濾過によって、高分子
酸の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、
7M尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度20%)の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、2〜5dの溶出用バフ7F [500
mM NH40Ac−i mMEDTA−0,1%
SDS (pH7,5> ]を加え、37℃で一晩撮と
うした。遠心分離により、目的のDNAを含む水相の回
収を行なったa最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶
液をゲル濾過カラム(セフ1デツクスG −50)にか
けることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得
た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上
をはかった。
溶液を55℃で一晩保つことにより、Dt’JA塩基の
保護基をはずし、セファデックスG−50フアイン・ゲ
ル(ファルマシア)を用いたゲル濾過によって、高分子
酸の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、
7M尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度20%)の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、2〜5dの溶出用バフ7F [500
mM NH40Ac−i mMEDTA−0,1%
SDS (pH7,5> ]を加え、37℃で一晩撮と
うした。遠心分離により、目的のDNAを含む水相の回
収を行なったa最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶
液をゲル濾過カラム(セフ1デツクスG −50)にか
けることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得
た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上
をはかった。
実施例3(化学合成ヒトTNF遺伝子のクローン化)
実施例2で作成した17本の合成オリゴヌクレオチド(
TNF−1〜TNF−17>を用いて、ヒトTNF遺伝
子を3つのブロックに分けてクローン化した。
TNF−1〜TNF−17>を用いて、ヒトTNF遺伝
子を3つのブロックに分けてクローン化した。
0.1〜1.0μ3の合成オリゴヌクレオチドTNF−
2〜TNF−6の5′末端側を、5〜15ユニツトのI
4−ポリヌクレオチドキナーゼ(E。
2〜TNF−6の5′末端側を、5〜15ユニツトのI
4−ポリヌクレオチドキナーゼ(E。
coliBタイプ、宝酒造)を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は10〜20μ塁の50m
MTris−HCj (pH9,5) 、 10 mM
MOCI2゜5 mMジチオスレイトール、10m
M ATP水溶液中で、37℃で、30分間行なった
。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液
をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽出により
I4−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。
リン酸化する。リン酸化反応は10〜20μ塁の50m
MTris−HCj (pH9,5) 、 10 mM
MOCI2゜5 mMジチオスレイトール、10m
M ATP水溶液中で、37℃で、30分間行なった
。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液
をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽出により
I4−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。
この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに0.1〜
1.0μりの合成オリゴヌクレオチドTNF−1及びT
NF−7を加え、90℃で5分間加熱した侵室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。
1.0μりの合成オリゴヌクレオチドTNF−1及びT
NF−7を加え、90℃で5分間加熱した侵室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。
次に、これを減圧乾固した後に、30μ文の66 m1
VITris−HCf (pH7,6) 、 6.6
mM M(] (J2゜101Mジチオスレイトー
ル、1n+MATP水溶液に溶解させ、300ユニツト
の74−DNAリガーゼ(宝酒造)を加えて、11℃で
15時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)を行ない、エチ
ジウムブロマイド染色法により泳動パターンの1M察を
行なう。目的とする大きさく約220bl))のバンド
部分を切出して、実施例2の方法に従ってポリアクリル
アミドゲルよりDNAを回収する。
VITris−HCf (pH7,6) 、 6.6
mM M(] (J2゜101Mジチオスレイトー
ル、1n+MATP水溶液に溶解させ、300ユニツト
の74−DNAリガーゼ(宝酒造)を加えて、11℃で
15時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)を行ない、エチ
ジウムブロマイド染色法により泳動パターンの1M察を
行なう。目的とする大きさく約220bl))のバンド
部分を切出して、実施例2の方法に従ってポリアクリル
アミドゲルよりDNAを回収する。
一方、3μびの大腸菌用プラスミドI)BR322(約
4.4K bp)を30μ旦の1On+M T ri
s−HC1(EIH7,5) 、 60 mM Na
C1,71MMCIC1z水溶液に溶解させ、10ユ
ニツトの制限酵素CfaIにューイングランド・バイオ
ラプズ)を添加して、37℃で1時間切断反応を行なっ
た。
4.4K bp)を30μ旦の1On+M T ri
s−HC1(EIH7,5) 、 60 mM Na
C1,71MMCIC1z水溶液に溶解させ、10ユ
ニツトの制限酵素CfaIにューイングランド・バイオ
ラプズ)を添加して、37℃で1時間切断反応を行なっ
た。
制限酵素C1a工による切断の債、フェノール抽出。
エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりDNAを
回収する。このDNAを30μ旦の50□11IMTr
is−HCf (pH7,4) 、 100 mM
Na C1,10RIM MgSO4水溶液に溶解
させ、10ユニツトの制限酵素5alI (宝酒造)を
添加して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度0.8%)を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドDBR322の大部分を
含む約3.7KbpのDNAの部分に相当するバンドを
切出し、そのアガロースゲル断片を3倍ω(vol /
wt)の8M NaCl0a水溶液に溶解させた。C
henらのグラスフィルター法[C,W。
回収する。このDNAを30μ旦の50□11IMTr
is−HCf (pH7,4) 、 100 mM
Na C1,10RIM MgSO4水溶液に溶解
させ、10ユニツトの制限酵素5alI (宝酒造)を
添加して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度0.8%)を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドDBR322の大部分を
含む約3.7KbpのDNAの部分に相当するバンドを
切出し、そのアガロースゲル断片を3倍ω(vol /
wt)の8M NaCl0a水溶液に溶解させた。C
henらのグラスフィルター法[C,W。
Chenら、 Anal 、 Biochem、 1
01. 339(1980) ]により、約3.7Kb
pのDNA断片<cxa l−8alI)をアガロース
ゲルより回収した。
01. 339(1980) ]により、約3.7Kb
pのDNA断片<cxa l−8alI)をアガロース
ゲルより回収した。
先に得られたヒトTNF31伝子の一部を含む約220
bpのDNA断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドpBR322の
大部分を含む約3.7KbpのDNA水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両DNA断
片の連結反応を行なった。
bpのDNA断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドpBR322の
大部分を含む約3.7KbpのDNA水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両DNA断
片の連結反応を行なった。
エシェリヒア・コリC600r−11−株の形質転換は
、通常のCaCl2法(M、 V、 Norgardら
の方法)の改良法で行なった。すなわち、5ml!のし
培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%
Na CL pl−17,2)にエシェリヒア・コリ
C600r−m−株の18時間培養基を接種し、菌体を
含む培養液の600nmにおける濁度(OD jaa)
が0.3に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネ
シウム・バッファ [0,IM Na Cj、 5
mM M(1(J2゜5 mM Tris−H
Cf (1)H7,6,0℃)]中で2回洗い、2dの
冷したカルシウム・バッファー[100mMCa Cj
z 、 250 mM K(J、 5111MM(
I Cf2.5 mM Tris−HCj (ph
7.6゜0℃)]中に再懸濁させ、0℃で25分間fi
l装する。
、通常のCaCl2法(M、 V、 Norgardら
の方法)の改良法で行なった。すなわち、5ml!のし
培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%
Na CL pl−17,2)にエシェリヒア・コリ
C600r−m−株の18時間培養基を接種し、菌体を
含む培養液の600nmにおける濁度(OD jaa)
が0.3に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネ
シウム・バッファ [0,IM Na Cj、 5
mM M(1(J2゜5 mM Tris−H
Cf (1)H7,6,0℃)]中で2回洗い、2dの
冷したカルシウム・バッファー[100mMCa Cj
z 、 250 mM K(J、 5111MM(
I Cf2.5 mM Tris−HCj (ph
7.6゜0℃)]中に再懸濁させ、0℃で25分間fi
l装する。
次に菌体をこの容量の1/10にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2:1 (v
ol、 : vol、)混合する。この混合物を60分
間。
ーの中で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2:1 (v
ol、 : vol、)混合する。この混合物を60分
間。
0℃で保った後、1dのLBG培地(1%トリプトン、
0.5%酵母エキス、1%NaCj、 0.08%グ
ルコース、 l)H7,2)を添加し、37℃で1時
間振どう培養する。培養液を、選択培地[アンピシリン
(シグマ) 30μ9/rdを含むし培地プレート]に
100μρ/プレートの割合で接種する。プレートを3
7℃で1晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てDNAを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドpTNF1BR(約4.0K bp)の
取得を確認した。第3図に、プラスミドpTNF1BR
の作成方法を示す。
0.5%酵母エキス、1%NaCj、 0.08%グ
ルコース、 l)H7,2)を添加し、37℃で1時
間振どう培養する。培養液を、選択培地[アンピシリン
(シグマ) 30μ9/rdを含むし培地プレート]に
100μρ/プレートの割合で接種する。プレートを3
7℃で1晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てDNAを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドpTNF1BR(約4.0K bp)の
取得を確認した。第3図に、プラスミドpTNF1BR
の作成方法を示す。
以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドTN
F−8〜TNF−13を用いてプラスミドpTNF2N
(約3.IKbp)を、合成オリゴヌクレオヂドTNF
−14〜TNF−17を用いてプラスミドpTNF3(
約2.4K bp)を、それぞれ作成した。第4図及び
第5図に、プラスミドpTNF2N及びpTNF3の作
成方法を、それぞれ示す。
F−8〜TNF−13を用いてプラスミドpTNF2N
(約3.IKbp)を、合成オリゴヌクレオヂドTNF
−14〜TNF−17を用いてプラスミドpTNF3(
約2.4K bp)を、それぞれ作成した。第4図及び
第5図に、プラスミドpTNF2N及びpTNF3の作
成方法を、それぞれ示す。
こうして得られたヒトTNF遺伝子の一部を含むプラス
ミドI)TNFlBR,pRNF2N及びpTNF3の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法[A、 M、
Maxamら、 MethodsEnzymol、、
65. 499(1980) ]によって確認した。
ミドI)TNFlBR,pRNF2N及びpTNF3の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法[A、 M、
Maxamら、 MethodsEnzymol、、
65. 499(1980) ]によって確認した。
実施例4(ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドの作成)
実施例3で得られたプラスミドpTNFIBR10μ9
を、実施例3と同様にして制限酵素CjaI及び3al
■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃
度5%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF3
1伝子の一部を含む約220bpのDNA断片<CJa
I 4−4SalI > ヲポリアクリルアミドゲル
より回収した。
を、実施例3と同様にして制限酵素CjaI及び3al
■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃
度5%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF3
1伝子の一部を含む約220bpのDNA断片<CJa
I 4−4SalI > ヲポリアクリルアミドゲル
より回収した。
次に、実施例3で得られたプラスミドpTNF2 10
μgをiooμ41の10 mM T ris−HC
j(pH7,5) 、 60n+ M Na C1,
7mMM(lcj2水溶液に溶解させ、40ユニツトの
制限酵素PvuI[(宝酒造)を添加し、37℃で1時
間切断反応を行なった。そして、実施例3の方法に準じ
て制限酵素5alIによる切断、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(ゲル′f:J度5%)の後、実施例2の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約170b
pのDNA断片(SalI+PvuII)をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。
μgをiooμ41の10 mM T ris−HC
j(pH7,5) 、 60n+ M Na C1,
7mMM(lcj2水溶液に溶解させ、40ユニツトの
制限酵素PvuI[(宝酒造)を添加し、37℃で1時
間切断反応を行なった。そして、実施例3の方法に準じ
て制限酵素5alIによる切断、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(ゲル′f:J度5%)の後、実施例2の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約170b
pのDNA断片(SalI+PvuII)をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。
また、実施例3で得られたプラスミドDTNF3 10
μ9も10(I nの10 mM T ris−1−
I CI(pH7,5>、60 mM Na C1
,7mMM(]Cfz水溶液に溶解させ、40ユニツト
の制限酵素pvu[及び40ユニツトの制限酵素Hin
dll!(宝酒造)を添加し、37℃で1時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
くゲル濃度5%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒト
TNF遺伝子の一部を含む約110bpのDNA断片(
PVulI←HindI[l)をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。
μ9も10(I nの10 mM T ris−1−
I CI(pH7,5>、60 mM Na C1
,7mMM(]Cfz水溶液に溶解させ、40ユニツト
の制限酵素pvu[及び40ユニツトの制限酵素Hin
dll!(宝酒造)を添加し、37℃で1時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
くゲル濃度5%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒト
TNF遺伝子の一部を含む約110bpのDNA断片(
PVulI←HindI[l)をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。
一方、大腸菌trpプロモーターを有するプラスミドp
Ys31N(約4.7Kbp) 5μ9を、上記と同様
に制限酵素CjaI及び)lindIIIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施
例3の方法に準じて、プラスミド1)YS31Nの大部
分を含む約4.7K bpのDNA断片(CfaI+)
lindI[I)をアガロースゲルより回収した。
Ys31N(約4.7Kbp) 5μ9を、上記と同様
に制限酵素CjaI及び)lindIIIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施
例3の方法に準じて、プラスミド1)YS31Nの大部
分を含む約4.7K bpのDNA断片(CfaI+)
lindI[I)をアガロースゲルより回収した。
こうして得られた、ヒトTNFm伝子の一部を含む杓2
20bp、約170bD及び約110bpの3つのDN
A断片とプラスミド1)YS31Nの大部分を含む約4
.7KbpのDNA断片とを混合し、エタノール沈澱の
優、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方法
に準じてエシェリヒア・コリC600r−m−株に導入
し、形質転換株の中より目的のヒトTNFffl伝子発
現型プラスミドpTNF401NN(約5.2K bp
)を有するクローンを選択した。第6図に、そのプラス
ミドpTNF 401NNの作成方法を示した。
20bp、約170bD及び約110bpの3つのDN
A断片とプラスミド1)YS31Nの大部分を含む約4
.7KbpのDNA断片とを混合し、エタノール沈澱の
優、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方法
に準じてエシェリヒア・コリC600r−m−株に導入
し、形質転換株の中より目的のヒトTNFffl伝子発
現型プラスミドpTNF401NN(約5.2K bp
)を有するクローンを選択した。第6図に、そのプラス
ミドpTNF 401NNの作成方法を示した。
また、上記プラスミドpYs31N5μ9を、上記の方
法に準じて制限酵素PvuI[で部分分解した後、さら
に制限酵素)(indlfiで切断し、アガロースゲル
電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方法に
準じて、trpプロモーターを含む約2.7K bpの
DNA断片[PvuII(2)HHind m ]を7
ガロースゲルより回収した。
法に準じて制限酵素PvuI[で部分分解した後、さら
に制限酵素)(indlfiで切断し、アガロースゲル
電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方法に
準じて、trpプロモーターを含む約2.7K bpの
DNA断片[PvuII(2)HHind m ]を7
ガロースゲルより回収した。
次に第7図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例2の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た2本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μ3に
ついて、実施例3の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先ニ得うレタ約2,7K b
po D N A断片[p VLIII (2)” i
f ind mコと混合シ、工’2/−/1itQ(7
)I、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方
法に準じてエシェリヒア・コリC600r−m−株に導
入し、形質転換株の中より目的のプラスミドpAA41
(約2.7K bp)を有するりO−ンを選択した。こ
のようなプラスミドは、プラスミドpYs31Nからコ
ピー数制御領域除去し、trpプロモーター下流に存在
するクローニング・サイトの下流に大腸菌trp Aタ
ーミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベ
クターであり、第7図にその作成方法を示した。
を、実施例2の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た2本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μ3に
ついて、実施例3の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先ニ得うレタ約2,7K b
po D N A断片[p VLIII (2)” i
f ind mコと混合シ、工’2/−/1itQ(7
)I、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方
法に準じてエシェリヒア・コリC600r−m−株に導
入し、形質転換株の中より目的のプラスミドpAA41
(約2.7K bp)を有するりO−ンを選択した。こ
のようなプラスミドは、プラスミドpYs31Nからコ
ピー数制御領域除去し、trpプロモーター下流に存在
するクローニング・サイトの下流に大腸菌trp Aタ
ーミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベ
クターであり、第7図にその作成方法を示した。
このプラスミドI)AA41 2μりを、上記と同様に
制限酵素CfaI及びHindlで切断し、アガロース
ゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方
法に準じて、プラスミドl)A A 41の大部分を含
む約2.7K bl)のDNA断片(CjaI−)1i
ndl[I)をアガロースゲルより回収した。
制限酵素CfaI及びHindlで切断し、アガロース
ゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方
法に準じて、プラスミドl)A A 41の大部分を含
む約2.7K bl)のDNA断片(CjaI−)1i
ndl[I)をアガロースゲルより回収した。
また、先に得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミド
DTNF 401NN5μシを、上記と同様に制限酵素
CjaI及びHindllで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例2の方法
に準じて、ヒトTNF遺伝子全域を含む約49obD
t7) ON、A断片(Cja I”l−1ind I
II)をポリアクリルアミドゲルより回収した。
DTNF 401NN5μシを、上記と同様に制限酵素
CjaI及びHindllで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例2の方法
に準じて、ヒトTNF遺伝子全域を含む約49obD
t7) ON、A断片(Cja I”l−1ind I
II)をポリアクリルアミドゲルより回収した。
こうして得られた、プラスミドI)A A 41の大部
分を含む約2.7)(bpのDNA断片とヒトTNF遺
伝子全域を含む約490bE)のDNA断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4
−DNAリガーゼによる連結反応を行なった。
分を含む約2.7)(bpのDNA断片とヒトTNF遺
伝子全域を含む約490bE)のDNA断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4
−DNAリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、実施例3の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ600「−量一株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpT N F 401A <約3.2K
bp)を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトTNF遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第8図にその作成方法を示した。
コリ600「−量一株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpT N F 401A <約3.2K
bp)を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトTNF遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第8図にその作成方法を示した。
実施例5(新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成) 実施例4で得られたヒトTNF3m伝子発現型プラスミ
ドpTNF 401A20μyを、実施例4の方法に準
じて制限酵素CjaI及びHindllIで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)及びア
ガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、それ
ぞれ実施例2及び3の方法に準じて、生成する2つのD
NA断片(約490b11及び約2.7K bp、両方
共c1a I+Hind I[[)をゲルより回収した
。
ラスミドの作成) 実施例4で得られたヒトTNF3m伝子発現型プラスミ
ドpTNF 401A20μyを、実施例4の方法に準
じて制限酵素CjaI及びHindllIで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)及びア
ガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の後、それ
ぞれ実施例2及び3の方法に準じて、生成する2つのD
NA断片(約490b11及び約2.7K bp、両方
共c1a I+Hind I[[)をゲルより回収した
。
ここで得られたヒトTNF3fi伝子全域を含む約49
0bl)のDNA断片を50μ旦の10 mM Tr
is−HCf (pH7,4> 、 IOIM Mg
5Oa 、 1 mMジチオスレイトール水溶液に溶
解させ、10ユニツトの制限酵素HapI[(宝酒造)
を添加して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5
%)を行ない、実施例2の方法に準じて、ヒトTN F
m伝子の大部分を含む約370bpのDNA断片(Bg
1H,−*HindI[[)をポリアクリルアミトゲ、
ルより回収した。
0bl)のDNA断片を50μ旦の10 mM Tr
is−HCf (pH7,4> 、 IOIM Mg
5Oa 、 1 mMジチオスレイトール水溶液に溶
解させ、10ユニツトの制限酵素HapI[(宝酒造)
を添加して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5
%)を行ない、実施例2の方法に準じて、ヒトTN F
m伝子の大部分を含む約370bpのDNA断片(Bg
1H,−*HindI[[)をポリアクリルアミトゲ、
ルより回収した。
また、第9図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例2の方法に準じて、合成。
ドを、実施例2の方法に準じて、合成。
精製した。得られた4本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ0.5μ9について、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。
ぞれ0.5μ9について、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、得られた2本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約2,7K bpのDNA断片<C1a I
”Hind m )及びヒトTNF3i伝子の大部分を
含む約370brlのDNA断片(BolIHl−1i
ndl[[)と混合し、エタノール沈澱の後、実施例3
の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例3の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリC600r−11−株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミド1)TNF480(約3
.2K bp>を有するクローンを選択した。このプラ
スミドは、次のアミノ酸配列(82N) Pro−
3et−ASI)、 Lys−P ro−Val−A
Ia−His−Val−Val−A Ia−A sn
−P ro−G In−A Ia−G Iu−G Iy
−G In−しeLI−G In −T rl)−L
ell −A an −A r(1−G Iu −A
Ia−A sn−A Ia−1eu−1eu−A Ia
−A 5n−G Iy−Val−G Iu−L eu−
A ra−A sp−A 5n−G In−L eu−
Val−Val−Pro−5er−G Iu−Gly−
Leu−Tyr−Leu−I Ie−Tyr−3er−
G tn−Val−Leu−Phe−Lys−G Iy
−G In−G IV−Cys−Pro−5er−Th
r−HiS−Val−Leu−Leu−Thr−His
−Thr−11e−Ser −Arg−11e−AIa
−Val−8er−Tyr−Gln−T hr−LVs
−Val−A sn−Leu−L eu−S er−A
Ia−11e−Lys−5er−Pro−Cys−G
In−A ro −G lu −T hr −P r
o −G lu −G ly −A Ia −G lu
−A la−Lys−P ro−T rp−Tyr−G
1u−P rO−11e−Tyr−Leu7 G I
V−G +y−va+−Phe−G In−Leu−G
Iu−L vS−G ly−A 5l)−Ara−L
eu−8er−Ala−Glu−11e−Asn−A
rlll−P rO−A S+)−T Vr−L eu
−A SD−P he−A Ia−G Iu−S er
−G IV−G In−Val−TVr−Phe−GI
V−11e−11e、−Ala−Leu −(COOH
) で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第9図にその作成方法を示した。
に得られた約2,7K bpのDNA断片<C1a I
”Hind m )及びヒトTNF3i伝子の大部分を
含む約370brlのDNA断片(BolIHl−1i
ndl[[)と混合し、エタノール沈澱の後、実施例3
の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例3の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリC600r−11−株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミド1)TNF480(約3
.2K bp>を有するクローンを選択した。このプラ
スミドは、次のアミノ酸配列(82N) Pro−
3et−ASI)、 Lys−P ro−Val−A
Ia−His−Val−Val−A Ia−A sn
−P ro−G In−A Ia−G Iu−G Iy
−G In−しeLI−G In −T rl)−L
ell −A an −A r(1−G Iu −A
Ia−A sn−A Ia−1eu−1eu−A Ia
−A 5n−G Iy−Val−G Iu−L eu−
A ra−A sp−A 5n−G In−L eu−
Val−Val−Pro−5er−G Iu−Gly−
Leu−Tyr−Leu−I Ie−Tyr−3er−
G tn−Val−Leu−Phe−Lys−G Iy
−G In−G IV−Cys−Pro−5er−Th
r−HiS−Val−Leu−Leu−Thr−His
−Thr−11e−Ser −Arg−11e−AIa
−Val−8er−Tyr−Gln−T hr−LVs
−Val−A sn−Leu−L eu−S er−A
Ia−11e−Lys−5er−Pro−Cys−G
In−A ro −G lu −T hr −P r
o −G lu −G ly −A Ia −G lu
−A la−Lys−P ro−T rp−Tyr−G
1u−P rO−11e−Tyr−Leu7 G I
V−G +y−va+−Phe−G In−Leu−G
Iu−L vS−G ly−A 5l)−Ara−L
eu−8er−Ala−Glu−11e−Asn−A
rlll−P rO−A S+)−T Vr−L eu
−A SD−P he−A Ia−G Iu−S er
−G IV−G In−Val−TVr−Phe−GI
V−11e−11e、−Ala−Leu −(COOH
) で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第9図にその作成方法を示した。
実施例6(発現の確認)
前記実施例4で得られた発現ベクターEIA A 41
゜ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドI)TNF401
NN又はI)TNF 401A1又は実施例5で得られ
た、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドDTNF480を有するエシェリヒア・コリC600
r−m−株を、30〜50μg/Idのアンピシリン、
0.2%のグルコース及び4jI!F/ai!のカザミ
ノ酸を含むM9培地[0,6%Na 2 HPO4−0
,3%に2 HPO4−0,05%Na(J−0,1%
NH4Cj水溶液(pH7,4)をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したM(]SO4
水溶液及びCaCl2水溶液をそれぞれ最終濃度2n+
M及び0.111Mになるように加える。]250Id
に接種し、0Dlaoが0.1に達するまで、31℃で
振どう培養を行なった。次いで、最終濃度50μg/d
の3−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、
さらに37℃で12時間撮とう培養を続けた。
゜ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドI)TNF401
NN又はI)TNF 401A1又は実施例5で得られ
た、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドDTNF480を有するエシェリヒア・コリC600
r−m−株を、30〜50μg/Idのアンピシリン、
0.2%のグルコース及び4jI!F/ai!のカザミ
ノ酸を含むM9培地[0,6%Na 2 HPO4−0
,3%に2 HPO4−0,05%Na(J−0,1%
NH4Cj水溶液(pH7,4)をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したM(]SO4
水溶液及びCaCl2水溶液をそれぞれ最終濃度2n+
M及び0.111Mになるように加える。]250Id
に接種し、0Dlaoが0.1に達するまで、31℃で
振どう培養を行なった。次いで、最終濃度50μg/d
の3−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、
さらに37℃で12時間撮とう培養を続けた。
遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、PBSバッファ
ー(1501M Na CMを含む20111Mリン
酸バッファー、 tlH7,4)を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を1011のPBSバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置(久保田、 200M
型)を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
漬の除去を行なった。
ー(1501M Na CMを含む20111Mリン
酸バッファー、 tlH7,4)を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を1011のPBSバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置(久保田、 200M
型)を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
漬の除去を行なった。
得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Tris−
HCfバッファ −(pH6,8) 、 SO8,2−
メルカブトエタノール、グリセO−)しを、それぞれ最
終濃度601M、2%、4%、10%になるように加え
、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動[鈴木、遺
伝、旦、 43(1977) ]を行なった。
HCfバッファ −(pH6,8) 、 SO8,2−
メルカブトエタノール、グリセO−)しを、それぞれ最
終濃度601M、2%、4%、10%になるように加え
、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動[鈴木、遺
伝、旦、 43(1977) ]を行なった。
分離用ゲルは16%とし、泳動バッファーはSDS。
Tris−グリシン系[U、 K、 Laemmli。
Nature 、 227. 680(1970)
]を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープル−R〜250(バイオ・ラッド)で染色し、ヒ
トTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第1
0図に示した。
]を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープル−R〜250(バイオ・ラッド)で染色し、ヒ
トTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第1
0図に示した。
なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナーく島津、
O3−930型)にかけて、産生されたヒトTNF蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトT
NF遺伝子発現型プラスミドpTNF401Aを有する
大腸菌においては全細胞質蛋白質の約16%のヒトTN
F蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドDTNF480を有する大腸菌においては同じ
く約11%の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、そ
れぞれ認められた。また、ヒトTNF遺伝子発現型プラ
スミドI)T N F 401N Nを有する大腸菌に
おけるヒトTNF蛋白質の産生量は、上記pTNF40
1Aの場合の約40%にすぎず、発現ベクターpAA4
1の有用性が示された。
O3−930型)にかけて、産生されたヒトTNF蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトT
NF遺伝子発現型プラスミドpTNF401Aを有する
大腸菌においては全細胞質蛋白質の約16%のヒトTN
F蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドDTNF480を有する大腸菌においては同じ
く約11%の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、そ
れぞれ認められた。また、ヒトTNF遺伝子発現型プラ
スミドI)T N F 401N Nを有する大腸菌に
おけるヒトTNF蛋白質の産生量は、上記pTNF40
1Aの場合の約40%にすぎず、発現ベクターpAA4
1の有用性が示された。
実施例7(活性の評価)
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ruf
fの方法に準じて行なった。すなわち、実施例6で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料100μ文と、4 X 1
05個/Idの濃度のマウス上−929繊維芽細胞(A
TCCCCL−929>懸濁液100μ文を、96穴の
組織培養用マイクロプレート(コースタ−)内で混合し
た。なおこの際に、最終濃度1μ9/mi!のアクチノ
マイシンD(コスメゲン、萬有製薬)を添加しておく。
fの方法に準じて行なった。すなわち、実施例6で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料100μ文と、4 X 1
05個/Idの濃度のマウス上−929繊維芽細胞(A
TCCCCL−929>懸濁液100μ文を、96穴の
組織培養用マイクロプレート(コースタ−)内で混合し
た。なおこの際に、最終濃度1μ9/mi!のアクチノ
マイシンD(コスメゲン、萬有製薬)を添加しておく。
培地としては、5%(vol /vol )のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地(
日永製薬)を用いた。上記マイクロプレートを、5%炭
酸ガスを含む空気中、37℃で18〜20時間培養した
模、クリスタル・バイオレット溶液[5%(vol/v
ol )メタノール水溶液に、0.5%(wt/vol
)のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの]を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを100μ旦の0.5%SDS水溶液で抽出し、
その595na+における吸光度をELISAアナライ
ザー(東洋側器、ETY−96型)で測定する。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトT
NF蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大I
I!菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の
50%の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグ
ラフ(たとえば第11図)によって求め、その希釈倍率
をユニットと定義する。第11図より、発現型プラスミ
ド1)TNF401AにコードされるヒトTNF蛋白質
を含む大腸菌ライゼート 100μ旦は6.3X 10
5ユニツト程度の活性を、そして発現型プラスミド1)
TNF480にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼート 100μ又は1.6×10
4ユニツト程度の活性を、それぞれ有していることが明
らかになった。
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地(
日永製薬)を用いた。上記マイクロプレートを、5%炭
酸ガスを含む空気中、37℃で18〜20時間培養した
模、クリスタル・バイオレット溶液[5%(vol/v
ol )メタノール水溶液に、0.5%(wt/vol
)のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの]を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを100μ旦の0.5%SDS水溶液で抽出し、
その595na+における吸光度をELISAアナライ
ザー(東洋側器、ETY−96型)で測定する。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトT
NF蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大I
I!菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の
50%の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグ
ラフ(たとえば第11図)によって求め、その希釈倍率
をユニットと定義する。第11図より、発現型プラスミ
ド1)TNF401AにコードされるヒトTNF蛋白質
を含む大腸菌ライゼート 100μ旦は6.3X 10
5ユニツト程度の活性を、そして発現型プラスミド1)
TNF480にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼート 100μ又は1.6×10
4ユニツト程度の活性を、それぞれ有していることが明
らかになった。
実施例6で得られた発現型プラスミドpTNF401
AにコードされるヒトTNF蛋白質又は発現型プラスミ
ドI)TNF480にコードされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量
は、プロティン・アッセイ・キット(バイオ・ラッド)
を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線よ
り計算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白
質定量結果よりヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドの比活性を計算したところ、表1のような値
が得られた。
AにコードされるヒトTNF蛋白質又は発現型プラスミ
ドI)TNF480にコードされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量
は、プロティン・アッセイ・キット(バイオ・ラッド)
を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線よ
り計算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白
質定量結果よりヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドの比活性を計算したところ、表1のような値
が得られた。
表1 ヒトTNF蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較
ペプチドの比較
第1図は設計したヒトTNF遺伝子の塩基配列を、第2
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第3図、第4図及び第5
図は、ヒトTNF遺伝子の一部を有するプラスミドpT
NF1BR,1)TNF2N及びpTNF3の作成方法
を、それぞれ示したものである。第6図はヒトTNFl
伝子発現型プラスミドl)T N F 401N Nの
作成方法を、第7図は発現ベクター1)A A 41の
作成方法を、そして第8図はヒトTNFm転子発現型プ
ラスミドpTNF401Aの作成方法を、それぞれ示し
たものである。第9図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミド11TNF480の作成方法を示
したものである。第10図はヒトTNFJ伝子及び新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示した
ものである。第11図はヒトTNF蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したものである
。 特許出願人 帝 人 株 式 会 社 鳥 4[I F−u IC 躬!i″口 PvulCJ) )1rhcJ TL 乳ct匹cA8
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第3図、第4図及び第5
図は、ヒトTNF遺伝子の一部を有するプラスミドpT
NF1BR,1)TNF2N及びpTNF3の作成方法
を、それぞれ示したものである。第6図はヒトTNFl
伝子発現型プラスミドl)T N F 401N Nの
作成方法を、第7図は発現ベクター1)A A 41の
作成方法を、そして第8図はヒトTNFm転子発現型プ
ラスミドpTNF401Aの作成方法を、それぞれ示し
たものである。第9図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミド11TNF480の作成方法を示
したものである。第10図はヒトTNFJ伝子及び新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示した
ものである。第11図はヒトTNF蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したものである
。 特許出願人 帝 人 株 式 会 社 鳥 4[I F−u IC 躬!i″口 PvulCJ) )1rhcJ TL 乳ct匹cA8
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)第1図に示した1番目のValから157番目の
Leuまでで表わされるアミノ酸配列において、1また
はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がな
された配列のうち、少なくとも32番目のArgのGl
uへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性ポ
リペプチド。 (2)次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、第1項記載の新規 生理活性ポリペプチド。 (3)アミノ末端にMetが結合していることを特徴と
する第1項記載のポリペプチド。 (4)第1図に示した1番目のValから157番目の
Leuまでで表わされるアミノ酸配列において、1また
はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも32番目のArgのG
luへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
ポリペプチドまたは、そのアミノ酸末端にMetが結合
しているポリペプチドをコードするDNA領域を含む組
換えプラスミド。 (5)該ポリペプチドが次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドであること
を特徴とする第4項記載の組換えプラスミド。 (4)該DNA領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DN
Aとから成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする第4
項記載のプラスミド。 (7)該DNA領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DN
Aとから成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする第4
項記載のプラスミド。 (8)該プラスミドがプラスミドpTNF467である
第4項記載のプラスミド。 (9)第1図に示した1番目のValから157番目の
Leuまでで表わされるアミノ酸配列において1または
それ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなさ
れた配列のうち、少なくとも32番目のArgのGlu
への置換を含むような配列を含有する新規生理活性ポリ
ペプチドまたはそのアミノ末端にMetが結合している
ポリペプチドをコードするDNA領域を含む組換えプラ
スミドにより形質転換された組換え微生物細胞。 (10)該微生物細胞がエシエリヒア・コリ(Esch
erichia coli)であることを特徴とする第
9項記載微生物細胞。 (11)第1図に示した1番目のValから157番目
のLeuまでで表わされるアミノ酸配列において、1ま
たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも32番目のArgのG
luへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
ポリペプチドまたはそのアミノ末端にMetが結合して
いるポリペプトチドをコードするDNA領域を含む組換
えプラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を
培養し、培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄
積せしめ、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチ
ドを分離することを特徴とする、新規生理活性ポリペプ
チドの製造方法。 (12)第1図に示した1番目のValから157番目
のLeuまでで表わされるアミノ酸配列において、1ま
たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも32番目のArgのG
luへの置換を含むような配列を含有する抗腫瘍に有効
な量の新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端
にMetが結合しているポリペプチドを含有する医薬組
成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12567787A JPS63291591A (ja) | 1987-05-25 | 1987-05-25 | 新規生理活性ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12567787A JPS63291591A (ja) | 1987-05-25 | 1987-05-25 | 新規生理活性ポリペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63291591A true JPS63291591A (ja) | 1988-11-29 |
Family
ID=14915930
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12567787A Pending JPS63291591A (ja) | 1987-05-25 | 1987-05-25 | 新規生理活性ポリペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63291591A (ja) |
-
1987
- 1987-05-25 JP JP12567787A patent/JPS63291591A/ja active Pending
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