JPS63291591A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物１Ｉｒｆ！
及び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの
製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する
新規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
と略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａｆｆ１域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによ
って形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞
を用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関す
る。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡｌａＬ−アラニン ＡｒりＬ−アルギニン ＡＳｎＬ−アスパラギン ＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸 ＣＶＳ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン １−１ｉＳＬ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １ｅｕＬ−ロイシン ＬｙｓＬ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−プロリン ３８ｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′　
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）発明の前頭 Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、ＢａｃＮｌｕｓ　　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｔｌｍｏｒ　　Ｎ　ｅＩＣｒ
Ｏ３ｉ３Ｆａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、
　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になって、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　ＡりＯ−ニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ
１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、３ｈｉｒａ
ｉら。

Ｎａｔｕｒｅ、ユ１３．　８０３（１９８５）　］　、
宗村ら［塞材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０＜１
９８５）　］　、ＷａｎＱら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｏら、　
５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８５）　
　］及びＭ　ａｒｌｌｌｅｎＯＬＩｔら［Ａ　、　Ｍ　
ａｒｌｅｎｏｕｔら。

Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、ユ５２．　５
１５　（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦｍ伝子の大腸菌
における発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　Ｂｅｕｌｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影Ｗ［Ｊ、Ｒ。

Ｇａ１ｂｌｅら、Ｊ、ＥＸＤ、　Ｍｅａ、、ユ６２．２
１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ，Ｂ
ｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９．　
５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、ＣｙｓｊＰ及びＣｙ　ｓ　／＃／のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願
公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６１−１０６７
７２号）　、Ｇ　Ｉｙ”の他のアミノ酸残基への置換（
特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４
８号）。

Ａｌａ　　の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−
２３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末端
側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５
０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜１
０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、そ
の比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大にな
ること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　（１２３８１号）
、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有している
こと（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１１アミノ
酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭
６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換、えプラスミドを提供す
ることにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第１
図に示した１番目のＶａｌから１５７５７番目ｅｕまで
で表わされるアミノ酸配列において１またはそれ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなされた配列の
うち、少なくとも３２番目のＡｒ（ｌのＧｌｕへの置換
を含むような配列を含有する新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチ
ドを提供することによって達成され、また上記新規抗腫
瘍活性ボリペプ、チドをコードするＤＮＡ領域を含む組
換えプラスミドを提供することによって達成され、更に
かくして得られた組換えプラスミドによって形質転換さ
れた組換え微生物ｌＩｌ胞、その微生物細胞を用いて目
的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及
びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成
物を提供することによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［０，ｐｅ
ｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの中
から適当なものを選び、それを化学合成することによっ
て取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にクローン化及び遺伝“子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コド°ン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流
方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コ
ドン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮ［１伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

”Ｓｏｍｅ　　ＲｅＣｅｎｔ　　ＤｅＶｅｌＯｌ）ｌｌ
ｅｎｔｓ　　、ｉｎｃ　ｈｅ−ｉｓｔｒｙ　　ｏｒ　　
ｐ　ｈＯ３ｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ、　　ｏｆＢ
　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　、
Ｊｏｈｎ　　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　　５ｏｎｓ　　、
　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）］
。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水Ｍｕを、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえば・ｐＢＲ３２２［Ｆ　、　
　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、’　　２　、
　９５（１９７７）　］のようなベクターに一度クロー
ン化した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結す
る方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成
するブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好
ましくはｐＴＮＦ１８Ｒ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａＣプロモーターＩＰＬプロモーター、
　Ｉｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｐＹ　Ｓ　３１Ｎ　
１又はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ３１１
伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を
付与することができる。このようなターミネータ−とし
て、１ｐｐターミネータ−２ｔｒｐターミネータ−等が
あげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミ
ドとして、好ましくはＤＡ　Ａ　４１が用いられる。こ
の発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＥＩＴ
ＮＦ　４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
： こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
―域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子のｖｉ復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗ｌ瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはＥＩＴＮＦ４８０が用
いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価ニ ーヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子を発現させるための微生物宿主としては、大ｌｌ！
菌、枯草菌、醇母等があげられるが、とりわけ大腸菌［
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉ）　１が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏ
ｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ，６００
ｒ−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することがで
きる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉ
ｎａ”、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ＤｒｉｎＧ）
−１ａｒｂｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ
　　”ｙ’ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば撮とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で
２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌら。

前出）、マウスＬ＄Ｉｌｌ胞に対する細胞障害性を見る
ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法［ＲｕＨ、Ｊ。

Ｉｎ５ｕｎｏ１．、１２６．　２３５（１９８１）　１
等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便さ
等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評価
が好ましい。

か（して本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎｉｃａら［０゜ｐ　ｅｎ
ｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２
４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前駆体ｃ
Ｄ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、
適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、５
′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側に２
″個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞれ
付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限酵
素（ＪａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開始
コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの
連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流に
は制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［による切断部位を設け、ベク
ター・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　＞を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、Ｄｔ’ＪＡ塩基の
保護基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲ
ル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子
酸の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、
７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、２〜５ｄの溶出用バフ７Ｆ　　［５００
ｍＭ　　ＮＨ４０Ａｃ−ｉ　　ｍＭＥＤＴＡ−０，１％
ＳＤＳ　（ｐＨ７，５＞　］を加え、３７℃で一晩撮と
うした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回
収を行なったａ最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶
液をゲル濾過カラム（セフ１デツクスＧ　−５０）にか
けることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得
た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上
をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７＞を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ３の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ塁の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ９，５）　、　１０　ｍＭ
　　ＭＯＣＩ２゜５　ｍＭジチオスレイトール、１０ｍ
Ｍ　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった
。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液
をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽出により
Ｉ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した侵室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６　ｍ１
ＶＩＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，６）　、　　６．６
　ｍＭ　　Ｍ（］　（Ｊ２゜１０１Ｍジチオスレイトー
ル、１ｎ＋ＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツト
の７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で
１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチ
ジウムブロマイド染色法により泳動パターンの１Ｍ察を
行なう。目的とする大きさく約２２０ｂｌ））のバンド
部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリル
アミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μびの大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ旦の１Ｏｎ＋Ｍ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ＥＩＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ
　Ｃ１，７１ＭＭＣＩＣ１ｚ水溶液に溶解させ、１０ユ
ニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオ
ラプズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。

制限酵素Ｃ１ａ工による切断の債、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ旦の５０□１１ＩＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，４）　、　　１００　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃ１，１０ＲＩＭ　　ＭｇＳＯ４水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドＤＢＲ３２２の大部分を
含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを
切出し、そのアガロースゲル断片を３倍ω（ｖｏｌ　／
ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｌ０ａ水溶液に溶解させた。Ｃ
ｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片＜ｃｘａ　ｌ−８ａｌＩ）をアガロース
ゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ３１伝子の一部を含む約２２０
ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１−株の形質転換は
、通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｍｌ！のし
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％
Ｎａ　ＣＬ　　ｐｌ−１７，２）にエシェリヒア・コリ
Ｃ６００ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を
含む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ　ｊａａ）
が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネ
シウム・バッファ　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃｊ、　５
　　ｍＭ　　Ｍ（１（Ｊ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｆ　（１）Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄの
冷したカルシウム・バッファー［１００ｍＭＣａ　Ｃｊ
ｚ　、　２５０　　ｍＭ　　Ｋ（Ｊ、　５１１１ＭＭ（
Ｉ　Ｃｆ２．５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐｈ　
７．６゜０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間ｆｉ
ｌ装する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８％グ
ルコース、　　ｌ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時
間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）　３０μ９／ｒｄを含むし培地プレート］に
１００μρ／プレートの割合で接種する。プレートを３
７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオヂドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドＩ）ＴＮＦｌＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、
　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、
６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及び３ａｌ
■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ３
１伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜ＣＪａ
　Ｉ　４−４ＳａｌＩ　＞　ヲポリアクリルアミドゲル
より回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｇをｉｏｏμ４１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
ｊ（ｐＨ７，５）　、　６０ｎ＋　Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，
７ｍＭＭ（ｌｃｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰｖｕＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時
間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じ
て制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル′ｆ：Ｊ度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩＩ）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドＤＴＮＦ３　１０
μ９も１０（Ｉ　ｎの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−１−
Ｉ　ＣＩ（ｐＨ７，５＞、６０　ｍＭ　　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｍＭＭ（］Ｃｆｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌ！（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（
ＰＶｕｌＩ←ＨｉｎｄＩ［ｌ）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄＩＩＩで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミド１）ＹＳ３１Ｎの大部
分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ＋）
ｌｉｎｄＩ［Ｉ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦｍ伝子の一部を含む杓２
２０ｂｐ、約１７０ｂＤ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミド１）ＹＳ３１Ｎの大部分を含む約４
．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈澱の
優、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法
に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入
し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦｆｆｌ伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｐ
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ＰｖｕＩ［で部分分解した後、さら
に制限酵素）（ｉｎｄｌｆｉで切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に
準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐの
ＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２）ＨＨｉｎｄ　ｍ　］を７
ガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ３に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先ニ得うレタ約２，７Ｋ　ｂ
ｐｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片［ｐ　ＶＬＩＩＩ　（２）”　ｉ
ｆ　ｉｎｄ　ｍコと混合シ、工’２／−／１ｉｔＱ（７
）Ｉ、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導
入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１
（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有するりＯ−ンを選択した。こ
のようなプラスミドは、プラスミドｐＹｓ３１Ｎからコ
ピー数制御領域除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在
するクローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａタ
ーミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベ
クターであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＩ）ＡＡ４１　２μりを、上記と同様に
制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌで切断し、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方
法に準じて、プラスミドｌ）Ａ　Ａ　４１の大部分を含
む約２．７Ｋ　ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＣｊａＩ−）１ｉ
ｎｄｌ［Ｉ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４０１ＮＮ５μシを、上記と同様に制限酵素
ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９ｏｂＤ　
ｔ７）　ＯＮ、Ａ断片（Ｃｊａ　Ｉ”ｌ−１ｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７）（ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂＥ）のＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００「−量一株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　＜約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ３ｍ伝子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μｙを、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌＩで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それ
ぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤ
ＮＡ断片（約４９０ｂ１１及び約２．７Ｋ　ｂｐ、両方
共ｃ１ａ　Ｉ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をゲルより回収した
。

ここで得られたヒトＴＮＦ３ｆｉ伝子全域を含む約４９
０ｂｌ）のＤＮＡ断片を５０μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，４＞　、　ＩＯＩＭ　　Ｍｇ
５Ｏａ　、　１　　ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶
解させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩ［（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ　Ｆ
ｍ伝子の大部分を含む約３７０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂｇ
１Ｈ，−＊ＨｉｎｄＩ［［）をポリアクリルアミトゲ、
ルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ
”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ３ｉ伝子の大部分を
含む約３７０ｂｒｌのＤＮＡ断片（ＢｏｌＩＨｌ−１ｉ
ｎｄｌ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３
の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１−株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４８０（約３
．２Ｋ　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。このプラ
スミドは、次のアミノ酸配列（８２Ｎ）　　　Ｐｒｏ−
３ｅｔ−ＡＳＩ）、　　Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ
　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ
−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ
−Ｇ　Ｉｎ−しｅＬＩ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　
ｅｌｌ　−Ａ　ａｎ　−Ａ　ｒ（１−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　
Ｉａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　Ｉａ−１ｅｕ−１ｅｕ−Ａ　Ｉａ
−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−
Ａ　ｒａ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−
Ｇ　ｔｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ＩＶ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈ
ｒ−ＨｉＳ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｓｅｒ　−Ａｒｇ−１１ｅ−ＡＩａ
−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔ　ｈｒ−ＬＶｓ
−Ｖａｌ−Ａ　ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ
　Ｉａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇ
　Ｉｎ−Ａ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ
−Ａ　ｌａ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ
　１ｕ−Ｐ　ｒＯ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ７　Ｇ　Ｉ
Ｖ−Ｇ　＋ｙ−ｖａ＋−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｌ　ｖＳ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｌ）−Ａｒａ−Ｌ
ｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ　
ｒｌｌｌ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　Ｓ＋）−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　ＳＤ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ
−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−ＴＶｒ−Ｐｈｅ−ＧＩ
Ｖ−１１ｅ−１１ｅ、−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ
） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクターＥＩＡ　Ａ　４１
゜ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４０１
ＮＮ又はＩ）ＴＮＦ　４０１Ａ１又は実施例５で得られ
た、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドＤＴＮＦ４８０を有するエシェリヒア・コリＣ６００
ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／Ｉｄのアンピシリン、
０．２％のグルコース及び４ｊＩ！Ｆ／ａｉ！のカザミ
ノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０
，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％Ｎａ（Ｊ−０，１％
ＮＨ４Ｃｊ水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭ（］ＳＯ４
水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最終濃度２ｎ＋
Ｍ及び０．１１１Ｍになるように加える。］２５０Ｉｄ
に接種し、０Ｄｌａｏが０．１に達するまで、３１℃で
振どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ／ｄ
の３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、
さらに３７℃で１２時間撮とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
ー（１５０１Ｍ　　Ｎａ　ＣＭを含む２０１１１Ｍリン
酸バッファー、　　ｔｌＨ７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０１１のＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
漬の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファ　−（ｐＨ６，８）　、　ＳＯ８，２−
メルカブトエタノール、グリセＯ−）しを、それぞれ最
終濃度６０１Ｍ、２％、４％、１０％になるように加え
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、遺
伝、旦、　４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープル−Ｒ〜２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１
０図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナーく島津、
Ｏ３−９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａを有する
大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１６％のヒトＴＮ
Ｆ蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドＤＴＮＦ４８０を有する大腸菌においては同じ
く約１１％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、そ
れぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラ
スミドＩ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎを有する大腸菌に
おけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記ｐＴＮＦ４０
１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクターｐＡＡ４
１の有用性が示された。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料１００μ文と、４　Ｘ　１
０５個／Ｉｄの濃度のマウス上−９２９繊維芽細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ−９２９＞懸濁液１００μ文を、９６穴の
組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合し
た。なおこの際に、最終濃度１μ９／ｍｉ！のアクチノ
マイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
模、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μ旦の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５ｎａ＋における吸光度をＥＬＩＳＡアナライ
ザー（東洋側器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴ
ＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大Ｉ
Ｉ！菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の
５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグ
ラフ（たとえば第１１図）によって求め、その希釈倍率
をユニットと定義する。第１１図より、発現型プラスミ
ド１）ＴＮＦ４０１ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質
を含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は６．３Ｘ　１０
５ユニツト程度の活性を、そして発現型プラスミド１）
ＴＮＦ４８０にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼート　１００μ又は１．６×１０
４ユニツト程度の活性を、それぞれ有していることが明
らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１　
ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミ
ドＩ）ＴＮＦ４８０にコードされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量
は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラッド）
を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線よ
り計算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白
質定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値
が得られた。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ，１）ＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法
を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦｌ
伝子発現型プラスミドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの
作成方法を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の
作成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦｍ転子発現型プ
ラスミドｐＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示し
たものである。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミド１１ＴＮＦ４８０の作成方法を示
したものである。第１０図はヒトＴＮＦＪ伝子及び新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示した
ものである。第１１図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したものである
。 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 鳥　４［Ｉ Ｆ−ｕ　ＩＣ 躬！ｉ″口 ＰｖｕｌＣＪ） ）１ｒｈｃＪ　ＴＬ 乳ｃｔ匹ｃＡ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１また
   はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がな
   された配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＧｌ
   ｕへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性ポ
   リペプチド。 （２）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、第１項記載の新規 生理活性ポリペプチド。 （３）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。 （４）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１また
   はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入が
   なされた配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＧ
   ｌｕへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
   ポリペプチドまたは、そのアミノ酸末端にＭｅｔが結合
   しているポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組
   換えプラスミド。 （５）該ポリペプチドが次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドであること
   を特徴とする第４項記載の組換えプラスミド。 （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第４
   項記載のプラスミド。 （７）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第４
   項記載のプラスミド。 （８）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４６７である
   第４項記載のプラスミド。 （９）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において１または
   それ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなさ
   れた配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＧｌｕ
   への置換を含むような配列を含有する新規生理活性ポリ
   ペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合している
   ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラ
   スミドにより形質転換された組換え微生物細胞。 （１０）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
   ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする第
   ９項記載微生物細胞。 （１１）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目
   のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
   たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
   なされた配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＧ
   ｌｕへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
   ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合して
   いるポリペプトチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換
   えプラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を
   培養し、培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄
   積せしめ、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチ
   ドを分離することを特徴とする、新規生理活性ポリペプ
   チドの製造方法。 （１２）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目
   のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
   たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
   なされた配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＧ
   ｌｕへの置換を含むような配列を含有する抗腫瘍に有効
   な量の新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端
   にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する医薬組
   成物。