JPH02142493A

JPH02142493A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH02142493A
Application number: JP63296307A
Authority: JP
Inventors: Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-11-25
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1990-05-31
Anticipated expiration: 2010-11-29
Also published as: JPH07110238B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）　　産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換されたｉｌｌ換え微生物細胞及び該微生ｊ＋ＩＪ細胞
を用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関す
る。

本明細書にａ３いて、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

７！ｉ、Ｉａｌ−−アラニンＡｒｏＬ−アルギニンＡｓｎＬ−アスパラギンＡｓｐ　　Ｌ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧｌｎ　　Ｌ−グルタミンＧＩｕＬ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨ＋ｓＬ−ヒスチジン１１ｅｌ−−イソロイシン１ｅｕｌ−ロイシンＬｙｓＬ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンｐｈａ＋−−フェニルアラニンｐｒｏｌ−ブＯリン３ｅｒ　　Ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−ｔ−リブトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンｖａｌ　　ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す、）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′　
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけた［Ｅ、Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　
Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａ口。

Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、（Ｊ　Ｓ　Ａ　、　７２．３
６６６　（１９７５）コ。このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、
しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてきた。

最近になッテ、ｐｅｎｎｉｏａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
　Ｆ３ｉ伝子の発現について報告した［Ｄ　、　　Ｐ　
ｅｎｎｉＣａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　
７２４（１９８４）　］　。その後、０井ら［Ｔ、　５
ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ１３．　８０３（１９８５）　］　
、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０（
１９８５）　］　、Ｗａｎｃ＋ら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａら
、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８
５）　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　Ｍ　ａ
ｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１５
（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌におけ
る発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　Ｂｅｕｌｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

ユ徂、　　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＥの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅ　　ら、　Ｊ、　　ＥＸＩ）、　　Ｍｅｄ
、　　、　　　１６２．　２１６３（１９８５）　］　
、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ，３ｅｌｔｏｌｉｎｉら、Ｎａ
ｔｕｒｅ　、　　３坦、　　５１６（１９８Ｂ）　］等
が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもい（っがの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ’Ｆ及びｃｙｓｌｇｌのいずれか
又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換（
ＰＣＴ出願公ＩＷＯａ８／　０４６０６号、特願昭６ｌ
−１０６７７２）　、Ｇ　ＩＶ肩の他のアミノ酸残基へ
の置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２
３８０４８号）、Ａｌａ”の他のアミノ酸残基への置換
（特願昭６１−２３３３３７号）が報告されている。ま
た、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失についても、６
アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（
特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが
細胞障害活性を有していること（特願昭６１−９００８
７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦに
おいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０
２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性
を有していること（特願昭６１−１１４７５４号）、１
１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−１７３８２２号）、及び７アミノ酸欠失
ＴＮＦを基盤として、Ｐ　ｒｏ＠ｓ　ｅｒｓ　Ａ　３ｐ
ｌｅをＡ　ｒｇＬ　ＶＳＡ　ｒＱへｌｉｔ換を行なうと
、その比活性が大きく上昇することが報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上６安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、　８１作用の低減化等を目的と
して、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変につぃて鋭意研究を行な
い、本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ）　　Ａｒ＜１−Ｌｙｓ　　ｘｒｏ　　Ｌｙｓ
　−Ｐｒｏ−Ｖａｔ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ
　−Ｖａｔ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｎ−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−１−ｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｌ）　−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ａｒり−Ａｒ（１−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌ
ａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ｇ　ＩＶ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｕ　−１ｅｕ　−
Ａ　ｒＧ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ａ　ｓｎ　−Ｑ　Ｉｎ−Ｌ
　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｐ　ｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　１０
Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−１−ｅｕ　−１ｌｅ
　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ
−Ｌ　ｅｖ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−５ｅｒ−Ａｒａ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−ＬｙＳ−Ｖａｔ−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ　−１１ｅ　−Ｉ　　
ＶＳ　−Ｓｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　
−△ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　
Ｉｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　１ａ−Ｌ　ｙｓ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ
ｒｏ　−Ｉ　１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｖａｔ　−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅＬｌ−Ｇ　ｌｕ
−Ｌ　’／Ｓ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　ＳＬ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−
３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　　１ｅ−ＡｓｎＡ　ｒｆ
Ｊ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　ｌ−Ｌ　ｅｌＪ−Ａ　
５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ
　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｔ−Ｔ　ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ１
１／−Ｉ　　１ｅ−Ｉ　　＋ｅ−”ｒｒｐ−Ｌｅｕ−（
ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また、ト
記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミドを提供することによって達成さ
れ、更にかくして（９られた組換えプラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用
いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる
方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医
薬組成物を提供することによって達成されることがわか
った。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノＭ　［Ｄ、　
Ｐｅｎｎ１ｃａら５前出］ヲ指定するいくつかのコドン
の中から適当なものを選び、それを化学合成することに
よって取得できる。ヒトＴＮＦｉ転子の設計に際しては
、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが
望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行な
えるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位
を股１プることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ＞を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

”　Ｓ　０１１１０　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅ［ｌ１ｉｓｔｒｌ／　　
Ｏｆ　　Ｐ　ｈｏｓｏｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒＳ　　
Ｏｆ３　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ
　”　、　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏ
ｎｓ　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９
６１）　］。

トリエステル法［Ｒ，１，ｌｅｔｓｉｎｇｃｒら、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして（ｑられた合成オリゴヌクレオチドの５′末端
側の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえ
ばＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴ
ヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方
法としては、合成オリゴヌクレオチドをい（つかのブロ
ックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　
　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９
５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化
した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方
法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成する
ブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好まし
くはｐＴＮＦｌＢＲ。

１）ＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
Φオペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｔｉｌｌ）プロモーター等があげられるが、とりわけ
ｔｒｐブＤモーターが好適である一０ｔｒｐプロモータ
ーを有するプラスミドとして、好ましくはｐＹｓ３１Ｎ
１又はＭ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦＭ転子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
！ｐｐターミネーターｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発現
型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえば１）ＢＲ３２２由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトＴＮＦ３１１伝子発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ
　４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
：こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくは９ＴＮＦ６１Ｂが用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｆｆｌ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することが
できる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎａ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照１があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培！ｉ後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を
集め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば
超音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離
により組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られた
ライゼート中の蛋白質を、ラウリル１ｉＡ酸ナトリウム
（以下、ＳＯ８と略すこともある）を含むポリアクリル
アミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の
蛋白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前出）、マウ
スＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　ＶｉｔｒＯ
活性測定法［ＲｕＨ、Ｊ、　　１ｍｍｕｎｏｌ、、ユ２
６．　２３５　（１９８１）コ等により行なえる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・り０マドグラフイーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドＭ製品を用いること
により、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作用に
関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ＶｉｔｒＯ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗！Ｉｌ瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供
することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始フドン上流には
制限酵素Ｃ１ａ■による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌによる切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦｍ転子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全白りｌＤＮＡ合成ＩＩ（アプライ
ド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５−の溶出用バッファー［５００ｍＭ　
　ＮＨ４０ＡＣ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＯ８（ｐ
Ｈ７，５＞　１を加え、３７℃で一晩振とうした。遠心
分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行なった
。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル濾過
カラム（セファデックスＧ−５０＞にかけることにより
、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお、必要
に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰り返し
、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてりＯ−ン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｓ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ＤＨ９，５）　　、　　１０
　１Ｍ　　　Ｍｇ　Ｃ１ｚ　　。

５　ｓＭジチオスレイトール、１０ａＭ　　Ａ’ＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＩ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６　ｉＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（＋）８　７．６＞　、　　６．６
１Ｍ　　ＭＯＣＩ２゜１０１Ｍジチオスレイトール、１
＋ｅＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトのＩ４
−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１５時
間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウム
ブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行なう。

目的とする大きさ（約２２０ｂｐ　）のバンド部分を切
出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミドゲ
ルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μりの大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ磨の１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ
−）−Ｉ　ＣＩ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，７ｍＭＭＱＣ１ｚ水溶液に溶解させ、１０ユ
ニツトの制限酵素Ｃ＃ａＩにューイングランド・バイオ
ラプズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。

制限酵素Ｃ１ａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ皇の５０　ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ　（ｐＨ７，４）　、　　１００　ｓＭ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，１０１Ｍ　　Ｍｌ；１８０４水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの
観察を行なう。プラスミドＤＢＲ３２２の大部分を含む
約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切
出し、そのアガロースゲル断片を３倍ｍ（ｖｏｌ　／ｗ
ｔ）の８Ｍ　　Ｎａ（ＪＯ＜水溶液に溶解させた。Ｃｈ
ｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

（：、　ｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、３ｉｏｃｈｅｍ、　
　１０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７
１（ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ→５ａｌＩ）をアガロ
ースゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２
の大部分を含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮ
Ａ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒアΦコリＣ６００ｒ−１０−株の形質転換は
、通常のＣａＣｊｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５Ｉｄのし培
地（１％トリプトン、０．５％［ｔエキス、０．５％Ｎ
ａ（Ｊ、　　ｐＨ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６０
０ｒ−１１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む
培養液の６００ｎｉにおける濁度（ＯＤｙ、ｐθ）が０
．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウ
ム・バッファ　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃｊ、　５１１
１Ｍ　　Ｍ（ｌ　Ｃｏ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
Ｊ　（ＤＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄの冷し
たカルシウム・バッファー［１００１＋１Ｍｃａ　Ｃ１
２，２５０１１１Ｍ　　ＫＣｊ、　５１１ＭＭｇＣＩ２
．５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（１）Ｈ７，６゜０
℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２＝１（ｖｏ
ｌ、：ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間。

０℃で保った後、１ｍｌのＬＢＧ培地（１％トリプトン
、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣオ、　　０．０８％
グルコース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時
間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）３０μｇ／Ｉ１１を含むＬ培地プレート］に
１００μ旦／プレートの割合で接種する。プレートを３
７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４に、ｂｌ））を、それぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれホす。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ　
３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設
計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　
Ｍ、　Ｍａｘａｉ＋ら、　ＭｅｔｈＯｄｓＥｎｚｙｍｏ
ｌ、、６５．　４９９（１９８０）　］によって確認し
た。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＪａＩ及び３ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲルａ
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ　
Ｔ−３ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｙを１００μＮの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ＋ｓ−ＨＣｆ
（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＬ　７　
ＩｌｌＭＭ（ＪＣＢ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰＶＩＩＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１
時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準
じて制限酵素３ａｌ■による切断、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐの
ＤＮＡ断片（Ｓ　ａｌＩ　ＨＰｖｉ　）をポリアクリル
アミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μｇも１００μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ９
（ｐＨ７，５）、６ｏ　　ｍＭ　　　Ｎａ　　ｃＬ　　
７　　ｍＭＭｇ’Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ＰｖｕＩＩ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉ
ｎｄ［Ｉ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反
応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒ
トＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片
（ＰＶｕＩＩＨＨｉｎｄ　ｍ　）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）５μ９を、上記と同様に
制限酵素ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄＤＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部
分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａｉ→Ｈ
ｉｎｄＩ［［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドＤＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む約
４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ト株に導
入し１．形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５，２Ｋ　ｂｐ
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミドＤＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミド１）ＹＳ３１Ｎ５μグを、上記の
方法に準じて制限酵素ｐｖｕ■で部分分解した後、さら
に制限酵素１−１ｉｎｄｌｌで切断し、アガ０−スゲル
ミ気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に
準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂ−ｐ
のＤＮＡ断片［ＰｖｕＩ［（２）＋Ｈｉｎｄ　ｍ　］を
アガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μりに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＦ（２）”Ｈｉｎｄ　ｆｉｒ
　］と混合し、ＩＪ／−／Ｌ沈１１Ｒ（７）Ｉ、実施例
３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反
応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエ
シェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｉ−株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミドｐＡ　Ａ　４１　（約２
．７Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このよう
なプラスミドは、プラスミドＥＩＹＳ３１Ｎからコピー
数制御領域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在す
るクローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒＤ　Ａター
ミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベク
ターであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μグを、上記と同様に制
限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｕ［で切断し、アガロース
ゲル電気泳動くゲル１１度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分を含
む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐの
ＤＮＡ断片（Ｃｊａ　Ｉ＋４Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をポリ
アクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｅ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミド１）ＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂＤ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦｌ転子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４０１Ａ２０μりを、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、それぞ
れ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮ
Ａ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋ　ｂｐ、両方共Ｃ
１ａ　Ｉ　Ｈｌ−１ｉｎｄ　ｍ　）をゲルより回収した
。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ隻の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣｆ（ＤＨ７，４）、　１０１１Ｍ　　Ｍ！ＪＳＯ
４、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素ＨａｐＩ［（宝酒造）を添加して、
３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない
、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分
を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｐ■←Ｈｉｎｄ
ｌｌ）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ
”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含
む約３９０ｂＤ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ＨａｐＨ−）
−１ｉｎｄＩ［）と混合し、エタノール沈澱の後、実施
例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結
反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じて
エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミドＤＴＮＦ４７１（約３．
２Ｋ　ｂｌ））を有するクローンを選択した。このプラ
スミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　　−ＡｒＯ
−Ｌｙｓ−Ａｒ！Ｊ　−Ｌｙｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−
Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　
ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　
ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　
ｅｕ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ａ　
ｓｎ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａ　
５ｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒ
ａ−Ａ　ｓｐ−Ａ　ｓｎＧ　Ｉｎ−１ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｑ　１ｙ−１ｅｕ　
−Ｔｙｒ　−１ｅｕ−Ｉｌｅ　−Ｔ　ｙｒ−３ｅｒＧ　
Ｉｎ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−ｐｈｅ−１ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｑｌｙ−Ｃｙｓ−ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈ
ｔｓ−ＶａＬ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈ
ｒ−１１ｅ−５ｅｒＡ　ｒｏ−ｒ　　ｌｅ−Ａ　ｌａ−
Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ＩｎＴｈｒ−Ｌ　ｙｓ−
Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−
１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−ＣＶｓ−Ｇ　Ｉｎ
−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ
−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｌａＱ　ｌｕ−Ａ　ｌａ−１ｙｓ−ｐ
　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　Ｖｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐ　ｒｏ−１
１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａｌ−
Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙｓ−
Ｇ　Ｉｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−
Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−１ｌｅ−Δ５ｎ−Ａ　ｒｇ　−ｐ
　ｒＯ−Ａ　Ｓ＋）　−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ、　
ｓｐ　−ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−
Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ
−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４７１　２０μ３を、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断した後、５０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ　（１）Ｈ７，４）　、　１００
　ｒａ　ＭＮａ　ＣＬ　１０１Ｍ　　Ｍｇ８０４水溶液
中で制限酵素Ｎ０ＯＩ（宝酒造）による切断反応を３７
℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度０．７％）及びポリアクリルアミドゲル電
気泳動くゲルａ度５％）を行ない、実施例２の方法に準
じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（ＮｃｏＩＨ）ｌｉｎｄ　ＩＩ）をポリアクリ
ルアミドゲルより、そして実施例３の方法に準じて、ｐ
ＴＮＦ４７１の大部分を含む約３．０ＫｂｐのＤＮＡ断
片（ＮｃｏＩ＋）ｌ　ｉｎｄ　ｉｌｌ　）をアカロース
ゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｎ
ＣＯｌｌ−Ｈｉｎｄ　■）を５０ｃｚ　ｆｌのｉｏｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｉ（Ｃオ（１）Ｈ７，４）　、　１０　ｍＭ
　　Ｍ（ｌ　ＳＯ４、１ｍＭジチオスレイトール水溶液
に溶解させ、１０ユニツ１への制限酵１ＡｃｃＩ（宝酒
造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ　
Ｃ０工←ＡＣＣＩ＞をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ”Ｈｉｎｄ　ｌｌ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一部含
む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ４−４Ａｃｃ
Ｉ）と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミドＥｌＴＮＦ６１８（約３．２Ｋｂｌ
））を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
次のアミノ酸配列（８２Ｎ　）　−Ａｒ＜１−　Ｌｙｓ−ＡｒＯ−ｔ−ｙ
ｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　
−Ｖａｌ　−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌ
ｎ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｌｌ　−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ａ　ｒｔ）　−Ａ　Ｉａ　−
Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｌａ　−Ａ　Ｓｎ　−Ｇ　＋ｙ−Ｖ　ａｔ−Ｇ　ｌｕ
−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒ（ｌｌ−Ａ　５ＥＩ−Ａ　５ｎ−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−
Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｖ　ａｌ
−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ
−Ｇ　ｌｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　
ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｓｅ
ｒ　−Ａ　ｒａ−Ｉ　Ｉｅ−Ａ　Ｉａ−Ｖａｔ−５ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　ｌａ−１１ｅ−Ｌ　ｙ
ｓ−５ｅｒ−ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｑ　Ｉｎ−Ａ　ｒｏ−Ｇ
　ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　
１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒ
ｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　＋ｙ−ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　５ｐ−Ａｒ
ｌｌｌ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇｌｕ　−１１
ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒＯ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　Ｓｐ−ＴＶｒ
−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌ
ｕ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−Ｉ　１ｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた発現型プ
ラスミドｐＴＮＦ４７１又は新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６１８を有するエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−ａ−株を、３０〜５０μ９
／ｒｄのアンピシリン、０．２％のグルコース及び４Ｉ
ＩＩ！Ｊ／Ｉｄのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％
Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ４０，０５
％Ｎａ＋！−０．１％Ｎ８４Ｃオ水溶液（ｐＨ７，４）
をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ
滅菌したＭＯＳＯ４水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれ
ぞれ最終濃度２　ｉＭ及び０、Ｉ　ＲＩＭになるように
加える。］２５０−に接種し、０Ｄｉ−、が０．７に達
するまで、３７℃で振とう培養を行なった。次いで、最
終濃度５０μ９７ｄの３−β−インドールアクリル酸を
培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間振どう培養
を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
　−（１５０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１Ｍリン酸
バッファー　ｐＨ７，４）を用いて菌体の洗浄を行なっ
た。洗浄後の菌体を１０ａｉ！のＰＢＳバッファーに懸
濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を
用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残漬の除
去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊバッフル　−（１）８６．８＞　、　ＳＤＳ、　
２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように加
え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、
遺伝、　３１．４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｉｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
）を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルー・Ｒ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、
ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第
１１図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
８−９３０型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペ
プチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行
なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ４０１Ａを有する大腸菌においては全細胞質蛋
白質の約１６．２％の発現型プラスミド１１ＴＮＦ４７
１を有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約２３．
２％の新規抗腫瘍活性ポリフベブチド遺転子発現型プラ
スミド１）ＴＮＦ６１８を有する大腸菌においては同じ
く約１３．５％の抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、そ
れぞれ認められた。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ旦と、４　Ｘ　１０５個／ｄの濃度のマウスＬ
−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸濁液１
００μ文を、９６穴の組織培養用マイクロプレート（コ
ースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μ
ｇ／−のアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）
を添加しておく。

培地としては、５％（ｙｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシセル培地（
日本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μすの０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳ△アナライザ
ー（東洋側器。

ＥＴＹ〜９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現型
プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＡにコードされるヒトＴＮ
Ｆ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μ塁は３．８
Ｘ　１０’ユニット程度の活性を、発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性ポリペプチドを
含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は約３．６Ｘ　１０
’ユニット程度の活性を、そして発現型プラスミドｐＴ
ＮＦ６１８にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は約３，９ｘ　１
０’ユニット程度の活性を、それぞれ有していることが
明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・
ランド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量、活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、ｐＴＮＦ６１８にコードされるＦｒＭＡ抗腫瘍
活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約１４倍の比活
性を、そして０ＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性
ポリペプチドの約２倍の比活性を有していることがわか
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦｉ仏子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの作成
方法を、第７図は発現ベクターＤＡ　Ａ　４１の作成方
法を、そして第８図はヒトＴＮＦｍ転子発現型プラスミ
ドＤＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したもの
である。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミド１）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したもので
ある。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミド１）ＴＮＦ６１８の作成方法を示したも
のである。第１１図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍
活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したもので
ある。第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性
ポリペプチドのＶｉｔｒＯ抗癌活性測定結果を示したも
のである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６１８である
請求項３記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする請求項７記載の微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。