JPS63291590A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗ｍＩ！活性を有する新規
ポリペプチド（以下、斬規抗Ｉｌｌ瘍活性ポリペプチド
と略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ領域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドは１ｔＪＰ
ＡＣ−１ｔＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方
法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用い
る。

ＡＩａＬ−アラニン Ａｒ！ＩＩＬ−アルギニン ＡＳｎ　Ｌ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃ’／Ｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉＳＬ−ヒスチジン １１１３１−インロイシン ＬｅｕＬ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ｐｈｅｌ−−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−プロリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−１リブトフアン Ｔｙｒ　　Ｌ−ヂロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′）
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。

（２１発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌ、らは、３ａｃｉｌｌｕｓ　　　Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ　　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（Ｂ　ＣＧ　）な
どで前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投
与した後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫
による癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見
出し、この物質を腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　　ｆｓＪ
　ｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記す
ることもある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅ
ｌｌら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａＮ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＬＩ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６
６　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、
しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてぎた。

最近になッテ、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告したＣＤ、　　Ｐｅｎｎ
１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
（１９８４）　］　。その後、自弁ら［王、　３　ｈｉ
ｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［余材う、癌ト化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇ
ら、　３ｃｉｅｎｃｅ、ユ２８．　１４９（１９８５）
　　］及びＭａｒｍｅｎＯＬｌｔら［Ａ　、　　Ｍ　ａ
ｒｌｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ３！伝子の大腸菌に
おける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［１３，３ｅｕｌｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影１１［Ｊ、Ｒ。

Ｑａｌｌｌｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸＤ、　Ｍｅｄ、、ユ６
２．２１６３＜１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　
Ｒ，１３ｅｌｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８Ｇ）　１等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ３７Ｆ及びＣｙ　３　＃ｌ／のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願
公開Ｗ０８Ｂ／　０４６０６号、特願昭６１−１０６７
７２号）、ＧＩＶ”の他のアミノ酸残基への置換（特願
昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８号
）。

Ａｌａ／’の伯のアミノ酸残基への置換（特願１１ａ６
１−２３３３３７号）が報告されている。また、アミノ
末端側のアミノ酸残塁の欠失についても、６アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１
−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活
性を有していること（特願昭６１−９（１０８７＠）、
１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有してお
り、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極
大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　（１２３８
１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有し
ていること（特ＷＲ昭６１−１１４７５４号）、及び１
１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変に°ついてｌ息研究を行ない
、本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の伯の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤ　Ｎ　Ａ　ｆａ’ｉ　ＶＡを含む組換えプラ
スミドを提供することにある。

本発明の更に伯の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第１
図に示した１番目のＶａｌから１５７５７番目ｃｕまで
で表わされるアミノ酸配列において、１またはそれ以上
のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなされた配列
のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＡｌａへの置換
を含むような配列を含有する新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドまたはそのアミノ末端にＭｅｉｔが結合したポリペプ
チドを提供することによって達成され、また上記新規抗
腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組
換えプラスミドを提供することによって達成され、更に
かくして得られた組換えプラスミドによって形質転換さ
れた組換え微生物細胞、その微生物＠胞を用いて目的と
する新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及びこ
の新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物を
提供することによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［０、ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを運び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主Ｉ［ｌ胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ＞を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮ　Ｆｉｌｆｆ仏子・は、その上流
及び下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることに
より、適当なベクターへのクローン化が可能になる。こ
のようなヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に
示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ、Ｇ　、　Ｋ　ｈｏｒａ
ｎａ。

”　Ｓ　０１ｌｌｅ　　Ｒｅｃ１３ｎｔ　　Ｄ　１１ｉ
Ｖｅ＋０１）ｍｅｎｔｓ　　ｉｎＧ　ｈｅｍｉｓｔｒｙ
　　ｏｆ　　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｊｅｒＳ
　　ｏｆＢ　１ｏｌｏｏｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅ
ｓｔ　　”　、　　Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｅｙａｎ
ｄ　　　５ｏｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏ
ｒｋ　　（１９６１）　　］　　。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　ｏ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｃｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成様を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水［ｉを、たとえばＴ４−１リヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た復、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オ
ペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーターＩＰＬプロモーター、
　＋ｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐブＯモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくは１）ＹＳ３ＩＮ、又
はＩ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−２ｔｒｐターミネータ−等があげ
られるが、とりわけｔｒＤ　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドと
して、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ３ｍ伝子を、たとえばＩＩＢＲ３２２由
来のベクターにクローン化することにより、発現型プラ
スミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮＦ
　　４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはＩ）ＴＮＦ４８１が用い
られる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価： ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６（
１０ｒ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することがで
きる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎ。

ト１ａｒｂｏｒ　　　　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　、
　　　Ｎｅｗ　　　　Ｙｏｒｋ　　　（１９８２）参照
］があげられ、必要に応じて、たとえばアンピシリン等
を添加するのが望ましい。培養は目的の組換え微生物に
適した条件、たとえば撮とうによる通気、Ｉｊ！拌を加
えながら、３１℃で２〜３６時間行なう。また、培養開
始時または培養中に、プロモーターを効率良く機能させ
る目的で、３−β−インドールアクリル酸等の薬剤を加
えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦｍ伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗！
ｌｉ瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見ルｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ、Ｊ。

１＋ｍｕｎｏ１．．１２６．　２３５（１９８１）　］
等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便さ
等の点から、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ活性測定法による評価
が好ましい。

かくして本、発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白
質とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可
能になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いるこ
とによって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供す
ることが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦｍ伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　］の報告したヒトＴＮＦ＊駆
体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤とし
て、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け
、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側
に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞ
れ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限
酵素（ＪａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開
始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターと
の連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流
には制限酵素１−（ｉｎｄＩ［［による切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成Ｉｍ（アプライド
・バイオシステムズモデル３８０Ａ　）を用いて、ホス
ファイト法により行なった。合成オリゴヌクレオチドの
精製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアル
に準じて行なった。すなわち、合成オリゴヌクレオチド
を含むアンモニア水溶液を５５℃で一晩保つことにより
、ＤＮＡ塩基の保［ｉをはずし、セファデックスＧ−５
０フアイン・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル濾過に
よって、高分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取
する。ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャドウィン
グ法により泳動パターンの観察を行なう。目的とする大
きさのバンド部分を切出して、そのポリアクリルアミド
ゲル断片を細かく破砕した後、２〜５ｍの溶出用バッフ
ァ［５（１０１ＭＭ　　ＮＨ４０Ａｃ　　１　　ｍＭＥ
ＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ　（ｐＨ７，５）　］を加え、
３７℃で一晩娠とうした。遠心分離により、目的のＤＮ
Ａを含む水相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌク
レオチドを含む溶液をゲル濾過カラム（セファデックス
Ｇ−５０）にかけることにより、合成オリゴヌクレオチ
ドの精製品を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチ
ドの純度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮ　Ｆ３ｉＲ伝子のクローン
化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ３１
伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツＩ・の
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＱタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ＤＨ９，５）　　、　　　１
０　　ｍＭ　　　　Ｍ　　ｇ　＋Ｊ　　２　　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、す
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０”Ｃで５分間加熱した後室温まで
徐冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３ｏμ磨の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，６）　、　　６．６　ｍ
Ｍ　　ＭＣＩ　Ｃｆ２゜１０ＩＩＩＭジチオスレイトー
ル、１　　ＩＩＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３（１０ユ
ニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１
１℃で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気法ｅ（ゲル濃度５％）を行ない
、エチジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観
察を行なう。目的とする大きさく約２２０ｂｌ）　）の
バンド部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリア
クリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μ３の大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐｉ−１７，５）　、　Ｇｏ　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃｊ、　７　ｍＭＭ（］Ｃｊ２水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素（ＪａＩにューイングランド・
バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を
行なった。

制限酵素（ＪａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５０　ＩＢＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，４）　、　　１（１０１ＭＭ　
　Ｎａ　ＣＬ　１０ｍＭ　　Ｍｇ５ｏ４水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、アガロ電気法ル電気泳！ＩＩＪ（ゲル濃度０．８％）
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部
分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ
　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣオ０４水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０１
．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂｐ
のＤＮＡ断片（ＣｆａＩ←＞５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ３ｉｉ伝子の一部を含む約２２
０ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端
のリン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢ　Ｒ３２
２の大部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液と混合
する。エタノール沈澱の侵、前記の方法に準じて両ＤＮ
Ａ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６Ｃ６（１０ｒ−株の形質転換は
、通常のＣａＣＲ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄら
の方法）の改良法ぐ行なった。すなわち、５ｍｉのＬ培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａ　Ｃｊ、　　ｐＨ７，２）にニジエリｌ：：７−：ｌ
ｌＪｃ６（１０ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、
菌体を含む培養液の６（１０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６
ａｇｐ）が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷た
いマグネシウム・バッファ’　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　
ＣＬ　５　　ｍＭ　　Ｍ（ｌ　Ｃｊ２゜５　ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣオ（ｐＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２Ｉ
Ｉ！ｉ！の冷したカルシウム・バッファー［１（１０ｔ
ｎＭｃａ　Ｃ１ｚ　、　２５０　　ｍＭ　　ＫＣｌ、　
５１１ＭＭ（ｌ　Ｃｊｚ　、　５　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
オ（ＤＨ７，６゜０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５
分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１（ｖｏ
ｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１ｄのしＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１，０，０８％グルコ
ース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間娠と
う培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シグ
マ）　３０μ９／ｒｔｔｌを含むし培地プレート］に１
（１０μ磨／プレートの割合で接種する。プレートを３
７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。１ｑら
れたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用
いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、
目的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４，０Ｋｂ１１）
の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢ
Ｒの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ３ｆｉ仏子の一部を含むプ
ラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計
通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ
、　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｎ＋ｏｌ
、、６５．　４９９（１９８０）コによって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドＩ）ＴＮＦ１ＢＲ１０μ
９を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及びＳａ
１■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の模、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
３１伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊ
ａ　Ｉ　Ｈ８ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回
収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μ９を１（１０μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
１（１）Ｈ７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　ＣＬ　
７１１１ＭＭ！ｊｃｆｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ＰｖｕＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で
１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に
準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐ
のＤＮＡ断片（ＳａｌＩ４−ＩＰｖｕｌをポリアクリル
アミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドＤＴＮＦ３　１０
μ９も１ｏｏμｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｌ
（１）Ｈ７，５）　　、　　６０　ｍＭ　　　Ｎａ　Ｃ
１，７ｍＭＭＩＪＣｆ２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反
応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒ
トＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片
（ＰｖｕＩＩ４−４８ｉｎｄ　ｌｌ）をボＩＪ　７クリ
ルアミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ＞　５μ９を、上記と同様
に制限酵素Ｃ１ａ工及びＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部
分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ＋Ｈ
ｉｎｄｌ［［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦｌ伝子の一部を含ム約２
２０ｂｐ、　約１７０ｂ１１及ヒ約１１０ｂｐ（７）３
ツ（７）ＤＮＡ断片とプラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの
大部分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了
後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６（
１０ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒ
トＴＮＦＩ転子発現型プラスミドｐ−ｒＮＦ４０１ＮＮ
＜約５．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第
６図に、そのプラスミドＩ）ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成
方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖＪで部分分解した後、さらに制
限酵素Ｈｉｎｄｌ［［で切断し、アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準じて
、ｔｒｐブＯモーターを含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断
片［ＰｖｕＩ［（２］＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［］をアガロー
スゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アユ−。リングの後、先に得られた約２．７）（
ｂｐのＤＮＡ断片［ｐ、ｖｕｎ　（２１”　ｌ−１ｉｎ
ｄ　ｌ［コと混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実ｔｉ＆例３の方法に準じてエ
シェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−ｍ−株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ
　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプラ
スミドは、プラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数
制御領域除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するク
ローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネ
ータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクター
であり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミド１１ＡＡ４１　２μ３を、上記と同様に
制限酵素ｃｔａ工及びＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＩ）Ａ△４１の大部分を含
む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａｍ。

ＨｉｎｄｌｌＩ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
Ｃｊａ■及びｌ−１ｉｎｄ［［で切断し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ　ＩＨＨｉｎｄ　Ｉ［［）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｌ）の０ＮＡＩＩｉ片とヒトＴ
ＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混
合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６（１０ｒ−１１−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミドＩ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３
・、２Ｋｂｌ））を有するクローンを選択した。このプ
ラスミドは、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させ
る能力を有しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ３ｉ伝子発現型プラスミ
ドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ２０μＪを、実施例４の方
法に準じて制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌ［で切断
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）
及びアガロースゲル電気法ｅ＜ゲル濃度０．８％）の後
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片（約４９０ｂり及び約２．７Ｋｂｐ、両
方共Ｃｆａ　Ｉ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をゲルより回収　
゛した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ旦の１０１１１Ｍ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　（ｐ＋−＋　７．４）　、　１０ｍＭ　　
ＭＩＪ　８０４　、１　１１Ｍジチオスレイトール水溶
液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素Ｈａｔ）ＩＩ（
宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒト
Ｔ　Ｎ　Ｆ　ｊＭ伝子の大部分を含む約３７０ｂｌ）の
ＤＮＡ断片（Ｂ（ＩＩ■←Ｈｉｎｄｌ）をポリアクリル
アミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ゛
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片＜ＣＲａ　Ｉ　
ＨＨｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦｉ伝子の大部分を含
む約３７０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｂ０１１←Ｈｉｎｄｌ
［［）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法
に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行な
った。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒ
ア・コリＣ６（１０ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドｐＴＮＦ４８１（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
次のアミノ酸配列（８２Ｎ）−Ｐｒｏ−３ｅｐ−Ａｓｔ
＋−Ｌｙｓ−ｐ　ｒｏ−Ｖ　ａｔ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−
Ｖ　ａｌ−Ｖ　ａｌ−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ−ｐ　ｒｏ−
Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ−Ｑ　ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｑ　Ｉｎ−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｎ−Ａ
　ｒｇ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｌ　
ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ　−Ｇｌｙ−Ｖａ１
７Ｑｌｕ−１ｅｕ−Ａｒ（１−ＡＳＩ）−ＡＳｎ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ
　１ｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−
Ｉ　Ｉｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇｌｙ
　−Ｃｙｓ　−ｐ　ｒｏ　−３ｃｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈ
ｉｓ　−Ｖ　ａｌ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｈｒ　
−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−Ｉ　Ｉｅ　−５ｅｒ−Ａｒｇ−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｖａｌ　−Ａｓｎ−Ｌ　ｅｕ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ａｌａ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌ　ｙ
ｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ　−Ａ　ｒ！＋　
−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｊ　−
Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ
　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　
ｌｕ　−Ｐ　ｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ＝　Ｌｅｕ　−Ｇ　
Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　
ｓｐ　−Ａｒａ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉ
ｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒＯ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　
５ｌ）−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−
Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
、Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−ＧＩＶ　
−Ｉ　Ｉｅ　−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ　−Ｌｅｕ　−（ＣＯ
ＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で１すられた発現ベクター１）Ａ　Ａ　４
１゜ヒトＴＮＦｍ伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４０
１ＮＮ又は１１Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　、又は実施例５
で得られた、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドｐＴＮＦ４８１を有するエシェリヒア・コリ
Ｃ６（１０ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／　ｄのアン
ピシリン、０．２％のグルコース及び４■／ｄのカザミ
ノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０
，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣｆ−０，１％
ＮＨ４Ｃｊ水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭ（］ＳＯ，
＋水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最終濃度２１
１Ｍ及び０．１１Ｍになるように加える。］　　２５０
７に接種し、０ＤｊＩ＋６が０．７に達するまで、３７
℃で抛とう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ
／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加
し、さらに３１℃で１２時間振どう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｊを含む２０　ｍ１ｙｌ
リン酸バツフアー、　　ｐＨ７，４＞を用いて菌体の洗
浄を行なった。洗浄後の菌体を１０蔵のＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２（１０
Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体
残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
１−１（Ｊハッ７ア−（ｐＨ６，８）　、　ＳＤＳ、　
２−メルカブトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度６０１１１Ｍ、２％、４％、　１０％になるよ
うに加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し
銘木、遺伝、　３１．４３　（１９７７）　］を行なっ
た。

分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。

Ｔ　ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　ＬａｅＩＩ＋ｍ
ｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気原初終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
ブルーＲ−２５０（バイオ・ラット）で染色し、ヒトＴ
ＮＦｌ伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発
現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１０図
に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナー〈島津、
　Ｃ３−９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋
白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋
白質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒト
ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４０１Ａを有
する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１６％のヒト
ＴＮＦ蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミド１）ＴＮＦ４８１を有する大腸菌において
は同じく約１２％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生
が、それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎを有する大
腸菌におけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、゛上記ｐＴ
ＮＦ４０１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクター
ｒｌＡＡ４１の有用性が示された。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料１（１０μ旦と、４　Ｘ　
１０５個／ｄの濃度のマウスし一部１）２９ＩＪＡ雑芽
細胞＜ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）　１ｉｌｌ液１（１０
μ旦を、９６穴の組織培養用マイクロプレート（コース
タ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μ９７
ｍ１のアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を
添加しておく。培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ
　）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセ
ンシャル培地（日本製薬）を用いた。上記マイクロプレ
ートを、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２
０時間培養した後、クリスタル・バイオレット溶液［５
％（ＶＯＩ／ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％
（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・バイオレットを溶解
させたもの］を用いて生細胞を染色した。余分なりリス
タル・バイオレットを洗い流し乾燥した後、残ったクリ
スタル・バイオレットを１（１０μ旦の０．５％ＳＯ８
水溶液で抽出し、その５９５ｎｍにおける吸光度をＥし
ＩＳＡアナライザー（東洋測置、ＥＴＹ−９６型）で測
定する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。

そこで、ヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照
の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希
釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求め、そ
の希釈倍率をユニットと定義する。第１１図より、発現
型プラスミド１）ＴＮＦ４０１ＡにコードされるヒトＴ
ＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１（１０μ旦は６
．３Ｘ　１０５ユニツト程度の活性を、そして発現型プ
ラスミド１）ＴＮＦ４８１にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート１（１０μすは
７．３×１０４ユニツト程度の活性を、それぞれ有して
いることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ４８１にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量は
、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラッド）を
用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線より
針線した。上記で得られた発現Ｏ１活性の値及び蛋白質
定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値が
得られた。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦｌ伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦＷ伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの１作成方法
を、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方法を
、そして第８図はヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子発現型プラス
ミドル”ｒＮＦ４０１△の作成方法を、それぞれ示した
ものである。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４８１の作成方法を示し
たものである。第１０図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を認定した
ゲル電気泳動の写真を示したものである。第１１図はヒ
トＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性
測定結果を示したものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 史−／″′ ＜−Ｃｔコ　　ロク　　０−　　ロー　　Ｏ・　　ヒｇ
　　ロコ拓　４−（！！Ｑ Ｐｖｕ　１［ 島りｌ のの 晃ｒＴ里のＢ Ｐｖｕ正（１） 名８　凱 ）１ｉＦ％、Ｊ［ 嵩９匹の８

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１また
   はそれ以上のアミノ酸残基の置換欠失または挿入がなさ
   れた配列のうち少なくとも３２番目のＡｒｇのＡｌａへ
   の置換を含むような配列を含有する新規生理活性ポリペ
   プチド。
2. （２）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、第１項記載の新規 生理活性ポリペプチド。
3. （３）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
4. （４）第１図に示した１番目のＶａｌから　１５７番目
   のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
   たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
   なされた配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＡ
   ｌａへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
   ポリペプチドまたはそのアミノ酸末端にＭｅｔが結合し
   ているポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換
   えプラスミド。
5. （５）該ポリペプチドが次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドであること
   を特徴とする第４項記載の組換えプラスミド。
6. （６）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第４
   項記載のプラスミド。
7. （７）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第４
   項記載のプラスミド。
8. （８）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４８１である
   第４項記載のプラスミド。
9. （９）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目の
   Ｌｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１また
   はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がな
   された配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＡｌ
   ａへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性ポ
   リペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合してい
   るポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプ
   ラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞。
10. （１０）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
    ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする第
    ９項記載微生物細胞。
11. （１１）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目
    のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
    たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
    なされた配列のうち、少なくとも３２番目のＡｒｇのＡ
    ｌａへの置換を含むような配列を含有する新規生理活性
    ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合して
    いるポリペブトチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換
    えプラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を
    培養し、培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄
    積せしめ、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチ
    ドを分離することを特徴とする、新規生理活性ポリペプ
    チドの製造方法。
12. （１２）第１図に示した１番目のＶａｌから１５７番目
    のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
    たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
    なされた配列のうち少なくとも３２番目のＡｒｇのＡｌ
    ａへの置換を含むような配列を含有する抗腫瘍に有効な
    量の新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端に
    Ｍｅｔが結合しているポリペプチドを含有する医薬組成
    物。