JPH06256395A - Ｔｎｆ−突然変異タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のアミノ酸配列
が１個またはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入および／
または置換により変更され、その結果としてＴＮＦ突然
変異タンパク質がヒトｐ７５−腫瘍壊死因子レセプター
への結合親和性とヒトｐ５５−腫瘍壊死因子レセプター
への結合親和性との間で有意な差を示すことを特徴とす
るＴＮＦ突然変異タンパク質またはその薬学的に許容し
うる塩、前記突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配
列、前記ＤＮＡ配列を含むベクター、前記ベクターで形
質転換された宿主細胞、前記形質転換細胞を用いた前記
突然変異タンパク質の生産方法、前記突然変異タンパク
質を含む医薬組成物、および病気（例．癌）の治療のた
めのそれらの使用に関する。 【効果】 この化合物は細胞障害性を有し、抗腫瘍剤と
して有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト腫瘍壊死因子突然
変異タンパク質またはその薬学的に許容しうる塩に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子、より詳細には腫瘍壊死因
子−α、は主に刺激されたマクロファージにより生産さ
れるサイトカインであり、これは種々の腫瘍細胞に対し
て顕著な細胞障害性を示すばかりでなく〔Carswell et
al., Procd. Nat. Acad. Sci.,U.S.A. 72, 3666-3670,
(1975) 〕、炎症や免疫反応のメディエーターとして多
様な役割を演ずる〔概説については、Beutler and Cera
mi, Ann. Rev. Immunol.7, 625-655 (1989); Bonavista
and Granger (eds.)“Tumor Necrosis Factor:Structu
re, Mechanism of Action, Role in Disease and Thera
py（腫瘍壊死因子：構造、作用機構、疾病および治療で
の役割）”, Karger, Basel (1990)を参照されたい〕。
ヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）の一次構造は大
腸菌にクローン化して発現させたｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列から推定された〔Pennicaet al., Nature 312, 7
24-729 (1984); Marmenout et al., Europ. J. Bioche
m.152, 515-522 (1985); Wang et al., Science 228, 1
49-154 (1985); Shirai et al., Nature 313, 803-806
(1985) 〕。リンパ球のサブセットにより生産されるサ
イトカインであり、しばしばヒト腫瘍壊死因子−β（ｈ
ＴＮＦ−β）と呼ばれるヒト・リンホトキシンとｈＴＮ
Ｆ−αとの間にはアミノ酸配列の著しい相同（３０％）
が見られた〔Gray et al., Nature 312, 721-724 (198
4); Fiers etal., Cold Spring Harbour Symp. 51, 587
-595 (1986) 〕。

【０００３】また、修飾されたアミノ酸配列を有するｈ
ＴＮＦ−α、いわゆるＴＮＦ−α−突然変異タンパク
質、も当分野ですでに開示されている〔例えば、Yamagi
shi etal., Protein Engineering 3, 713-719 (1990);
Fiers, “Tumor Necrosis Factors: Structure, Functi
on and Mechanism of Action （腫瘍壊死因子：構造、
機能および作用機構）”, Aggarwal and Vilcek (ed
s.), Marcel Dekker, Inc.,New York, 印刷中; Fiers
et al., Bonavista and Granger, pp.77-81 （前掲）を
参照されたい〕。さらに、ＴＮＦ−α−突然変異タンパ
ク質はいくつかの特許出願の主題となっている；例え
ば、国際特許出願公開番号ＷＯ８６／０２３８１、ＷＯ
８６／０４６０６およびＷＯ８８／０６６２５、欧州特
許出願公開第１５５５４９、１５８２８６、１６８２１
４、２５１０３７および３４０３３３号、並びにドイツ
特許出願公開第３８４３５３４号を参照されたい。

【０００４】また、リンホトキシンの突然変異タンパク
質も当分野で、例えば欧州特許出願公開第２５０００
０、３１４０９４および３３６３８３号に、開示されて
いる。ＴＮＦの生物学的作用は特異的レセプター、すな
わちドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で見掛け分子量５５ｋＤ
のレセプター（ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ）とＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで見掛け分子量７５ｋＤのレセプター（ｐ７５−ＴＮ
Ｆ−Ｒ）、によって仲介される。両方のＴＮＦレセプタ
ーともすでにクローン化されており、すなわちｐ５５−
ＴＮＦ−Ｒは Loetscher et al. Cell 61, 351-359 (1
990)〕によって、そしてｐ７５−ＴＮＦ−Ｒは Dembic
et al. Cytokine 2, 53-58 (1990)〕によってそれぞれ
クローン化され（両レセプターについては欧州特許出願
第９０１１６７０７．２号も参照されたい）、かなり最
近になって両レセプターはＴＮＦ−αばかりでなくＴＮ
Ｆ−βとも高い親和性を示して結合することが見いださ
れた〔Schonfeld et al.,J. Biol. Chem. 266, 3863-38
69 (1991)〕。

【０００５】

【発明の具体的説明】本発明の対象は、ヒト腫瘍壊死因
子のアミノ酸配列を土台とした突然変異タンパク質また
はその薬学的に許容しうる塩であり、前記配列が１個ま
たはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入および／または置
換により変更され、その結果として前記突然変異タンパ
ク質がヒトｐ７５−腫瘍壊死因子レセプターへの結合親
和性とヒトｐ５５−腫瘍壊死因子レセプターへの結合親
和性との間で有意差を示すものである。

【０００６】本発明の好適な実施態様は、Pennica et a
l. 前掲 により開示されたＴＮＦ−αのアミノ酸配
列：

【０００７】

【式１】

【０００８】または Marmenout et al. （前掲）、Wang
et al. （前掲）あるいはShirai etal. （前掲）によ
り開示されたＴＮＦ−αのアミノ酸配列、より詳細には
成熟ＴＮＦ−αをコードするプラスミドｐＤＳ５６／Ｒ
ＢＳＩＩ，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαの挿入物のヌクレオチド
配列（図３ａおよび３ｂ、実施例Ｉを参照）によりコー
ドされるＴＮＦ−αのアミノ酸配列、を土台とした上記
のような突然変異タンパク質である。

【０００９】本発明の特に好適な実施態様は、ＴＮＦ−
αのアミノ酸配列が１個またはそれ以上の、好ましくは
１個または２個の、アミノ酸を他のアミノ酸、好ましく
は自然界に存在するアミノ酸、で置換することにより変
更された、上記のような突然変異タンパク質である。よ
り詳細には、本発明の好適な実施態様は、ＴＮＦ−αの
アミノ酸配列が（１５７個のアミノ酸を有するＴＮＦ−
αのアミノ酸配列を参照して）２９および／または３２
位、３１および３２位、３１位、あるいは２９および３
１位で他のアミノ酸、好ましくは自然界に存在するアミ
ノ酸により置換された（２９および／または３２位、３
１および３２位、あるいは３１位での置換が好適であ
る）上記のような突然変異タンパク質である。任意のア
ミノ酸、好ましくは天然アミノ酸がこの位置で使用さ
れ、これによりヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒおよびヒトｐ５
５−ＴＮＦ−Ｒに対するその結合親和性間で有意差を示
すＴＮＦ−突然変異タンパク質が導かれる。２９位置換
の場合は、セリン、グリシンまたはチロシンが好適であ
り、例えば２９位での単一位置突然変異タンパク質の場
合には、セリンが特に好適である（Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦ
α）。３１位置換の場合は、グルタミン酸（Ｇｌｕ³¹−
ＴＮＦα）またはアスパラギンが好適である。３２位置
換の場合は、チロシン（Ｔｙｒ³²−ＴＮＦα）またはト
リプトファン（Ｔｒｐ³²−ＴＮＦα）が好適であり、後
者が特に好ましい。２９および３２位での二重位置突然
変異タンパク質の場合の特に好適な置換はＳｅｒ²⁹−Ｔ
ｒｐ³²−ＴＮＦαであり、３１および３２位ではＡｓｎ
³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦαである。本発明の突然変異タン
パク質はまた、当分野で知られた化学的ペプチド・タン
パク質合成法、例えばGrossand Meyenhofer, “The Pep
tides”Vol.1-9, Academic Press, Inc., HarcountBrac
e Jovanovich, Publs., San Diego (1979-1987) または
Fields and Nobel,Int. J. Pept. Prot. Res. 35, 161
-214 (1990)に記載されるような、部分的または全体的
な液相もしくは固相合成法によっても製造できることが
理解されよう。

【００１０】前の段落で定義した突然変異タンパク質か
らのまたは突然変異タンパク質への１個または数個のア
ミノ酸の欠失、置換および／または付加により得られる
類縁体、すなわち突然変異タンパク質の２９および／ま
たは３２位、３１位、あるいは３１および３２位が変更
されておらず、しかもなおヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒへの
結合親和性とヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒへの結合親和性と
の間で有意差を示す前記類縁体も本発明の対象である。
このような置換類縁体に関して、タンパク質の活性を一
般に変えないアミノ酸置換は当分野で知られており、例
えば H. Neurath and R.L. Hill,“The Proteins”(Aca
demic Press, New York, 1979,特に１４頁の図６を参
照）に記載されている。最も一般的な変更は：Ａｌａ／
Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓ
ｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓ
ｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈ
ｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓ
ｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌ
ｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、およびこれらの逆である（３文字
の略号はアミノ酸に対して使用され、当分野で慣例的で
ある）。

【００１１】置換、付加および／または欠失類縁体は、
当分野で知られた方法、例えば Sambrook et al. Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Lab
oratory Press, USA (1989)に、あるいは以下の段落に
記載される方法により製造することができる。この種の
類縁体がｐ７５−ＴＮＦ−Ｒおよびｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ
への結合親和性間でまだ有意差を示すかどうかは、以下
に記載するように、例えばより詳細には実施例IIａ）お
よびｂ）あるいは実施例VIIIに記載するようにして調べ
ることができる。さらに、この種の突然変異タンパク質
および類縁体の塩も本発明の対象である。このような塩
は当分野で知られた方法によって製造されうる。

【００１２】さらに、病気、例えば癌、を治療するため
の上記のような突然変異タンパク質を提供することも本
発明の対象である。ＴＮＦ−αが、その生物学的活性に
基づいて、いろいろな疾患の治療に有効であることは当
分野でよく知られている。例えば、ＴＮＦ−αは、単独
であるいはインターフェロンと組み合わせて、効果的な
抗腫瘍剤でありうる〔Brouckaert et al., Int. J. Can
cer 38, 763-769 (1986)〕。しかしながら、その全身的
毒性はより広い治療用途の主な制限となっている〔Tagu
chi T. and Sohmura Y., Biotherapy 3, 177-186 (199
1）〕。

【００１３】（推定上）異なる機能的役割を有する２種
類のＴＮＦレセプターの発見により、所定の症状におけ
るＴＮＦに対する有益な生物学的応答と望ましくない生
物学的応答の分析が可能となるだろう。この方法の実行
可能性を支持する状況証拠が存在する。例えば、マウス
において、マウスＴＮＦ−α（ｍＴＮＦ−α）はヒトＴ
ＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）よりも最高５０倍毒性が強い
が、細胞培養で試験した場合は双方とも感受性細胞系列
に対して同等の活性を示すことが判明した〔Brouckaert
et al., Agents and Actions 26, 196-197 (1989); Ev
eraerdt, B. etal., Biochem. Biophys. Res. Comm. 16
3, 378-385 (1989)〕。

【００１４】一方または他方のＴＮＦレセプターに特異
的に結合する化合物（例えば、本発明のＴＮＦ突然変異
タンパク質）を使用することにより有益なＴＮＦ−α活
性と望ましくないＴＮＦ−α活性を調べる戦略は、ＴＮ
Ｆがある役割を演ずる他の症状において一般的に採用し
うると考えられる。また、先に記載したＴＮＦ突然変異
タンパク質をコードするＤＮＡ配列も本発明の対象であ
る。このようなＤＮＡ配列は、in vitro突然変異誘発の
既知方法〔例えば、Sambrook et al., 1989 を参照〕を
使って、当分野で開示されたｈＴＮＦをコードするゲノ
ムまたはｃＤＮＡ配列から出発して作製することができ
る。この突然変異誘発は多数の突然変異タンパク質を得
るためにランダムに（その後突然変異タンパク質は適当
な検定系でそれらの望ましい性質について試験され
る）、あるいはＤＮＡ配列の所定位置に突然変異を起こ
すために、いわゆる部位特異的突然変異誘発〔例えば、
Sambrook et al., 1989, 15.51-15.113 を参照〕によ
り、またはポリメラーゼ・チェイン・リアクションを用
いる突然変異誘発〔例えば、White et al., Trends in
Genetics 5, 185-189 (1989)を参照〕により実施され
る。

【００１５】ランダム突然変異誘発にしばしば使用され
る化学的突然変異原の１つは重亜硫酸ナトリウムであ
り、これはシトシン残基をウラシル残基に変換し、それ
故に“Ｃ”の“Ｔ”（ヌクレオチドの標準略号）へのト
ランジションへ導く〔この方法については、例えば、Sh
ortle and Nathans, Procd. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 7
5, 2170-2174 (1978) または Pine and Huang, Meth. E
nzym. 154, 415-430 (1987) を参照されたい〕。この突
然変異原は一本鎖ＤＮＡに単独で作用し、一方突然変異
を起こした標的ＤＮＡ配列の発現は二本鎖プラスミドベ
クターを使って達成される。突然変異誘発および発現ベ
クターへの再クローニングの必要性を回避するための１
つの可能性は、いわゆる“ファスミド（phasmid ）”を
使用することである。これらは、プラスミド複製起点の
ほかに、繊維状ファージから誘導された複製起点を保有
するベクターである。このようなプラスミドの例はStan
ssenet al. 〔Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454, (19
89)〕により記載されるｐＭａおよびｐＭｃファスミド
である。この発現系を使うことにより、いわゆる“ギャ
ップ−二重鎖”構造を構築することが可能であり〔Kram
er et al., Nucl. Acids. Res. 12, 9441-9456 (1984)
を参照〕、そこではＴＮＦコード配列のみが一本鎖形状
であるために、特定の化学的突然変異原にとって近づき
やすい。ランダム突然変異誘発に使用する“ギャップ−
二重鎖”はStanssen et al. 〔前掲〕が部位特異的突然
変異誘発に関して記載する通りに構築しうる。ただし、
（−）鎖は（＋）鎖と同じ活性抗生物質耐性遺伝子を含
まないようにする。ｈＴＮＦαをコードするＤＮＡ配列
中の異なる制限部位を利用することによって、ギャップ
幅の変更が可能である。このような制限部位の例はＣｌ
ａｌ−Ｓａｌｌ部位（４７０ヌクレオチド）、ＢｓｔＸ
ｌ−ＢｓｔＸｌ部位（２３７ヌクレオチド）またはＳｔ
ｙｌ−Ｓｔｙｌ部位（６８ヌクレオチド）である。その
後、ギャップ−二重鎖構築物は、Shortle and Nathans
〔前掲〕に記載されるように、次第に増加する濃度（最
高４Ｍ）の重亜硫酸塩で処理し、続いて数回の透析を行
う。このようなファスミド構築物を使って、例えばSamb
rook et al. 〔前掲〕に記載される方法に従って、適当
な原核宿主細胞を形質転換することができる。適当な原
核宿主細胞とは、この状況下では、宿主細胞が特定の修
復機能を欠き、その結果ウラシル残基が複製の間ＤＮＡ
中に保持され、そして該宿主細胞が対応する突然変異Ｔ
ＮＦを発現する能力を有するような宿主細胞を意味す
る。この種の特定の宿主株は当分野で知られており、例
えば大腸菌株としては大腸菌ＢＷ３１３〔Kunkel,T.A.,
Procd. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985)〕
がある。得られたクローンはその後適当な検定系により
目的のＴＮＦ突然変異タンパク質を発現するものについ
てスクリーニングする。例えば、マイクロタイタープレ
ートを使って、適切な抗生物質を含む培地にそれぞれの
コロニーをまく。リゾチームを加えて細胞を溶解し、続
いて連続凍結−融解サイクルにかける。核酸の沈殿およ
び遠心後に、各コロニーの上清は、例えば実施例IIａお
よびIIｂまたは実施例VIIIに記載されるような適当な検
定法により、直接または精製後に、生存細胞表面上のｐ
７５−ＴＮＦ−Ｒおよびｐ５５−ＴＮＦ−Ｒへの結合に
ついて測定される。

【００１６】所望により、突然変異の特定部位は、例え
ば制限断片分析〔Sambrook et al.（前掲）を参照〕に
より決定することができる。このような断片のＤＮＡ配
列の決定により、正確な突然変異位置を決めることがで
き、そしてその突然変異がアミノ酸置換へ導く場合は、
決定されたＤＮＡ配列から新しいアミノ酸を誘導するこ
とができる。ＤＮＡの塩基配列決定は当分野で知られた
方法に従って行われ、例えば市販のシークエンシングキ
ット（スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia 社）では超
コイルＤＮＡに対してＴ７ポリメラーゼを使って実施さ
れる。

【００１７】すでに上で述べたように、所定のＤＮＡ配
列に突然変異を起こすもう１つの可能性は“部位特異的
突然変異誘発”によるものである。最初に Hutchinson
andEdgell J. Virol. 8, 181 (1971)〕により概説さ
れたこの種の突然変異誘発の汎用される戦略は、一本鎖
ＤＮＡ配列（ここに突然変異が導入される）の標的領域
へ目的のヌクレオチド置換を有する合成オリゴヌクレオ
チドをアニーリングすることを包含する〔再検討のため
には、Smith, Annual. Rev. Genet. 19, 423 (1985)
を、改良法については、Stanssen et al. (1989)中の文
献２−６を参照されたい〕。

【００１８】１つの好適な上記方法は Stanssen et al.
(1989) の方法であり、この方法は最初に Kramer et a
l. (1984) 〔前掲およびKramer and Fritz, Methods in
Enzymology, (1987), Academic Press, Inc., USA〕に
より記載された“ギャップのある二重鎖ＤＮＡ”を使用
するが、やはりStanssen et al. (1989)〔前掲〕により
開示されたファスミド技法と共に、突然変異保有鎖の選
択のためにＭ１３機能遺伝子の代わりに抗生物質耐性遺
伝子を使用するものである。この方法の利点は、遺伝子
を新しい突然変異誘発ベクターに移すことなく連続して
突然変異誘発サイクルを行うことができる点にある：す
なわち、２回目の突然変異誘発は別の抗生物質マーカー
に対する選択のみが相違する（Stanssen et al. 前
掲）。確認のために、突然変異型ＴＮＦの野生型ＴＮＦ
への部位特異的復帰突然変異誘発が使用される。さら
に、ＴＮＦ遺伝子中に制限部位を作製したりあるいはＴ
ＮＦ遺伝子中の制限部位を破壊するオリゴヌクレオチド
を使用することにより、部位特異的突然変異誘発に使用
したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションば
かりでなく制限部位の存在または不在によっても突然変
異型を確認することができる。アミノ酸配列の所定の位
置で野生型アミノ酸が任意の天然アミノ酸により置換さ
れている１組のＴＮＦ突然変異タンパク質を形成するた
めに、その所定位置で可能なあらゆるコドンを有する１
組のオリゴヌクレオチドが使用される。

【００１９】すでに上述したように、所定のＤＮＡ配列
に突然変異を起こす別の可能性は、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）を用いる突然変異誘発で
ある。この方法の原理は例えば White et al. (1989)に
よって概説されており、その改良法は例えば Innis et
al. 〔PCR Protocols: A Guide to Methods and Applic
ations, Academic Press, Inc. (1990) 〕に記載されて
いる。

【００２０】ＰＣＲは規定された鎖長および配列の特定
のＤＮＡ断片を少量の鋳型ＤＮＡから大量に生産する i
n vitro 方法である。こうして、ＰＣＲは標的配列の反
対鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマーによってはさまれるＤＮＡ断片の酵素的増幅に
基づいている。プライマーはそれらの３′末端が互いに
面するように方向づけられる。鋳型の熱変性、相補配列
へのプライマーのアニーリング、およびアニーリングし
たプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応から
成る反復サイクルは、ＰＣＲプライマーの５′末端によ
り規定されるセグメントの増幅をもたらす。各プライマ
ーの伸長産物は他方の鋳型として役立つので、各サイク
ルは前のサイクルで生産されたＤＮＡ断片の量を実質的
に２倍にする。プライマーは物理的に増幅産物に組み込
まれ、かつプライマーの５′末端と鋳型の間の誤対合は
増幅効率に顕著な影響を及ぼさないので、増幅配列を変
更して増幅ＤＮＡに希望の突然変異を導入することが可
能である。好熱菌テルムス・アクアチクス（Thermus aq
uaticus ）から単離された熱安定性ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを利用することによって、それぞれの熱変性段階
後に酵素の添加を必要としたポリメラーゼの変性を回避
することが可能となった。この開発は種々の簡単な温度
循環デバイスによるＰＣＲの自動化へ導いた。さらに、
プライマーアニーリングおよび伸長反応でのより高い温
度の使用を可能にすることによって、増幅反応の特異性
が高められる。高められた特異性は、酵素およびプライ
マーに対する非標的断片による競合を最小限に抑えるこ
とによって、増幅産物の全収量を増大させる。

【００２１】オリゴヌクレオチドのデザインおよび合成
は、例えば Sambrook et al. (1989) または部位特異的
突然変異誘発に関して先に挙げた文献に記載されるよう
な、当分野で知られた方法により行われる。本発明のＴ
ＮＦ突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列が作製
されたらすぐに、上記のようなファスミド技法により、
あるいは当分野でよく知られた適当な原核または真核発
現系の使用により、発現が実施される〔例えば、 Sambr
ooket al., 前掲を参照されたい〕。

【００２２】発現は好ましくは原核細胞、例えば大腸
菌、枯草菌（Bacillus subtilis ）などで行われ、大腸
菌、特に大腸菌Ｋ１２株、例えばＭ１５〔Villarejo et
al.,J. Bacteriol. 120, 466-474 (1974) にＤＺ２９
１として記載されている〕、ＨＢ１０１〔ＡＴＣＣ番号
３３６９４〕、ＷＫ６（Stranssens et al. 前掲）、ま
たは大腸菌ＳＧ１３００９〔Gottesman et al., J. Bac
teriol. 148, 265-273 (1981) 〕が好適である。また、
本発明の突然変異タンパク質の発現は、例えばサッカロ
ミセス（Saccharomyces ）、ピキア（Pichia）などの酵
母細胞、アスペルギルス（Aspergillus ）などの糸状
菌、またはチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系列など
の細胞系列のような下等または高等真核細胞で行うこと
もでき、酵母細胞での発現が好適である〔Sreekrishna
et al., Biochem. 28, 4117-4125 (1989); Hitzeman et
al., Nature 293, 717-722 (1981); 欧州特許出願公開
第２６３３１１号を参照されたい〕。本発明のＴＮＦ突
然変異タンパク質の発現はこのような系において細胞内
で、あるいは遺伝子の適当な改変後では細胞外で起こる
（Leemans et al., Gene 85, 99-108, 1989 を参照され
たい）。

【００２３】大腸菌による発現に使用される適当なベク
ターは、例えば Sambrook et al.〔前掲〕、または Fie
rs et al.,“Procd. 8th Int. Biotechnology Symposiu
m ”〔Soc. Franc. de Microbiol., Paris, (Durand et
al., eds.), pp. 680-697 (1988) 〕に記載されてお
り、より詳細には、ｐＤＳファミリーのベクター〔Buja
rd et al., Methods in Enzymology, eds. Wu and Gros
smann, Academic Press,Inc. Vol. 155, 416-433 (198
7); Stuber et al., Immunological Methods, eds. Lef
kovits and Pernis, Academic Press, Inc. Vol. IV, 1
21-152 (1990) 〕、例えばｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐ
ｈ１−ＴＮＦαＳｅｒ２９またはｐＤＳ５６／ＲＢＳI
I，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＴｒｐ３２（実施例Ｉ参照）、
あるいはｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＧ
ｌｕ３１またはｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮ
ＦαＡｓｎ３１Ｔｈｒ３２（実施例VII 参照）である。
形質転換された大腸菌株Ｍ１５（ｐＲＥＰ４；ｐＤＳ５
６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＧｌｕ３１）および
Ｍ１５（ｐＲＥＰ４；ｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１
−ＴＮＦαＡｓｎ３１Ｔｈｒ３２）は、特許のためのブ
ダペスト条約のもとで、１９９１年９月１８日に BRD、
Braunschweigの Deutsche Sammlung von Mikroorganism
en und Zellkulturen GmbH (DSM)に、それぞれ寄託番号
ＤＳＭ６７１４およびＤＳＭ６７１５として寄託され
た。これらの特定のｐＤＳ５６／ＲＢＳIIプラスミドで
は、それらの特殊な調節可能のプロモーター／オペレー
ター要素およびリボソーム結合部位のために高レベルの
発現が達成されるから、プロモーター／オペレーター要
素の活性が該オペレーターへのｌａｃリプレッサーの結
合により抑制されるときだけ、これらのプラスミドは大
腸菌細胞内に維持される。プロモーターの活性は、リプ
レッサーを不活性化してプロモーターを活性化するＩＰ
ＴＧの添加により、希望する細胞密度で回復させること
が可能である。大部分の大腸菌株はこれらの高コピー数
プラスミドに存在するプロモーター配列の機能を完全に
抑制するに足るリプレッサー分子を供給しないので、大
腸菌Ｍ１５またはＳＧ１３００９のような大腸菌株は、
初めにｌａｃリプレッサーをコードするｐＲＥＰ４のよ
うなプラスミドで形質転換し、続いて本発明のｐＤＳ５
６／ＲＢＳIIプラスミドで形質転換しなければならず、
このプラスミドはその後大腸菌細胞内に安定した状態で
維持される。ｌａｃリプレッサーをコードするほかに、
ｐＲＥＰ４は複製と娘細胞への安定した伝達に必要とさ
れるすべての情報を含むプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
〔Chang and Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1
978)〕の領域をも含んでいる〔これ以上の情報について
は、Stuber et al. による“大腸菌での高レベル生産系
および組み換えタンパク質の迅速精製：エピトープマッ
ピング、抗体の生産および構造機能分析への応用”, Im
munological Methods, Vol.IV, pp.121-152, Lefkovits
and Pernis (eds.), Academic Press, New York (199
0) を参照されたい〕。

【００２４】上記ベクターによる宿主細胞の形質転換は
通常の方法によって実施することができる〔例えば、Sa
mbrook et al. ( 前掲）を参照〕。宿主細胞が大腸菌の
ような原核細胞である場合、ＤＮＡを取り込むことので
きるコンピテント細胞は指数的生長相後に回収して既知
のＣａＣｌ₂ 法により処理した細胞から調製される。ま
た、形質転換は宿主細胞のプロトプラストを形成した後
で、あるいは当分野で知られた、例えばSambrook et a
l. ( 前掲）に記載される他の方法で実施してもよい。
従って、上記のようなＴＮＦ突然変異タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列を含み、特に原核または下等真核宿主
細胞での発現に適したベクター、およびこのようなベク
ターで形質転換された宿主細胞、特に原核宿主細胞
（例．大腸菌）または下等真核宿主細胞も本発明の対象
である。

【００２５】通常、希望の発現ベクターを含む宿主生物
はそれらの増殖に最適な条件下で増殖される。指数的増
殖の最終段階にある原核宿主細胞の場合には、単位時間
あたりの細胞数の増加が減少するとき、目的のＴＮＦ突
然変異タンパク質の発現が誘導され、すなわち目的のＴ
ＮＦ突然変異タンパク質をコードするＤＮＡが転写さ
れ、転写されたｍＲＮＡが翻訳される。この誘導は誘導
物質または抑制解除物質を培地に加えることによって、
あるいは物理的パラメーターを変える（例えば、温度を
変える）ことによって実施される。本発明の好適な実施
態様で用いられる発現ベクターでは、発現がｌａｃリプ
レッサーにより調節される。イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによ
り、発現調節配列は抑制解除され、これにより目的のＴ
ＮＦ突然変異タンパク質の合成が誘導される。

【００２６】上記のように形質転換宿主細胞により生産
された本発明のＴＮＦ突然変異タンパク質は、培地から
あるいは細胞を破壊した後に、タンパク質・ペプチド化
学において知られた適当な方法、例えば硫酸アンモニウ
ム沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、アフィ
ニティークロマトグラフィー（例．イムノアフィニティ
ークロマトグラフィー）、ＨＰＬＣなどにより抽出・回
収することができる。特に好適な方法は硫酸アンモニウ
ムおよび／またはポリエチレンイミンによる沈殿、透
析、アフィニティークロマトグラフィー、例えばフェニ
ル−アガロース、特にフェニル−セファロースによるも
の、またはイオン交換クロマトグラフィー、特にＭＯＮ
Ｏ−Ｑ−および／またはＭＯＮＯ−Ｓ−マトリックス
（スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia 社）によるもの
であり、より詳細には、Tavernier et al.〔J. Mol. Bi
ol. 211, 493-501 (1990) 〕に記載されるものおよび実
施例Ｉまたは実施例III に記載されるものである。

【００２７】従って、上で述べた形質転換宿主細胞を適
当な培地で培養し、培養上清または宿主細胞自体から突
然変異タンパク質を単離し、所望により該突然変異タン
パク質を薬学的に許容しうる塩に転換することから成
る、先に定義した化合物の生産方法を提供することは本
発明の対象である。また、このような方法によって生産
された化合物も本発明の対象である。

【００２８】本発明の突然変異タンパク質は、ヒトｐ７
５−ＴＮＦ−Ｒおよびヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒに対する
その結合親和性間で有意差を示す点に特徴がある。この
ような特性は結合親和性を測定する当分野で知られた検
定法を使って調べることができる。例えば、ＴＮＦ自体
の結合および本発明の突然変異タンパク質の結合は、２
種類のＴＮＦレセプターを異なるレベルで発現する培養
下の細胞、例えばヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒを独占的に発
現するＨｅｐ−２細胞およびさらにヒトｐ７５−ＴＮＦ
−Ｒも発現するＵ９３７またはＨＬ６０細胞、を使って
測定することができる〔Brockhaus et al., Procd. Na
t. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3127-3131 (1990); Hohmann
et al., J. Biol. Chem. 264, 14927-14934 (1989); L
oetscheret al. (1990); Dembic et al. (1990) を参照
されたい〕。もちろん、結合親和性は実施例IIｂに詳し
く記載されるように精製した天然または組み換えｐ５５
−ＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５−ＴＮＦ−Ｒを使うことによ
って、あるいはこの種のレセプターの対応する可溶性類
縁体を使うことによって、直接測定することも可能であ
る。

【００２９】“ヒトｐ７５−腫瘍壊死因子レセプターお
よびヒトｐ５５−腫瘍壊死因子レセプターに対するその
結合親和性間の有意差”なる表現は、本発明の状況にお
いて、本発明の突然変異タンパク質が使用した検定系で
野生型ＴＮＦと比べて２種類のＴＮＦレセプターの一方
に優先的に結合すると言うに足るほど有意な、２種類の
ＴＮＦレセプターに対する結合親和性の差を意味する。
より詳細には、この表現は、実施例IIａ）の検定系の状
況において、本発明の特定のＴＮＦ突然変異タンパク質
のＫ_D 値が、Ｕ９３７細胞を使って測定したＴＮＦ−α
自体のＫ_D 値より少なくとも１０倍またはそれ以上、特
に好適には少なくとも１０² 倍、大きいが、同じＴＮＦ
突然変異タンパク質のＨｅｐ−２細胞を使って測定した
Ｋ_D 値はＴＮＦ−α自体のＫ_D 値の２倍より大きくない
ことを意味する〔詳細なデータについては、実施例II
ａ）の表１を参照されたい〕。しかしながら、これらの
明確なＫ_D 値は例示のためのものであって、いかなる場
合も限定として解釈されるべきでない。

【００３０】本発明の突然変異タンパク質は、例えば実
施例IVに記載した当分野で知られた方法により、それら
の抗腫瘍活性によって特徴づけられる。本発明の突然変
異タンパク質は、例えばＬ９２９（表１参照）またはＬ
−Ｍ細胞系列のようなマウス細胞系列に基づいた標準Ｔ
ＮＦ検定において、必ずしもそうとは限らないが、かな
り低減した細胞障害活性を示す。

【００３１】本発明のＴＮＦ突然変異タンパク質は病気
（例えば、癌）の治療に使用することができる。本発明
の更なる対象は、本発明の化合物１種またはそれ以上
を、所望により、別の薬学的活性物質および／または無
毒性で、不活性の、治療上適合しうる担体物質と組み合
わせて含有する医薬組成物、並びにその調製方法であ
る。このために、１種またはそれ以上の本発明化合物
は、所望によりまたは必要に応じて他の薬学的活性物質
と組み合わせて、常用される固体または液体の担体物質
と共に既知方法で調製される。このような調製物は、す
でに使用されている類似した活性および構造の調製物か
ら類推して、通常の基準を考慮して投与される。

【００３２】上で本発明を一般的に説明してきたが、以
下の実施例で本発明の細部を例示することにする。しか
しながら、これらの実施例はいかなる場合も本発明を限
定するものではない。

【００３３】

【実施例】実施例Ｉ Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦαの製造 突然変異誘発ベクターの構築

【００３４】

【式２】

【００３５】Ｎ２５ＯＰＳＮ２５ＯＰ２９およびＲＢＳ
IIの支配下にあるコード領域は矢印で示してある；この
プラスミドの完全なヌクレオチド配列については、ヌク
レオチドの一文字標準略号で示される図３ｂ／１−３ｂ
／３を参照されたい〕から、リボソーム結合部位ＲＢＳ
II、成熟ＴＮＦαコード配列および１３０ｂｐの非翻訳
配列を含むＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。
この断片はＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄIII 開環ｐＭａｃファ
スミド（Stanssens et al., 前掲）にクローニングし、
構築物ｐＭａ／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαおよびｐ
Ｍｃ／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαを得た。 一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡの単離 ｐＭａ／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαファスミドを大
腸菌ＷＫ６に形質転換した（Stanssens et al., 前
掲）。１つのコロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ培地（Sa
mbrook et al., 1989 ）＋カルベニシリン（５０μｇ／
ｍｌ）中３７℃で一晩培養した。この集密培養物１ｍｌ
を２００ｍｌのＬＢ＋カルベニシリンにまいた。吸光度
（６５０ｎｍ）が０．１の値に達したとき、培養物にＭ
１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Stanssens et al., 198
9）を約２０のｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）で感染さ
せ、さらに３７℃で一晩インキュベートした。その後、
細胞を遠心し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を
別のチューブに移した。５０ｍｌのＰＥＧ溶液（２０％
ポリエチレングリコール６０００；２．５Ｍ ＮａＣ
ｌ）を加え、この混合物を氷の上に１時間置いてファー
ジを沈殿させた。遠心（１０分、８０００ｒｐｍ）後、
上清を除き、チューブをペーパータオル上で１０分間乾
かした。ファージペレットは６ｍｌのＴＥ緩衝液（１０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８）に再懸濁させた。最初の抽出は６ｍｌのＴＥ飽和フ
ェノールを加え、その後３分間ボルテックス混合するこ
とにより行った。Eppendorf 遠心機で遠心（３分）後、
水相を新しいチューブに移し、２回目の抽出をクロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２４：１）を使って同様
に行った。一本鎖ＤＮＡは１／１０容量の５Ｍ ＮａＣ
ｌＯ₄ と１容量のイソプロパノールを加えることにより
沈殿させることができた（−２０℃、２時間）。このｓ
ｓＤＮＡをEppendorf 遠心機で２０分遠心してペレット
化した。このペレットは乾燥し、対照として５００μｌ
のＴＥ緩衝液に溶解した。この混合物５μｌを１μｇ／
ｍｌエチジウムブロミドを含むアガロースゲルで泳動し
た。通常、ヘルパーファージｓｓＤＮＡに対するｐＭａ
／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαｓｓＤＮＡ（＝（＋）
鎖）の比は２：１と２０：１の間であった。全ｓｓＤＮ
Ａの量は少なくとも２００ｎｇ／μｌであると概算され
た。 ギャップ−二重鎖の構築 ファスミドｐＭｃから、ＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄIII 大型
断片を単離し、ｐＭａ／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦα
（＋）鎖とのハイブリダイゼーションに使用した。代表
的な実験では、１５μｌのｓｓＤＮＡ（±３μｇ）、１
５μｌの二本鎖線状断片（±１．５μｇ）、１０ｍｌの
ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５Ｍ ＫＣｌ；１
００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）および４０μ
ｌのＨ₂Ｏを混合し、１００℃で４分、６５℃で８分お
よび室温で１５分インキュベートした。アリコート（１
０ｍｌ）はエチジウムブロミドを含むアガロースゲルで
電気泳動し、ギャップ−二重鎖ＤＮＡの形成を調べ、形
成されている場合はその量を見積もった（これは通常５
０ｎｇ／１０ｍｌハイブリダイゼーション混合物になっ
た）。 突然変異オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびギャ
ップ−二重鎖の修復 突然変異コドンを含みかつＴＮＦ遺伝子中の制限部位を
破壊するかまたはその遺伝子中に制限部位を形成させる
オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド
５′ＣＣＧＧＣＧＧＴＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＣ
３′および５′ＣＡＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡ
Ｇ３′がそれぞれＳｅｒ²⁹およびＴｒｐ³²突然変異をつ
くるために使用された。酵素的リン酸化の後、約８ｐｍ
ｏｌを４０ｎｇのギャップ−二重鎖に加えた。Ｈ₂ Ｏを
加えて最終容量を１０ｍｌとした。この混合物は６５℃
で５分間加熱し、その後室温へ冷却させた。続いて、１
８ｍｌのＨ₂ Ｏ、４μｌの修復用緩衝液１０（６２５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、２７５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．５）、２μ
ｌのＡＴＰ １ｍＭ、４μｌずつの４種類のｄＮＴＰ
１ｍＭ、１μｌのリガーゼ、および１ｍｌの Klenow ポ
リメラーゼを加え、この混合物を室温で４５分間インキ
ュベートした。 大腸菌ＷＫ６ｍｕｔＳおよび大腸菌ＷＫ６への形質転換 １０μｌの修復したギャップ二重鎖ＤＮＡを使って、大
腸菌ＷＫ６ｍｕｔＳ（Stranssens et al.,前掲）を形質
転換した（Sambrook et al., 1989 ）。この混合物
（１．２ｍｌ）から、１００μｌを２５μｇ／ｍｌクロ
ラムフェニコール含有寒天平板にまき、形質転換効率を
調べた。残部は２０ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール
にまき、２５℃でさらに一晩増殖させた。この培養物の
小規模プラスミドＤＮＡ調製物〔Birnboim, H.C. and D
oly, J., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979) 〕は混
合ファスミド集団をもたらし、これを大腸菌ＷＫ６に形
質転換した。この場合も、１００μｌの形質転換混合物
をクロラムフェニコール含有寒天平板にプレートした。 コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニング 大腸菌ＷＫ６への形質転換から得られた約１００個のコ
ロニーをナイロンフィルター（PALL, Glen Cove, New Y
ork ）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートし
た。このフィルターを０．５Ｍ ＮａＯＨ（３分）中に
浸漬したWhatmann３ＭＭペーパーに移した（対面させ
た）。中和は１Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４（１分
間２回）および２ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ＝３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ；０．３Ｍ クエン酸Ｎａ，ｐＨ７）（５分）中に
浸漬したWhatmann３ＭＭシートへの移行により行った。
乾燥後、フィルターを３ＭＭペーパーのシート間で８０
℃で焼き付けた。続いて、フィルターは６ｘＳＳＣ（５
分）中で予め湿潤させ、１０ｘDenhardt溶液（２％（ｗ
／ｖ）フィコール（４００，０００ＭＶ）、２％（ｗ／
ｖ）ポリビニルピロリドン（４４，０００ＭＷ）、２％
（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）、６ｘＳＳＣ緩衝液お
よび０．２％ＳＤＳ中で６７℃５分間プレハイブリダイ
ズした。６ｘＳＳＣ緩衝液中ですすいだ後、フィルター
を４ｍｌの６ｘＳＳＣおよび６０ｐｍｏｌの³²Ｐ標識突
然変異オリゴヌクレオチドを含むペトリ皿に室温で１時
間入れ、１００ｍｌの６ｘＳＳＣ中ですすいだ。このフ
ィルターをサランラップで包み、前露光したフィルム
（Fuji）を重ねて−７０℃で１時間オートラジオグラフ
ィーを行った。その後、フィルターを再び６ｘＳＳＣ緩
衝液中で次第に上昇する温度（プローブの長さやＧおよ
びＣ残基の量に応じて５１℃と７５℃の間で変化する）
において洗浄し、各回ごとに上記のようにオートラジオ
グラフィーを行った。例えば、６４℃での洗浄は野生型
コロニーからＳｅｒ２９変異体をはっきりと区別するこ
とができ、一方Ｔｒｐ３２変異体は６２℃と６３℃での
２回の連続洗浄後に検出された。 制限断片分析 Ｓｅｒ２９の突然変異はＡｖａ２制限部位を形成し、Ａ
ｒｇ３２はＮｃｉ１制限部位を破壊するので、両方の対
応するエンドヌクレアーゼが突然変異の存在をもう一度
調べるために制限断片分析において使用された。コロニ
ーを採取して、５ｍｌ＋クロラムフェニコールで集密的
に増殖させた。これらの培養物から、古典的な手法に従
って（Sambrook et al., 1989 ）、プラスミドＤＮＡを
調製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、そし
てアガロースゲルによる電気泳動にかけた。 細菌発現ベクターへのサブクローニング 突然変異を起こしたＴＮＦ遺伝子の発現ベクターへの移
行は、突然変異誘発ベクターの構築と正反対の方法で実
施された。ファスミドｐＭｃ／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−Ｔ
ＮＦαＳｅｒ２９またはｐＭｃ／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−
ＴＮＦαＴｒｐ３２をＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄIII で消化
し、小さい断片をＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄIII 開環ｐＤＳ
５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαベクターに挿入し
て、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮ
ＦαＳｅｒ２９およびｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１
−ＴＮＦαＴｒｐ３２を形成し、そしてすでにプラスミ
ドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーをコードする；図２
ａおよびヌクレオチドの一文字標準略号で示されるこの
プラスミドの完全ヌクレオチド配列については図２ｂ／
１−２ｂ／３を参照されたい）を含む大腸菌Ｍ１５細胞
に標準方法（前掲）で形質転換した。形質転換した大腸
菌Ｍ１５の培養物は１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび
２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＬＢ培地（１０ｇバク
トトリプトン、５ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌ／リット
ル）中で３７℃で増殖させた。約０．７−１．０の光学
密度（６００ｎｍ）で、ＩＰＴＧを加えて最終濃度を２
ｍＭとした。３７℃でさらに２．５−５時間後、細胞を
遠心により回収し、ＴＮＦ突然変異タンパク質を Taver
nier et al. 〔J. Mol. Biol. 211, 493-501 (1990) 〕
に従って精製した。形質転換大腸菌株Ｍ１５（ｐＲＥＰ
４；ｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＳｅｒ
２９）およびＭ１５（ｐＲＥＰ４；ｐＤＳ５６／ＲＢＳ
II，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＴｒｐ３２）は、特許のための
ブダペスト条約のもとで、１９９０年１１月１９日に B
RD、Braunschweigの Deutsche Sammlung von Mikroorga
nismen und Zellkulturen GmbH (DSM)に、それぞれ寄託
番号ＤＳＭ６２４０およびＤＳＭ６２４１として寄託さ
れた。実施例II Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦαの性状決
定 ａ）Ｈｅｐ２およびＵ９３７細胞に対する示差結合およ
び生物学的活性 細胞培養 Ｈｅｐ２〔ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２３〕、Ｕ９３７〔ＡＴ
ＣＣ番号ＣＲＬ１５９３〕およびＲＡＪＩ〔ＡＴＣＣ番
号ＣＣＬ８６〕細胞は１０％（ｖ／ｖ）不活性化ウシ胎
児血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリ
ウム（１ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５ｘ１０
^-5Ｍ）、１％の非必須アミノ酸の１００ｘ混合物〔Gibr
o Laboratories, Paisley, GB 〕およびゲンタマイシン
（２５ｍｇ／ｍｌ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地で
増殖させた。１ｘ１０⁶ 細胞／ｍｌの密度に達した後に
非付着細胞を収穫した。結合実験のために、付着Ｈｅｐ
２細胞を集密的に増殖させ、トリプシン処理を行い、集
めて、大きいペトリ皿（１５０ｃｍ² ）に２．５ｘ１０
⁶ 細胞／ｍｌの密度でまいた。その後、ペトリ皿をＣＯ
₂ 恒温室の中に一晩置いた。Ｈｅｐ２細胞は強く付着し
ないので、非付着細胞と同じようにして収穫できた。Ｌ
９２９細胞の増殖のためには、１０％不活性化ウシ新生
児血清を補給したダルベッコ培地を使用した。

【００３６】Ｌ９２９、Ｈｅｐ２およびＵ９３７細胞に
対する比活性の測定 タンパク質の量は Biorad （Richmond, CA, USA ）タン
パク質色素試薬を使って製造者の説明書に従って測定し
た。ＴＮＦ突然変異タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより測定した。マウスＬ９２９細胞に対する細胞障
害活性は標準Ｌ９２９検定により測定した（Ruff and G
ifford, “Lymphokines ”, ed. by E. Pick, Vol. 2,
235-275, Academic Press, 1981, Orlando, USA ）。Ｈ
ｅｐ２細胞に対する細胞障害検定はＬ９２９検定と同様
に行ったが、アクチノマイシンＤの代わりにシクロヘキ
シミド（５０μｇ／ｍｌ）を加えた。

【００３７】レセプター結合検定 −ＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦのヨウ素化 ５μｇのヨードゲン（Iodogen, Pierce, USA）を小ガラ
スチューブ中で窒素流のもとに１０μｌのクロロホルム
に溶解し、乾燥させた。これに、１０μｌのＮａ¹²⁵ Ｉ
（Amersham, ０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８中１００ｍＣ
ｉ／ｍｌ）を加え、氷上に１５分間保持した。この溶液
は１０μｌリン酸緩衝液ｐＨ７中に５μｇのＴＮＦα
〔Pennica et al. 前掲〕または３．２μｇのＴｒｐ³²
−ＴＮＦを含む Eppendorfチューブにすばやくピペット
で注入した。再度、反応混合物を氷上に１５分間保持し
た。Ｎａ ¹²⁵Ｉからヨウ素化ＴＮＦαを分離するため
に、初めにＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Pharmacia ）を
０．１Ｍリン酸緩衝液＋０．２５％ゼラチンで平衡化
し、ヨウ素化ＴＮＦ種に応じて１μｇのＴＮＦαまたは
Ｔｒｐ³²−ＴＮＦでプレランした。その後、反応混合物
をカラムに添加し、約４００μｌの画分を集め、その画
分からの２μｌアリコートをγ−カウンター（ＬＫＢ１
２７５ Minigamma, Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden
）で計数した。ＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦに対
して、それぞれ１０−７５および８０μＣｉ／ｍｇの比
放射能が得られた。

【００３８】−スカッチャード分析による標識したＴＮ
ＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦのＫ_D値の測定 マイクロタイタープレートに標識ＴＮＦαまたはＴｒｐ
³²−ＴＮＦの１２．８ｎＭ→０．００６ｎＭの範囲の２
倍の段階希釈系列をつくった。各希釈液は３通りつくっ
た。同じ設定で非特異的結合を測定し、その際各ポイン
トは１００倍過剰の非標識ＴＮＦ（１．２８μＭ→０．
６ｎＭ）を含んでいた。各ウェルに、約２ｘ１０⁶ 個の
細胞（Ｕ９３７、Ｈｅｐ２またはＲＡＪＩ）を加えた。
この反応は０．１％ＮａＮ₃ を含む組織培養培地０．２
ｍｌ中４℃で２−３時間行った。その後、試料をマイク
ロタイタープレートから、３００μｌのフタレート油
（ジノニルフタレート３３％、ジブチルフタレート６６
％（ｖ／ｖ））をすでに含む小型のプラスチックチュー
ブへ移した。チューブを微量遠心機（Eppendorf ）で１
０分遠心して細胞を沈殿させ、フタレート油を分離媒体
として使用して、それらを上清から分離した。チューブ
を逆さにした後、加熱メスでチューブの上部から融解す
ることにより、（上部にある）細胞ペレットを簡単に分
離することができた。細胞に結合した放射能の量はγ−
カウンターで計数した。これらのデータから、スカッチ
ャードプロットと解離定数Ｋ_D をＥＢＤＡ／ＬＩＧＡＮ
Ｄプログラムの平衡結合型“ＨＯＴ”を使って求めた
〔Mc.Pherson et al., J. Pharmacol. Methods 14, 213
-228 (1985) 〕。

【００３９】−競合分析による突然変異ＴＮＦ〔Ｓｅｒ
²⁹−ＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦα〕のＫ_D の測定 スカッチャードデータは、０．４ｎＭの放射性標識ＴＮ
Ｆαの濃度がはっきりした検出可能なシグナルを示すの
に十分高く、飽和曲線の線状部分にはいることを示し
た。しかしながら、この濃度は競合実験（ ¹²⁵Ｉ−野生
型ＴＮＦが第一のリガンドで、冷却突然変異体が競合物
質である）を行うのに必要な、最高５０００倍過剰の冷
却突然変異ＴＮＦ（２μＭ）の添加を可能にするのに十
分なほど低かった。

【００４０】非標識突然変異ＴＮＦの１０ウェル希釈系
列（２ｍＭ→０．００４μＭ）を２倍の濃度段階でマイ
クロタイタープレートにつくった。残りの２つのウェル
はそれぞれ非標識ＴＮＦをまったく含まないか（全結
合）、５０００倍過剰の野生型非標識ＴＮＦを含んでい
た（バックグラウンド）。すべてのウェルに、０．４ｎ
Ｍの放射性標識ＴＮＦα（１０−７５μＣｉ／μｇ）を
加えた。２ｘ１０⁶ 細胞の添加後、全容量は０．２ｍｌ
／ウェルであった。インキュベーションの培地、反応条
件および細胞の単離はスカッチャード分析実験について
先に記載したものと正確に同じであった。各ポイントは
３通りずつ測定し、解離実験を２回行い、２つのＫ_D の
平均を表１に示した。ＥＢＤＡ／ＬＩＧＡＮＤプログラ
ムの“ＤＲＵＧ”法（前掲）を使って、競合曲線をプロ
ットし、突然変異タンパク質のＫ_Dを計算した。この種
の計算のために、以下の実験データを使用した： １．ｈＴＮＦの標識化 １回目の標識化（＝バッチ１）： １．２ｘ１０⁸ ｄｐ
ｍ／５μｇ ＝３．７ｘ１０⁵ ｄｐｍ／ｐｍｏｌ ＝±１０μＣｉ／μｇ ２回目の標識化（＝バッチ２）：５．３ｘ１０⁸ ｄｐｍ
／３．２μｇ ＝１．９ｘ１０⁶ ｄｐｍ／ｐｍｏｌ ＝±７５μＣｉ／μｇ ２．野生型ＴＮＦのＫ_D の測定 スカッチャード分析により、Ｈｅｐ２およびＵ９３７細
胞に対する ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ（バッチ１）のＫ_D を測定し
た。

【００４１】Ｈｅｐ２：Ｋ_D ＝９．１７ｘ１０^-10 Ｕ９３７：Ｋ_D ＝２．５ｘ１０^-10 ３．競合実験 すべての置換実験は第一のリガンドとして ¹²⁵Ｉ−ＴＮ
Ｆ（バッチ１）を使って実施した。ただし、実験Ｂ．３
（表Ｂ，３．）では ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ（バッチ２）を使用
した。

【００４２】各実験においてそれぞれの濃度での結合を
３通りずつ測定し、以下の表（Ａ−Ｄ）には平均のみを
示してある。これらの表に示した各実験から、Mc. Pher
son et al. (1985) のプログラムを使ってＫ_D 値を計算
した。Ｋ_D 測定値の平均（Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦαの場合は
Ｈｅｐ２細胞およびＵ９３７細胞に対して２回の実験、
Ｔｒｐ³²−ＴＮＦαの場合はＨｅｐ２細胞に対して２
回、およびＵ９３７細胞に対して３回の実験）を表１に
示す。

【００４３】 表 Ａ U937細胞に対するSer²⁹-TNFαとの競合 平 均 突然変異体の濃度 １． 2120 0 1869 １ ×10^-9 1779 ２ ×10^-9 1719 ４ ×10^-9 1708 ８ ×10^-9 1575 1.6 ×10^-8 1415 3.2 ×10^-8 1320 6.4 ×10^-8 1200 1.25×10^-7 983 2.5 ×10^-7 949 ５ ×10^-7 632 １ ×10^-6 533 ２ ×10^-6 バックグラウンド 299 ２． 1014 ０ 635 ４ ×10^-9 603 ８ ×10^-9 541 1.5 ×10^-8 572 ３ ×10^-8 489 ６ ×10^-8 413 1.2 ×10^-7 380 2.5 ×10^-7 319 ５ ×10^-7 263 １ ×10^-6 238 ２.10 ^-6 バックグラウンド 205 表 Ｂ U937細胞に対するTrp³²-TNFαとの競合 １． 2120 ０ 1917 １ ×10^-9 1698 ２ ×10^-9 1655 ４ ×10^-9 1585 ８ ×10^-9 1488 1.5 ×10^-8 1377 ３ ×10^-8 1333 ６ ×10^-8 1166 1.25×10^-7 1026 2.5 ×10^-7 953 ５ ×10^-7 777 １ ×10^-6 628 ２ ×10^-6 バックグラウンド 299 ２． 1047 ０ 653 ４ ×10⁹ 629 ８ ×10^-9 636 1.5 ×10^-8 585 ３ ×10^-8 546 ６ ×10^-8 508 1.2 ×10^-7 479 2.5 ×10^-7 422 ５ ×10^-7 357 1.10^-6 294 ２ ×10^-6 バックグラウンド 214 ３． 8340 ０ （¹²⁵I-TNF、バッチ2 4759 ４ ×10^-9 を用いて実施した） 4041 ８ ×10^-9 3620 1.5 ×10^-8 3275 ３ ×10^-8 3034 ６ ×10^-8 2387 1.25×10^-7 1981 2.5 ×10^-7 1472 ５ ×10^-7 1192 １ ×10^-6 814 ２ ×10^-6 バックグラウンド 307 表 Ｃ Hep2細胞に対するSer²⁹-TNFとの競合 １． 938 ０ 799 １ ×10^-9 677 ２ ×10^-9 564 ４ ×10^-9 510 ８ ×10^-9 451 1.6 ×10^-8 442 3.2 ×10^-8 446 6.4 ×10^-8 379 1.25×10^-7 374 2.5 ×10^-7 437 ５ ×10^-7 359 １ ×10^-6 383 ２ ×10^-6 バックグラウンド 353 ２． 457 ０ 273 ４ ×10^-9 240 ８ ×10^-9 253 1.5 ×10^-8 235 ３ ×10^-8 207 ６ ×10^-8 239 1.2 ×10^-7 215 2.5 ×10^-7 211 ５ ×10^-7 193 １ ×10^-6 238 ２ ×10^-6 バックグラウンド 215 表 Ｄ Hep2細胞に対するTrp³²-TNFαとの競合 １． 938 ０ 742 １ ×10^-9 608 ２ ×10^-9 537 ４ ×10^-9 547 ８ ×10^-9 397 1.6 ×10^-8 394 3.2 ×10^-8 405 6.4 ×10^-8 395 1.25×10^-7 388 2.5 ×10^-7 379 ５ ×10^-7 353 １ ×10^-6 386 ２ ×10^-6 バックグラウンド 353 ２． 445 ０ 298 ４ ×10^-9 222 ８ ×10^-9 256 1.5 ×10^-8 202 ３ ×10^-8 227 ６ ×10^-8 210 1.2 ×10^-7 221 2.5 ×10^-7 197 ５ ×10^-7 231 １ ×10^-6 202 ２ ×10^-6 バックグラウンド 203

【００４４】

【表１】

【００４５】星印（＊）で示したＫ_D 値はスカッチャー
ド分析により得られた。他のＫ_D 値はすべて競合分析に
より測定した。相対値（ＴＮＦαに対する百分率）は括
弧内に示してある。Ｈｅｐ−２細胞（ｐ５５−ＴＮＦ−
Ｒのみを保有する）を用いて測定したＳｅｒ²⁹−ＴＮＦ
−αとＴｒｐ³²−ＴＮＦ−αの結合定数（Ｋ_D ）はＴＮ
Ｆ−αの結合定数とほとんど同じであることが分かる。
また、これらの細胞に対する生物学的活性（比活性）も
大部分が保持される（この検定の精度は３倍にすぎない
ことに注意されたい）。驚いたことに、Ｕ９３７細胞
（排他的ではないが、主として高親和性レセプターｐ７
５−ＴＮＦ−Ｒを保有する）に対するＳｅｒ²⁹−ＴＮＦ
−αとＴｒｐ³²−ＴＮＦ−αの結合親和性（競合検定に
より測定）は大部分が失われた（Ｋ_D 値の１００倍以上
の増加）。さらに、Ｌ９２９細胞を用いて標準検定で測
定した、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦ−αとＴｒｐ³²−ＴＮＦ−α
の生物学的活性も大部分が失われた（１００倍以上減
少）ことが分かる。 ｂ）ヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒおよびヒトｐ５５−ＴＮＦ
−Ｒに対する示差結合 ＨＬ６０細胞から精製したＴＮＦレセプターに対するＴ
ｒｐ³²−ＴＮＦ−α、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦ−αおよびヒト
ＴＮＦ−αによるヒト ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦ−α結合の競合は
次のように測定した。欧州特許出願第９０１１６７０
７．２号に記載される通りに精製した天然ｐ５５−ＴＮ
Ｆ−Ｒおよびｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの２μｌアリコートを
２０ｍＭヘペス、５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％オクチルグルコシド、
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ８．０中に約０．３ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で溶解し、予め湿らせたニトロセルロー
スフィルターに３通りずつスポットした。フィルターは
ブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス、１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＮａＮ₃ 、１
％脱脂粉乳）を使って室温で１．５時間ブロックした。
ＰＢＳで洗浄後、フィルターを１０ｎｇ／ｍｌ ¹²⁵Ｉ−
ＴＮＦαおよび可変濃度のＴｒｐ³²−またはＳｅｒ²⁹−
ＴＮＦα、もしくはＴＮＦαと４℃で一晩インキュベー
トした。フィルターをブロッキング緩衝液（２ｘ５分
間）およびＨ₂ Ｏ（１ｘ５分間）で洗い、自然乾燥さ
せ、γ−カウンターで計数した。結果は図１ａおよびｂ
に示してあり、図１ａの場合はヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ
への、そして図１ｂの場合はヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒへ
の、ＴＮＦα（白の四角）、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦα（黒の
円）およびＴｒｐ³²−ＴＮＦα（黒の四角）の結合を示
す。

【００４６】実施例III Ｔｒｐ³²−ＴＮＦαの精製 実施例Ｉにより得られた形質転換細胞は次の方法で処理
した： ａ）フレンチプレスによる破砕、最終濃度０．４％、ｐ
Ｈ７．６になるまでポリエチレンイミンを添加；沈殿物
の除去； ｂ）ｐＨ７．２で硫酸アンモニウム沈殿；画分３０−７
０％； ｃ）１０ｍＭトリス、ｐＨ６．８中の２５％硫酸アンモ
ニウムに対して透析； ｄ）フェニル−セファロースカラムＣＬ−４Ｂ（３５ｘ
２５０ｍｍ） 負荷：２５％硫酸アンモニウム−１０ｍＭトリス、ｐＨ
６．８を使用 溶出：２５％硫酸アンモニウム−トリス緩衝液から２０
ｍＭエタノールアミン、ｐＨ９までの勾配（２回、１５
０ｍｌ）； ｅ）カラムＭｏｎｏ Ｑ（ＨＲ １６／１０） 負荷：２０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ９ 溶出：同一緩衝液中の０−１Ｍ塩化ナトリウムの勾配
（２回、３００ｍｌ） （Pharmacia 、ＦＰＬＣ）；活性画分は０．０１Ｍリン
酸緩衝液ｐＨ７に対して透析した； ｆ）ヘパリンセファロースカラムＣＬ−６Ｂ（３０ｘ８
０ｍｍ） 負荷：０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７ 溶出：同一緩衝液中の０−１Ｍ塩化ナトリウムの勾配； ｇ）活性画分をアミコン（マイクロ限外濾過システム８
ＭＣ；メンブランＯ２５ｍｍ；ダイアフロ１０ ＹＭ１
０−２５ｍｍ）で濃縮し、０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
７および０．９％塩化ナトリウムで平衡化したゲル濾過
カラム（ウルトラパックＴＳＫ Ｇ−２０００ＳＷＧ；
２１．５ｘ６００ｍｍ）に別々に負荷した； ＬＰＳ（ Kabivitrum の試験キットにより測定）：最大
活性画分は５ｍｇ／ｍｌのＴｒｐ³²−ＴＮＦαを含んで
いた；内毒素含有量：２６Ｅ．Ｕ．／ｍｇ。 最後の活性画分は１．８ｍｇ／ｍｌのＴＮＦおよび４７
Ｅ．Ｕ．／ｍｇのタンパク質を含んでいた。

【００４７】実施例IV １．ヌードマウスにおける皮下ＨＴ−２９腫瘍に対する
ｈＴＮＦαおよびｈＩＦＮγの抗腫瘍作用 ヌードマウスに５ｘ１０⁶ 個のＨＴ−２９ヒト結腸腺癌
細胞〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ３８〕を皮下注射した。１群５
匹のマウスから成っていた。１週あたり６日間は毎日病
変周囲に注射を施し、その後の１日は処置を施さなかっ
た。結果は図４に示してあり、ここで“ＰＢＳ”は当分
野で知られたリン酸緩衝溶液を表す。１本の矢印は５μ
ｇのｈＴＮＦαまたは５０００ＩＵのヒト・インターフ
ェロンγ（ｈＩＦＮγ）もしくは両方による処置の開始
を示す。２本の矢印は用量を２倍にした時点を示し、そ
して交差させた矢印は処置の終了を示す。 ２．ｈＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦαの抗腫瘍効力
の比較 ヌードマウスに５ｘ１０⁶ 個のＨＴ−２９ヒト結腸腺癌
細胞（前掲）を皮下注射した。１群５匹のマウスから成
っていた。接種後６日目に処置を開始し、１週あたり６
日間は毎日病変周囲に注射を施した。腫瘍の体積は、よ
り大きい（ａ）およびより小さい（ｂ）直径を測定し、
当分野で知られた Attia and Weissに従ってａｘｂ² ｘ
０．４を計算することにより、３日または４日ごとに概
算した。結果は図５に示してあり、ここで矢印は処置の
開始を示し、先端が下向きの白の三角形は１０⁴ ＩＵの
ｈＩＦＮγおよび１０μｇのｈＴＮＦαを示し、先端が
下向きの黒の三角形は１０⁴ ＩＵのｈＩＦＮγおよび１
０μｇのＴｒｐ³²−ＴＮＦαを示し、黒の四角形は１０
μｇのＴｒｐ³²−ＴＮＦαを示し、白の四角形は１０μ
ｇのｈＴＮＦαを示し、白の三角形はリン酸緩衝溶液を
示し、そして黒の円は１０⁴ ＩＵのｈＩＦＮγを示す。
in vitroでは、ｈＴＮＦαとＴｒｐ³²−ＴＮＦαとの間
にＨｅｐまたはＨＴ−２９細胞に対する細胞障害性に差
がない。

【００４８】実施例Ｖ Ｓｅｒ²⁹−Ｔｒｐ³²−ＴＮＦαの製造 Ｓｅｒ²⁹−Ｔｒｐ³²−ＴＮＦαは以下の点を除いて実施
例Ｉに記載する通りに製造した： １．使用したオリゴヌクレオチドは次の配列（突然変異
を起こした塩基には下線が引いてある）を含む： ５′ＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＡＣ
ＣＡＣＴＧＧＡＧＣ３′ ２．Ｎｃｉ１部位を破壊し、Ａｖａ２部位を形成して、
制限断片分析による突然変異の存在のチェックを可能に
した。ハイブリダイゼーション分析は行わなかった。Ｗ
Ｋ６形質転換から得られた６個のクローンを増殖させ、
ＤＮＡを調製し、そして実施例Ｉに記載するように分析
した。６個のクローンからの３個が突然変異をもってい
た。

【００４９】このＤＮＡ配列はｐＤＳ５６発現ベクター
にサブクローニングしてプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ
II，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＳｅｒ２９Ｔｒｐ３２を作製
し、その後大腸菌Ｍ１５株に形質転換した。発現および
精製は実施例Ｉに記載する通りに行った。実施例VI Ｇｌｙ²⁹−ＴＮＦα、Ｔｙｒ²⁹−ＴＮＦαおよびＴｙｒ
³²−ＴＮＦαの製造 Ｇｌｙ²⁹−ＴＮＦα、Ｔｙｒ²⁹−ＴＮＦαおよびＴｙｒ
³²−ＴＮＦαは以下の点を除いて実施例Ｉに記載する通
りに製造した。２９位または３２位に完全改変コドンを
含み、２つの位置の一方に２０個全部のアミノ酸のラン
ダム挿入をもたらすオリゴヌクレオチドを使用した。こ
れらのオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである： ２９位： ５′ＣＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡ
ＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＸＸＸＣＣＡＣＴＧＧＡ
ＧＣ３′ ３２位： ５′ＣＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡ
ＴＴＧＧＣＸＸＸＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＣ３′ ここでＸはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり、突然変異を起こ
した塩基には下線が引いてある。

【００５０】突然変異と共に、唯一のＮｒｕ−１部位も
導入される。従って、ＷＫ６ ｍｕｔＳ株から単離した
ファスミドプールを直接形質転換する代わりに、このＤ
ＮＡを最初にＮｒｕ−１で消化し、線状バンドをアガロ
ースゲルから溶出し、連結してＳＵＲＥ株（Stratagen
e, La Jolla, CA, USA ）に形質転換した。この方法で
は、突然変異を含むファスミドだけを選択することがで
きる。得られた１６８個のコロニーをマイクロタイター
プレートに接種し、集密的に増殖させ、その後それらの
細胞溶解物は実施例IIａに記載する方法でＨｅｐ−２細
胞に対する生物学的活性を、さらに実施例IIｂまたは実
施例VIIIに記載するように示差結合を試験した。Ｈｅｐ
−２細胞に対する生物学的活性および実施例IIｂまたは
実施例VIIIに従って測定した示差結合に基づいてコロニ
ーを選択し、選択したコロニーは当分野で知られるよう
な対応挿入物のＤＮＡ配列解析によりさらに分析した。
Ｇｌｙ²⁹−ＴＮＦα、Ｔｙｒ²⁹−ＴＮＦαおよびＴｙｒ
³²−ＴＮＦαをコードするＤＮＡ配列を対応コロニーか
ら単離し、実施例Ｉに記載する細菌発現ベクターにクロ
ーニングした。発現された突然変異タンパク質は、ＭＯ
ＮＯ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、
９５％以上の均質性が得られるまで精製した。

【００５１】実施例VII Ｇｌｕ³¹−ＴＮＦαおよびＡｓｎ³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦ
αの製造 ＰＣＲを使ったＴＮＦα遺伝子の突然変異誘発：３つの
ＰＣＲ反応は鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＤＳ５６／
ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦα〔図３〕を使用し、また
AmpliTaq（登録商標）組み換えＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼを含む Perkin-Elmer Cetus GeneAmp （登録商標）Ｄ
ＮＡ増幅試薬キット（ Perkin Elmer Cetus, Vaterstet
ten, BRD）を使って実施した〔図８参照〕。反応Ｉで
は、プライマー１７／Ｆ（５′−ＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣ
ＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧ−３′；プライマー１７／Ｆ
はプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，ＳｐｈＩ−ＴＮＦ
αのヌクレオチド３９４９−３９７０から成る）および
２１／Ｍ５（５′−ＡＴＴＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＴＴＣ
ＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣ−３′；プ
ライマー２１／Ｍ５はプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳI
I，ＳｐｈＩ−ＴＮＦαのヌクレオチド２１９−１８４
に相補的なヌクレオチドから成り、突然変異を起こした
塩基には下線が引いてある）を使用し、反応IIはプライ
マー１７／Ｆおよび２１／Ｍ６（５′−ＡＴＴＧＧＣＡ
ＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣ
ＣＣＴＣ−３′；プライマー２１／Ｍ６はプラスミドｐ
ＤＳ５６／ＲＢＳII，ＳｐｈＩ−ＴＮＦαのヌクレオチ
ド２１９−１８４に相補的なヌクレオチドから成り、突
然変異を起こした塩基には下線が引いてある）を含み、
そして反応III はプライマー２１／ＭＲ（５′−ＧＣＣ
ＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧ−３′；プラ
イマー２１／ＭＲはプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，
ＳｐｈＩ−ＴＮＦαのヌクレオチド２２０−２４１から
成る）および１７／Ｏ（５′−ＣＡＴＴＡＣＴＧＧＡＴ
ＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧ−３′；プライマー１７／Ｏは
プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，ＳｐｈＩ−ＴＮＦα
のヌクレオチド７４８−７２７に相補的なヌクレオチド
から成る）を含んでいた。こうして、Eppendorf チュー
ブ中で１０μｌの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ）、５μｌずつ
の２つのプライマー（１００ｐｍｏｌｅずつ）、１６μ
ｌのｄＮＴＰミックス（１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）、１０μｌの１０ｘ
反応緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．３、５
００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、および０．
１％ゼラチン）、１μｌ（５単位）のAmpliTaq（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼおよび５３μｌのＨ₂ Ｏを混合
し、８０μｌの鉱油（ Perkin-Elmer Cetus ）を重層さ
せた。これらのチューブはＤＮＡサーマルサイクラー
（TRIO-Thermoblock, Biometra）に移し、９４℃で１分
間保持し、その後３５サイクルのＤＮＡの融解（９４℃
で１分）、プライマーのアニーリング（５０℃で１分）
およびプライマーの伸長（７２℃で３分）を行った。７
２℃でさらに２分後、反応混合物を室温まで冷却し、ク
ロロホルムで抽出した。水相に存在するＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動を行った〔Sambrook et al., 1989 〕。エチジウム
ブロミドでＤＮＡを染色した後、断片Ｉ、IIおよびIII
〔図８参照；これらの断片はそれぞれ反応Ｉ、IIおよび
III に由来する〕をゲルから単離し、精製した〔Sambro
ok et al., 1989 〕。 Ｇｌｕ³¹−ＴＮＦαおよびＡｓｎ³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦ
αをコードするＤＮＡ断片の製造：断片Ｉ、IIおよびII
I を酵素によりリン酸化し、その後２つの並行する反応
において、断片ＩとIII および断片IIとIII を互いに連
結させた〔Sambrook et al., 1989 〕。リガーゼの熱不
活化および制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII による消
化後、ＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
にかけた。エチジウムブロミドでＤＮＡを染色した後、
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片ＡおよびＢ〔図８参照〕
をゲルから単離し、精製した〔前掲〕。 Ｇｌｕ³¹−ＴＮＦαおよびＡｓｎ³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦ
αをコードするプラスミドの作製：別々の実験におい
て、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片ＡおよびＢを標準方
法〔Sambrook et al., 1989 〕に従ってＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄIII 開環プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐ
ｈ１−ＴＮＦαＳｅｒ²⁹に挿入し、それぞれｐＤＳ５６
／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＧｌｕ３１およびｐＤ
Ｓ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαＡｓｎ３１Ｔｈ
ｒ３２を作製した。プラスミドＤＮＡを調製し〔Birnbo
im et al., 1979 〕、ＴＮＦα突然変異タンパク質のコ
ード領域のヌクレオチド配列を２本鎖ＤＮＡの塩基配列
決定により確かめた〔Sambrook et al.,1989 〕。 Ｇｌｕ³¹−ＴＮＦαおよびＡｓｎ³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦ
αの生産：プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１
−ＴＮＦαＧｌｕ３１およびｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓ
ｐｈ１−ＴＮＦαＡｓｎ３１Ｔｈｒ３２を、プラスミド
ｐＲＥＰ４をすでに含む大腸菌Ｍ１５細胞に標準方法
〔前掲〕により形質転換した。形質転換細胞は１００ｍ
ｇ／ｌアンピシリンおよび２５ｍｇ／ｌカナマイシンを
含むＬＢ培地〔前掲〕中３７℃で増殖させた。約０．７
−１．０の光学密度（６００ｎｍ）でＩＰＴＧを加え、
最終濃度を２ｍＭとした。３７℃でさらに２．５−５時
間経過後、細胞を遠心により回収した。

【００５２】実施例VIII 組み換えヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒおよび組み換えヒトｐ
５５−ＴＮＦ−Ｒへの示差結合 １．組み換えヒトＴＮＦα、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦα、Ｔｒ
ｐ³²−ＴＮＦα、Ｇｌｕ ³¹−ＴＮＦα、およびＡｓｎ³¹
−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦαを発現する形質転換大腸菌細胞の
１０ｍｌ懸濁液〔対照として組み換えジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）を発現する大腸菌細胞を含んでいた〕
を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、０．９ｍｌの細
胞溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭベンズア
ミジン、２００単位／ｍｌアプロチニンおよび０．１ｍ
ｇ／ｍｌリゾチーム）に再懸濁させた。室温で２０分イ
ンキュベートした後、５０μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、２
０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、５０μｌの５Ｍ
ＮａＣｌおよび５０μｌの１０％ＮＰ−４０を加え、
この混合物を室温でさらに１５分間インキュベートし
た。１３，０００ｒｐｍで５分間遠心して清澄化した細
胞溶解液０．５ｍｌは硫酸アンモニウム沈殿に付した
（３０％−７０％カット）。７０％硫酸アンモニウムペ
レットを０．２ｍｌのＰＢＳに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析して、組み換えタンパク質の存在を確かめた。

【００５３】示差結合検定のために、マイクロタイター
プレートに、それぞれ０．３μｇ／ｍｌおよび０．１μ
ｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解した組み換えヒトｐ７５−ＴＮ
Ｆ−Ｒ−ヒトＩｇＧγ３およびｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ−ヒ
トＩｇＧγ３融合タンパク質（欧州特許出願公開第４１
７５６３および４２２３３９号）を被覆した（１００μ
ｌ／ウェル、４℃で一晩）。ブロッキング緩衝液（５０
ｍＭトリスｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ₃ 、１％脱脂粉乳）でブ
ロックした後、マイクロタイタープレートをＰＢＳで洗
い、硫酸アンモニウム沈殿により部分精製した大腸菌細
胞溶解液の異なる希釈液の存在下に５ｎｇ／ｍｌのヒト
¹²⁵Ｉ−ＴＮＦα〔上記のように約３０μＣｉ／μｇの
比活性にヨードゲン法により標識した〕と共にインキュ
ベートした。体積は１００μｌ／ウェルであり、各希釈
液は２通り検定した。室温で３時間後、ウェルをＰＢＳ
で十分に洗い、γ−カウンターで計数した。結果は図６
に示してあり、ここで黒の円はｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ−ヒ
トＩｇＧγ３への結合を表し、白の円はｐ７５−ＴＮＦ
−Ｒ−ヒトＩｇＧγ３への結合を表す。 ２．Ｓｅｒ²⁹−Ｔｒｐ³²−ＴＮＦα、Ｇｌｙ²⁹−ＴＮＦ
α、Ｔｙｒ²⁹−ＴＮＦαおよびＴｙｒ³²−ＴＮＦαの結
合の測定は１．に記載した通りに行ったが、ただしＭＯ
ＮＯ−Ｑイオン交換クロマトグラフィーで精製した突然
変異タンパク質を使用した。結果は図７に示してあり、
ここで白および黒の円は図６と同じ意味であり、μｇ／
ｍｌは精製した突然変異タンパク質の量／ｍｌである。

【００５４】なお、上記したように、図１ａは、ヒトｐ
７５−ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦα（白の四角）、Ｓｅ
ｒ²⁹−ＴＮＦα（黒の円）またはＴｒｐ³²−ＴＮＦα
（黒の四角）と ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦαとの競合結合を示して
おり、図１ｂは、ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮ
Ｆα（白の四角）、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦα（黒の円）また
はＴｒｐ³²−ＴＮＦα（黒の四角）と ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦα
との競合結合を示している。

【００５５】さらに、図２ａは、プラスミドｐＲＥＰ４
を、図２ｂは、プラスミドｐＲＥＰ４の完全ヌクレオチ
ド配列を示しており、図３ａは、ヒトＴＮＦ発現プラス
ミドｐＤＳ５６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαを、図
３ｂは、ヒトＴＮＦ発現プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ
II，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαの挿入物のヌクレオチド配列を
示している。

【００５６】また、図４は、ヌードマウスにおける皮下
ＨＴ−２９腫瘍に対するｈＴＮＦαおよびｈＩＦＮγの
抗腫瘍作用を、図５は、ヌードマウスにおける皮下ＨＴ
−２９腫瘍に対するｈＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦ
αの抗腫瘍効力の比較を、図６は、ヒトｐ５５−ＴＮＦ
−Ｒ（黒の円）およびヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ（白の
円）に対する、組み換えヒトＴＮＦα、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮ
Ｆα、Ｔｒｐ³²−ＴＮＦα、Ｇｌｕ³¹−ＴＮＦα、また
はＡｓｎ³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮＦαと ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦαと
の競合結合を、図７は、ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ（黒の
円）およびヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ（白の円）に対す
る、組み換えヒトＴＮＦα、Ｓｅｒ²⁹−Ｔｒｐ³²−ＴＮ
Ｆα、Ｇｌｙ²⁹−ＴＮＦα、Ｔｙｒ²⁹−ＴＮＦα、また
はＴｙｒ³²−ＴＮＦαと ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦαとの競合結合
を、図８は、ＴＮＦα遺伝子に突然変異を起こすＰＣＲ
反応において使用したプライマー、これにより得られた
断片をそれぞれ示している。

【００５７】本発明は、さらに次の実施態様を包含す
る：請求項１のヒト腫瘍壊死因子突然変異タンパク質に
おいて、ヒト腫瘍壊死因子のアミノ酸配列は次の配列：

【００５８】

【式３】

【００５９】から成る；前記アミノ酸配列は１個または
それ以上の、好ましくは１個または２個の、アミノ酸を
他のアミノ酸、好ましくは自然界に存在するアミノ酸、
で置換することにより変更される；前記アミノ酸配列は
上記のように２９位で変更され、この場合の前記自然界
に存在するアミノ酸はセリン、グリシンまたはチロシン
である；前記アミノ酸配列は上記のように３２位で変更
され、この場合の前記自然界に存在するアミノ酸はトリ
プトファンまたはチロシンである；前記アミノ酸配列は
上記のように３１位で変更され、この場合の前記自然界
に存在するアミノ酸はグルタミン酸である；前記アミノ
酸配列は上記のように２９および３２位で変更され、こ
の場合、２９位の前記自然界に存在するアミノ酸はセリ
ン、グリシンまたはチロシン、好ましくはセリンであ
り、３２位の前記自然界に存在するアミノ酸はチロシン
またはトリプトファン、好ましくはトリプトファンであ
る；前記アミノ酸配列は上記のように３１および３２位
で変更され、この場合、３１位の前記自然界に存在する
アミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン、好ましく
はアスパラギンであり、３２位の前記自然界に存在する
アミノ酸はチロシン、トリプトファンまたはトレオニ
ン、好ましくはトレオニンである；前記突然変異タンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換
された宿主細胞は大腸菌である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ａは、ヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒに対する、
図１ｂ、ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒに対する、ＴＮＦα
（白の四角）、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦα（黒の円）またはＴ
ｒｐ³²−ＴＮＦα（黒の四角）と ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦαとの
競合結合を示す図。

【図２】図２ａは、プラスミドｐＲＥＰ４を示し、図２
ｂは、その完全ヌクレオチド配列を示す図。

【図３】図３ａは、ヒトＴＮＦ発現プラスミドｐＤＳ５
６／ＲＢＳII，Ｓｐｈ１−ＴＮＦαを示し、図３ｂは、
その挿入物のヌクレオチド配列を示す図。

【図４】ヌードマウスにおける皮下ＨＴ−２９腫瘍に対
するｈＴＮＦαおよびｈＩＦＮγの抗腫瘍作用を示す
図。

【図５】ヌードマウスにおける皮下ＨＴ−２９腫瘍に対
するｈＴＮＦαおよびＴｒｐ³²−ＴＮＦαの抗腫瘍効力
の比較を示す図。

【図６】ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ（黒の円）およびヒト
ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ（白の円）に対する、組み換えヒト
ＴＮＦα、Ｓｅｒ²⁹−ＴＮＦα、Ｔｒｐ³²−ＴＮＦα、
Ｇｌｕ³¹−ＴＮＦα、またはＡｓｎ³¹−Ｔｈｒ³²−ＴＮ
Ｆαと ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦαとの競合結合を示す図。

【図７】ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ（黒の円）およびヒト
ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ（白の円）に対する、組み換えヒト
ＴＮＦα、Ｓｅｒ²⁹−Ｔｒｐ³²−ＴＮＦα、Ｇｌｙ²⁹−
ＴＮＦα、Ｔｙｒ²⁹−ＴＮＦα、またはＴｙｒ³²−ＴＮ
Ｆαと ¹²⁵Ｉ−ＴＮＦαとの競合結合を示す図。

【図８】ＴＮ ＴＮＦα遺伝子に突然変異を起こすＰＣ
Ｒ反応において使用したプライマー、これにより得られ
た断片を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年１０月２０日

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図２ａ】

【図３ａ】

【図２ｂ／１】

【図２ｂ／２】

【図２ｂ／３】

【図３ｂ／１】

【図３ｂ／２】

【図３ｂ／３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヤン タヴェルニール ベルギー王国 ベー−9860 バルゲム， ボッテルウェグ ２ (72)発明者 グザヴィール ヴァン オスタデ ベルギー王国 べー−2000 アントウェル ペン， キプドルプヴェスト 46

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＴＮＦ配列が１個またはそれ以上のアミ
   ノ酸の欠失、挿入および／または置換により変更され、
   その結果としてＴＮＦ突然変異タンパク質がヒトｐ７５
   −腫瘍壊死因子レセプターへの結合親和性とヒトｐ５５
   −腫瘍壊死因子レセプターへの結合親和性との間で有意
   な差を示すことを特徴とする、ヒト腫瘍壊死因子突然変
   異タンパク質またはその薬学的に許容しうる塩。
2. 【請求項２】 請求項１に記載した突然変異タンパク質
   の欠失、置換および／または付加類縁体もしくはその薬
   学的に許容しうる塩であって、該突然変異タンパク質の
   ２９および／または３２位、３１位、あるいは３１およ
   び３２位が変更されておらず、しかもなお該類縁体がヒ
   トｐ７５−腫瘍壊死因子レセプターへの結合親和性とヒ
   トｐ５５−腫瘍壊死因子レセプターへの結合親和性との
   間で有意な差を示すことを特徴とする、上記の類縁体。
3. 【請求項３】 請求項１に記載した突然変異タンパク質
   をコードするＤＮＡ配列から成るＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 請求項３に記載したＤＮＡ配列を含む、
   特に原核または下等真核宿主細胞における発現に適し
   た、ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載したベクターで形質転換
   された宿主細胞、特に原核または下等真核宿主細胞。
6. 【請求項６】 病気を治療するための請求項１または２
   に記載した化合物。
7. 【請求項７】 請求項５に記載した宿主細胞を適当な培
   地で培養し、培養上清または宿主細胞自体から突然変異
   タンパク質を単離し、所望により該突然変異タンパク質
   を薬学的に許容しうる塩に変換することから成る、請求
   項１または２に記載した化合物の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載した化合物１種
   またはそれ以上を、所望により、別の薬学的活性物質お
   よび／または無毒性で、不活性の、治療上適合しうる担
   体物質と組み合わせて、含有する医薬組成物。
9. 【請求項９】 病気を治療するための請求項１または２
   に記載した化合物の使用。
10. 【請求項１０】 請求項７に記載した方法により製造さ
    れる、請求項１または２に記載した化合物。