ES2340038T3

ES2340038T3 - Composicion farmaceutica para tratar cancer de pancreas localmente avanzado (cpla) no extirpable.

Info

Publication number: ES2340038T3
Application number: ES04795677T
Authority: ES
Inventors: Paul D. Kessler; Henrik S. Rasmussen; Karen W. Chu
Original assignee: Genvec Inc
Current assignee: Genvec Inc
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2010-05-28
Anticipated expiration: 2024-10-20
Also published as: EP1687032B1; JP2007511507A; US20110034752A1; EP1687032A1; CA2545815A1; EP2168603A1; US20060257369A1; DE602004025726D1; ATE458500T1; US20120123186A1; WO2005051432A1

Abstract

Uso de un vector adenovírico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-α humano y que está ligada operativamente a un promotor inducible por radiación, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) no extirpable en un ser humano, en el que (a)se administrará una dosis de la composición farmacéutica que comprende (i) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (ii) de aproximadamente 4 x 107 a aproximadamente 4 x 1012 unidades de partícula (up) de dicho vector adenovírico localmente en un tumor del ser humano aproximadamente una vez a la semana en un período terapéutico que comprende aproximadamente 3-8 semanas; (b)se administrará una dosis de radiación ionizante al ser humano durante el período terapéutico; y (c)se administrará una dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos al ser humano durante el período terapéutico.

Description

Composición farmacéutica para tratar cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) no extirpable.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de un vector adenovírico en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) en un ser humano.

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Antecedentes de la invención

La identificación de una terapia eficaz contra uno o varios tipos diferentes de cáncer es el deseo de la investigación sobre el cáncer. Sólo la Sociedad Estadounidense contra el Cáncer distribuyó aproximadamente mil millones de dólares el año pasado entre los investigadores sobre el cáncer que trabajan para dilucidar los mecanismos de una multitud de tipos de cáncer. Sin embargo, a pesar de la extensa investigación sobre la enfermedad, sigue siendo difícil para la comunidad médica encontrar agentes terapéuticos eficaces contra el cáncer. Los profesionales de la salud han obtenido un éxito limitado con las terapias estándar actuales: la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía. Sin embargo, cada terapia tiene limitaciones inherentes. La quimioterapia y la radioterapia provocan un daño de consideración en el tejido normal sano, a pesar de los esfuerzos por dirigir tal terapia al tejido anómalo (p. ej., tumores). La cirugía puede ser eficaz en eliminar las masas de células cancerosas; sin embargo, no es posible, incluso para el mejor cirujano, garantizar la eliminación total del tejido afectado, ni todos los tumores tienen una ubicación anatómica que permita su resección quirúrgica. Las limitaciones de las terapias existentes se reflejan en una tasa de supervivencia relativa durante 5 años del 60% para todos los cánceres combinados (Cáncer Facts & Figures 2001, The American Cancer Society, Nueva York, NY).

Los profesionales de la salud han considerado la administración de secuencias de ácidos nucleicos terapéuticas como una posible alternativa a las terapias existentes contra el cáncer. La producción local de agentes terapéuticos a niveles biológicamente relevantes en sitios diana in vivo, reduciendo de ese modo la toxicidad de los tejidos normales, aborda algunas de las limitaciones asociadas a la terapia convencional. Se han examinado numerosos genes en cuanto a sus efectos antitumorales. Uno de los agentes antitumorales más prometedores es el factor de necrosis tumoral (FNT), en particular, el FNT-\alpha, que ha mostrado una actividad con respecto a un número de líneas celulares cancerosas. El FNT-\alpha es un polipéptido de 17 kDa secretado por macrófagos y monocitos. Se ha observado que el FNT-\alpha destruye selectivamente la vasculatura tumoral y activa una miríada de inmunocitos, así como que induce a la apoptosis de algunos tipos de células tumorales (Baher et al., Anticancer Research, 19, 2917-2924 (1999), y Mauceri et al., C. R. Acad. Sci. III, 322, 225-228 (1998)). Sin embargo, el uso del FNT en seres humanos como agente anticancerígeno ha estado limitado por sus graves efectos sistémicos, incluyendo la hipotensión y la insuficiencia respiratoria (Mauceri et al., supra). Además, muchos tipos de cáncer no responden al tratamiento con la proteína FNT-\alpha, tal como, por ejemplo, el cáncer de páncreas (Brown et al., J; Immunotherapy, 10, 376-378 (1991)), el cáncer gástrico (Muggia, Anticancer Drugs, 3, 211-217 (1992)), el cáncer de mama metastásico (Budd et al., Cancer, 68, 1694-1695 (1991)) y el cáncer colorrectal (Heim et al, Onkologie, 13, 444-447
(1990)).

En el documento WO 03/039458 A2, se describe un procedimiento para tratar el cáncer en un ser humano usando FNT. Este procedimiento comprende administrar a un ser humano una dosis de una composición farmacéutica que comprende (i) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (ii) un vector adenovírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha ligado operativamente a un promotor, comprendiendo la dosis de aproximadamente 1 x 10^{6} a aproximadamente 4 x 10^{12} unidades de partícula (up) de vector adenovírico, al menos una vez en un período terapéutico que comprende hasta aproximadamente 10 semanas.

Se ha publicado que la administración sistémica de la proteína FNT-\alpha ha tenido un éxito clínico limitado debido a los graves efectos tóxicos limitantes de la dosis, y que esta limitación ha sido superada por el uso de un enfoque de administración génica combinado con un promotor inducible mediante radiación para expresar la proteína FNT-\alpha en el tejido tumoral radiado (Weichselbaum et al, Lancet Oncology, 3, 665-671 (2002)).

Sigue existiendo la necesidad de una composición adecuada para su uso en el tratamiento de una variedad de tipos de cáncer en un paciente, así como de un procedimiento para administrar la composición con el fin de tratar el cáncer. En particular, sigue existiendo la necesidad de una composición y un procedimiento que optimice los efectos locales de los agentes anticancerígenos, tales como el FNT, a la vez que minimice la toxicidad. La invención proporciona tal composición y tal procedimiento. Estas y otras ventajas de la invención, así como otras características de la invención, quedarán claras a partir de la descripción de la invención proporcionada en la presente
memoria.

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Breve resumen de la invención

La invención proporciona el uso de un vector adenovírico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano y que está ligada operativamente a un promotor inducible mediante radiación, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) no extirpable en un ser humano, en el que

(a): se administrará una dosis de la composición farmacéutica que comprende (i) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (ii) de aproximadamente 4 x 10^{7} a aproximadamente 4 x 10^{12} unidades de partícula (up) de dicho vector adenovírico localmente a un tumor del ser humano aproximadamente una vez a la semana en un período terapéutico que comprende aproximadamente 3-8 semanas;

(b): se administrará una dosis de radiación ionizante al ser humano durante el período terapéutico; y

(c): se administrará una dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos al ser humano durante el período terapéutico.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática del genoma de un vector adenovírico sin modificar.

La figura 2 es una representación esquemática de un vector adenovírico que contiene un genoma adenovírico modificado y elementos genéticos según una realización de la invención.

La figura 3A es una vista posterior de un tumor sólido con una ilustración de un patrón preferido para aplicaciones múltiples de una monodosis de composición farmacéutica en el tumor sólido. La figura 3B es una vista lateral de un tumor sólido con una ilustración de un patrón preferido para aplicaciones múltiples de una monodosis de composición farmacéutica en el tumor sólido.

La figura 4 es una vista posterior de un sarcoma de tejido blando con una ilustración de un patrón preferido para aplicaciones múltiples de una monodosis de composición farmacéutica en el sarcoma de tejido blando.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona el uso de un vector adenovírico en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar el CPLA en un ser humano (p. ej., un paciente en necesidad de tal tratamiento). El procedimiento implica la administración de FNT-\alpha en un tumor, preferiblemente, directamente en el tumor, en combinación con quimioterapia y radioterapia, mediante lo que se reduce el tamaño del tumor. En particular, el procedimiento comprende administrar a un ser humano en necesidad de tratamiento una composición farmacéutica que comprende un vector adenovírico, preferiblemente, un vector adenovírico de replicación deficiente, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El procedimiento comprende además administrar una dosis de radiación ionizante y una dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos al ser humano. La administración de la secuencia codificante del FNT-\alpha humano, especialmente, en combinación con la administración de la radiación y la quimioterapia, ofrece una mejora de los tratamientos anteriormente descritos que usan proteína FNT soluble mediante la optimización del efecto local y la minimización de la toxicidad sistémica. De hecho, la invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que es posible reducir el tamaño tumoral sin producir una toxicidad relevante en el paciente. Además, se ha demostrado que el procedimiento de la invención reduce el tamaño de tumores que no respondieron al tratamiento con proteína FNT-\alpha. A continuación, se tratan diversos aspectos del procedimiento de la invención. Aunque se trata cada parámetro por separado, el procedimiento de la invención comprende combinaciones de los parámetros expuestos a continuación para tratar a un ser humano de cáncer. Por consiguiente, se puede usar cualquier combinación de parámetros según el procedimiento de la invención.

Vector adenovíríco

La invención comprende una composición farmacéutica para su administración a un ser humano, composición que comprende un vector adenovírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El adenovirus (Ad) es un virus de ADN bicatenario de 36 kb que transfiere eficazmente ADN in vivo a una variedad de diferentes tipos de células diana. El vector se puede producir en títulos elevados y puede transferir eficazmente ADN a células replicantes y no replicantes. Se puede usar cualquier subtipo, mezcla de subtipos o adenovirus quiméricos como fuente del genoma vírico para el vector adenovírico. Las reservas de adenovirus que se pueden emplear como fuente del adenovirus se pueden amplificar a partir de los serotipos adenovíricos 1 al 51, que se encuentran actualmente disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA), o de cualquier otro serotipo de adenovirus disponible de cualquier otro origen. Por ejemplo, un adenovirus puede ser un subgrupo A (p. ej., serotipos 12, 18 y 31), subgrupo B (p. ej., serotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50), subgrupo C (p. ej., serotipos 1, 2, 5 y 6), subgrupo D (p. ej., serotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39 y 42-48), subgrupo E (serotipo 4), subgrupo F (serotipos 40 y 41), un serogrupo sin clasificar (p. ej., serotipos 49 y 51) o cualquier otro serotipo de adenovirus. Preferiblemente, el vector adenovírico es del subgrupo C, especialmente, el serotipo 2 ó 5.

El vector adenovírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha está idealmente manipulado para limitar la replicación del vector dentro del tejido diana. Por ejemplo, el vector adenovírico de la composición farmacéutica puede ser un vector adenovírico condicionalmente replicante que esté diseñado genéticamente para que se replique en condiciones predeterminadas por el profesional. Por ejemplo, las funciones génicas esenciales para la replicación, p. ej., las funciones génicas codificadas por las regiones adenovíricas tempranas, pueden estar ligadas operativamente a una secuencia de control de la transcripción de un tejido específico represible e inducible, p. ej., un promotor. En esta realización, la replicación requiere la presencia o la ausencia de factores específicos que interactúen con la secuencia de control de la transcripción. La replicación del vector adenovírico puede estar limitada a un tejido diana, permitiendo así una mayor distribución del vector por el tejido mientras se aprovecha la capacidad natural del adenovirus para lisar células durante el ciclo de replicación, proporcionando así otro modo de destruir las células tumorales. Los vectores adenovíricos condicionalmente replicantes se describen además en la patente estadounidense n.º 5.998.205.

Preferiblemente, el vector adenovírico es de replicación deficiente. "Replicación deficiente" pretende significar que el vector adenovírico comprende un genoma adenovírico que carece al menos de una función génica esencial para la replicación (i. e., tal que el vector adenovírico no se replica en células huésped comunes, especialmente, en aquéllas del paciente humano que podrían ser infectadas por el vector adenovírico en el transcurso del tratamiento según la invención). Una deficiencia en un gen, en una función génica, o en una región génica o genómica, como se usa en la presente memoria, se define como una eliminación de suficiente material genético del genoma vírico como para impedir u obliterar la función del gen cuya secuencia de ácido nucleico fue eliminada en su totalidad o en parte. A menudo, no se requiere la eliminación de toda una región génica para ejercer un efecto en una función génica esencial para la replicación. Sin embargo, a efectos de proporcionar suficiente espacio en el genoma adenovírico para uno o más transgenes, puede ser deseable la eliminación de una mayoría de una región génica. Las funciones génicas esenciales para la replicación son aquellas funciones génicas que son necesarias para la replicación (p. ej., propagación) y que están codificadas por, por ejemplo, las regiones tempranas adenovíricas (p. ej., las regiones E1, E2 y E4), las regiones tardías (p. ej., las regiones L1-L5), los genes implicados en el empaquetamiento vírico (p. ej., el gen IVa2) y ARN asociados a virus (p. ej., VA-RNA1 y/o VA-RNA-2). Preferiblemente, el vector adenovírico de replicación deficiente comprende un genoma adenovírico deficiente en al menos una función génica esencial para la replicación de una o más regiones del genoma adenovírico (tales como eliminaciones dentro de o de la región E1 del genoma adenovírico), solo o en combinación con eliminaciones del genoma adenovírico que no vuelven al vector adenovírico en deficiente en cuanto a la replicación (tales como eliminaciones del genoma adenovírico dentro de o de la región E3, que no es esencial para la replicación adenovírica). Preferiblemente, el vector adenovírico es deficiente en al menos una función génica de la región E1 del genoma adenovírico necesaria para la replicación vírica (siendo denominado vector adenovírico deficiente en E1). Además de tal deficiencia en la región E1, el adenovirus recombinante también puede tener una mutación en el promotor tardío principal (PTP), según lo tratado en la solicitud de patente internacional WO 00/00628. Más preferiblemente, el vector es deficiente en al menos una función génica esencial para la replicación (deseablemente, en todas las funciones génicas esenciales para la replicación) de la región E1 y al menos parte de la región E3 no esencial (p. ej., una eliminación de Xba I de la región E3) (siendo denominado vector adenovírico deficiente en E1/E3). Con respecto a la región E1, el vector adenovírico puede ser deficiente en parte o en toda la región E1A y en parte o en toda la región E1B, p.ej., en al menos una función génica esencial para la replicación de cada una de las regiones E1A y E1B. Cuando es deficiente en E1, el genoma del vector adenovírico puede comprender una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 335 a 375 (p. ej., el nucleótido 356) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 3.310 a 3,350 (p. ej., en el nucleótido 3,329) o que acaba incluso en cualquier nucleótido entre 3.490 y 3.530 (p. ej., nucleótido 3.510) (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5). Cuando es deficiente en E2A, el genoma del vector adenovírico puede comprender una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 22.425 a 22.465 (p. ej., el nucleótido 22.443) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 24.010 a 24.050 (p. ej., nucleótido 24.032) (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5). Cuando es deficiente en E3, el genoma del vector adenovírico puede comprender una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 28.575 a 29.615 (p. ej., el nucleótido 28.594) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 30.450 a 30.490 (p. ej., nucleótido 30.469) (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5). Cuando el vector adenovírico es deficiente en al menos una función génica esencial para la replicación de una región del genoma adenovírico (p. ej., un vector adenovírico deficiente en E1 o en E1/E3), el vector adenovírico se denomina "de replicación individualmente deficiente".

Preferiblemente, el vector adenovírico es "múltiplemente deficiente", lo que significa que el vector adenovírico es deficiente en una o más funciones génicas necesarias para la replicación vírica en cada una de las dos o más regiones del genoma adenovírico. Por ejemplo, el vector adenovírico deficiente en E1 o deficiente en E1/E3 anteriormente mencionado puede ser además deficiente en al menos una función génica esencial para la replicación de la región E4 (siendo denominado vector adenovírico deficiente en E1/E4 o E1/E3/E4). Un vector adenovírico eliminado de toda la región E4 puede provocar una respuesta inmune del huésped más baja. Cuando es deficiente en E4, el genoma del vector adenovírico puede comprender una eliminación que comienza en, por ejemplo, cualquier nucleótido entre los nucleótidos 32.805 a 32.845 (p. ej., nucleótido 32.826) y que acaba en, por ejemplo, cualquier nucleótido entre los nucleótidos 35.540 a 35.580 (p. ej., nucleótido 35.561) (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5), opcionalmente, además de las eliminaciones en la región E1 (p. ej., nucleótidos 356 a 3.329 o nucleótidos 356 a 3.510) y/o las eliminaciones en la región E3 (p. ej., nucleótidos 28.594 a 30.469 o los nucleótidos 28.593 a 30.470).

Alternativamente, el vector adenovírico es deficiente en al menos una función génica de la región E1 y es deficiente en al menos una función génica de la región E2 (siendo denominado vector adenovírico deficiente en E1/E2A o en E1/E2A/E3). Si el vector adenovírico de la invención es deficiente en una función génica esencial para la replicación de la región E2A, el vector, preferiblemente, no comprende una eliminación completa de la región E2A, que es de una longitud de menos de aproximadamente 230 pares de bases. Generalmente, la región E2A del adenovirus codifica una DBP (proteína de unión a ADN), un polipéptido necesario para la replicación del ADN. La DBP está compuesta por de 473 a 529 aminoácidos en función del serotipo vírico. Se cree que la DBP es una proteína asimétrica que existe como un elipsoide prolato que consta de un dominio Ct globular con un dominio Nt ampliado. Los estudios indican que el dominio Ct es responsable de la capacidad de la DBP para unirse con los ácidos nucleicos, unirse al cinc y funcionar en la síntesis de ADN al nivel del alargamiento de la cadena de ADN. Sin embargo, se cree que el dominio Nt, que funciona en la expresión génica tardía tanto a niveles transcripcionales como post-transcripcionales, es responsable de la ubicación nuclear eficaz de la proteína y que también puede estar implicado en el aumento de su propia expresión. Las eliminaciones en el dominio Nt entre los aminoácidos 2 a 38 han indicado que esta región es importante para la función de la DBP (Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)). Mientras que las eliminaciones en la región E2A que codifica la región Ct de la DBP no tienen efecto en la replicación vírica, las eliminaciones en la región E2A que codifican los aminoácidos 2 a 38 del dominio Nt de la DBP impiden la replicación vírica. Es preferible que cualquier vector adenovírico de replicación múltiplemente deficiente contenga esta parte de la región E2A del genoma adenovírico. En particular, por ejemplo, la parte deseada de la región E2A por conservar es esa parte de la región E2A del genoma adenovírico que está definida por el extremo 5' de la región E2A, específicamente, las posiciones Ad5 (23816) a Ad5 (24032) de la región E2A del genoma del serotipo de adenovirus Ad5. Es deseable incluir esta parte del genoma adenovírico en el vector adenovírico, porque no está complementado en las líneas celulares E2A actuales para proporcionar el nivel deseado de propagación vírica.

En una realización particularmente preferida, el vector adenovírico comprende un genoma adenovírico deficiente en una o más funciones génicas esenciales para la replicación de cada una de las regiones E1 y E4 (i.e., el vector adenovírico es un vector adenovírico deficiente en E1/E4), preferiblemente, en el que toda la región codificante de la región E4 ha sido eliminada del genoma adenovírico. En otras palabras, se han eliminado todos los marcos de lectura abierta (ORF) de la región E4. La región E4 del vector adenovírico conserva, preferiblemente, el promotor E4 nativo, la secuencia de poliadenilación y/o la repetición terminal invertida (ITR) del lado derecho.

El vector adenovírico, cuando es de replicación múltiplemente deficiente, especialmente, en las funciones génicas esenciales para la replicación de las regiones E1 y E4, incluye preferiblemente un elemento espaciador para proporcionar crecimiento vírico en una línea celular de complementación similar a la alcanzada por vectores adenovíricos de replicación individualmente deficiente, particularmente, un vector adenovírico que comprende una deficiencia en la región E1. El elemento espaciador puede contener cualquier secuencia o secuencias que sean de una longitud deseada, tal como secuencias de al menos aproximadamente 15 pares de bases (p. ej., de entre aproximadamente 15 pares de bases y aproximadamente 12.000 pares de bases), preferiblemente, de aproximadamente 100 pares de bases a aproximadamente 10.000 pares de bases, más preferiblemente, de aproximadamente 500 pares de bases a aproximadamente 8.000 pares de bases, incluso más preferiblemente, de aproximadamente 1.500 pares de bases a aproximadamente 6.000 pares de bases, y lo más preferible, de aproximadamente 2.000 pares de bases a aproximadamente 3.000 pares de bases. La secuencia del elemento espaciador puede ser codificante o no codificante y nativa o no nativa con respecto al genoma adenovírico, pero no restablece la función esencial para la replicación a la región deficiente. En ausencia de un espaciador, se reduce la producción de la proteína de fibra y/o el crecimiento vírico del vector adenovírico de replicación múltiplemente deficiente en comparación con la de un vector adenovírico de replicación individualmente deficiente. Sin embargo, la inclusión del espaciador en al menos una de las regiones adenovíricas deficientes, preferiblemente, la región E4, puede contrarrestar esta disminución de la producción de proteína de fibra y de crecimiento vírico. En la patente estadounidense n.º 5.851.806, se describe el uso de un espaciador en un vector
adenovírico.

Lo deseable es que el vector adenovírico requiera, como máximo, la complementación de las funciones génicas esenciales para la replicación de las regiones E1, E2A y/o E4 del genoma adenovírico para la replicación (i.e., propagación). Sin embargo, se puede modificar el genoma adenovírico para afectar a una o más funciones génicas esenciales para la replicación según el deseo del profesional, siempre y cuando el vector adenovírico siga siendo deficiente y pueda ser propagado usando, por ejemplo, células de complementación y/o ADN exógeno (p. ej., adenovirus auxiliar) que codifiquen las funciones génicas esenciales para la replicación afectadas. A este respecto, el vector adenovírico puede ser deficiente en funciones génicas esenciales para la replicación sólo de las regiones tempranas del genoma adenovírico, sólo de las regiones tardías del genoma adenovírico y tanto de las regiones tempranas como de las tardías del genoma adenovírico. El vector adenovírico también puede tener esencialmente todo el genoma adenovírico eliminado, en cuyo caso es preferible dejar intactas al menos bien las repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas y uno o más promotores o las ITR víricas y una señal de empaquetamiento (i.e., un amplicón adenovírico). Cuanto mayor es la región del genoma adenovírico que es eliminada, mayor es la parte de la secuencia de ácido nucleico exógena que puede ser insertada en el genoma. Por ejemplo, dado que el genoma adenovírico es de 36 kb, dejando las ITR víricas y uno o más promotores intactos, la capacidad para el inserto exógeno del adenovirus es de aproximadamente 35 kb. Alternativamente, un vector adenovírico múltiplemente deficiente que contiene sólo una ITR y una señal de empaquetamiento permite la inserción eficaz de una secuencia de ácido nucleico exógena de aproximadamente 37-38 kb (en ese adenovirus se puede empaquetar ADN de hasta aproximadamente el 105% del tamaño del genoma adenovírico de tipo natural). Por supuesto, la inclusión de un elemento espaciador de cualquiera o de todas las regiones adenovíricas deficientes disminuirá la capacidad del vector adenovírico para albergar insertos grandes. En las patentes estadounidenses n.º 5.837.511, 5.851.806, 5.994.106 y 6.579.522, las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.º 2001/0043922 A1, 2002/0004040 A1, 2002/0031831 A1 y 2002/0110545 A1, y las aplicaciones de patente internacional WO 95/34671, WO 97/12986 y WO 97/21826, se revelan vectores adenovíricos de replicación deficiente adecuados, incluyendo vectores adenovíricos de replicación múltiplemente deficiente.

Un vector adenovírico particularmente preferido para su uso en el contexto de la invención contiene una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 335 a 375 (p. ej., nucleótido 356) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 3.310 a 3,350 (p. ej., nucleótido 3.329) y una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 28.575 a 29.615 (p. ej., nucleótido 28.594) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 30.450 a 30.490 (p. ej., nucleótido 30.469) (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5). Alternativamente, el genoma del vector adenovírico contiene preferiblemente una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 335 a 375 (p. ej., nucleótido 356) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 3.490 y 3.530 (p. ej., nucleótido 3.510), una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 28.575 y 29.615 (p. ej., nucleótido 28.593) y que acaba en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 30.450 y 30.490 (p. ej., nucleótido 30.470) y una eliminación que comienza en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 32.805 a 32.845 (p. ej., nucleótido 32.826) y que acaba en, por ejemplo, cualquier nucleótido entre los nucleótidos 35.540 a 35.580 (p. ej., nucleótido 35.561) (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5). Los puntos finales que definen las partes de nucleótidos eliminadas pueden dificultar la determinación exacta y, comúnmente, no afectarán significativamente a la naturaleza del vector adenovírico, i.e., cada uno de los números de nucleótido anteriormente mencionados puede ser +/- 1, 2, 3, 4, 5, 10 o incluso 20 nucleótidos. Un vector adenovírico especialmente preferido para su uso en el procedimiento de la invención es aquél descrito en la patente estadounidense n.º 6.579.522 y la solicitud de patente internacional WO 02/00906. El vector adenovírico, por ejemplo, puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1, i.e., el genoma adenovírico del vector adenovírico, por ejemplo, puede ser la parte adenovírica del vector adenovírico que codifica el FNT-\alpha humano, cuya secuencia de nucleótidos se expone en la SEC ID N.º 1.

Lo ideal es que la composición farmacéutica esté casi libre de contaminación de adenovirus competente en la replicación (RCA) (p. ej., la composición farmacéutica comprende menos del aproximadamente 1% de contaminación por RCA). Lo más deseable es que la composición farmacéutica esté libre de RCA. Las composiciones y las reservas de vectores adenovíricos que están libres de RCA se describen en las patentes estadounidenses 5.944.106 y 6.482.616, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2002/0110545 A1 y la solicitud de patente internacional WO 95/34671. Lo ideal es que la composición farmacéutica también esté libre de revertientes de E1 cuando el vector adenovírico sea deficiente en E1 en combinación con deficiencias en otras funciones génicas esenciales para la replicación de otra región del genoma adenovírico, como se describe también en la solicitud de patente internacional WO 03/040314.

Además de la modificación (p. ej., la eliminación, mutación o sustitución) de las secuencias adenovíricas que codifican funciones génicas esenciales para la replicación, el genoma adenovírico puede contener modificaciones benignas o no letales, i.e., modificaciones que no convierten al adenovirus en uno de replicación deficiente o, deseablemente, no afectan negativamente al funcionamiento vírico ni/o a la producción de proteínas víricas, incluso si tales modificaciones están en regiones del genoma adenovírico que de otro modo contienen funciones génicas esenciales para la replicación. Tales modificaciones resultan comúnmente de la manipulación del ADN o sirven para facilitar la construcción de vectores de expresión. Por ejemplo, puede ser ventajoso eliminar o introducir sitios de enzimas de restricción en el genoma adenovírico. Tales mutaciones benignas a menudo no tienen efectos negativos detectables en el funcionamiento vírico. Por ejemplo, el vector adenovírico puede comprender una eliminación de los nucleótidos 10.594 y 10.595 (en base al genoma del serotipo de adenovirus 5) que están asociados a la transcripción de VA-1, pero cuya eliminación no prohíbe la producción de VA-1.

En el vector adenovírico deficiente en E1/E4 preferido para su uso en el procedimiento de la invención, se conserva la región de la fibra L5 y hay un espaciador ubicado entre la región de la fibra L5 y la ITR del lado derecho. Más preferiblemente, en tal vector adenovírico, la secuencia de poliadenilación de E4 sola o, lo más preferiblemente, en combinación con otra secuencia, existe entre la región de la fibra L5 y la ITR del lado derecho, para separar suficientemente la región de la fibra L5 conservada de la ITR del lado derecho, tal que la producción vírica de tal vector se acerque a la de un vector adenovírico de replicación individualmente deficiente, particularmente, un vector adenovírico deficiente en E1.

El elemento espaciador insertado en el genoma adenovírico puede contener un casete de expresión variable de un promotor, que puede incluir cualquier promotor (celular o vírico), secuencia de ácido nucleico foránea y/o secuencia de poliadenilación. Preferiblemente, en el caso de un elemento espaciador insertado en la región E4 (secuencias codificantes para las que se han eliminado), tanto la secuencia de poliadenilación de E4 como el promotor E4 permanecen en el vector. En tal realización, el elemento espaciador está ubicado entre el sitio de poliadenilación de E4 y el promotor E4 o, si el promotor E4 no está presente en el vector, el elemento espaciador está próximo a la ITR del lado derecho (3').

El elemento espaciador puede comprender cualquier secuencia de poliadenilación adecuada. Los ejemplos de secuencias de poliadenilación adecuadas incluyen secuencias optimizadas sintéticas, así como las secuencias de poliadenilación de la BGH (hormona del crecimiento bovino), virus del polioma, TK (timidina-quinasa), EBV (virus de Epstein Barr) y el papilomavirus, incluyendo el papilomavirus humano y el BPV (virus del papiloma bovino). Preferiblemente, el elemento espaciador incluye una secuencia de poliadenilación del SV40 (Virus del sarcoma humano 40). La secuencia de poliadenilación del SV40 permite niveles mayores de producción vírica de vectores adenovíricos múltiplemente deficientes. Si el elemento espaciador comprende toda o parte de una secuencia codificante y no se desea la producción de un producto génico, el elemento espaciador puede estar flanqueado por secuencias de poliadenilación.

También puede funcionar como elemento espaciador una secuencia codificante foránea en la región deficiente en E4 del genoma adenovírico. La secuencia codificante foránea sólo está limitada por el tamaño del inserto que el vector puede albergar y puede ser cualquier secuencia codificante adecuada. Los ejemplos de secuencias codificantes foráneas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, secuencias codificantes que codifican proteínas marcadoras tales como pGUS, fosfatasa alcalina secretora, luciferasa, \beta-galactosidasa y anti-tripsina humana; factores terapéuticos; posibles modificadores inmunes tales como B3-19K, E3-14.7, ICP47, ligando fas y CTLA4; secuencias biológicamente inactivas (p. ej., secuencias que (i) no están transcritas para generar un producto o (ii) que codifican un producto defectuoso o biológicamente inactivo) y otras secuencias inocuas tales como el gen de la glucuronidasa.

Debería tenerse en cuenta que la eliminación de diferentes regiones del vector adenovírico puede modificar la respuesta inmune del mamífero. En particular, la eliminación de diferentes regiones puede reducir la respuesta inflamatoria generada por el vector adenovírico. Además, es posible modificar la cubierta proteínica del vector adenovírico para disminuir la capacidad o la incapacidad del vector adenovírico para ser reconocido por un anticuerpo neutralizante dirigido frente a la cubierta proteínica de tipo natural, según lo descrito en la solicitud de patente internacional WO 98/40509.

De manera similar, es posible manipular la cubierta proteínica del vector adenovírico para modificar la especificidad de unión o el reconocimiento del vector adenovírico por un receptor vírico en una posible célula huésped. Tales manipulaciones pueden incluir la eliminación de regiones de la fibra, pentón, hexón, pilla, pVI y/o pIX, inserciones de diversos ligandos nativos o no nativos en partes de la cubierta proteínica, y similares. La manipulación de la cubierta proteínica puede ampliar la selección de células infectadas por el vector adenovírico y permitir la dirección del vector adenovírico hacia un tipo específico de célula.

Por ejemplo, en una realización, el vector adenovírico comprende una cubierta proteínica quimérica (p. ej., una proteína de fibra, hexón, pIX, pIIIa o pentón) que difiere de la cubierta proteínica de tipo natural (i.e., nativa) en la introducción de una secuencia de aminoácidos no nativa, preferiblemente, en o cerca del terminal carboxilo. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos no nativa está insertada en o en lugar de una secuencia interna de la cubierta proteínica. La secuencia de aminoácidos no nativa puede estar insertada en la secuencia interna de la cubierta proteínica o en el extremo de la secuencia interna de la cubierta proteínica. La cubierta proteínica vírica quimérica resultante es capaz de dirigir la entrada a células del vector adenovírico que comprende la cubierta proteínica que es más eficaz que la entrada a células de un vector adenovírico que es idéntico a excepción de que comprende una cubierta proteínica vírica de tipo natural en lugar de la cubierta proteínica vírica quimérica. Preferiblemente, la cubierta proteínica quimérica se une a un nuevo sitio de unión endógeno presente en la superficie celular que no es reconocido, o es escasamente reconocido, por un vector adenovírico que comprende una cubierta proteínica de tipo natural. Un resultado directo de este aumento de la eficacia de entrada es que el vector adenovírico puede unirse a y entrar en tipos de células en los que un adenovirus que comprende una cubierta proteínica de tipo natural comúnmente no puede entrar o en los que puede entrar sólo con una eficacia baja. Si se desea, se puede eliminar la unión nativa del las cubiertas proteínicas adenovíricas, p. ej., la fibra o la base del pentón.

En otra realización, el vector adenovírico comprende una cubierta proteínica vírica quimérica no selectiva de un tipo específico de célula eucariota. La cubierta proteínica quimérica difiere de la cubierta proteínica de tipo natural en una inserción de una secuencia de aminoácidos no nativa en o en lugar de una secuencia interna de la cubierta proteínica. Por ejemplo, un ligando que comprende aproximadamente de cinco a aproximadamente nueve residuos de lisina (preferiblemente, siete residuos de lisina) está unido al terminal C de la proteína de fibra adenovírica por una secuencia espaciadora no codificante. En esta realización, la cubierta proteínica vírica quimérica se une eficazmente a una selección más amplia de células eucariotas que la cubierta vírica de tipo natural, tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 97/20051. Tales vectores adenovíricos son particularmente preferidos cuando un tumor no comprende una población homogénea de células cancerosas.

La especificidad de unión del vector adenovírico con una célula dada también se puede ajustar por el uso de un adenovirus que comprenda un gen de fibra adenovírica de eje corto, según lo tratado en la patente estadounidense n.º 5.962.311. El uso de un adenovirus que comprende un gen de fibra adenovírica de eje corto reduce el nivel o la eficacia de la unión de la fibra adenovírica con su receptor de la superficie celular y aumenta la unión de la base del pentón adenovírico con su receptor de la superficie celular, aumentado de ese modo la especificidad de unión del vector adenovírico con una célula dada. Alternativamente, el uso de un adenovirus que comprende una fibra de eje corto permite dirigir el adenovirus a un receptor de la superficie celular deseado mediante la introducción de una secuencia de aminoácidos no nativa bien en la base del pentón o en la perilla de la fibra.

Por supuesto, la capacidad de un vector adenovírico para reconocer una posible célula huésped se puede modular sin la manipulación genética de la cubierta proteínica, i. e., a través del uso de una molécula biespecífica. Por ejemplo, la formación de un complejo de un adenovirus con una molécula biespecífica que comprende un dominio de unión con la base del pentón y un dominio que se une selectivamente a un determinado sitio de unión de la superficie celular permite la dirección del vector adenovírico a un determinado tipo de célula.

En las patentes estadounidenses 5.543.328, 5.559.099, 5.712.136, 5.731.190, 5.756.086, 5.770.442, 5.846.782, 5.871.727, 5.885.808, 5.922.315, 5.962.311, 5.965.541, 6.057.155, 6.127.525, 6.153.435, 6.329.190, 6.455.314 y 6.465.253, la publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.º 2001/0047081 A1, 2002/0099024 A1 y
2002/0151027 A1, y las solicitudes de patente internacional WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/07734, WO 96/22378, WO 96/26281, WO 97/20051, WO 98/07865, WO 98/07877, WO 98/40509, WO 98/54346, WO 00/15823, WO 01/58940 y WO 01/92549, se describen modificaciones adecuadas de un vector adenovírico. La construcción y la propagación de vectores adenovíricos son bien conocidas en la técnica. Además, hay numerosos vectores adenovíricos disponibles comercialmente.

Los vectores adenovíricos de replicación deficiente se producen comúnmente en líneas celulares de complementación que proporcionan funciones génicas que no están presentes en los vectores adenovíricos de replicación deficiente, pero que son necesarias para la propagación vírica, a niveles apropiados con el fin de generar títulos elevados de reserva de vectores víricos. Una línea celular preferida complementa al menos una y, preferiblemente, todas las funciones génicas esenciales para la replicación que no están presentes en un adenovirus de replicación deficiente. La línea celular de complementación puede complementar una deficiencia en al menos una función génica esencial para la replicación codificada por las regiones tempranas, las regiones tardías, las regiones de empaquetamiento vírico, las regiones de ARN asociadas a un virus, o combinaciones de las mismas, incluyendo todas las funciones adenovíricas (p. ej., para permitir la propagación de amplicones adenovíricos). Lo más preferible es que la línea celular de complementación complemente una deficiencia en al menos una función génica esencial para la replicación (p. ej., dos o más funciones génicas esenciales para la replicación) de la región E1 del genoma adenovírico, particularmente, una deficiencia en una función génica esencial para la replicación de cada una de las regiones E1A y E1B. Además, la línea celular de complementación puede complementar una deficiencia en al menos una función génica esencial para la replicación de la región E2 (particularmente, en lo que se refiere a la ADN polimerasa adenovírica y la proteína terminal) y/o la región E4 del genoma adenovírico. Lo deseable es que una célula que complemente una deficiencia en la región E4 comprenda la secuencia génica ORF6 de E4 y produzca la proteína ORF6 de E4. Tal célula comprende deseablemente al menos el ORF6 y ningún otro ORF de la región E4 del genoma adenovírico. La línea celular, preferiblemente, se caracteriza además por contener los genes de complementación de una manera no solapante con el vector adenovírico, lo que minimiza, y prácticamente elimina, la posibilidad de que el genoma del vector se recombine con el ADN celular. Por consiguiente, la presencia de adenovirus competentes en la replicación (RCA) es minimizada si no evitada en la reserva de vectores, lo que por tanto es adecuado a ciertos efectos terapéuticos, especialmente, a efectos de terapia génica. La carencia de RCA en la reserva de vectores evita la replicación del vector adenovírico en células de no complementación. La construcción de tales líneas celulares de complementación implica la Biología Molecular y las técnicas de cultivo celular estándar, tales como aquéllas descritas por Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", II edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) y Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y. (1994).

Las líneas celulares de complementación para producir el vector adenovírico incluyen, pero no se limitan a, células 293 (descritas en, p. ej., Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 (1977)), células PER.C6 (descritas en p. ej., la solicitud de patente internacional WO 97/00326 y las patentes estadounidenses 5.994.128 y 6.033.908) y células 293-ORF6 (descritas en, p. ej., solicitud de patente internacional WO 95/34671 y Brough et al., J. Virol., 71, 9206-9213 (1997)). En algunos ejemplos, la célula de complementación no complementará todas las funciones génicas adenovíricas necesarias. Se pueden emplear virus auxiliares para proporcionar las funciones génicas en trans que no estén codificadas por los genomas celulares o adenovíricos para permitir la replicación del vector adenovírico. Se pueden construir vectores adenovíricos, propagarlos y/o purificarlos usando los materiales y los procedimientos expuestos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.965.358, 5.994.128, 6.033.908, 6.168.941, 6.329.200, 6.383.795, 6.440.728, 6.447.995 y 6.475.757, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2002/0034735 A1 y las solicitudes de patente internacional WO 98/53087, WO 98/56937, WO 99/15686, WO 99/54441, WO 00/12765, WO 01/77304 y WO 02/29388, así como otras referencias identificadas en la presente memoria.

Secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT

El vector adenovírico, preferiblemente, el vector adenovírico de replicación deficiente, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha, preferiblemente, un FNT-\alpha humano. Mientras que otros miembros de la familia de proteínas de los FNT, tales como el ligando Fas y el ligando CD40, tienen utilidad en el tratamiento de una serie de enfermedades, se ha demostrado que el FNT-\alpha es un eficaz agente anticancerígeno. El efecto del FNT-\alpha sobre el cáncer es multifactorial, incluyendo la inducción de la apoptosis y la necrosis tumoral. Los efectos sistémicos indirectos del FNT-\alpha incluyen la activación de células efectoras inmunes que incluyen la inducción de la secreción de citocina y la activación del sistema de coagulación vascular. El FNT-\alpha induce la adherencia del endotelio vascular a neutrófilos y plaquetas, y disminuye la producción de trombomodulina (Koga et al., Am. J. Physio, 268, 1104-1113 (1995)). El resultado es la formación de coágulos en la neovasculatura tumoral y la posterior necrosis hemorrágica de los tumores. En la patente estadounidense n.º 4.879.226, se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano.

Aunque es preferible que la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano sea la expuesta en la patente estadounidense n.º 4.879.226, cuya secuencia de nucleótidos está expuesta en la SEC ID N.º 2, hay muchas modificaciones y variaciones de la secuencia de ácido nucleico que son posibles y apropiadas en el contexto de la invención. Por ejemplo, la degeneración del código genético permite la sustitución de nucleótidos por las regiones codificantes del polipéptido, así como en la señal de terminación de la traducción, sin la modificación del polipéptido codificado. Es posible deducir tales secuencias sustituibles de la secuencia de aminoácidos conocida de un FNT-\alpha humano o una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano (tal como la secuencia revelada en la patente estadounidense n.º 4.879.226) y es posible construirlas mediante procedimientos sintéticos convencionales o de mutagénesis de sitio específico. Se pueden llevar a cabo procedimientos sintéticos de ADN sustancialmente según los procedimientos de Itakura et al., Science, 198, 1056-1063 (1977) y Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 75, 5765-5769 (1978). En Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor", NY (II ed. 1989), se describen procedimientos de mutagénesis de sitio específico.

Además, en el vector adenovírico (p. ej., un vector adenovírico de replicación deficiente), se puede incorporar una secuencia de ácido nucleico que codifique un homólogo de un FNT-\alpha humano, i. e., cualquier proteína que sea más del aproximadamente 70% idéntica (preferiblemente, más del aproximadamente 80% idéntica, más preferiblemente, más del aproximadamente 90% idéntica y, lo más preferible, más del aproximadamente 95% idéntica) a la proteína en el nivel de aminoácidos y que presente el mismo nivel de actividad anticancerígena de un FNT-\alpha humano. El grado de identidad entre los aminoácidos se puede determinar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como la base de datos de secuencias BLAST. Además, un homólogo de la proteína puede ser cualquier péptido, polipéptido o parte del mismo que se hibride con la proteína en condiciones restrictivas que sean al menos moderadas, preferiblemente, elevadas, y que conserve la actividad anticancerígena. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas incluye la incubación durante toda una noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguida por un lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC, o condiciones sustancialmente similares, p. ej., las condiciones moderadamente restrictivas descritas en Sambrook et al., supra. Las condiciones muy restrictivas son condiciones que usan, por ejemplo, (1) una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para lavar, tal como, cloruro de sodio 0,015 mM/citrato de sodio 0,0015 mM/dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino (ASB) al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona (PVP) al 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75M, citrato de sodio 0,075M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a tratamiento con ultrasonidos (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC con lavados a (i) 42ºC en 0,2 x SSC (ii) a 55ºC en formamida al 50% e (iii) a 55ºC en 0.1 x SSC (preferiblemente, en combinación con EDTA). En, p. ej., Ausubel et al., supra, se proporcionan más información y una explicación de las condiciones restrictivas de las reacciones de hibridación.

La secuencia de ácido nucleico puede codificar una parte funcional de un FNT-\alpha humano, i.e., cualquier parte de la proteína que conserve la actividad biológica de la proteína de longitud completa natural a niveles medibles. Es posible identificar un fragmento funcional del FNT-\alpha producido por la expresión de la secuencia de ácido nucleico del vector adenovírico, preferiblemente, del vector adenovírico de replicación deficiente, usando Biología Molecular y técnicas de cultivo celular estándar, tales como analizar la actividad biológica del fragmento en células humanas transfectadas transitoriamente con una secuencia de ácido nucleico que codifique el fragmento de proteína.

Alternativamente, se puede manipular la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano para modificar (preferiblemente, aumentar) la actividad del FNT-\alpha. Se puede manipular la secuencia de ácido nucleico para aumentar la secreción de la proteína FNT-\alpha o se puede manipular para codificar una proteína FNT-\alpha que permanezca unida a la superficie celular. Se puede manipular la secuencia de ácido nucleico para aumentar la estabilidad de la proteína FNT-\alpha (p. ej., conservar una configuración tridimensional apropiada bajo condiciones adversas) o aumentar la potencia de la proteína FNT-\alpha para la activación del receptor de FNT. Como tal, la invención no se limita específicamente a esa secuencia de ácido nucleico de la patente estadounidense n.º 4.879.226, contemplándose en la presente memoria modificaciones de la secuencia de ácido nucleico.

Lo deseable es que la secuencia de ácido nucleico esté presente como parte de un casete de expresión, i. e., una determinada secuencia de bases que posea funciones que faciliten la subclonación y la recuperación de una secuencia de ácido nucleico (p. ej., uno o más sitios de restricción) o la expresión de una secuencia de ácido nucleico (p. ej., sitios de poliadenilación o sitios de corte y empalme). La secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano se ubica preferiblemente en la región E1 (p. ej., sustituye a la región E1 en parte o en su totalidad) del genoma adenovírico. Por ejemplo, la región E1 puede estar reemplazada por un casete de expresión variable de un promotor que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique un FNT-\alpha humano, según lo mostrado, por ejemplo, en las Figuras 1 y 2, que representan un genoma de vector adenovírico sin modificar y modificado, respectivamente. La región E1 (10) puede estar reemplazada por un casete de expresión (13) que comprenda un promotor inducible mediante radiación (14), una secuencia de ácido nucleico que codifique un FNT-\alpha (15) y una secuencia de poliadenilación (16). El casete de expresión está insertado, preferiblemente, en un sentido de 5'-3', p. ej., orientado de modo que la dirección de la transcripción del casete de expresión sea la misma que la del genoma adenovírico de alrededor. Además del casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano, el vector adenovírico puede comprender otros casetes de expresión que contengan secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen otros productos, cuyos casetes pueden reemplazar cualquiera de las regiones eliminadas del genoma adenovírico. La inserción de un casete de expresión en el genoma adenovírico (p. ej., la región E1 del genoma) puede ser facilitada por procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante la introducción de un sitio de restricción único en una posición dada del genoma adenovírico. Según lo expuesto anteriormente, preferiblemente, la región E3 del vector adenovírico (11) está eliminada (17) y la región E4 (12) está reemplazada por un elemento espaciador (18).

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano comprende además una región de terminación de la transcripción, tal como una secuencia de poliadenilación ubicada en 3' de la secuencia que codifica el FNT-\alpha (en el sentido de la transcripción de la secuencia codificante). Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación adecuada, incluyendo una secuencia optimizada sintética, así como la secuencia de poliadenilación de la BGH (hormona del crecimiento bovino), virus del polioma, TK (timidina-quinasa), EBV (virus de Epstein Barr) y el papilomavirus, incluyendo el papilomavirus humano y el BPV (virus del papiloma bovino). Una secuencia de poliadenilación preferida es la secuencia de poliadenilación del SV40 (Virus del sarcoma humano 40).

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano está ligada operativamente (i.e., bajo el control transcripcional de) uno o más elementos promotores y/o potenciadores, por ejemplo, como parte de un casete de expresión variable de un promotor. Las técnicas para ligar operativamente secuencias entre sí son conocidas en la materia. Los promotores víricos incluyen, por ejemplo, promotores del citomegalovirus (CMV), tales como el promotor temprano inmediato del CMV (descrito en, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.168.062), promotores derivados del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tales como el promotor de la repetición terminal larga del VIH, promotores del virus del sarcoma de Rous (VSR), tales como el promotor de la repetición terminal larga del VSR y el promotor del virus del tumor mamario murino (MMTV), promotores del HSV, tales como el promotor Lap2 o el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 144-145 (1981)), promotores derivados del SV40 o del virus de Epstein Barr, un promotor vírico adeno-asociado, tal como el promotor p5, y similares. Las secuencias reguladoras a las que la secuencia de ácido nucleico está ligada operativamente también pueden comprender un promotor de un tejido específico, i.e., un promotor que sea activado de forma preferente en un tejido dado y dé como resultado la generación de un producto génico, particularmente, del FNT-\alpha, en el tejido en el que sea activado. Por ejemplo, las secuencias reguladoras activas selectivamente en, por ejemplo, células endoteliales o células estromales son ideales para expresar una secuencia de ácido nucleico exógena en el medio de las células cancerosas.

Muchos de los promotores descritos anteriormente son promotores constitutivos. En lugar de ser un promotor constitutivo, el promotor puede ser un promotor inducible, i. e., un promotor que sea sobre- y/o infra-regulado como respuesta a una señal apropiada. Por ejemplo, una secuencia de control de la expresión sobre-regulada por un agente quimioterapéutico es particularmente útil en las aplicaciones en el cáncer (p. ej., un promotor quimio-inducible). Además, es posible sobre-regular una secuencia de control de la expresión mediante una fuente de radiación de energía o mediante una sustancia que afecte a las células. Por ejemplo, es posible sobre-regular una secuencia de control de la expresión mediante ultrasonidos, compuestos activados por luz, radiofrecuencia, quimioterapia y criocongelación. El vector adenovírico según la invención comprende un promotor inducible por radiación ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano. El uso de un promotor inducible por radiación permite el control localizado de la producción de FNT-\alpha, por ejemplo, mediante la administración de radiación a una célula o un huésped que comprenda el vector adenovírico, minimizando así la toxicidad sistémica. Se puede usar cualquier promotor inducible por radiación en el contexto de la invención. Un promotor inducible por radiación preferido para su uso en el contexto de la invención es el promotor de la región de crecimiento temprana 1 (EGR-1), específicamente, el dominio CArG del promotor EGR-1. La región del promotor EGR-1 probablemente responsable de la expresión inducible mediante radiación se ubica entre los nucleótidos de 550 pb y 50 pb. El promotor EGR-1 se describe detalladamente en la patente estadounidense n.º 5.206.152 y en la solicitud de patente internacional WO 94/06916 y en la patente estadounidense n.º 6.605.712. Otro promotor inducible por radiación adecuado es el promotor c-Jun, que se activa mediante radiación X. Se cree que la región del promotor c-Jun probablemente responsable de la expresión inducible mediante radiación se ubica entre los nucleótidos de 1,1 kb a 740 pb. El promotor c-Jun y el promotor EGR-1 también se describen en, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.770.581. Se puede introducir el promotor en el genoma adenovírico mediante cualquier procedimiento adecuado, tal como mediante el uso de un sitio de restricción único en una región dada del genoma adenovírico. Alternativamente, es posible insertar el promotor como parte del casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha
humano.

Otras consideraciones acerca del vector adenovírico

El vector adenovírico descrito puede comprender secuencias de ácidos nucleicos distintas de la que codifica un FNT-\alpha humano, p. ej., una secuencia de ácido nucleico para tratar otras enfermedades y/o dolencias similares o diferentes que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades pulmonares crónicas, tales como enfisema, asma, síndrome de dificultad respiratoria del adulto y bronquitis crónica, así como la enfermedad coronaria, complicaciones comunes asociadas con el cáncer y otras dolencias tratadas o prevenidas adecuadamente mediante terapia génica, vacunación, y similares. Si la secuencia de ácido nucleico adicional (i.e., el transgén) confiere un beneficio profiláctico o terapéutico, la secuencia de ácido nucleico puede ejercer su efecto a nivel proteico o del ARN. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico adicional puede codificar una molécula antisentido, una ribozima, una proteína que afecte al corte y empalme o al procesamiento en 3' (p.ej., poliadenilación) o una proteína que afecte al nivel de expresión de otro gen de la célula (i.e., considerándose, en líneas generales, que la expresión génica incluye todas la etapas desde el inicio de la transcripción a la producción de una proteína procesada), tal como mediante la mediación de una velocidad alterada de acumulación o transporte de ARNm o una alteración de la regulación post-transcripcional. La secuencia de ácido nucleico adicional puede codificar una proteína quimérica para una terapia de combinación. La secuencia de ácido nucleico adicional también puede codificar un factor que actúe sobre una diana diferente de un FNT-\alpha, proporcionando así un tratamiento multifactorial del cáncer. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico adicional puede codificar un factor que aumente el efecto del FNT-\alpha. Un ejemplo de tal factor es la PKR, la proteína quinasa dependiente de ARN bicatenario, que convierte las células cancerosas en más propensas a la apoptosis (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.976.800).

El vector adenovírico puede comprender una secuencia de ácido nucleico adicional que codifique una sustancia anti-angioagénica distinta del FNT-\alpha. Una sustancia anti-angiogénica es cualquier factor biológico que previene o mejora la neovascularización. La sustancia anti- angiogénica puede ejercer una prevención y una mejoría parcial o total de la angiogénesis para conseguir un efecto terapéutico. Una sustancia anti-angiogénica incluye, por ejemplo, un factor anti-angiogénico, una molécula antisentido específica de un factor angiogénico, una ribozima, un receptor de un factor angiogénico y un anticuerpo que se una a un receptor de un factor angiogénico. Para prevenir la fuga vascular hacia el tejido circundante, que puede conducir a una propagación del tumor, el vector adenovírico puede comprender una secuencia de ácido nucleico adicional que codifique un factor de maduración de los vasos, tal como, por ejemplo, una angiopoyetina (Ang, p. ej., Ang-1 y Ang-2), midquina (MK), COUP-TFII y factor neurotrópico de unión a la heparina (HBNF, también conocido como factor de crecimiento de unión a la heparina). También se puede incorporar al vector adenovírico una secuencia de ácido nucleico que codifique un inmunosupresor para reducir cualquier respuesta inmune inapropiada hacia el mismo como resultado de la administración del vector adenovírico a un huésped.

El vector adenovírico puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifique una citocina, tal como un interferón (INF \alpha, \beta, y), un factor estimulante de colonias o una interleucina (IL-1, IL-2, IL-3, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, etc). La secuencia de ácido nucleico adicional puede codificar una enzima conversora de pro-fármacos, tal como la timidina-quinasa del HSV (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 01/24684). La secuencia de ácido nucleico adicional codifica, preferiblemente, una proteína que es perjudicial para las células cancerosas de un mamífero (i.e., "una proteína perjudicial"). Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas que son perjudiciales para las células cancerosas son conocidas en la técnica, incluyendo los ejemplos se las mismas secuencias de ácidos nucleicos que codifican p53, Fas, ligando Fas (FasL), FasLM45 (un derivado del FasL que tiene una eliminación en el sitio de escisión de la proteasa), proteína en asociación con Fas con el dominio de muerte (FADD; también conocida como mediador de la toxicidad inducida por un receptor (MORT-1)), una secuencia codificante inductora de la muerte celular de Bcl-2 que comprende una eliminación N-terminal, una secuencia codificante inductora de la muerte celular de Bcl-x que comprende una eliminación N-terminal, caspasas (p. ej., caspasa 1 (enzima conversora de la interleucina 1\beta (ICE)), caspasa 3, caspasa 8 (MACH/FLICE (proteasa de tipo CED3 de la ICE homóloga a FADD)/Mch5) y caspasa 10 (Mch4)), proteína de interacción con un receptor (RIP), muerte celular anómala (CED4), Apaf-1, proteína homóloga a ICH-1/CED-3 asociada a una RIP con un dominio de muerte (RAIDD)/caspasa y adaptador de RIP con dominio de muerte (CRADD), inhibidor de NF-\kappaB (I\kappaB), factor de fragmentación de ADN (DFF), FNT-R1, ligando inductor de la apoptosis relacionado con un FNT (TRAIL; ligando apo2 (Apo2L)), receptor de muerte 4 (DR4), DR5, bax, bak, bid, bad, bik, bif-2, c-myc, JUN, un producto JUN negativo dominante, una proteasa, una proteína quinasa, un activador transcripcional, una proteína de transducción de señales, una proteína quinasa C, quinasa PITSLRE, quinasa DAP, quinasa N-terminal JUN (JNK)/SAPK, Daxx, ras, Raf, NIK, MEKK1, ASK1, proteína quinasa R (PKR), Rb194, un producto E1A adenovírico, un producto E2F adenovírico, una forma sintética independiente del ciclo celular de un producto E2F adenovírico, un producto E4/ORF4 adenovírico, apotina, una parte activa apoptótica de cualquiera de los anteriores y una combinación de dos o más de los anteriores.

La secuencia de ácido nucleico adicional puede codificar una proteína marcadora, tal como la proteína verde fluorescente o la luciferasa. Tales proteínas marcadoras son útiles en la construcción de vectores y en la determinación de la migración de los vectores. Las proteínas marcadoras también se pueden usar para determinar los puntos de inyección con el fin de espaciar eficazmente las inyecciones de la composición farmacéutica para proporcionar una zona extendida de tratamiento. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede codificar un factor de selección (p. ej., un factor de resistencia a un antibiótico) que también sea útil en los protocolos de construcción de vectores. Si se desea, la o las secuencias de ácido nucleico adicionales pueden formar parte de uno o varios casetes de expresión.

Cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria puede ser modificada de su forma nativa para aumentar su efecto terapéutico. Por ejemplo, una forma citoplasmática de un producto génico terapéutico se puede convertir en una forma secretada mediante la incorporación de un péptido señal en el producto génico codificado. También se puede diseñar genéticamente un producto génico para que sea absorbido por las células circundantes mediante fusión del péptido con VP22.

Composición farmacéutica

La composición farmacéutica de la invención comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y el vector adenovírico (p. ej., un vector adenovírico de replicación deficiente) que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica FNT-\alpha. Se puede usar cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en el contexto de la invención, y tales vehículos son conocidos en la técnica. La elección del vehículo estará determinada, en parte, por el sitio concreto en el que se vaya a administrar la composición farmacéutica y el procedimiento concreto usado para administrar la composición farmacéutica.

Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que convierten la formulación en isotónica con la sangre u otro fluido corporal del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, disolventes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un líquido que contiene un tampón y una sal. Las formulaciones se pueden presentar en envases cerrados herméticamente de una monodosis o de múltiples dosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado de crio-congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, de agua, inmediatamente antes de su uso. Cuando se presenta la formulación en un vial, el vial puede estar fabricado de cualquier material adecuado para contener una composición farmacéutica. Lo deseable es que el vial esté fabricado de vidrio o de plástico. Preferiblemente, el vial es un vial de vidrio. Los viales de vidrio están fabricados, comúnmente, de vidrio claro o vidrio tintado (p. ej., verde, azul o ámbar) para proteger de la degradación a la composición farmacéutica sensible a la luz contenida en el mismo. Se pueden preparar soluciones y suspensiones extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución salina tamponada.

Más preferiblemente, la composición farmacéutica está formulada para proteger al vector adenovírico de ser dañado antes de su administración. Lo deseable es que la formulación en particular disminuya la sensibilidad a la luz y/o la sensibilidad a la temperatura del vector adenovírico. De hecho, la composición farmacéutica se mantendrá durante diversos períodos de tiempo y, por tanto, debería formularse para garantizar la estabilidad y la actividad máxima en el momento de su administración. Comúnmente, la composición farmacéutica se mantiene a una temperatura mayor de 0ºC, preferiblemente, a 4ºC o más (p. ej., 4-10ºC). En algunas realizaciones, es deseable mantener la composición farmacéutica a una temperatura de 10ºC o más (p. ej., 10-20ºC), 20ºC o más (p. ej., 20-25ºC) o incluso a 30ºC o más (p. ej., 30-40ºC). La composición farmacéutica se puede mantener a la o las temperaturas anteriormente mencionadas durante al menos 1 día (p. ej., 7 días (1 semana) o más), aunque lo más común es que el período de tiempo sea más largo, tal como de al menos 3, 4, 5 ó 6 semanas, o incluso mayor, tal como de al menos 10, 11 ó 12 semanas, antes de la administración a un paciente. Durante ese período de tiempo, el vector adenovírico de transferencia de genes óptimamente no pierde, o sustancialmente no pierde, actividad, aunque se acepta alguna pérdida de actividad, especialmente, con temperaturas de almacenamiento relativamente más elevadas y/o tiempos de almacenamiento relativamente mayores. Lo deseable es que la actividad de la composición de vector adenovírico disminuya aproximadamente un 50% o menos, preferiblemente, aproximadamente un 20% o menos, más preferiblemente, aproximadamente un 10% o menos, y lo más preferible, aproximadamente un 5% o menos, tras cualquiera de los períodos de tiempo anteriormente mencionados.

Con este fin, la composición farmacéutica comprende preferiblemente un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, aquéllos descritos anteriormente, y un agente estabilizante seleccionado del grupo constituido por polisorbato 80, L-arginina, polivinilpirrolidona, \alpha-D-glucopiranosil \alpha-D-glucopiranósido deshidratado (comúnmente conocido como trehalosa), y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, el agente estabilizante es trehalosa o trehalosa en combinación con polisorbato 80. El agente estabilizante puede estar presente en cualquier concentración adecuada en la composición farmacéutica. Cuando el agente estabilizante es trehalosa, lo deseable es que la trehalosa esté presente en una concentración del aproximadamente 1-25% (p/v), preferiblemente, del aproximadamente 2-10% (p/v) y, más preferiblemente, del aproximadamente 4-6% (p/v) de la composición farmacéutica. Cuando, en la composición farmacéutica, están presentes la trehalosa y el polisorbato 80, la trehalosa está preferiblemente presente en una concentración del aproximadamente 4-6% (p/v), más preferiblemente, del aproximadamente 5% (p/v), mientras que lo deseable es que el polisorbato 80 esté presente en una concentración del aproximadamente 0,001-0,015% (p/v), más preferiblemente, del aproximadamente 0,0025% (p/v). Cuando se incluye un agente estabilizante, p. ej., trehalosa, en la composición farmacéutica, el vehículo líquido farmacéuticamente aceptable contiene preferiblemente un sacárido distinto de la trehalosa. La composición farmacéutica puede comprender además aproximadamente 0,05-3 mM (p. ej., aproximadamente 0,05-2 mM, aproximadamente 0,05-1,8 mM, aproximadamente 0,05-1,5 mM, aproximadamente 0,5-1,5 mM o aproximadamente 0,05-1 mM), preferiblemente, aproximadamente 1 mM o aproximadamente 2 mM, de una sal de metal divalente y/o un polímero catiónico para estabilizar aún más la composición farmacéutica. Lo deseable es que la sal de metal divalente sea MgCl_{2}. Además, la composición farmacéutica puede comprender una cantidad adecuada de NaCl, tal como NaCl aproximadamente 50-150 mM, preferiblemente, NaCl aproximadamente 75 mM. El vehículo líquido es comúnmente agua, preferiblemente, agua adecuada para inyección (WFI). En las patentes estadounidenses n.º 6.225.289 y 6.514.943, las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.º 2002/0019041 A1 y 2003/0153065 A1 y las solicitudes de patente internacional WO 00/34444 y WO 03/59292, se describen más detalladamente formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica. Lo más preferible es que el vector adenovírico esté dispersado en un tampón de formulación acuosa que contenga trehalosa al 5% (p/v), polisorbato 80 al 0,0025% (p/v), MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM y Tris HCl 10 mM (pH 7,6 \pm 0,02).

Además la composición farmacéutica se puede formular para reducir la pérdida de adherencia del vector adenovírico sobre los dispositivos usados para preparar, almacenar o administrar el vector de expresión, tal como cristalería, jeringas, catéteres o agujas. El uso de tal composición farmacéutica prolongará la estabilidad de almacenamiento de la composición farmacéutica, facilitará la administración y aumentará la eficacia del procedimiento de la invención. A este respecto, la composición farmacéutica también se puede formular para aumentar la propagación del vector adenovírico por el tejido diana y/o aumentar la eficacia de transducción. Con este fin, la composición farmacéutica también puede comprender hialuronidasa, de la que se ha observado que aumenta la absorción de vectores adenovíricos. La adición de proteasas a la composición farmacéutica puede aumentar la propagación del vector adenovírico por el tumor. Es deseable formular la composición tal que el vector adenovírico (p. ej., el vector adenovírico de replicación deficiente) permanezca en el tejido diana y no se fugue al tejido normal circundante, i.e., aumentar la retención de la composición farmacéutica en el tejido diana. Por consiguiente, se pueden incluir agentes que aumenten la viscosidad de la composición farmacéutica, tales como polímeros sensibles a estímulos. Alternativamente, los vectores adenovíricos de la composición farmacéutica se pueden unir a vehículos sólidos biocompatibles, tales como vehículos particulados (p. ej., perlas, obleas, etc.) que permanezcan en el tejido diana debido a su tamaño, o se pueden incorporar a una matriz, tal como gel o espuma.

Además, la composición farmacéutica puede comprender otros agentes terapéuticos o biológicamente activos. Por ejemplo, puede haber factores terapéuticos útiles en el tratamiento de una determinada indicación. Los factores que controlan la inflamación, tales como el ibuprofeno o los esteroides, pueden formar parte de la composición farmacéutica para reducir la hinchazón y la inflamación asociadas con la administración in vivo del vector adenovírico y con el sufrimiento fisiológico. Se pueden administrar supresores del sistema inmune con la composición farmacéutica para reducir cualquier respuesta inmune hacia el propio vector adenovírico o asociada con un trastorno. Alternativamente, se pueden incluir potenciadores inmunes a la composición farmacéutica para sobre-regular las defensas naturales del cuerpo frente a una enfermedad. Además, se pueden administrar citocinas distintas del FNT-\alpha con la composición farmacéutica para atraer las células efectoras inmunes hacia el sitio tumoral.

Los factores anti-angiogénicos, tales como los receptores de factores de crecimiento solubles (p.ej., sflt), los antagonistas de factores de crecimiento, i.e., la angiotensina, y similares, también pueden formar parte de la composición farmacéutica. De manera similar, se pueden co-administrar con la composición farmacéutica vitaminas y minerales, antioxidantes y micronutrientes. Puede haber antibióticos, i.e., microbicidas y fungicidas, para reducir el riesgo de infección asociado con los procedimientos de transferencia de genes y con otros trastornos. La adición de agentes quimioterapéuticos a la composición farmacéutica puede proporcionar un mecanismo adicional para ejercer la reducción tumoral.

Tejido diana

Se puede usar la invención para administrar una secuencia de ácido nucleico que codifique un FNT-\alpha humano a cualquier tejido diana (p. ej., tejido tumoral) capaz de ser transducida mediante vectores adenovíricos, tales como aquellos vectores adenovíricos descritos en la presente memoria. Preferiblemente, el tejido diana comprende receptores del FNT-\alpha, tal que el FNT-\alpha pueda ejercer su actividad biológica sobre el tejido. El tejido diana es un tumor, p. ej., un tumor sólido asociado con el CPLA en un ser humano. El término "tumor" se refiere tanto a células tumorales como a células estromales asociadas. Un tumor puede estar asociado con cánceres de (i.e., ubicado en) la cavidad oral y la faringe, el sistema digestivo, el sistema respiratorio, los huesos y las articulaciones (p. ej., metástasis óseas), el tejido blando, la piel (p. ej., melanoma), la mama, el sistema genital, el sistema urinario, el ojo y la órbita ocular, el cerebro y el sistema nervioso (p. ej., glioma) o el sistema endocrino (p. ej., tiroides), y no ser necesariamente el tumor primario. Los tejidos asociados con la cavidad oral incluyen, pero no se limitan a, la lengua y tejidos de la boca. El cáncer puede surgir en tejidos del sistema digestivo, incluyendo, por ejemplo, esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto, ano, hígado, vesícula biliar y páncreas. Los cánceres del sistema respiratorio pueden afectar a la laringe, a los pulmones y a los bronquios, e incluyen, por ejemplo, el carcinoma pulmonar de células no pequeñas. Los tumores pueden surgir en el cuello uterino, cuerpo uterino, ovario, vulva, vagina, próstata, testículos y pene, que constituyen los sistemas genitales masculino y femenino, y la vejiga urinaria, el riñón, la pelvis renal y el uréter, que comprenden el sistema urinario. El tejido diana también puede estar asociado con el linfoma (p. ej., enfermedad de Hodgkin y linfoma de no Hodgkin), el mieloma múltiple o la leucemia (p. ej., la leucemia linfocítica aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia mieloide aguda, la leucemia mieloide crónica, y similares).

El tumor puede estar en cualquier estadio. La expresión "estadio tumoral" se usa en la técnica para describir el tipo de tumor y el grado de propagación del tumor. Se conocen varios sistemas de gradación tumoral en la técnica, y se puede usar cualquier sistema de gradación adecuado para determinar el estadio del tumor a tratar. Por ejemplo, el sistema TNM (Tumor, Nódulo, Metástasis) es un sistema aceptado internacionalmente que se usa con frecuencia para determinar el estadio tumoral. A este respecto "T" describe el tamaño, la profundidad y la zona del tumor primario. "TX" indica que el tumor primario no se puede medir. "T0" indica que no hay pruebas de la existencia de un tumor primario. "Tis" indica carcinoma in situ (i. e., las células malignas están confinadas en la capa epitelial del tejido). "T1" indica un tumor localizado de dos centímetros (cm) o menos de diámetro y confinado en el órgano de origen. "T2" indica un tumor localizado de un diámetro menor de 5 cm que se extiende hacia el interior del tejido adyacente del mismo órgano. "T3" indica un tumor avanzado de un diámetro de más de 5 cm con una mayor implicación del tejido adyacente del mismo órgano y "T4" indica un tumor masivo que se extiende hacia los nervios, los vasos sanguíneos, huesos u otro órgano. "N" describe si el cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos regionales. A este respecto, "NX" indica que los ganglios linfáticos regionales no se pueden medir. "N0" indica que no hay pruebas de metástasis hacia los ganglios linfáticos regionales y los estadios "N1", "N2" y "N3" indican una implicación creciente de los ganglios linfáticos regionales. La clasificación de "M" describe la presencia o la ausencia de metástasis distantes. A este respecto, "MX" indica que las metástasis distantes no se pueden medir. "M0" indica que no hay pruebas de metástasis y "M1" indica la presencia de metástasis distantes. Una vez que se ha clasificado un tumor según el sistema TNM, es posible combinar cada clasificación, pudiéndose entonces asignar un estadio global de I, II, III o IV al tumor. Aunque la descripción anterior del sistema TNM se aplica en general a la mayoría de los tipos de tumores, la definición específica de cada nivel puede variar en función del tipo de cáncer. Por ejemplo, en "AJCC Cancer Staging Manual", VI ed., American College of Surgeons, Lippincott-Raven. Filadelfia (2002), se describe más información acerca de la gradación tumoral.

El procedimiento de la invención también es útil en el tratamiento de tumores de cualquier grado. El "grado" de un tumor se refiere al grado de diferenciación de las células tumorales. El grado tumoral se evalúa comúnmente mediante la caracterización histológica de una muestra tumoral y la determinación de la velocidad de crecimiento de las células tumorales (tal como midiendo el índice mitótico). En general, las células tumorales que están bien diferenciadas se asemejan a las células normales y son de un grado más bajo (p. ej., grado 1 ó 2), mientras que las células tumorales no diferenciadas son, por lo común, más agresivas y de un grado superior (p. ej., grado 3 ó 4).

El tumor se puede someter a diferentes terapias. A este respecto, el procedimiento de la invención es útil en el tratamiento de tumores (i. e., la destrucción de células tumorales o la reducción del tamaño del tumor) que han demostrado ser resistentes a otras formas de terapia contra el cáncer, tales como los tumores resistentes a la radiación. El tumor también puede ser de cualquier tamaño. De hecho, la invención se basa, en parte, en la sorprendente capacidad del procedimiento de la invención para reducir significativamente el tamaño de tumores inicialmente grandes (p. ej., 42 cm^{2} o 4.400 cm^{3}). Lo ideal, en el tratamiento de un ser humano con cáncer, es que el procedimiento de la invención dé como resultado la muerte de las células cancerosas (tumorales) y/o la reducción del tamaño del tumor. Se entenderá que la muerte de las células tumorales puede tener lugar sin una disminución sustancial del tamaño del tumor, debido a, por ejemplo, la presencia de células de soporte, de vascularización, de matrices fibrosas, etc. Por consiguiente, aunque se prefiere la reducción del tamaño tumoral, no es necesaria en el tratamiento del cáncer.

El tejido diana es un tumor que no se puede extirpar quirúrgicamente. En este caso, se puede usar la invención para encoger el tumor, facilitando así la resección quirúrgica. Según la invención, el tejido diana es un tumor asociado con el cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) no extirpable, que se define como un tumor de páncreas que tiene una implicación vascular y que incide en los vasos sanguíneos principales, pero que no tiene una implicación del colon, las suprarrenales o los riñones, siembra peritoneal (según lo observado radiográficamente) y sin enfermedad metastásica.

Procedimientos de administración

La revelación comprende la administración de la composición farmacéutica a un ser humano para el tratamiento del cáncer. El uso de la proteína FNT-\alpha en seres humanos como agente anticancerígeno/antitumoral se ha visto limitado por los graves efectos sistémicos que surgen como resultado del tratamiento. Por lo tanto, para atenuar o prevenir tales efectos secundarios negativos, es deseable administrar la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano sólo en el tejido que lo necesita (i. e., el tumor) o, como mínimo, promover la expresión de la secuencia de ácido nucleico predominantemente en el tejido tumoral. Por consiguiente, la composición farmacéutica se puede administrar mediante cualquier procedimiento tal que el FNT-\alpha sea producido dentro o muy cerca del tejido diana.

La revelación implica poner en contacto el tejido diana, mediante la administración de la composición farmacéutica que comprende el vector adenovírico (p. ej., el vector adenovírico de replicación deficiente) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano de una manera localizada, con el tejido diana. Aunque se puede usar cualquier procedimiento adecuado de administración de la composición farmacéutica al tejido diana (p. ej., un tumor) en el contexto de la invención, se realiza preferiblemente la administración localizada en el tumor inyectando directamente la composición farmacéutica que comprende el vector adenovírico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano en un tumor. El término "inyectar" pretende significar que la composición farmacéutica es introducida a la fuerza en el tejido diana. Preferiblemente, la composición farmacéutica se inyecta percutáneamente (i. e., a través de la piel). La vía concreta usada para inyectar la composición farmacéutica en el tejido diana dependerá de la ubicación del tejido diana en el cuerpo. A este respecto, por ejemplo, la composición farmacéutica se administra, preferiblemente, por una vía transabdominal cuando el tejido diana es un tumor de páncreas. Además, la composición farmacéutica se administra, preferiblemente, por una vía endorrectal o transperineal cuando el tejido diana es un tumor de recto. Por supuesto, la administración de la composición farmacéutica se puede realizar por cualquier vía que administre eficazmente el vector adenovírico al tejido diana.

Lo deseable es que la composición farmacéutica se administre de una manera uniforme por la masa tumoral. De este modo, cuando se administra la composición farmacéutica mediante inyección, la inyección se aplica para maximizar la distribución por el tumor. Por ejemplo, la aguja del dispositivo de inyección pincha la superficie del tejido tumoral (comúnmente, a una profundidad de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 5 cm, preferiblemente, de aproximadamente 2 cm a aproximadamente 4 cm (p. ej., 3 cm) en función del volumen tumoral) y la composición farmacéutica sale del dispositivo de administración a medida que se retira lentamente la aguja del tejido, de modo que el vector se va liberando a lo largo del recorrido de la aguja. Además, es posible controlar el momento de la aplicación de cada inyección para administrar uniformemente la composición farmacéutica en el tumor. En otras palabras, la composición farmacéutica puede ser expelida del dispositivo de inyección lentamente (p. ej., aproximadamente 5 segundos por inyección, preferiblemente, aproximadamente 10 segundos por inyección, y más preferiblemente, aproximadamente 15 segundos por inyección) para una absorción eficaz del vector adenovírico por parte del tejido circundante. En una realización, se administran de aproximadamente 1 \mul a aproximadamente 10 \mul de composición farmacéutica en el tumor durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos (p. ej., durante aproximadamente 10 minutos, durante aproximadamente 20 minutos o durante aproximadamente 30 minutos). Alternativamente, es posible expeler la composición farmacéutica rápidamente y a la fuerza del dispositivo de inyección (p. ej., en un "pulverizado") para forzar la absorción del vector. De hecho, se puede administrar la composición farmacéutica tal que la composición farmacéutica atraviese el tejido normal antes de entrar en contando con el tejido diana. Por supuesto, no es necesaria la distribución homogénea de la composición farmacéutica por el tejido diana.

En los casos en los que un tumor no es fácilmente visible a través de la piel, el profesional sanitario puede usar equipamiento médico para visualizar el tumor, estimar el volumen tumoral y guiar la colocación de la inyección. La tecnología de generación de imágenes para el diagnóstico del cáncer está bastante avanzada. Los equipos de ultrasonidos y de tomografía informatizada (CT) se usan comúnmente para detectar las masas tumorales. Sin embargo, se han desarrollado técnicas de generación de imágenes más avanzadas e incluyen la tomografía por emisión de positrones (PET), que revela la actividad metabólica de los tejidos, la tomografía informatizada por emisión de un solo fotón (SPECT), la CT espiral, la visualización de imágenes por resonancia magnética (MRI) y la ultrasonografía endoscópica (EUS), que emplea un endoscopio de fibra óptica dotado de una sonda.

Se puede usar cualquier dispositivo de inyección adecuado en el contexto de la invención. Por ejemplo, se puede usar la jeringa médica común para inyectar directamente la composición farmacéutica en un tumor subcutáneo. Las jeringas médicas pueden estar dotadas de cualquier aguja de inyección adecuada. Las agujas de inyección adecuadas incluyen, pero no se limitan a, agujas de inyección de Winston-Cook (p. ej., el inyector de varices) ((Winston-Salem, Carolina del Norte), la aguja de ultrasonidos EchoTip® y la aguja de inyección Quadra-Fuse (Rex Medical, Conshohocken, PA). Por supuesto, se pueden usar jeringas médicas estándar para inyectarlas en el tejido diana (p. ej., tumores) no directamente bajo la piel. Si el tumor no es fácilmente accesible, se puede exponer el tumor durante el procedimiento quirúrgico para permitir la inyección. Sin embargo, los dispositivos de administración mínimamente invasivos permiten la administración de la composición farmacéutica sin procedimientos médicos invasivos. Tales dispositivos son capaces de acceder a tejidos diana que no son accesibles directamente a través de la piel, por ejemplo, mediante pequeñas incisiones de menos 12,70 cm. Los dispositivos de inyección mínimamente invasivos pueden comprender puntas inyectoras que son flexibles y dirigibles para permitir el acceso por pequeñas incisiones a la superficie exterior curvada de un órgano, p. ej., del hígado. Un medio alternativo de inyección no invasiva comprende el uso de un dispositivo de inyección sin aguja, tal como el Biojector 2000 Needle-Free Injection Management System® disponible en Bioject, Inc. La composición farmacéutica se puede administrar en un tejido diana usando un catéter. Por ejemplo, la quimioembolización transcatéter implica la inserción de un catéter en el tejido diana a través de una pequeña incisión en la piel. Se usa la angiografía para guiar el catéter por la vasculatura que alimenta al tejido diana, sobre la que se libera el agente terapéutico junto con materia particulada que bloquea el flujo de sangre hacia el tejido diana. El agente terapéutico no se escapa hacia los tejidos de alrededor, y el tumor es privado de nutrientes. La endoscopia es similar a la cateterización, mientras que permite la visualización del tejido diana mientras se administra la composición farmacéutica. Los catéteres son útiles tanto en la liberación de la composición farmacéutica en el torrente sanguíneo que alimenta al tumor, como en la inyección de la composición farmacéutica en el tejido tumoral. Para permitir múltiples inyecciones con una geometría específica, se puede emplear un sistema de marcaje tal que los puntos de las inyecciones previas queden bien delineados. El aumento de la visualización del tumor y de las inyecciones se garantiza especialmente al administrar la composición farmacéutica en el tejido tumoral mediante aplicaciones múltiples en un patrón geométrico definido.

Además de inyectar directamente la composición farmacéutica en el tejido tumoral, es posible aplicar tópicamente la composición farmacéutica en el tejido tumoral. Por ejemplo, se puede bañar el tejido tumoral en la composición farmacéutica, efectuando así la transferencia de genes hacia la superficie del tejido y el medio circundante. Por supuesto, se puede usar más de una vía de administración, tal que, por ejemplo, se inyecte la composición farmacéutica y se administre tópicamente en el tejido tumoral. La administración tópica que comprende el baño del tumor en la composición farmacéutica permite la exposición del tejido correspondiente ante el vector adenovírico durante un período de tiempo más largo del comúnmente permitido por la inyección. La exposición del tejido ante la composición farmacéutica durante un período de tiempo prolongado puede aumentar el nivel de absorción en las células diana y las células de soporte. Asimismo, se puede perfusionar el tejido diana con la composición farmacéutica durante un período de tiempo usando cualquier dispositivo de administración adecuado, p. ej., un catéter. Se puede perfusionar un tumor con la composición farmacéutica durante cualquier período de tiempo siempre y cuando tenga lugar la transducción, p. ej., de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 horas (p. ej., de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 12 horas), preferiblemente, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 10 horas (p. ej., de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 6 horas), más preferiblemente, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 5 horas (p. ej., de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 3 horas) y más preferiblemente, de aproximadamente 1-2 horas.

Aunque son menos preferidas, es posible usar otras vías de administración para administrar la composición farmacéutica. De hecho, aunque se puede usar más de una vía para administrar la composición farmacéutica, una determinada vía puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Por ejemplo, aunque no sea lo particularmente preferido, la composición farmacéutica puede ser aplicada o infundida en cavidades corporales, absorbida a través de la piel, inhalada o administrada por vía parenteral, por ejemplo, mediante una administración intramuscular, intravenosa, peritoneal o intraarterial. Preferiblemente, el vector adenovírico de la composición farmacéutica administrada parenteralmente en un paciente se dirige específicamente a determinadas células, p. ej., células cancerosas. Para una administración regional, es posible administrar la composición farmacéutica intraarterial o intravenosamente, p. ej., por la arteria hepática para su administración al hígado o por la arteria carótida para su administración al cerebro. Para una administración al cerebro, la composición farmacéutica se puede introducir en el tejido tumoral usando un catéter de administración intratumoral, un catéter de derivación ventricular unido a un reservorio (p. ej., reservorio de Ommaya), una bomba de infusión, o se puede introducir en una cavidad de resección del tumor (tal como, Gliasite, Proxima Therapeutics). También se puede entrar en contacto con el tejido tumoral del cerebro administrando la composición farmacéutica por convección usando un catéter de infusión continua o a través del fluido cerebroespinal. Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica a la cavidad pleural para su administración al pulmón o a la cavidad peritoneal para el mesotelioma. Además, se puede acceder al sistema linfático, por ejemplo, tras una inyección intratumoral, para su administración a los ganglios linfáticos. Para una administración regional, lo preferible es administrar la composición farmacéutica directamente en una arteria que riegue el tejido diana. Según lo tratado en la presente memoria, es posible modificar un vector adenovírico para alterar la especificidad de unión o el reconocimiento del vector adenovírico por un receptor sobre una posible célula huésped. Con respecto al adenovirus, tales manipulaciones pueden incluir la eliminación de regiones de la fibra, pentón o hexón, inserciones de diversos ligandos nativos o no nativos en partes de la cubierta proteínica, y similares. La administración parenteral puede requerir grandes dosis o múltiples administraciones para administrar eficazmente el vector adenovírico de la composición farmacéutica a las células huésped apropiadas.

En algunos casos, no es necesario que la composición farmacéutica entre en contacto con el tejido diana directamente para ejercer un efecto terapéutico. Por ejemplo, es posible administrar la composición farmacéutica al tejido de soporte, mediante lo que se transmite bien el vector adenovírico o el FNT-\alpha resultante al tejido diana en el que ejerce su efecto biológico. Por ejemplo, se ha observado que, sorprendentemente, la administración de la composición farmacéutica directamente en el tejido tumoral según el procedimiento de la invención puede promover el tratamiento de lesiones ubicadas en otras regiones del cuerpo. En otras palabras, la administración de la composición farmacéutica en un tumor puede promover la regresión de otros tumores (i. e., uno o más tumores distintos) ubicados en otra parte del cuerpo, p. ej., metástasis. Por consiguiente, el procedimiento de la invención puede tratar a un ser humano de múltiples tumores (i. e., dos o más), preferiblemente, reduciendo el tamaño de múltiples tumores del cuerpo humano. En particular, es posible tratar múltiples tumores ubicados en diferentes regiones del cuerpo (p. ej., un primer tumor en el hombro y un segundo tumor en el abdomen) mediante la administración de la composición farmacéutica a un primer tumor. En esta realización, la composición farmacéutica se administra a un primer tumor, lo que permite el tratamiento del primer tumor y, adicionalmente, de uno o más tumores distintos a los que no se administró directamente la composición farmacéutica. Preferiblemente, se destruyen las células tumorales del primer tumor y del uno o más tumores adicionales. También preferiblemente, se reduce el tamaño del primer tumor y del uno o más tumores adicionales. Por lo tanto, se puede ejercer un efecto biológico sistémico mediante la administración local (directa) o regional (p. ej., administración directamente en la linfa regional o en el suministro sanguíneo) de la composición
farmacéutica.

La composición farmacéutica se puede administrar en o sobre un dispositivo que permita una liberación controlada o sostenida del vector adenovírico, tal como una esponja, una malla biocompatible, un reservorio mecánico o un implante mecánico. Los implantes (véase, p. ej., la patente estadounidense n.º 5.443.505), los dispositivos (véase, p. ej., la patente estadounidense n.º 4.863.457), tales como un dispositivo implantable, p. ej., un reservorio mecánico o un implante o un dispositivo compuesto por una composición polimérica, son particularmente útiles para la administración del vector adenovírico. La composición farmacéutica del procedimiento de la invención también se puede administrar en forma de formulaciones de liberación sostenida (véase, p. ej., la patente estadounidense n.º 5.378.475) que comprenden, por ejemplo, espuma de gel, ácido hialurónico, gelatina, sulfato de condroitina, un polifosfoéster, tal como, bis-2-hidroxietil-tereftalato (BHET) y/o un ácido poliláctico-glicólico.

La composición farmacéutica también se puede incorporar a o revestir otros materiales, tales como perlas de vidrio o magnéticas, que sean administrados posteriormente a un paciente. Por ejemplo, la FDA ha autorizado el estudio del uso de perlas de vidrio radiactivas para administrar una terapia de radiación concentrada a tejidos ocultos (p. ej., cánceres invasivos, tumores profundos de la cavidad corporal, etc.). Tales perlas pueden contener o estar revestidas con la composición farmacéutica. Alternativamente, se pueden administrar perlas magnéticas revestidas con la composición farmacéutica a un paciente y dirigirlas hacia el tejido diana mediante la colocación de un imán en las proximidades de un tumor. Mientras que las perlas tienden a permanecer depositadas en el cuerpo a no ser que se retiren forzosamente, los dispositivos de administración biodegradables se disuelven en productos finales no tóxicos que son eliminados de manera natural del cuerpo. La oblea Gliadel®, por ejemplo, se usa actualmente para administrar fármacos quimioterapéuticos la zona de los glioblastomas. Tales matrices biodegradables, una vez implantadas, pueden liberar el vector adenovírico que codifica el FNT-\alpha a través de la degradación de la matriz, administrando así el agente terapéutico a la zona correspondiente sin intervención clínica.

Aplicaciones múltiples de monodosis

Aunque la administración de una dosis de la composición farmacéutica se puede realizar mediante una sola aplicación (p. ej., una sola inyección o una sola aplicación tópica en el tejido diana), lo preferible es administrar una monodosis mediante aplicaciones múltiples de la composición farmacéutica en diferentes puntos del tumor diana. Las aplicaciones múltiples pueden ascender a un número cualquiera de entre aproximadamente 2 aplicaciones a aproximadamente 50 aplicaciones o más (incluyendo todos los números enteros comprendidos entre 2 y 50), en función del tamaño y la ubicación del tumor. Por ejemplo, es posible administrar una monodosis en un tejido en cuestión en 40 inyecciones separadas o más. Lo preferible es administrar una monodosis de composición farmacéutica en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aplicaciones (p. ej., 15, 20, 25, 30, 35, 40 ó 45 aplicaciones), más preferiblemente, en aproximadamente 2-8 aplicaciones, e incluso más preferiblemente, en aproximadamente 2-5 aplicaciones. El número de aplicaciones depende de la ubicación del tumor, del tamaño del tumor, del tipo de tumor, y similares. Por ejemplo, si la administración se realiza a un sarcoma de tejido blando, que comúnmente es muy grande (p. ej., 78 cm en su mayor dimensión), preferiblemente, la dosis única se administra en aproximadamente 3-8 aplicaciones. Para tumores sólidos más pequeños o más compactos, se prefieren sólo 2-5 aplicaciones. Aplicaciones múltiples proporcionan una ventaja frente a las aplicaciones únicas, en tanto en cuanto pueden ser manipuladas mediante parámetros tales como una geometría específica definida por la ubicación sobre el tumor en el que se administra cada aplicación. La administración de una monodosis de la composición farmacéutica se controla mejor usando aplicaciones múltiples, siendo posible maximizar la eficacia con la que se administra cualquier dosis dada. De este modo, además, es posible distribuir uniformemente por el tumor el vector adenovírico y, en última instancia, la producción de
FNT-\alpha.

La geometría específica de las aplicaciones múltiples está definida por la ubicación sobre el tejido diana, bien en un espacio bi- o tridimensional, en el que se administra cada aplicación de la composición farmacéutica. La ubicación de cada aplicación estará establecida por el tipo y el volumen del tumor. El patrón de aplicaciones se selecciona para ejercer una distribución amplia del vector adenovírico de replicación deficiente y, en última instancia, de la proteína FNT-\alpha producida, en el tumor. Respecto a la geometría específica de las aplicaciones múltiples en un espacio bidimensional, la geometría específica está definida por un plano (i. e., un corte transversal del tejido diana) en el que se ubican aplicaciones múltiples. El plano definido por aplicaciones múltiples se puede encontrar a una distancia constante de la superficie del tejido diana (i. e., sustancialmente paralelo a la superficie del tejido diana) o, alternativamente, el plano se puede encontrar a un ángulo con respecto a la superficie del tejido diana. Además, aplicaciones múltiples pueden definir cualquier patrón adecuado o geometría específica. Por lo tanto, por ejemplo, en un espacio bidimensional, aplicaciones múltiples pueden definir un cuadrado, mientras que en un espacio tridimensional, aplicaciones múltiples pueden definir un cubo. Dado que el procedimiento de la invención comprende múltiples series de terapia (i. e., la administración de múltiples dosis de la composición farmacéutica durante un período de tiempo (período terapéutico), según lo tratado más adelante), lo deseable es rotar o desplazar la geometría de aplicaciones múltiples para alcanzar la máxima distribución de la composición farmacéutica durante el período terapéutico. Para contribuir a que la aplicación de la composición farmacéutica sea constante y siga un patrón, un revestimiento de rejilla o molde ayudará a guiar las inyecciones, los dispositivos de marcaje pueden registrar los puntos de inyección anteriores y las técnicas de generación de imágenes se pueden usar para visualizar el tejido
diana.

Cuando se administra la composición farmacéutica directamente en un tumor sólido, preferiblemente, se administra una monodosis de composición farmacéutica mediante aplicaciones múltiples alrededor de la circunferencia del tumor, especialmente, cuando el dispositivo de administración, p. ej., una aguja, está insertado hasta una profundidad de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 5 cm en la masa tumoral, preferiblemente, a una profundidad de aproximadamente 2 cm a aproximadamente 4 cm (p. ej., aproximadamente 3 cm). Lo ideal es que se administren aplicaciones múltiples en el tumor a intervalos espaciados uniformemente alrededor de la periferia (circunferencia), p. ej., en un patrón que siga el sentido de las agujas del reloj o el sentido contrario a las agujas del reloj (p. ej., en las posiciones de las 12 en punto, las 3 en punto, las 6 en punto y las 9 en punto), y en una posición anterior-posterior o dorsal-caudal, según lo ilustrado en la figura 3A y la figura 3B, que representan una vista posterior y una vista lateral de un tumor sólido, respectivamente, con una ilustración de un patrón preferido para aplicaciones múltiples de monodosis de la composición farmacéutica en el tumor sólido. Entonces se desplaza la geometría de las aplicaciones múltiples en posteriores administraciones de la dosis. Por ejemplo, en una realización especialmente preferida, el procedimiento de la invención comprende administrar la composición farmacéutica según el siguiente patrón: (a) posiciones de las 12 en punto (31), 3 en punto (32), 6 en punto (33) y 9 en punto (34), y en una posición anterior-posterior o dorsal-caudal (35) para cada administración en la semana 1; (b) posiciones de la 1 en punto, las 4 en punto, 7 en punto y 10 en punto, y una posición anterior-posterior o dorsal-caudal para la primera administración en la semana 2; (c) posiciones de las 2 en punto, las 5 en punto, las 8 en punto y las 11 en punto, y una posición anterior-posterior o dorsal-caudal para la segunda administración en la semana 2, y (d) repetir (a)-(c) alrededor de la periferia del tumor, usando inyecciones paralelas (36) con cada posterior administración de la
dosis.

Cuando se administra la composición farmacéutica a un tumor difuso o de gran tamaño, tal como el asociado al sarcoma de tejido blando, no es posible la inyección en la circunferencia del tumor. Por consiguiente, las inyecciones se administran en un patrón que comprende una serie de líneas paralelas, según lo ilustrado en la figura 4, que representa una vista posterior de un sarcoma de tejido blando (41) con una ilustración de un patrón preferido para aplicaciones múltiples (42) de una monodosis de composición farmacéutica en el sarcoma de tejido blando. Alternativamente, se pueden administrar las inyecciones en círculos concéntricos. En cualquier caso, la geometría específica de las aplicaciones se selecciona con el objetivo de una administración extendida del vector adenovírico (p. ej., del vector adenovírico de replicación deficiente). En algunas realizaciones, no se administra directamente una dosis de composición farmacéutica en el tejido tumoral, sino que se administra localmente en las células/tejido circundante del tumor para evitar la propagación del mismo.

Otro parámetro de aplicaciones múltiples que se puede manipular es el diferencial de tiempo entre cada aplicación. Preferiblemente, cada una de aplicaciones múltiples se administra en aproximadamente 10 minutos (p. ej., aproximadamente 0,5-10 minutos) entre sí, más preferiblemente, en aproximadamente 8 minutos (p. ej., aproximadamente 1-8 minutos) entre sí, e incluso más preferiblemente, en aproximadamente 6 minutos (p. ej., aproximadamente 3-6 minutos) entre sí. Lo más preferible es que todas aplicaciones múltiples de la monodosis se administren en los marcos temporales anteriormente citados.

Dosificación

La dosis de la composición farmacéutica y, particularmente, la cantidad del vector adenovírico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha, dependerá de una serie de factores que incluyen el tamaño del tumor, el grado de cualquier efecto secundario, la vía particular de administración, y similares. La dosificación debería ser tal que se minimicen los efectos secundarios negativos asociados al FNT-\alpha. Una monodosis de la composición farmacéutica comprende al menos aproximadamente 4 x 10^{7} partículas (denominándose también unidades de partícula) del vector adenovírico. La dosis es, preferiblemente, de al menos aproximadamente 1 x 10^{8} partículas (p. ej., de aproximadamente 4 x 10^{8}-4 x 10^{11} partículas) y lo más preferible, de al menos aproximadamente 1 x 10^{9} partículas a al menos aproximadamente 1 x 10^{10} partículas (p. ej., aproximadamente 4 x 10^{9}-4 x 10^{10} partículas) del vector adenovírico. Alternativamente, la dosis de la composición farmacéutica comprende no más de aproximadamente 4 x 10^{12} partículas, incluso más preferiblemente, no más de aproximadamente 1 x 10^{11} partículas, y lo más preferiblemente, no más de aproximadamente 1 x 10^{10} partículas (p. ej., no más de aproximadamente 1 x 10^{9} partículas). En otras palabras, una monodosis de composición farmacéutica puede comprender aproximadamente 4 x 10^{7} up, 1 x 10^{8} up, 4 x 10^{8} up, 1 x 10^{9} up, 4 x 10^{9} up, 1 x 10^{10} up, 4 x 10^{10} up, 1 x 10^{11} up, 4 x 10^{11} up, 1 x 10^{11} up, 4 x 10^{11 }up, 1 x 10^{12} up o 4 x 10^{12} up del vector adenovírico (p. ej., el vector adenovírico de replicación deficiente). Cada aplicación de un protocolo de aplicaciones múltiples para una monodosis incluirá la fracción aproximada del total tal que la suma de las aplicaciones individuales equivalga a una monodosis según lo descrito anteriormente. De este modo, si hay cinco aplicaciones de una dosis de la composición farmacéutica, lo deseable es que la cantidad de vector adenovírico (p. ej., el vector adenovírico de replicación deficiente) en cada aplicación sea un quinto de una monodosis según lo descrito anteriormente.

La dosis según lo descrito en la presente memoria es adecuada para un volumen del tejido diana de aproximadamente 3 cm^{2} a aproximadamente 300 cm^{2} (p. ej., aproximadamente 5 cm^{2}, 7 cm^{2}, 8 cm^{2} o 9 cm^{2}), comúnmente, aproximadamente 10 cm a aproximadamente 200 cm^{2} (p. ej., aproximadamente 15 cm^{2}, 20 cm^{2}, 25 cm^{2}, 30 cm^{2}, 35 cm^{2}, 40 cm^{2}, 45 cm^{2} o 50 cm^{2}), más comúnmente, aproximadamente 50 cm^{2} a aproximadamente 125 cm^{2} (p. ej., 75 cm^{2}, 80 cm^{2}, 85 cm^{2}, 90 cm^{2} o 110 cm^{2}), aunque los tumores más pequeños de 3 cm o mayores de 300 cm se pueden tratar con el procedimiento de la invención. Cuando se inyecta la composición farmacéutica directamente en un tejido diana, una sola aplicación puede comprender aproximadamente 100 \mul a aproximadamente 20 ml de la composición farmacéutica, preferiblemente, aproximadamente 250 \mul a aproximadamente 10 ml, más preferiblemente, aproximadamente 500 \mul a aproximadamente 5 ml (p. ej., 1 ml, 2 ml o 3 ml). Lo ideal es que, cuando se administran aplicaciones múltiples de una monodosis por inyección, cada aplicación contenga aproximadamente 1 ml de composición farmacéutica.

De este modo, en una monodosis de la composición farmacéutica que implica, por ejemplo, un vector adenovírico deficiente en E1A/E1B/E3/E4 que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano bajo el control del promotor EGR-1 (tal como aquel descrito en la solicitud de patente internacional WO 02/00906 y en la patente estadounidense n.º 6.579.522), se administran aproximadamente 1 x 10^{8}-1 x 10^{12} partículas adenovíricas a un tumor con un volumen estimado de aproximadamente 3 cm^{2} a aproximadamente 150 cm^{2}. En estas condiciones, se consigue un nivel sustancial de producción de FNT-\alpha en el tejido diana sin generar los efectos secundarios negativos asociados con la administración sistémica de la proteína FNT-\alpha.

Régimen de administración

La naturaleza proliferativa del cáncer impide la total eliminación de la enfermedad del cuerpo. Independientemente del tratamiento, no es probable que una monodosis de un agente terapéutico ejerza un efecto anticancerígeno completo, pues las células cancerosas supervivientes se replican con rapidez. De hecho, como ocurre con la mayoría de las enfermedades crónicas, puede ser necesario un tratamiento prolongado que implique múltiples dosis de un agente terapéutico. Por consiguiente, en una realización, el procedimiento de la invención comprende administrar múltiples dosis de composición farmacéutica durante un período de tiempo (i. e., un período terapéutico).

Existen dos cuestiones en cuanto al régimen de administración con respecto a la invención: el período terapéutico total, en otras palabras, la duración completa del tratamiento, y el tiempo transcurrido entre la administración de las dosis de composición farmacéutica y/o terapias adyuvantes. El período terapéutico es de aproximadamente 3-8 semanas (p. ej., 4-7 semanas) y, lo más preferible, de aproximadamente 5-6 semanas de duración (p. ej., de aproximadamente 5 semanas y ½). Un período terapéutico de 5-7 semanas proporciona suficiente tiempo para atacar eficazmente al cáncer, sin ser tan prolongado como para poner en peligro la conformidad del paciente. Lo ideal es que la composición farmacéutica, la dosis de radiación ionizante y la dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos se administren simultáneamente durante el período terapéutico.

Respecto a la administración de múltiples dosis de la composición farmacéutica, se administra una dosis aproximadamente una vez a la semana durante el período terapéutico. El inicio de la terapia puede requerir una dosificación más frecuente, p. ej., se administra una monodosis dos días/semana, tres días/semana, cuatro días/semana, cinco días/semana, seis días/semana o siete días/semana (administración diaria). En una realización, se administran al menos dos dosis durante la semana 1 del período terapéutico y, si es necesario, también durante la semana 2. Después de ello, se puede administrar una monodosis de la composición farmacéutica cada una de las restantes semanas del período terapéutico. Lo ideal es que el período terapéutico comprenda hasta seis semanas y el procedimiento comprenda administrar una dosis de composición farmacéutica cada semana del período terapéutico.

Sin embargo, como el régimen de las administraciones estará basado en varios factores, tales como la tolerancia del paciente al tratamiento, el grado de la enfermedad, la disponibilidad del profesional sanitario, etc., es aceptable que transcurra más de una semana entre las dosis. Por ejemplo, se puede administrar una dosis cada 10 días, bisemanalmente, cada 18 días, trisemanalmente, cada 25 días, una vez al mes y bimensualmente. Preferiblemente, las múltiples dosis de la composición farmacéutica se administran tal que el nivel de FNT-\alpha permanezca por encima de los niveles de fondo durante el período terapéutico.

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De hecho, el régimen de administración se selecciona de modo que tenga lugar la expresión génica (i.e., la expresión de la secuencia codificante del FNT-\alpha humano) y se ejerza el efecto biológico deseado. Por consiguiente, es posible optimizar el régimen de administración para reducir un determinado tipo de tumor. Por ejemplo, si el tumor es grande y difuso, tal como un sarcoma de tejido blando, lo deseable es que el período terapéutico comprenda hasta cinco semanas, administrándose dos dosis de composición farmacéutica en la semana 1 y una dosis de la composición farmacéutica en cada una de las semanas posteriores (p. ej., semanas 2-5). Para tumores sólidos compactos más pequeños, lo deseable es que el período terapéutico comprenda hasta seis semanas, administrándose dos dosis de composición farmacéutica en las semanas 1-2 y una dosis de la composición farmacéutica en cada una de las semanas posteriores (p. ej., semanas 3-6). En cualquier caso, cuando se administran dos dosis de la administración farmacéutica en una semana, las dosis se administran preferiblemente el día 1 y el día 4 del trata-
miento.

En algunas realizaciones, puede ser ventajoso emplear un procedimiento para administrar la composición farmacéutica en el que se administre una dosis de manera continua al tejido diana durante un período de tiempo prolongado. Puede ser deseable, por ejemplo, una perfusión continua del tejido diana con la composición farmacéutica. Por consiguiente, el procedimiento de la invención puede comprender entrar en contacto con el tejido diana (p. ej., tumor) al menos una vez durante el período terapéutico. En otras palabras, se aplica una sola administración de una dosis de composición farmacéutica durante un período de tiempo prolongado, tal como, por ejemplo, 1-10 semanas de duración, aunque puede ser más corto de 1 semana (p. ej., 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o 9 semanas) o más de 10 semanas (p. ej., 12, 14, 16 ó 18 semanas). Tal estrategia de administración se puede realizar mediante, por ejemplo, la incorporación de la composición farmacéutica a un dispositivo o reservorio de liberación sostenida y su implantación en el
paciente.

Radioterapia

Un modo común de tratamiento para la mayoría de los tipos de cáncer es la radioterapia. La radioterapia usa un haz de partículas u ondas de alta energía, tal como rayos X y rayos gamma, para erradicar las células cancerosas mediante la inducción de mutaciones en el ADN celular. Como las células cancerosas se dividen más rápidamente que las células normales, el tejido tumoral es más susceptible a la radiación que el tejido normal. También se ha observado que la radiación aumenta la expresión de ADN exógeno en las células expuestas. La revelación comprende además administrar una dosis de radiación a un paciente durante el período terapéutico. La administración intratumoral de la secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha y la radiación confocal de la zona del tumor da como resultado la administración localizada de dos potentes modalidades de tratamiento del cáncer. Cuando la secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha está ligada operativamente a un promotor inducible por radiación, la radiación potencia la producción de FNT-\alpha y mantiene niveles terapéuticos de FNT-\alpha en la zona del tumor de manera continua durante el período de la radioterapia, además del efecto aditivo o sinérgico de la radiación y el FNT-\alpha observado en la erradicación de las células tumorales (véase, por ejemplo, Hersh et al., "Gene Therapy", 2,124-131 (1995), y Kawashita et al., "Human Gene Therapy", 10, 1509-1519 (1999)).

Se puede administrar cualquier tipo de radiación a un paciente, siempre y cuando la dosis de la radiación sea tolerada por el paciente sin efectos secundarios negativos relevantes. Los tipos adecuados de radioterapia incluyen, por ejemplo, la radioterapia ionizante (electromagnética) (p. ej., rayos X o rayos gamma) o la radioterapia de haz de partículas (p. ej., la radiación de alta energía lineal). La radiación ionizante se define como la radiación que comprende partículas o fotones que tienen suficiente energía para producir una ionización, i.e., una ganancia o pérdida de electrones (según lo descrito en, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.770.581). El profesional sanitario puede controlar los efectos de la radiación, al menos parcialmente. Lo preferible es dividir la dosis de radiación para obtener una exposición máxima de las células diana y reducir la toxicidad. La radiación se puede administrar simultáneamente con radiosensibilizadores que aumentan la muerte de las células tumorales, o con radioprotectores (p. ej., IL-1 o IL-6) que protegen el tejido sano de los efectos dañinos de la radiación. De manera similar, la aplicación de calor, i. e., hipertermia o quimioterapia, puede sensibilizar el tejido hacia la radiación.

La fuente de radiación puede ser externa o interna al paciente. La radioterapia externa es la más común e implica dirigir un haz de radiación de alta energía hacia una zona tumoral a través de la piel, usando, por ejemplo, un acelerador lineal. Cuando el haz de radiación está ubicado hacia la zona tumoral, es casi imposible evitar la exposición del tejido sano normal. Sin embargo, habitualmente, los pacientes toleran bien la radiación externa. La radioterapia interna implica implantar una fuente emisora de radiación, tal como perlas, cables, nódulos, cápsulas, y similares, dentro del cuerpo o cerca de la zona tumoral. Tales implantes se pueden retirar tras el tratamiento o dejar inactivos en el cuerpo. Los tipos de radioterapia interna incluyen, pero no se limitan a, braquiterapia, radiación intersticial y radiación intracavital. La radioterapia interna es particularmente adecuada para el tratamiento del cáncer mediante el uso de vectores adenovíricos, de modo que es posible incorporar la composición farmacéutica del procedimiento de la invención en o sobre las estructuras implantadas, permitiendo así la administración simultánea de dos formas de terapia contra el cáncer. Una forma menos común de radioterapia interna es la radioinmunoterapia, en la que se administran a un paciente anticuerpos específicos del tumor unidos a material radiactivo. Los anticuerpos buscan y se unen a los antígenos tumorales, administrándose así eficazmente una dosis de radiación en el tejido en
cuestión.

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Independientemente del procedimiento de administración, la dosis total de radiación administrada a un paciente en el contexto de la invención es, preferiblemente, de aproximadamente 5 grays (Gy) a aproximadamente 70 Gy. Más preferiblemente, se administran aproximadamente 10 Gy a aproximadamente 65 Gy (p. ej., aproximadamente 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy, 50 Gy, 55 Gy o 60 Gy) o aproximadamente 10 Gy a aproximadamente 40 Gy (p. ej., aproximadamente 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy o 35 Gy) en el transcurso del tratamiento. Aunque se puede administrar una dosis completa de radiación en el transcurso de un día, lo ideal es fraccionar la dosis total y administrarla durante varios días, p. ej., se administra una fracción de la dosis de radiación ionizante cada día en el transcurso de varios días. Lo deseable es administrar la radioterapia en el transcurso de al menos aproximadamente 3 días, p. ej., al menos 4, 5, 7, 10, 14, 17, 21, 25, 28, 32, 35, 38, 42, 46, 52 ó 56 días (aproximadamente 1-8 semanas). Por consiguiente, una dosis diaria de radiación comprenderá aproximadamente 1-5 Gy (p. ej., aproximadamente 1 Gy, 1,5 Gy, 1,8 Gy, 2 Gy, 2,5 Gy, 2,8 Gy, 3 Gy, 3,2 Gy, 3,5 Gy, 3,8 Gy, 4 Gy, 4,2 Gy, 4,5 Gy o 5 Gy), preferiblemente 3-5 Gy (p. ej., aproximadamente 3-4 Gy o 4-5 Gy), y más preferiblemente, 1-2 Gy (p. ej., 1,5-2 Gy). La dosis diaria de radiación debería ser suficiente para inducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico si está ligada operativamente a un promotor inducible por radiación. Si se extiende durante un período de tiempo, lo preferible es no administrar la radiación todos los días, permitiendo así al paciente descansar y que la terapia tenga sus efectos. Por ejemplo, lo deseable es administrar la radiación durante 5 días consecutivos y no administrarla durante 2 días por cada semana de tratamiento, dejando así 2 días de descanso a la semana. Sin embargo, se puede administrar la radiación 1 día/semana, 2 días/semana, 3 días/semana, 4 días/semana, 5 días/semana, 6 días/semana o los 7 días/semana, en función de la respuesta del paciente a la terapia y de cualquier posible efecto secundario. La radioterapia se puede iniciar en cualquier momento del período terapéutico. Preferiblemente, la radiación se inicia en la semana 1 o en la semana 2, y se administra mientras dure el período terapéutico. Por ejemplo, se administra la radiación en las semanas 1-6 o en las semanas 2-6 de un período terapéutico que comprende 6 semanas para tratar, por ejemplo, un tumor sólido. Alternativamente, se administra la radiación en las semanas 1-5 o en las semanas 2-5 de un período terapéutico que comprende 5 semanas. El tratamiento de algunos tipos de cáncer puede requerir una dosis adicional de radiación ionizante (una dosis de "refuerzo") una vez finalizado el tratamiento de radiación inicial. En tales casos, la dosis de refuerzo puede ser cualquier dosis adecuada para aumentar el efecto terapéutico, pero comprende, preferiblemente, aproximadamente 5 a aproximadamente 10 Gy, más preferiblemente, aproximadamente 5,4 a aproximadamente
9 Gy.

En algunas realizaciones, tales como aquellos casos en los que la secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha está ligada operativamente a un promotor inducible por radiación, el procedimiento de la invención comprende exponer el tumor a la radiación inmediatamente después de la administración de la composición farmacéutica en una dosis suficiente para sobre- regular la actividad del promotor, aunque pueden pasar hasta dos meses entre la exposición a la radiación y la administración de las composiciones farmacéuticas a un ser humano, como se describe más detalladamente en "Cancer Facts and Figures", 2001, American Cancer Society, Nueva York, NY, y la solicitud de patente internacional WO 01/24684. Por consiguiente, un profesional sanitario puede usar análisis estándar para determinar la eficacia de las diversas realizaciones del procedimiento de la invención en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, además del tamaño y de la propagación del tumor, el profesional sanitario también debería tener en cuenta la calidad de vida y la supervivencia del paciente en la evaluación de la eficacia del
tratamiento.

Se debería tener cuidado de que las heridas resultantes del tumor o de la administración de la composición farmacéutica (i. e., úlceras) estén cicatrizadas o protegidas de una exposición excesiva a la radiación. Lo deseable es administrar al menos una aplicación de radiación el día que se administre la composición farmacéutica. Lo más preferible es que la zona diana esté expuesta a la radiación durante de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 8 horas (p. ej., aproximadamente 3 horas), preferiblemente, al menos aproximadamente 4 horas (p. ej., aproximadamente 4-6 horas) tras la administración de la composición farmacéutica, especialmente, cuando el vector adenovírico (p. ej., el vector adenovírico de replicación deficiente) comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique un FNT-\alpha humano, que esté ligada operativamente a un promotor inducible por radiación, para sobre-regular al máximo la actividad del promotor inducible por radiación y la posterior producción de FNT-\alpha. Por supuesto, cuando se emplean fuentes internas de radiación, p. ej., braquiterapia o radio- inmunoterapia, el tiempo de exposición aumentará, comúnmente, con una correspondiente disminución de la intensidad de la radiación.

Quimioterapia

Como la radiación, la quimioterapia es un tratamiento estándar para la mayoría de los tipos de cáncer. La revelación comprende además administrar una dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos a un paciente durante el período terapéutico. Se puede usar cualquier agente quimioterapéutico adecuado en el procedimiento de la invención. Los agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, adriamicina, asparaginasa, bleomicina, busulfán, cisplatino, carboplatino, carmustina, capecitabina, clorambucil, citarabina, ciclofosfamida, camptotecina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, etopósido, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, mercaptopurina, meplhalán, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nitrosurea, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbazina, rituximab, estreptozocina, tenipósido, tioguanina, tiotepa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, taxol, transplatino, compuestos frente al factor de crecimiento endotelial vascular ("anti-VEGF"), compuestos frente al receptor del factor de crecimiento epidérmico ("anti-EGFR"), 5-fluorouracilo, y similares. Se puede administrar una dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos según el procedimiento de la invención. El tipo y el número de agentes quimioterapéuticos usados en el procedimiento de la invención dependerán del régimen quimioterapéutico estándar para un determinado tipo de tumor. En otras palabras, aunque un determinado cáncer se pueda tratar rutinariamente con un solo agente quimioterapéutico, otro se puede tratar rutinariamente con una combinación de agentes quimioterapéuticos. Preferiblemente, el procedimiento de la invención comprende la administración de 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, ciclofosfamida, capecitabina y/o doxorrubicina. Se puede administrar cualquier dosis adecuada de uno o más agentes quimioterapéuticos al ser humano. Las dosis adecuadas de los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0082685 A1. En realizaciones en las que se administra una dosis de 5- FU al paciente, la dosis comprende preferiblemente aproximadamente 50 mg por m^{2} de superficie corporal del paciente al día (i. e., mg/m^{2}/día) a aproximadamente 1.500 mg/m^{2}/día (p. ej., aproximadamente 100 mg/m^{2}/día, aproximadamente 500 mg/m^{2}/día y aproximadamente 1.000 mg/m^{2}/día). Más preferiblemente, la dosis de 5-FU comprende aproximadamente 100 mg/m^{2}/día a aproximadamente 300 mg/m^{2}/día (p. ej., 200 mg/m^{2}/día) o aproximadamente 900 mg/m^{2}/día a aproximadamente 1.100 mg/m^{2}/día (p. ej., aproximadamente 1.000 mg/m^{2}/día). Cuando se administra una dosis de cisplatino al paciente, la dosis comprende preferiblemente aproximadamente 25 mg/m^{2}/día a aproximadamente 500 mg/m^{2}/día (p. ej., aproximadamente 50 mg/m^{2}/día, aproximadamente 100 mg/m^{2}/día o aproximadamente 300 mg/m^{2}/día). Más preferiblemente, la dosis de cisplatino es de aproximadamente 50-100 mg/m^{2}/día, lo más preferible, 75 mg/m^{2}/día. Cuando se administra una dosis de capecitabina al paciente, la dosis comprende preferiblemente aproximadamente 500 mg/m^{2}/día a aproximadamente 1.500 mg/m^{2}/día (p. ej., aproximadamente 700 mg/m^{2}/día, aproximadamente 800 mg/m^{2}/día o aproximadamente 900 mg/m^{2}/día). Más preferiblemente, la dosis de capecitabina comprende aproximadamente 800 mg/m^{2}/día a aproximadamente 1.000 mg/m^{2}/día (p. ej., aproximadamente 900 mg/m^{2}/día).

Como ocurre con la radiación, si se extiende durante un período de tiempo, la quimioterapia no se administra todos los días, permitiendo así al paciente descansar y que la terapia tenga sus efectos. Por ejemplo, lo deseable es administrar la quimioterapia durante 5 días consecutivos y no administrarla durante 2 días por cada semana de tratamiento, dejando así 2 días de descanso a la semana. Sin embargo, la quimioterapia se puede administrar 1 día/semana, 2 días/semana, 3 días/semana, 4 días/semana, 5 días/semana, 6 días/semana o los 7 días/semana, en función de la respuesta del paciente a la terapia y de cualquier posible efecto secundario. Por ejemplo, en una realización del procedimiento de la invención, la administración del uno o más agentes quimioterapéuticos comienza en cada uno de dos días alternos del período terapéutico. A este respecto, la dosis del uno o más agentes terapéuticos puede comenzar en dos días cualquiera del período terapéutico. En una realización particularmente preferida, se administra una dosis de 5-FU y de cisplatino al paciente comenzando el día 1 y el día 29 de un período terapéutico de 5
semanas.

La quimioterapia se puede iniciar en cualquier momento del período terapéutico. Preferiblemente, la quimioterapia se inicia en la semana 1 en el mismo día que se inicie la radioterapia (denominado "día 1"), y se administra durante el período terapéutico. Por ejemplo, la quimioterapia se administra en las semanas 1-6 o en las semanas 2-6 de un período terapéutico que comprende 6 semanas para tratar, por ejemplo, un tumor sólido. Alternativamente, la quimioterapia se administra en las semanas 1-5 o en las semanas 2-5 de un período terapéutico que comprende 5 semanas. La dosis del uno o más agentes quimioterapéuticos se administra tras la dosis de radiación ionizante. Lo más preferiblemente es exponer al paciente a la quimioterapia en las aproximadamente 24 horas (p. ej., aproximadamente 12 horas antes o después) de la exposición a la dosis de radiación ionizante.

En algunas realizaciones, puede ser ventajoso emplear un procedimiento para administrar el uno o más agentes quimioterapéuticos en el que se administre una dosis de manera continua al paciente durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, puede ser deseable la infusión continua del paciente con el agente quimioterapéutico. A este respecto, la duración de la administración de la dosis del uno o más agentes terapéuticos puede ser cualquier duración adecuada. Las tasas de infusión estándar para los agentes quimioterapéuticos descritos en la presente memoria son conocidas en la técnica y se pueden usar en el procedimiento de la invención, o modificarlas de cualquier modo adecuado según la naturaleza de la enfermedad. Por ejemplo, cuando se pone en práctica el procedimiento de la invención usando 5-FU como agente quimioterapéutico, una tasa de infusión muy común es la de aproximadamente 96 horas por semana de tratamiento (i. e., 5 días a la semana). Hay otros aspectos de la quimioterapia y los regímenes posológicos para tratar el cáncer descritos en, por ejemplo, Bast et al., (eds.), Cancer Medicine, V edición, BC. Decker Inc., Hamilton, Ontario (2000).

Resección quirúrgica

En una realización, la composición farmacéutica es para su administración antes, durante o después de la resección quirúrgica de un tumor. La extirpación quirúrgica completa de tejido tumoral a menudo se complica por la invasión del tejido tumoral por los tejidos de alrededor y los márgenes indefinidos de la masa. Según lo descrito en la presente memoria, el tratamiento de un tumor usando el procedimiento de la invención conduce al encogimiento del tumor, lo que facilita su resección. Lo ideal es que la resección quirúrgica de un tumor se realice tras finalizar el período terapéutico. La resección quirúrgica de un tumor se puede realizar en cualquier momento posterior a la finalización del período terapéutico, siempre y cuando se haya dejado suficiente tiempo al paciente para recuperarse de la administración de la composición farmacéutica, la radiación ionizante y la quimioterapia. Lo deseable es realizar la resección quirúrgica de un tumor al menos 1 semana después de finalizar el período terapéutico. Preferiblemente, la resección quirúrgica de un tumor se realiza aproximadamente 3-15 semanas (p. ej., aproximadamente 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas o 14 semanas) después de finalizar el período terapéutico. Más preferiblemente, la resección quirúrgica de un tumor se realiza aproximadamente 3-6 semanas (p. ej., aproximadamente 4 semanas o 5 semanas) o aproximadamente 4-10 semanas (p. ej., aproximadamente 6 semanas, 7 semanas u 8 semanas) después de finalizar el período
terapéutico.

Frecuentemente, la administración post-quirúrgica de la composición farmacéutica (usando el procedimiento de la invención) puede eliminar cualquier célula tumoral residual que quede tras la resección quirúrgica de un tumor. A menudo la radiación y/o la quimioterapia adyuvantes también forman parte de los regímenes terapéuticos estándar posteriores a la resección quirúrgica del tejido tumoral. De este modo, también se pueden usar la administración post-quirúrgica de la composición farmacéutica, una dosis de radiación ionizante y/o una dosis de uno o más agentes quimioterapéuticos (usando el procedimiento de la invención) para eliminar cualquier célula tumoral residual. La radiación y/o la quimioterapia adyuvantes se pueden administrar en cualquier momento posterior a la resección quirúrgica del tumor, siempre y cuando se haya dejado suficiente tiempo al paciente para recuperarse después de la cirugía. En una realización, se administra quimioterapia adyuvante al paciente al menos 1 semana después de la resección quirúrgica del tumor. Preferiblemente, la quimioterapia adyuvante se administra de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 10 semanas (p. ej., aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 5 semanas o aproximadamente 7 semanas) después de la resección quirúrgica de un tumor, más preferiblemente, de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 4 semanas (p. ej., aproximadamente 3 semanas) después de la resección quirúrgica de un tumor. Se puede administrar uno cualquiera o cualquier combinación de agentes quimioterapéuticos, tales como aquéllos descritos en la presente memoria, al paciente en cualquier dosis adecuada como parte de la quimioterapia adyuvante posterior a la resección quirúrgica de un tumor. En una realización, la quimioterapia adyuvante comprende la administración de 5-FU y de leucovorina, derivado del ácido fólico, al paciente.

Evaluación de la eficacia del tratamiento

La revelación proporciona un régimen terapéutico eficaz y seguro para la administración de FNT-\alpha a un ser humano para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad. Lo ideal es que el procedimiento de la invención promueva la inhibición de la proliferación de células tumorales, la inhibición de la vascularización tumoral, la erradicación de las células tumorales y/o una reducción del tamaño de al menos un tumor tal que se trate a un ser humano de cáncer. "Tratamiento del cáncer" pretende significar alivio del cáncer en su totalidad o en parte. En la presente memoria, se tratan varios parámetros a tener en cuenta cuando se administra un FNT-\alpha humano a un paciente humano usando la transferencia de genes mediada por un adenovirus. El profesional sanitario puede establecer la combinación apropiada de los parámetros para una determinada situación. Es posible determinar el progreso del procedimiento de la invención en el tratamiento del cáncer (p. ej., la reducción del tamaño tumoral o la erradicación de las células cancerosas) usando cualquier procedimiento adecuado, tal como aquellos procedimientos usados actualmente en el ámbito clínico para hacer un seguimiento del tamaño tumoral y del progreso del cáncer. El parámetro de eficacia principal usado para evaluar el tratamiento del cáncer mediante el procedimiento de la invención es, preferiblemente, una reducción del tamaño de un tumor. El tamaño tumoral se puede calcular usando cualquier técnica adecuada, tal como la medición de las dimensiones o la estimación del volumen tumoral usando un programa informático disponible, tal como el programa informático FreeFlight desarrollado en la Universidad Wake Forest, que permite estimar con exactitud el volumen tumoral. Es posible determinar el tamaño tumoral mediante la visualización del tumor usando, por ejemplo, CT, ultrasonido, SPECT, CT espiral, MRI, fotografías, y similares. En las realizaciones en las que se extirpa quirúrgicamente un tumor tras finalizar el período terapéutico, es posible determinar la presencia de tejido tumoral y el tamaño tumoral mediante el análisis bruto del tejido que se vaya a extirpar y/o mediante el análisis patológico del tejido extirpado.

Lo deseable es que el crecimiento de un tumor se estabilice (i. e., el crecimiento del tumor no aumente ni disminuya) como resultado del procedimiento de la invención. Preferiblemente, el procedimiento de la invención reduce el tamaño de un tumor al menos aproximadamente un 5% (p. ej., al menos aproximadamente un 10%, 15%, 20% o 25%). Más preferiblemente, el tamaño tumoral se reduce al menos aproximadamente un 30% (p. ej., al menos aproximadamente un 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65%). Todavía más preferiblemente, el tamaño tumoral se reduce al menos aproximadamente un 70% (p. ej., al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90% o 95%). Lo más preferible es que el tumor se elimine por completo.

El efecto de la invención sobre el tamaño tumoral también se puede clasificar en términos de la respuesta tumoral. A este respecto, una reducción de más del 50% del volumen de un tumor tratado según el procedimiento de la invención (i. e., un "tumor tratado") indica una "respuesta parcial" (RP). El crecimiento de un tumor tratado hasta más del 125% del tamaño del tumor antes del período terapéutico indica "enfermedad progresiva" (EP). "Antes del período terapéutico" pretende significar poco tiempo antes o inmediatamente antes de comenzar el período terapéutico. La desaparición completa de un tumor tratado durante al menos cuatro semanas después de la observación de la desaparición del tumor indica una "respuesta completa" (RC). Cuando el tamaño de un tumor tratado es de entre el 75% y el 125% del tamaño del tumor antes del período terapéutico, la respuesta tumoral se denomina "enfermedad estable" (EE). Una "respuesta marginal" (RM) está indicada por una reducción del tamaño del tumor tratado de entre el 50% y el 75% del tamaño del tumor antes del período terapéutico. De este modo, el parámetro de eficacia principal para el procedimiento de la invención también se puede describir como una "respuesta tumoral objetiva", que se define como una respuesta parcial o una respuesta completa. Cuando se prefiere una respuesta parcial o una respuesta completa, el tratamiento de un cáncer en un paciente mediante el procedimiento de la invención también se puede demostrar por la enfermedad estable.

Cuando un tumor se somete a resección quirúrgica tras finalizar el período terapéutico, es posible determinar la eficacia del procedimiento de la invención en la reducción del tamaño tumoral mediante la medición del porcentaje de tejido extirpado que es necrótico (i. e., muerto). A este respecto, un cáncer está tratado si el porcentaje de necrosis del tejido extirpado es mayor del aproximadamente 50% (p. ej., aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90% o 100%), más preferiblemente, aproximadamente el 90% o más (p. ej., aproximadamente el 90%, 95% o 100%). Lo más preferible es que el porcentaje de necrosis del tejido extirpado sea del 100%; es decir, que no haya tejido tumoral.

Se puede emplear una serie de parámetros secundarios para determinar la eficacia del procedimiento de la invención. Los ejemplos de los parámetros secundarios incluyen, pero no se limitan a, detección de nuevos tumores, detección de antígenos o marcadores tumorales (p. ej., CEA, PSA o CA-125), biopsia, retroceso del estadio quirúrgico (conversión del estadio quirúrgico de un tumor de no extirpable a extirpable), escáner PET, supervivencia, supervivencia sin la progresión de la enfermedad, tiempo hasta la progresión de la enfermedad, evaluaciones de la calidad de vida, tales como evaluación de la respuesta al beneficio clínico, y similares, pudiendo todos ellos indicar la progresión (o la regresión) global del cáncer en un ser humano. La biopsia es particularmente útil en la detección de la erradicación de células cancerosas dentro de un tejido. La radioinmunodetección (RAID) se usa para ubicar y determinar el estadio de los tumores usando niveles de marcadores (antígenos) en suero producidos por y/o asociados con los tumores ("marcadores tumorales" o "antígenos asociados a tumores"), y puede ser útil como base diagnóstica previa al tratamiento, como un indicador de diagnóstico posterior al tratamiento de la recurrencia y como un indicador posterior al tratamiento de la eficacia terapéutica. Los ejemplos de marcadores tumorales o de antígenos asociados a tumores que se pueden evaluar como indicadores de la eficacia terapéutica incluyen, pero no se limitan a, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata (PSA), CA-125, CA19-9, moléculas de gangliósido (p. ej., GM2, GD2 y GD3), MART-1, proteínas de choque térmico (p. ej., gp96), sialil-Tn (STn), tirosinasa, MUC-1, HER-2/neu, c-erb-B2, KSA, PSMA, p53, RAS, EGF-R, VEGF, MAGE y gp100. Hay otros antígenos asociados a tumores conocidos en la técnica. La tecnología de RAID en combinación con los sistemas de detección endoscópica también distingue eficazmente los pequeños tumores del tejido circundante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.932.412).

Lo deseable, según el procedimiento de la invención, es que el tratamiento del cáncer en un paciente humano se demuestre por uno o más de los siguientes resultados: (a) la completa desaparición de un tumor (i. e., una respuesta completa); (b) una reducción del aproximadamente 25% al aproximadamente 50% del tamaño de un tumor durante al menos cuatro semanas tras finalizar el período terapéutico en comparación con el tamaño del tumor antes del período terapéutico; (c) una reducción de como mínimo aproximadamente el 50% del tamaño de un tumor durante al menos cuatro semanas tras finalizar el período terapéutico en comparación con el tamaño del tumor antes del período terapéutico; y (d) una disminución de como mínimo el 2% (p. ej., una disminución del aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%) en un nivel de antígeno asociado a un tumor específico en aproximadamente 4-12 semanas de tras finalizar el período terapéutico en comparación con el nivel del antígeno asociado al tumor antes del período terapéutico. Aunque se prefiere una disminución de como mínimo el 2% del nivel de antígeno asociado al tumor, cualquier disminución del nivel de antígeno asociado al tumor demuestra el tratamiento de un cáncer en un paciente mediante el procedimiento de la invención. Por ejemplo, con respecto al cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable, su tratamiento se puede demostrar por una disminución de como mínimo el 10% del nivel de antígeno asociado con el tumor CA19-9 a las 4-12 semanas de finalizar el período terapéutico en comparación con el nivel de CA19-9 antes del período terapéutico. De manera similar, con respecto al cáncer de recto localmente avanzado, su tratamiento se puede demostrar por una reducción de como mínimo el 10% del nivel de antígeno asociado al tumor CEA a las 4-12 semanas de finalizar el período terapéutico en comparación con el nivel de CEA antes del período terapéutico.

Con respecto a las evaluaciones de la calidad de vida, tales como los criterios de respuesta al beneficio clínico, el beneficio terapéutico del tratamiento según la invención se puede demostrar en términos de intensidad del dolor, consumo de analgésicos y/o puntuación en la escala de rendimiento de Karnofsky. La escala de rendimiento de Karnofsky permite clasificar a los pacientes según su estado funcional. La escala de rendimiento de Karnosfsky va de 0-100. En general, una baja puntuación de Karnofsky predice un pronóstico de baja supervivencia. De este modo, el tratamiento del cáncer en un paciente humano se demuestra, alternativamente o además, por (a) una disminución de como mínimo el 50% (p. ej., una disminución de como mínimo el 60%, 70%, 80%, 90% o 100%) de la intensidad del dolor comunicada por un paciente durante cualquier período de cuatro semanas consecutivas en las 12 semanas posteriores a la finalización del período terapéutico en comparación con la intensidad del dolor comunicada por el paciente antes del período terapéutico; (b) una disminución de como mínimo el 50% (p. ej., una disminución de como mínimo el 60%, 70%, 80%, 90% o 100%) del consumo de analgésicos comunicada por un paciente durante cualquier período de cuatro semanas consecutivas en las 12 semanas posteriores a la finalización del período terapéutico en comparación con el consumo de analgésicos comunicado por el paciente antes del período terapéutico y/o (c) un aumento de como mínimo 20 puntos (p. ej., un aumento de como mínimo 30 puntos, 50 puntos, 70 puntos o 90 puntos) en la puntuación de la escala de rendimiento de Karnofsky comunicado por un paciente durante cualquier período de cuatro semanas consecutivas en las 12 semanas posteriores a la finalización del período terapéutico en comparación con la puntuación de la escala de rendimiento de Karnosfsky comunicada por el paciente antes del período terapéutico.

Lo deseable es que el tratamiento de un cáncer en un paciente humano se demuestre por uno o más (en cualquier combinación) de los resultados anteriores, aunque otros resultados alternativos o adicionales de las pruebas a las que se hace referencia y/o de otras pruebas pueden demostrar la eficacia del tratamiento.

Según la invención, el tamaño tumoral se reduce como resultado del procedimiento de la invención, preferiblemente, sin efectos negativos significativos en el ser humano. Los efectos negativos están clasificados o "graduados" por el programa de evaluación terapéutica del cáncer (CTEP) del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de Estados Unidos, en el que el grado 0 representa los mínimos efectos secundarios negativos y el grado 4 representa los efectos negativos más graves. La escala de toxicidad del NCI (publicada en abril de 1999) y el manual de criterios comunes de toxicidad (actualizado en agosto de 1999) está disponible en el NCI, p. ej., a través de la página Web del NCI en http://www.ctep.info.nih.gov o en "Investigator's Handbook" dirigido a los participantes de pruebas clínicas de agentes de investigación patrocinado por la División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer, NCI (actualizado en marzo de 1998). Lo deseable es que el procedimiento de la invención se asocie a los mínimos efectos negativos, p. ej., efectos negativos de grado 0, grado 1 o grado 2, según la clasificación realizada por el CTEP/NCI. Sin embargo, según lo tratado en la presente memoria, aunque es preferible la reducción del tamaño tumoral, no es necesaria, pues el tamaño real del tumor puede no encoger a pesar de la erradicación de las células tumorales. La erradicación de las células cancerosas es suficiente para ejercer un efecto terapéutico. Asimismo, cualquier reducción del tamaño tumoral es suficiente para ejercer un efecto terapéutico.

La detección, el control y la clasificación de diversos cánceres en un ser humano se describen además en "Cancer Facts and Figures", 2001, American Cancer Society, Nueva York, NY, y en la solicitud de patente internacional WO 01/24684. Por consiguiente, un profesional sanitario puede usar análisis estándar para determinar la eficacia de las diversas realizaciones del procedimiento de la invención en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, al evaluar la eficacia del tratamiento, además del tamaño y de la propagación del tumor, el profesional sanitario también debería tener en cuenta la calidad de vida y la supervivencia del paciente.

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Otras consideraciones

La invención se puede realizar en combinación con otros procedimientos terapéuticos para conseguir un efecto biológico deseado en un paciente. En una realización, se pueden administrar fármacos tales como bloqueadores H2 y/o inhibidores de la bomba de protones al paciente durante el período terapéutico para proteger el sistema gastrointestinal (p. ej., el estómago) de los efectos secundarios de la radiación ionizante. El procedimiento de la invención también se puede realizar junto con una terapia hormonal, que es la manipulación de los niveles hormonales en el cuerpo para tratar una enfermedad. Muchos cánceres son afectados de algún modo por los niveles de las hormonas en el cuerpo y, como tales, los agentes terapéuticos más comunes asociados a la terapia hormonal, p. ej., el tamoxifeno, funcionan para reducir el nivel de hormonas en circulación y/o interrumpir la unión de las hormonas a receptores
hormonales.

La hipertermia, por definición, es el aumento de la temperatura corporal como medio de terapia. Hay estudios que demuestran que la hipertermia es una eficaz terapia adyuvante porque aumenta los efectos de la quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia (Ito et al., Cáncer Gene Therapy, 8 (9), 649-654 (2001)). Es posible elevar la temperatura de una región específica del cuerpo, tal como de una zona tumoral, mediante un dispositivo de calentamiento (p. ej., un dispositivo que emita microondas) o mediante la administración de una toxina para inducir la fiebre o la inflamación. También se pueden administrar al paciente partículas que son inducidas a emitir calor, tal que la zona del tratamiento esté localizada y sea interna. Se ha observado que las partículas magnéticas generan calor bajo un campo magnético alterno (CMA) mediante pérdida de histeresis (Ito et al., supra). Se pueden administrar partículas submicrométricas tales como éstas al tejido diana y activarlas mediante un CMA. Si se desea, se puede ligar operativamente la secuencia de ácido nucleico que codifica el FNT-\alpha a un promotor sensible al calor o a la radiación de un CMA, proporcionando así otra medida de seguridad adicional que garantice la ubicación de la producción de FNT-\alpha en el tejido
diana.

Los siguientes ejemplos ilustran más detalladamente la invención, pero, por supuesto, no deberían ser considerados de ningún modo como restrictivos de su alcance.

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Ejemplo de referencia 1

Este ejemplo demuestra la seguridad y la eficacia de la composición farmacéutica de la invención que comprende (i) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (ii) un vector adenovírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha ligada operativamente a un promotor inducible por radiación, en la que la dosis comprende de aproximadamente 4 x 10^{9} a aproximadamente 4 x 10^{11} unidades de partícula (up) de vector adenovírico, en un modelo animal clínicamente relevante.

Se realizaron estudios toxicológicos preclínicos en ratones atímicos (nu/nu) que portaban un zenoinjerto de carcinoma de células escamosas SQ-20B humanas (n = 80) y ratones Balb/c (n = 100). En el estudio, se usaron diez ratones nu/nu/sexo/grupo en cuatro grupos que hicieron un total de 80 ratones. Los cuatro grupos constaron de: (1) vehículo control; (2) vehículo control más radiación; (3) composición farmacéutica que comprendía 4 x 10^{9} up de vector adenovírico más radiación y (4) composición farmacéutica que comprende 4 x 10^{10} up de vector adenovírico más radiación. Se administraron dosis de vehículo o de composición farmacéutica que comprendían vectores adenovíricos mediante inyección intratumoral (20 \mul en 2 zonas; 40 \mul en total) en tumores de células escamosas humanas SQ-20B establecidos de 0,4 cm a 0,6 cm de diámetro. También se usaron en el estudio diez ratones Balb/c/sexo/grupo con 5 grupos que hicieron un total de 100 ratones. Los grupos incluían: (1) vehículo control; (2) vehículo control más radiación; (3) composición farmacéutica que comprendía 4 x 10^{9} up de vector adenovírico más radiación; (4) composición farmacéutica que comprendía 4 x 10^{10} up de vector adenovírico más radiación, y (5) composición farmacéutica que comprendía 4 x 10^{11} up de vector adenovírico más radiación. Las dosis de vehículo o de composición farmacéutica se administraron mediante (i) inyección subcutánea (s.c.) en la extremidad posterior derecha de cada ratón Balb/c o (ii) intratumoralmente en ratones nu/nu los días 0, 3, 7 y 10 en combinación con las dosis de radiación de 5 Gy/fracción administradas diariamente de los días 0 a 4 y los días 7 a 11 (dosis total de 50 Gy) comenzando 4 h después de la inyección. La radiación fue en (i) la extremidad posterior derecha de los ratones Balb/c o (ii) en la zona tumoral de los ratones nu/nu, que tenían el resto del cuerpo protegido.

Los vectores adenovíricos comprendían una estructura vírica de serotipo de adenovirus 5 deficiente en E1A/E1B/
E3/E4 que comprendía la secuencia codificante del FNT-\alpha humano ubicada en la región E1 y ligada operativamente al promotor EGR-1. El vector adenovírico comprendía además una secuencia espaciadora en la región E4. Se evaluaron los efectos secundarios clínicos por enjaulamiento, el consumo de alimento, la hematología y la química, y la patología clínica. Se realizó la necropsia de los sujetos los días 14 y 28.

Además, se realizó un estudio de farmacocinética en los ratones atímicos (n = 33). Se inyectó intratumoralmente a los ratones una dosis de composición farmacéutica que comprendía 4 x 10^{9} up del vector adenovírico los días 0-2 o diariamente 5 días/semana durante dos semanas, con o sin radioterapia según lo descrito anteriormente. Los sujetos fueron sacrificados los días 3 ó 28. Se cuantificaron los niveles de FNT-\alpha en plasma y tejido tumoral mediante
ELISA.

Las dosis de hasta 350 veces la dosis máxima recomendada para estudios clínicos (tomando el peso en kg) fueron bien toleradas sin una toxicidad relevante. Se observó eritema cutáneo en la zona de inyección en todos los grupos de dosis tanto en ratones Balb/c como nu/nu, coincidiendo con el eritema comunicado tras la administración s.c. de FNT humano recombinante soluble en seres humanos. La mayoría del resto de las toxicidades observadas se encontraron en el grupo de dosis más elevada (4 x 10^{11} up) y fueron independientes de la radiación. Estas toxicidades consistían en una reacción local que incluyó ulceración, alopecia y decoloración de la piel. Cualquier reacción sistémica observada fue significativamente diferente estadísticamente al comparar el grupo de tratamiento con los controles tratados con vehículo; sin embargo, los cambios en estos parámetros en comparación con niveles normales no se consideraron de una relevancia toxicológica. No murió ningún ratón ni tuvo toxicidades relevantes por la administración de composición farmacéutica que comprendía 4 x 10^{9} ó 4 x 10^{10} up de vector adenovírico en combinación con 50 Gy de radiación. Además, la administración intratumoral de la composición farmacéutica en combinación con la radioterapia dio como resultado niveles relevantes y sostenidos de FNT-\alpha en homogeneizados tumorales sin que "rebosaran" hacia el plasma y demostró una pronunciada actividad anti-neoplásica. De hecho, la radiación aumentó por 12 los niveles intratumorales de FNT-\alpha.

Los resultados anteriormente descritos demuestran la seguridad y la eficacia de la composición farmacéutica y del procedimiento de la invención en modelos animales considerados en la técnica como razonablemente predictivos del éxito en seres humanos.

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Ejemplo de referencia 2

Este ejemplo ilustra el uso de la invención para tratar terapéuticamente el cáncer en un ser humano según lo indicado por la reducción del tamaño de la masa tumoral.

Se seleccionaron pacientes con tumores sólidos accesibles para administrarles repetidas inyecciones intratumorales para su tratamiento usando el procedimiento de la invención. Estos pacientes no habían obtenido resultados satisfactorios en una o más terapias anteriores. Se inyectó a los pacientes intratumoralmente una composición farmacéutica que comprendía uno de los cinco niveles de dosis del vector adenovírico que contenía la secuencia codificante del FNT-\alpha descrito en el ejemplo 1 (4 x 10^{9}-4 x 10^{11} up en incrementos logarítmicos de ½) durante un período terapéutico máximo de 6 semanas. Varios pacientes comprendían una lesión tratada sólo mediante radiación, lo que sirvió como control. Se administró una monodosis de composición farmacéutica mediante múltiples inyecciones en el tumor el día 1 y el día 4 de las semanas 1 y 2 del período terapéutico, y una vez a la semana durante las semanas 3-6. Por cada dosis, se administraron múltiples inyecciones en un patrón tal que las inyecciones se espaciaron uniformemente por la periferia del tumor. Por ejemplo, las inyecciones se administraron en el tumor en el siguiente patrón: posiciones de las 12 en punto, las 3 en punto, las 6 en punto y las 9 en punto y una posición anterior-posterior o dorsal-caudal para cada administración en la semana 1; (b) posiciones de la 1 en punto, las 4 en punto, las 7 en punto y las 10 en punto, y una posición anterior-posterior o dorsal-caudal para la primera administración en la semana 2; (c) posiciones de las 2 en punto, las 5 en punto, las 8 en punto y las 11 en punto, y una posición anterior-posterior o dorsal-caudal para la segunda administración en la semana 2, y repetir (a)-(c) por la periferia del tumor con cada administración posterior de la dosis. La radioterapia concomitante comenzó la semana 2 y se administró durante cinco días consecutivos, no siendo administrada durante dos días, por cada semana restante del período terapéutico, alcanzándose una dosis total de 30-70 Gy. Se calculó el tamaño tumoral al final del tratamiento y, en los casos en los que fue posible, a los 2-3 meses posteriores al tratamiento.

1

En cuanto a la seguridad, no se observó toxicidad limitante de la dosis en el intervalo de dosis de los vectores adenovíricos analizado. Los pacientes no experimentaron efectos negativos graves relacionados con el fármaco, mientras que los efectos negativos mínimos incluyeron dolor en la zona de inyección y escalofríos. No se observaron aumentos significativos en los niveles de FNT-\alpha en suero por encima del de referencia (1-50 pg/ml) en ninguno de los puntos temporales analizados. No se detectó ningún virus en los cultivos tomados de sangre u orina, y el título de anticuerpos frente al vector no aumentó en siete de los ocho pacientes analizados.

En cuanto a la eficacia del protocolo del tratamiento, se proporciona un resumen de las respuestas tumorales en la tabla anterior, en la que las siguientes abreviaturas tienen los significados indicados: CPCNP: cáncer pulmonar de células no pequeñas; RP: respuesta parcial, reducción de más del 50% del volumen de la lesión inyectada; EP: enfermedad progresiva, la lesión ha crecido hasta más del 125% del valor previo al estudio; RC: respuesta completa, desaparición completa de una lesión durante al menos cuatro semanas desde la fecha de la documentación; EE: enfermedad estable, el tumor está entre el 75% y el 125% del valor previo al tratamiento; RM: reducción de entre el 50% y el 75% del valor previo al tratamiento. RP y RC son habitualmente consideradas como "respuestas tumorales objetivas".

Se observó una respuesta tumoral objetiva en el 57% de los pacientes analizados, mostrando el 28,5% de los pacientes una respuesta completa y el 28,5% de los pacientes, una respuesta parcial. Se consiguió cierto encogimiento tumoral en todos los pacientes, con una disminución media del tamaño del 54% en las lesiones inyectadas. No se observó encogimiento en las lesiones control. Estos resultados prueban la eficacia del procedimiento de la invención para tratar una amplia selección de tumores sólidos, independientemente de su ubicación en el cuerpo.

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Ejemplo de referencia 3

Este ejemplo ilustra el uso de la invención para reducir el tamaño de un tumor asociado con el sarcoma de tejido blando.

Se seleccionan pacientes con sarcomas de tejido blando en las extremidades para su tratamiento usando el procedimiento de la invención. Se inyectó a los pacientes intratumoralmente una composición farmacéutica que comprendía uno de los cinco niveles de dosis del vector adenovírico que contiene la secuencia codificante del FNT-\alpha descrito en el ejemplo 1 (4 x 10^{9}-4 x 10^{12} up en incrementos logarítmicos de 1 - ½) durante un período terapéutico de 5 semanas. Se administra una monodosis de composición farmacéutica mediante múltiples inyecciones en el tumor el día 1 y día 4 de la semana 1 del período terapéutico y una vez a la semana durante las semanas 2-5. Para cada dosis, las múltiples inyecciones se administran en el tumor en líneas paralelas. La radioterapia concomitante se inicia la semana 1 y se administra durante cinco días consecutivos, no siendo administrada durante dos días, por cada semana del período terapéutico, alcanzándose una dosis total de 30-70 Gy.

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Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra el uso de la invención para reducir el tamaño de un tumor asociado con el cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) no extirpable.

Se seleccionaron pacientes con tumores asociados con un cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable recién diagnosticado para su tratamiento usando el procedimiento de la invención. Se inyectó a los pacientes una composición farmacéutica según lo descrito en el ejemplo 1 intratumoralmente mediante una administración transabdominal percutánea (ATP) (guiada bien por CT o por ultrasonidos) o mediante una administración endoscópica por inyección de aguja fina guiada por ultrasonido (EUS). En particular, se administró a los pacientes uno de tres niveles de dosis del vector adenovírico que contiene la secuencia codificante del FNT-\alpha humano descrito en el ejemplo 1 (4 x 10^{9}, 4 x 10^{10} ó 4 x 10^{11} up en un volumen de 2 ml) durante un período terapéutico de 5,5 semanas. Se administró una monodosis de composición farmacéutica en el tumor una vez a la semana durante cinco semanas del período terapéutico. Para la administración ATP, se administró el volumen entero de 2 ml de la dosis de la composición farmacéutica con el paso de una sola aguja en una sola zona tumoral en cada sesión de administración. Para la administración guiada por EUS, se administró el volumen de 2 ml de la dosis de la composición farmacéutica mediante hasta cuatro pasos de aguja y cuatro inyecciones siguiendo un patrón de abanico en la zona tumoral.

Se administró radiación ionizante a cada paciente comenzando aproximadamente 4 horas después de la administración de la composición farmacéutica el día 1 del período terapéutico. Se administró una dosis de radiación total de 50,4 Gy mediante 28 fracciones de 1,8 Gy cada una. Cada fracción de radiación se administró durante cinco días consecutivos, no siendo administrada durante dos días, por cada semana del período terapéutico. El primer día de cada semana del período terapéutico, se administró 5-fluorouracilo (5-FU) antes del tratamiento de radiación de ese día. El 5-FU se administró como una infusión continua de 200 mg/m^{2}/día durante cinco días consecutivos de cada semana del período terapéutico, dando como resultado una duración total de la infusión semanal de aproximadamente 96 horas. La administración de 5- FU continuó a lo largo de la radioterapia y fue interrumpida al concluir la radioterapia.

El tratamiento anteriormente descrito fue bien tolerado. A las cuatro semanas de finalizar el período terapéutico, aproximadamente el 56% de los pacientes presentaba disminuciones de los niveles del antígeno asociado al tumor de páncreas CA19-9, mientras que el 16% de los pacientes tratados presentaba niveles estables de CA19-9. Los resultados de la prueba de CA19-9 indicaron cierta correlación entre el aumento de los niveles de CA19-9 y la progresión de la enfermedad. A los tres meses de finalizar el período terapéutico, se observó una inhibición de la progresión global de la enfermedad (definida como una respuesta tumoral objetiva o enfermedad estabilizada más enfermedad no metastásica) en el 25% de los pacientes tratados con la dosis de 4 x 10^{9} up de la composición farmacéutica, y en el 50% de los pacientes tratados con la dosis de 4 x 10^{10} up de la composición farmacéutica. Se observó la enfermedad estabilizada o una reducción del tamaño tumoral en el 67% de los pacientes tratados con la dosis de 4 x 10^{9} up de la composición farmacéutica y en el 70% de los pacientes tratados con la dosis de 4 x 10^{10} up de la composición farmacéutica.

Estos resultados prueban la eficacia del procedimiento de la invención para tratar el cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable.

<110> GENVEC, INC.

\hskip1cm

KESSSLER, Paul D

\hskip1cm

RASMUSSEN, Henrik S

\hskip1cm

CHU, Karen W

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<120> RÉGIMEN TERAPÉUTICO PARA TRATAR EL CÁNCER

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<130> 231125

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<150> US 60/520.127

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<151> 14-11-2003

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 32798

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Constructo sintético

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<400> 1

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2

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3

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4

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5

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6

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7

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8

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9

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10

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11

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12

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13

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14

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15

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16

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17

\hskip0,8cm

18

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<210> 2

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<211> 465

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> ADN que codifica el factor de necrosis tumoral alfa

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<220>

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<221> misc_feature

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<223> SEC ID N.º 2 representa los nucleótidos de las posiciones 1469 a 1933 de SEC ID N.º 1

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<400> 2

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\hskip0,8cm

19

Claims

1. Uso de un vector adenovírico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un FNT-\alpha humano y que está ligada operativamente a un promotor inducible por radiación, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer de páncreas localmente avanzado (CPLA) no extirpable en un ser humano, en el que

(a): se administrará una dosis de la composición farmacéutica que comprende (i) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (ii) de aproximadamente 4 x 10^{7} a aproximadamente 4 x 10^{12} unidades de partícula (up) de dicho vector adenovírico localmente en un tumor del ser humano aproximadamente una vez a la semana en un período terapéutico que comprende aproximadamente 3-8 semanas;

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el vector adenovírico, la dosis de radiación ionizante y la dosis del uno o más agentes quimioterapéuticos se administrarán al ser humano simultáneamente durante el período terapéutico.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la composición farmacéutica se inyectará en el tumor, de modo se destruyan las células tumorales del tumor.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que la composición farmacéutica se inyectará en el tumor, de modo que se reduzca el tamaño del tumor.

5. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por una reducción del aproximadamente 25% al 50% del tamaño del tumor durante al menos cuatro semanas tras finalizar el período terapéutico en comparación con la superficie del tumor antes del período terapéutico.

6. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por una reducción como mínimo del aproximadamente 50% en el tamaño del tumor durante al menos cuatro semanas tras finalizar el período terapéutico en comparación con la superficie del tumor antes del período terapéutico.

7. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por una desaparición del tumor que se mantiene durante al menos cuatro semanas.

8. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por una reducción como mínimo del 10% del nivel de antígeno tumoral CA19-9 a las 4-12 semanas de finalizar el período terapéutico en comparación con el nivel de antígeno tumoral CA19-9 antes del período terapéutico.

9. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por la conversión del estadio quirúrgico del tumor de no extirpable a extirpable a las 12 semanas de finalizar el período terapéutico.

10. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por una disminución como mínimo del 50% de la intensidad del dolor según lo asignado por los criterios de respuesta al beneficio clínico durante cualquier período de cuatro semanas consecutivas en las 12 semanas posteriores a la finalización del período terapéutico en comparación con la intensidad del dolor antes del período terapéutico.

11. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por una disminución como mínimo del 50% del consumo de analgésicos según lo asignado por los criterios de respuesta al beneficio clínico durante cualquier período de cuatro semanas consecutivas en las 12 semanas posteriores a la finalización del período terapéutico en comparación con el consumo de analgésicos antes del período terapéutico.

12. El uso de la reivindicación 3, mediante el que el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado no extirpable se manifestará por un aumento de al menos 20 puntos en la puntuación de la escala de rendimiento de Karnofsky según lo asignado por los criterios de respuesta al beneficio clínico durante cualquier período de cuatro semanas consecutivas en las 12 semanas posteriores a la finalización del período terapéutico en comparación con la puntuación antes del período terapéutico.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el vector adenovírico es de replicación deficiente.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el promotor inducible por radiación es el promotor EGR-1.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que se administrará una dosis de composición farmacéutica en un tumor aproximadamente una vez a la semana en un período terapéutico que comprende aproximadamente de tres a siete semanas.

16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que el período terapéutico comprende hasta seis semanas y se administrará una dosis de composición farmacéutica en cada semana del período terapéutico.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la composición farmacéutica se administrará en el tumor mediante administración transabdominal percutánea, administración endoscópica o mediante administración endoscópica guiada por ultrasonido.

18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la composición farmacéutica se administrará en el tumor mediante 2-5 inyecciones.

19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la dosis de radiación ionizante comprende de aproximadamente 40 grays (Gy) a aproximadamente 60 Gy y se administrará durante el período terapéutico.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que se administrará una fracción de la dosis de radiación ionizante al día durante cinco días en cada semana del período terapéutico.

21. El uso de la reivindicación 20, en el que la fracción de dosis de radiación ionizante comprende aproximadamente 1-2 Gy.

22. El uso de la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que la fracción de la dosis de radiación ionizante se administrará al ser humano al menos cuatro horas después de la administración de la composición farmacéutica.

23. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en el que se administrará además una dosis de refuerzo de radiación ionizante que comprende aproximadamente 5-10 Gy en el tumor.

24. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en el que el uno o más agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo constituido por adriamicina, asparaginasa, bleomicina, busulfán, cisplatino, carboplatino, carmustina, capecitabina, clorambucil, citarabina, ciclofosfamida, camptotecina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, etopósido, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, mercaptopurina, meplhalán, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nitrosurea, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbazina, rituximab, estreptozocina, tenipósido, tioguanina, tiotepa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, taxol, transplatino y 5-fluorouracilo.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que el uno o los más agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo constituido por 5-fluorouracilo, capecitabina y cisplatino, o combinaciones de los mismos.

26. El uso de la reivindicación 25, en el que el agente quimioterapéutico es 5- fluorouracilo.

27. El uso de la reivindicación 26, en el que la dosis de 5-fluorouracilo comprende de aproximadamente 100 mg/m^{2}/día a aproximadamente 300 mg/m^{2}/día.

28. El uso de la reivindicación 25, en el que el agente quimioterapéutico es capecitabina.

29. El uso de la reivindicación 28, en el que la dosis de capecitabina comprende de aproximadamente 800 mg/m^{2}/día a aproximadamente 1.000 mg/m^{2}/día.

30. El uso de la reivindicación 25, en el que el período terapéutico comprende cinco semanas y se administrarán aproximadamente 50-100 mg/m^{2} de cisplatino y aproximadamente 900-1.100 mg/m^{2} de 5-fluorouracilo comenzando en cada uno de dos días distintos del período terapéutico.

31. El uso de la reivindicación 30, en el se administrarán aproximadamente 75 mg/m^{2} de cisplatino y aproximadamente 1.000 mg/m^{2} de 5-fluorouracilo comenzando el día 1 y el día 29 del período terapéutico.

32. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 24-31, en el que el uno o los más agentes quimioterapéuticos se administrarán en las 24 horas de la administración de la dosis de radiación ionizante.

33. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-32, en el que además se extirpará quirúrgicamente el tumor tras finalizar el período terapéutico.

34. El uso de las reivindicación 33, en el que el tumor se extirpará quirúrgicamente a las 4-10 semanas de finalizar el período terapéutico.

35. El uso de las reivindicación 34, en el que el tumor se extirpará quirúrgicamente a las 3-6 semanas de finalizar el período terapéutico.

36. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en el que se administrará quimioterapia adyuvante tras la resección quirúrgica del tumor.

37. El uso de la reivindicación 36, en el que la quimioterapia adyuvante se administrará las 2-4 semanas siguientes a la resección quirúrgica del tumor.

38. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-37, en el que se administrará además una dosis de un bloqueador H2 o un inhibidor de la bomba de protones.