JP2001517455A - 真核生物ウイルスベクター構築用プラスミド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、生物ウイルスベクター、ポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝子に相同性を有する第1および第2のDNA断片（各々が自身のプロモーターに機能的に連結している）、および少なくとも1つのユニーク制限酵素部位(URES)もしくは位置指定相同組換え部位を含む二重選択カセット(DSC)を提供する。本発明はまた、別のポジティブ選択マーカー遺伝子、複製開始点および二重選択カセットを含むプラスミドpN/Pを提供する。該二重選択カセットおよびpN/Pプラスミドは、時間的に連繋した二重組換え事象あるいは複製開始点の欠損を含むプラスミドの複製を許容する特別な細菌株を用いること無しに、真核生物遺伝子導入ベクターを製造するのに使用することができる。本方法は、所望しないプラスミドおよびベクター構築物に対する、所望のプラスミドおよびベクター構築物の割合を有効に上昇させる。さらに、本発明は、真核生物ウイルスベクターライブラリーを創製する方法を提供する。
Description
【０００１】 発明の技術分野 本発明は、プラスミドならびに真核生物ウイルスベクター等の構築における該
プラスミドの使用に関する。
プラスミドの使用に関する。
【０００２】 発明の背景 その大きなサイズの為に、多くの組換え真核生物ウイルスは相同組換えにより
製造される。従来、この相同組換えは、組換えウイルスの増殖を許容する宿主真
核細胞内で行われてきた（例えば、Berkner, BioTechniques, 6, 616-628 (1988
)参照）。しかしながら真核細胞内での相同組換えには少なくとも２つの主だっ た欠点がある。該工程には時間がかかり、そして好適な組換え真核生物ウイルス
構築物の多くは、それらが派生するもとの真核生物ウイルスベクターに比べ選択
性に不利な点がある。従って、仮に熟練者が真核細胞内で相同組換えの長い工程
を経て新しい組換えウイルスを創ろうと試み、そして所望のウイルスを作り出す
ことに失敗した場合、該熟練者が、構築技術を修正する必要があるのか、求めら
れるウイルスが該細胞内で生育できないという可能性があるのかを見分けること
は容易ではないであろう。従って、真核生物遺伝子導入ベクターを調製する新し
い方法が必要となる。
製造される。従来、この相同組換えは、組換えウイルスの増殖を許容する宿主真
核細胞内で行われてきた（例えば、Berkner, BioTechniques, 6, 616-628 (1988
)参照）。しかしながら真核細胞内での相同組換えには少なくとも２つの主だっ た欠点がある。該工程には時間がかかり、そして好適な組換え真核生物ウイルス
構築物の多くは、それらが派生するもとの真核生物ウイルスベクターに比べ選択
性に不利な点がある。従って、仮に熟練者が真核細胞内で相同組換えの長い工程
を経て新しい組換えウイルスを創ろうと試み、そして所望のウイルスを作り出す
ことに失敗した場合、該熟練者が、構築技術を修正する必要があるのか、求めら
れるウイルスが該細胞内で生育できないという可能性があるのかを見分けること
は容易ではないであろう。従って、真核生物遺伝子導入ベクターを調製する新し
い方法が必要となる。
【０００３】 遺伝子導入ベクターの調製における以前の改良としては、酵母をベースとした
系（Ketner ら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 91, 6186-6190 (1994) ）、 プラスミドをベースとした系（Chartierら, J. Virol., 70, 4805-4810 (1996);
国際特許出願 WO 96/25506 (Crouzet ら)、およびコスミドをベースとした系（
Miyake ら、 Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 93, 1320-1324 (1996) ）の使用
が挙げられる。
系（Ketner ら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 91, 6186-6190 (1994) ）、 プラスミドをベースとした系（Chartierら, J. Virol., 70, 4805-4810 (1996);
国際特許出願 WO 96/25506 (Crouzet ら)、およびコスミドをベースとした系（
Miyake ら、 Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 93, 1320-1324 (1996) ）の使用
が挙げられる。
【０００４】 Chartier らによって開発された系としては、Pac I 制限部位（普通アデノウ イルスゲノム内では生じない）の近傍に完全なアデノウイルスベクターゲノムを
かかえるプラスミドが挙げられる。Chartier らの方法では、線状DNA上に含まれ
るアデノウイルス配列は、インビボで左右ＩＴＲを有する線状化ベクターに相同
的に組換えられる。得られたベクターを増やし、単離し、Pac Iで消化し、そし てアデノウイルスベクターをかかえる該制限断片を該ウイルスの複製を許容する
哺乳類細胞にトランスフェクトする。Chartier らの方法は比較的純粋なアデノ ウイルスベクター配列の供給源を提供する。残念なことにChartier らの方法は 、所望の産物を自己選別する強力で能動的な手段を欠いており、また新規ベクタ
ーを産生し得るにあたり、柔軟性に欠ける。
かかえるプラスミドが挙げられる。Chartier らの方法では、線状DNA上に含まれ
るアデノウイルス配列は、インビボで左右ＩＴＲを有する線状化ベクターに相同
的に組換えられる。得られたベクターを増やし、単離し、Pac Iで消化し、そし てアデノウイルスベクターをかかえる該制限断片を該ウイルスの複製を許容する
哺乳類細胞にトランスフェクトする。Chartier らの方法は比較的純粋なアデノ ウイルスベクター配列の供給源を提供する。残念なことにChartier らの方法は 、所望の産物を自己選別する強力で能動的な手段を欠いており、また新規ベクタ
ーを産生し得るにあたり、柔軟性に欠ける。
【０００５】 国際特許出願 WO 96/25506 （'506 出願, Crouzetら）は、ユニークな制限部 位の近傍にアデノウイルスベクターを含むプラスミドの製造を可能にする選択圧
機構を有する2プラスミド系の使用を開示している。他の先行技術の方法と比べ て、'506 法はある点では真核生物ウイルスベクターの製造により適している。 例えば'506 法は、（Chartier らの方法が必要とするような）２つの相同組換え
(recombination event)が同時かあるいは事実上同時に起こることを必要としな い。この組換え事象の時間的な隔たりは結果としてベクターの製造過程において
両方の組換え工程を得る機会を増やすことになる。しかしながら所望しない相同
組換え産物という「バックグラウンド」を減じる為には、'506 系は特別な細菌 株を必要とし、また使用する。この特別な株は、正常のプラスミド複製開始点が
該株内で機能することがないようDNAポリメラーゼ欠損を有している。しかしな がら'506にはそのような株はたったひとつしか記載されていない。特別な株と改
変した複製開始点を用いずに'506法を行うことは、熟練者に困難なスクリーニン
グ作業を残すことになり、これはChartier らの方法を上回る'506 法の改良点を
打ち消してしまうぐらい重要なことである。つまり、'506 法は柔軟性に欠ける ものである。
機構を有する2プラスミド系の使用を開示している。他の先行技術の方法と比べ て、'506 法はある点では真核生物ウイルスベクターの製造により適している。 例えば'506 法は、（Chartier らの方法が必要とするような）２つの相同組換え
(recombination event)が同時かあるいは事実上同時に起こることを必要としな い。この組換え事象の時間的な隔たりは結果としてベクターの製造過程において
両方の組換え工程を得る機会を増やすことになる。しかしながら所望しない相同
組換え産物という「バックグラウンド」を減じる為には、'506 系は特別な細菌 株を必要とし、また使用する。この特別な株は、正常のプラスミド複製開始点が
該株内で機能することがないようDNAポリメラーゼ欠損を有している。しかしな がら'506にはそのような株はたったひとつしか記載されていない。特別な株と改
変した複製開始点を用いずに'506法を行うことは、熟練者に困難なスクリーニン
グ作業を残すことになり、これはChartier らの方法を上回る'506 法の改良点を
打ち消してしまうぐらい重要なことである。つまり、'506 法は柔軟性に欠ける ものである。
【０００６】 先行技術で記載されている系は新規組換え真核生物ウイルスの製造をはかどら
せ得るものであるが、しかし、さらなる柔軟性や選択圧が望まれている。従って
本発明は、真核生物ウイルスベクターを調製する効率的且つ柔軟性のある方法、
およびこれらの方法を実施するのに有用なベクターを提供する。本発明のこれら
のおよび他の利点、ならびにさらなる本発明の特徴はここに供せられる発明の記
載から明らかになるであろう。
せ得るものであるが、しかし、さらなる柔軟性や選択圧が望まれている。従って
本発明は、真核生物ウイルスベクターを調製する効率的且つ柔軟性のある方法、
およびこれらの方法を実施するのに有用なベクターを提供する。本発明のこれら
のおよび他の利点、ならびにさらなる本発明の特徴はここに供せられる発明の記
載から明らかになるであろう。
【０００７】 発明の簡単な要約 本発明は、真核生物ウイルスベクターと相同性を有する第1および第2のDNA断 片と、ポジティブおよびネガティブ選択遺伝子（各々それら自身のプロモーター
と機能的に連結している）とを含む二重選択カセット(DSC)を提供する。本発明 はまた、独立したポジティブ選択マーカー遺伝子；複製開始点；二重選択カセッ
ト；ならびに１または２以上のユニーク制限酵素部位(URES)、1または2以上のフ
ランキング位置指定相同組換え部位およびファージパッケージング部位のうちの
少なくとも１つ；を含むプラスミドpN/Pを提供する。二重選択カセットおよびpN
/P プラスミドは、時間的に連繋した2回の組換え事象あるいは特別な細菌株（条
件的な複製開始点を有するプラスミドの複製を許容する）の使用を必要とするこ
となく真核生物遺伝子導入ベクターを製造するために用いることができる。本方
法は、所望のプラスミドやベクター構築物の、所望でないプラスミドやベクター
構築物に対する割合を有効に増加させる。本発明はまた、多数の遺伝的要素（同
一または異なっていてもよく、1つの反応で同時にアッセンブリされる）を含む 多数の本発明のベクターを含むかあるいはそれらからなるライブラリーの構築方
法を提供する。これらの核酸および本方法の特徴が、機能的ゲノム等の研究にお
ける真核生物発現ライブラリーの作製ならびに使用をも可能にする。
と機能的に連結している）とを含む二重選択カセット(DSC)を提供する。本発明 はまた、独立したポジティブ選択マーカー遺伝子；複製開始点；二重選択カセッ
ト；ならびに１または２以上のユニーク制限酵素部位(URES)、1または2以上のフ
ランキング位置指定相同組換え部位およびファージパッケージング部位のうちの
少なくとも１つ；を含むプラスミドpN/Pを提供する。二重選択カセットおよびpN
/P プラスミドは、時間的に連繋した2回の組換え事象あるいは特別な細菌株（条
件的な複製開始点を有するプラスミドの複製を許容する）の使用を必要とするこ
となく真核生物遺伝子導入ベクターを製造するために用いることができる。本方
法は、所望のプラスミドやベクター構築物の、所望でないプラスミドやベクター
構築物に対する割合を有効に増加させる。本発明はまた、多数の遺伝的要素（同
一または異なっていてもよく、1つの反応で同時にアッセンブリされる）を含む 多数の本発明のベクターを含むかあるいはそれらからなるライブラリーの構築方
法を提供する。これらの核酸および本方法の特徴が、機能的ゲノム等の研究にお
ける真核生物発現ライブラリーの作製ならびに使用をも可能にする。
【０００８】 添付の図面および以下の好ましい実施態様の詳細な記載を参照することにより
本発明を最もよく理解することができる。
本発明を最もよく理解することができる。
【０００９】 好ましい実施態様の説明pN/Pプラスミド 本発明は、真核生物ウイルスベクター等の構築に有用なプラスミド pN/P （図
1）を提供する。該プラスミド pN/P は、独立した第1ポジティブ選択マーカー遺
伝子；複製開始点；二重選択カセット（DSC）；ならびに(a)1または2以上（例え
ば2つ）の位置指定相同組換え系DNA結合部位（例えばΨRec部位；pN/P1に存在す
る）、(b)（該DSCがURESを有する場合には）該二重選択カセットのURESとは異な
る1または2以上（例えば2つ）の制限酵素部位（例えばpRES；pN/P2に存在する）
および(c)少なくとも1つのファージパッケージング部位（例えばpN/φ(参照）か
らなる群より選択される要素を有する環状DNAである。多くの一連の関連するウ イルスベクター（各ベクターはpN/Pによって担持されているウイルスベクターの
DSCを置換する新しいウイルス遺伝子もしくはパッセンジャー遺伝子を含んでい る）を迅速に作るためにpN/Pプラスミドを使用することができる。
1）を提供する。該プラスミド pN/P は、独立した第1ポジティブ選択マーカー遺
伝子；複製開始点；二重選択カセット（DSC）；ならびに(a)1または2以上（例え
ば2つ）の位置指定相同組換え系DNA結合部位（例えばΨRec部位；pN/P1に存在す
る）、(b)（該DSCがURESを有する場合には）該二重選択カセットのURESとは異な
る1または2以上（例えば2つ）の制限酵素部位（例えばpRES；pN/P2に存在する）
および(c)少なくとも1つのファージパッケージング部位（例えばpN/φ(参照）か
らなる群より選択される要素を有する環状DNAである。多くの一連の関連するウ イルスベクター（各ベクターはpN/Pによって担持されているウイルスベクターの
DSCを置換する新しいウイルス遺伝子もしくはパッセンジャー遺伝子を含んでい る）を迅速に作るためにpN/Pプラスミドを使用することができる。
【００１０】ポジティブ選択マーカー遺伝子 pN/Pの第1の独立したポジティブ選択マーカー遺伝子（以後、「第1マーカー遺
伝子」）とは、環状DNAに担持され、特定且つ公知の条件下で該遺伝子を含むプ ラスミドを担持する細菌に増殖における有利さを与えるであろう任意の遺伝子で
ある。第1のマーカー遺伝子は、DSCのポジティブ選択遺伝子（以後、「ポジティ
ブ選択遺伝子」）とは異なり、後述するが、複製している細菌宿主内でpN/Pを維
持するために用いられる。第1マーカー遺伝子として使用に適した遺伝子として は一般的に、栄養要求性相補遺伝子(auxotrophy complementing genes)、および
ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を付与する）、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（クロラムフェニコール耐性を付与す
る）やカナマイシン耐性遺伝子（図2に図説）等の抗生物質耐性遺伝子が例示さ れる。
伝子」）とは、環状DNAに担持され、特定且つ公知の条件下で該遺伝子を含むプ ラスミドを担持する細菌に増殖における有利さを与えるであろう任意の遺伝子で
ある。第1のマーカー遺伝子は、DSCのポジティブ選択遺伝子（以後、「ポジティ
ブ選択遺伝子」）とは異なり、後述するが、複製している細菌宿主内でpN/Pを維
持するために用いられる。第1マーカー遺伝子として使用に適した遺伝子として は一般的に、栄養要求性相補遺伝子(auxotrophy complementing genes)、および
ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を付与する）、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（クロラムフェニコール耐性を付与す
る）やカナマイシン耐性遺伝子（図2に図説）等の抗生物質耐性遺伝子が例示さ れる。
【００１１】複製開始点 pN/Pの複製開始点としては任意の複製開始点を使用することができる。pN/Pが
とりわけ大きなプラスミドであるかもしくは毒性の高い配列を含んでいる場合に
は、好ましくは細胞内でのpN/Pプラスミドの持続性を高めるべく細胞内でのプラ
スミドのコピー数を低く維持するような該複製開始点であってもよい。さらにpN
/Pを第2のプラスミド（すなわち第2DNA）との相同組換えに用いることができる 。相同組換えは、該ネガティブ選択遺伝子をDSCから第2DNAへと移動させ、それ によって第2DNA副産物および産物であるpDesiredが作製されるようもくろまれる
。少なくとも１つの、pDesiredを含む細胞が、第2DNA副産物を有さないことが必
要で、その結果、ネガティブ選択が実際活発におこなわれている場合には、pDes
iredを含有する細胞が産生される。従って、方法IIあるいは方法III（図3で描写
し、後で詳しく説明する）のどちらかでは、pN/Pの複製開始点は第２DNAに担持 される複製開始点と同じであるかさもなければそれと相容れないものであるべき
である。あるいはまた、ドナープラスミドの複製開始点は条件付き複製開始点で
あってもよい。
とりわけ大きなプラスミドであるかもしくは毒性の高い配列を含んでいる場合に
は、好ましくは細胞内でのpN/Pプラスミドの持続性を高めるべく細胞内でのプラ
スミドのコピー数を低く維持するような該複製開始点であってもよい。さらにpN
/Pを第2のプラスミド（すなわち第2DNA）との相同組換えに用いることができる 。相同組換えは、該ネガティブ選択遺伝子をDSCから第2DNAへと移動させ、それ によって第2DNA副産物および産物であるpDesiredが作製されるようもくろまれる
。少なくとも１つの、pDesiredを含む細胞が、第2DNA副産物を有さないことが必
要で、その結果、ネガティブ選択が実際活発におこなわれている場合には、pDes
iredを含有する細胞が産生される。従って、方法IIあるいは方法III（図3で描写
し、後で詳しく説明する）のどちらかでは、pN/Pの複製開始点は第２DNAに担持 される複製開始点と同じであるかさもなければそれと相容れないものであるべき
である。あるいはまた、ドナープラスミドの複製開始点は条件付き複製開始点で
あってもよい。
【００１２】二重選択カセット 二重選択カセット(DSC)は少なくとも６つの遺伝的要素（または機能的DNA断片
）〔(i)第1ウイルスベクター相同領域、(ii)第2ウイルスベクター相同領域、(iv
)ネガティブ選択遺伝子プロモーターに機能的に連結している(iii)ネガティブ選
択遺伝子産物をコードするDNA、および(vi)ポジティブ選択遺伝子プロモーター に機能的に連結している(v)ポジティブ選択遺伝子を含み、互いにオーバーラッ プできる（必要はないが）〕を含有している。その選択プロモーターと機能的に
連結して選択遺伝子産物をコードしているDNAは、選択遺伝子と呼ばれる（本発 明の目的上）。
）〔(i)第1ウイルスベクター相同領域、(ii)第2ウイルスベクター相同領域、(iv
)ネガティブ選択遺伝子プロモーターに機能的に連結している(iii)ネガティブ選
択遺伝子産物をコードするDNA、および(vi)ポジティブ選択遺伝子プロモーター に機能的に連結している(v)ポジティブ選択遺伝子を含み、互いにオーバーラッ プできる（必要はないが）〕を含有している。その選択プロモーターと機能的に
連結して選択遺伝子産物をコードしているDNAは、選択遺伝子と呼ばれる（本発 明の目的上）。
【００１３】 第1および第2の相同領域の本質は、独立して選択されるものであり、且つ真核
生物ウイルスベクターもしくはその類似体との相同組換えが可能なように十分な
サイズと相同性を有し、そうしてウイルス、ウイルスベクターあるいはそれらの
類似体の所望の領域が、以下に記載のように相同組換えの結果置換（または改変
）される。第1および第2の相同領域はDSCのネガティブおよびポジティブ選択遺 伝子によって分け隔てられている。さらにpN/Pが1または2以上のウイルスITRを 含有する場合、どちらか一方あるいは両方の相同領域にITR、もしくはその一部 を含有することができる。DSCと組換わるであろうウイルス、ウイルスベクター またはそれらの類似体において、第1および第2の相同領域と相同性を有するDNA は隣接していてもよいし、あるいは介在するDNA断片によって分け隔てられてい てもよい（ウイルスベクターの多くの実施態様が異種パッセンジャー遺伝子また
は異種DNA断片を有すること、それらの異種パッセンジャー遺伝子または異種DNA
断片が本パラグラフで記載される相同組換え反応に利用できることもまた認識さ
れるであろう）。
生物ウイルスベクターもしくはその類似体との相同組換えが可能なように十分な
サイズと相同性を有し、そうしてウイルス、ウイルスベクターあるいはそれらの
類似体の所望の領域が、以下に記載のように相同組換えの結果置換（または改変
）される。第1および第2の相同領域はDSCのネガティブおよびポジティブ選択遺 伝子によって分け隔てられている。さらにpN/Pが1または2以上のウイルスITRを 含有する場合、どちらか一方あるいは両方の相同領域にITR、もしくはその一部 を含有することができる。DSCと組換わるであろうウイルス、ウイルスベクター またはそれらの類似体において、第1および第2の相同領域と相同性を有するDNA は隣接していてもよいし、あるいは介在するDNA断片によって分け隔てられてい てもよい（ウイルスベクターの多くの実施態様が異種パッセンジャー遺伝子また
は異種DNA断片を有すること、それらの異種パッセンジャー遺伝子または異種DNA
断片が本パラグラフで記載される相同組換え反応に利用できることもまた認識さ
れるであろう）。
【００１４】 本発明において、ネガティブ選択遺伝子産物は、適当な条件下で、それを発現
する宿主に強力な増殖における不利を与える、好ましくはそれを発現する宿主の
死をもたらすことができる任意のRNAまたはタンパク質である。ネガティブ選択 遺伝子は、反応過程をさきへと「推し進める」（すなわち所望するベクター構築
物を選別し、望まないベクター構築物の排除をもたらす）ために使用される。適
当なネガティブ選択遺伝子としては、NP-1、sacB、ccd遺伝子（例えばccdB）、 テトラサイクリン耐性遺伝子(tetR)、par遺伝子（例えばparD）およびKidが挙げ
られるがそれらに限定されるものではない。適当なネガティブ選択遺伝子として
はまた、これらの遺伝子の融合タンパク質が挙げられる（例えばこれらの遺伝子
の一部が、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、OmpAシグナル配列、ルシフ
ェラーゼ、プロテインAまたはその他任意の適当な融合相手をコードする遺伝子 の一部と融合しているものを含有する遺伝子）。適当なネガティブ選択遺伝子と
してはまた、上述の遺伝子の活性型の変異体が挙げられ、それらは欠失、変異あ
るいは他の改変を含むことができる。要約すれば、適当なネガティブ選択遺伝子
は、それを発現する細菌の死かあるいは増殖速度の実質的な低下をもたらすもの
である。ネガティブ選択遺伝子についての考察をEscherichia coli and Salmone lla , ch. 22, at 2317, 2318 (Niedhardt ed., 2d ed. 1996) に見ることができ
る。
する宿主に強力な増殖における不利を与える、好ましくはそれを発現する宿主の
死をもたらすことができる任意のRNAまたはタンパク質である。ネガティブ選択 遺伝子は、反応過程をさきへと「推し進める」（すなわち所望するベクター構築
物を選別し、望まないベクター構築物の排除をもたらす）ために使用される。適
当なネガティブ選択遺伝子としては、NP-1、sacB、ccd遺伝子（例えばccdB）、 テトラサイクリン耐性遺伝子(tetR)、par遺伝子（例えばparD）およびKidが挙げ
られるがそれらに限定されるものではない。適当なネガティブ選択遺伝子として
はまた、これらの遺伝子の融合タンパク質が挙げられる（例えばこれらの遺伝子
の一部が、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、OmpAシグナル配列、ルシフ
ェラーゼ、プロテインAまたはその他任意の適当な融合相手をコードする遺伝子 の一部と融合しているものを含有する遺伝子）。適当なネガティブ選択遺伝子と
してはまた、上述の遺伝子の活性型の変異体が挙げられ、それらは欠失、変異あ
るいは他の改変を含むことができる。要約すれば、適当なネガティブ選択遺伝子
は、それを発現する細菌の死かあるいは増殖速度の実質的な低下をもたらすもの
である。ネガティブ選択遺伝子についての考察をEscherichia coli and Salmone lla , ch. 22, at 2317, 2318 (Niedhardt ed., 2d ed. 1996) に見ることができ
る。
【００１５】 OmpA FLAG/NP-1 融合タンパク質をコードするDNAが本発明において有用なネガ
ティブ選択遺伝子の一例であることをさらなる説明によって示すが、それに限定
されるものではない。The OmpA FLAG/NP-1遺伝子産物は、そのコグネイト(cogna
te)シグナル配列を欠きさらにOmpAシグナル配列を含む、ラットのデフェンシン 融合タンパク質である。細菌内でのOmpA FLAG/NP-1 融合タンパク質の産生によ り細菌は生存できなくなる。OmpA FLAG/NP-1のネガティブ選択作用を説明する一
つに OmpAシグナルが該タンパク質のNP-1部分を細菌膜中もしくはそれに近いと ころに局在化させ、そうして該タンパク質のNP-1部分がその膜中に孔を形成し宿
主細胞の生存力(viability)を破壊する、ということがあるが、いかなる特定の 理論にも結びつける意図はない。
ティブ選択遺伝子の一例であることをさらなる説明によって示すが、それに限定
されるものではない。The OmpA FLAG/NP-1遺伝子産物は、そのコグネイト(cogna
te)シグナル配列を欠きさらにOmpAシグナル配列を含む、ラットのデフェンシン 融合タンパク質である。細菌内でのOmpA FLAG/NP-1 融合タンパク質の産生によ り細菌は生存できなくなる。OmpA FLAG/NP-1のネガティブ選択作用を説明する一
つに OmpAシグナルが該タンパク質のNP-1部分を細菌膜中もしくはそれに近いと ころに局在化させ、そうして該タンパク質のNP-1部分がその膜中に孔を形成し宿
主細胞の生存力(viability)を破壊する、ということがあるが、いかなる特定の 理論にも結びつける意図はない。
【００１６】 本発明において、好ましいというものではないが、sacB遺伝子を今ひとつのネ
ガティブ選択遺伝子の一例とする。sacB遺伝子産物はシュークロース（増殖培地
に存在する場合）を細菌にとって毒性の高い、影響を与える要素(leaven)へと転
換する。sacBを構成的に発現している細菌宿主にシュークロースを供給し、ある
いは供給を差し控えることによってsacBネガティブ選択遺伝子を制御することが
できる。
ガティブ選択遺伝子の一例とする。sacB遺伝子産物はシュークロース（増殖培地
に存在する場合）を細菌にとって毒性の高い、影響を与える要素(leaven)へと転
換する。sacBを構成的に発現している細菌宿主にシュークロースを供給し、ある
いは供給を差し控えることによってsacBネガティブ選択遺伝子を制御することが
できる。
【００１７】 ネガティブ選択遺伝子が作用するネガティブ選択圧によって制御できるように
、ネガティブ選択遺伝子プロモーターを強力に制御可能（すなわち誘導可能、抑
制可能、あるいは誘導・抑制の両方が可能）なものとしてもよい。あるいはまた
、ネガティブ選択遺伝子プロモーターが制御可能なものでない場合には、ネガテ
ィブ選択遺伝子の機能を妨げる適当な手段を使用しなければならない。ネガティ
ブ選択遺伝子の機能を制御する適当な手段としては、ネガティブ選択遺伝子が毒
性のある産物へと転換する基質（例えばsacB遺伝子ではシュクロース）を供給す
るのを差し控えるかあるいは供給すること、もしくはネガティブ選択遺伝子産物
の強力なレギュレーターをトランスに供給することが挙げられるが、これらに限
定されるものではない。lac Iタンパク質によって抑圧でき、IPTGによって誘導 可能なTacプロモーター(Trpとlacのハイブリッドプロモーター)は、本発明にお ける適当なネガティブ選択遺伝子プロモーターの一例である。Tacプロモーター によって十分なレベルの制御を達成するためには、このプロモーターを、lac株 、好ましくはlac IQ株のようなリプレッサータンパク質を発現している細菌株と
組み合わせて、あるいはlacリプレッサータンパク質を発現しているプラスミド を有する細菌株と組み合わせて使用することが好ましい。pN/Pにlac IQ遺伝子を
含めることによりE3およびE4領域へのDSCの挿入が容易になる。
、ネガティブ選択遺伝子プロモーターを強力に制御可能（すなわち誘導可能、抑
制可能、あるいは誘導・抑制の両方が可能）なものとしてもよい。あるいはまた
、ネガティブ選択遺伝子プロモーターが制御可能なものでない場合には、ネガテ
ィブ選択遺伝子の機能を妨げる適当な手段を使用しなければならない。ネガティ
ブ選択遺伝子の機能を制御する適当な手段としては、ネガティブ選択遺伝子が毒
性のある産物へと転換する基質（例えばsacB遺伝子ではシュクロース）を供給す
るのを差し控えるかあるいは供給すること、もしくはネガティブ選択遺伝子産物
の強力なレギュレーターをトランスに供給することが挙げられるが、これらに限
定されるものではない。lac Iタンパク質によって抑圧でき、IPTGによって誘導 可能なTacプロモーター(Trpとlacのハイブリッドプロモーター)は、本発明にお ける適当なネガティブ選択遺伝子プロモーターの一例である。Tacプロモーター によって十分なレベルの制御を達成するためには、このプロモーターを、lac株 、好ましくはlac IQ株のようなリプレッサータンパク質を発現している細菌株と
組み合わせて、あるいはlacリプレッサータンパク質を発現しているプラスミド を有する細菌株と組み合わせて使用することが好ましい。pN/Pにlac IQ遺伝子を
含めることによりE3およびE4領域へのDSCの挿入が容易になる。
【００１８】 DSCのポジティブ選択遺伝子は、好ましくは第1マーカー遺伝子とは異なるもの
であるが、しかしながら第1マーカー遺伝子として使用するのに適した遺伝子は また二重選択カセットのポジティブ選択遺伝子として使用するのに適している。
図2にゼオシン耐性遺伝子、bleをDSCのポジティブ選択遺伝子として描写した。 ポジティブ選択遺伝子は、物理的にはネガティブ選択遺伝子と密接している（す
なわち近い）。従って、これらの遺伝子は遺伝学的に関連しており、ポジティブ
選択遺伝子を保持するための選択圧はネガティブ選択遺伝子の消失に対する選択
圧（勿論ネガティブ選択遺伝子が不活性な場合）に適応する傾向にあるだろう。
であるが、しかしながら第1マーカー遺伝子として使用するのに適した遺伝子は また二重選択カセットのポジティブ選択遺伝子として使用するのに適している。
図2にゼオシン耐性遺伝子、bleをDSCのポジティブ選択遺伝子として描写した。 ポジティブ選択遺伝子は、物理的にはネガティブ選択遺伝子と密接している（す
なわち近い）。従って、これらの遺伝子は遺伝学的に関連しており、ポジティブ
選択遺伝子を保持するための選択圧はネガティブ選択遺伝子の消失に対する選択
圧（勿論ネガティブ選択遺伝子が不活性な場合）に適応する傾向にあるだろう。
【００１９】 ポジティブ選択遺伝子プロモーターは任意の適当なプロモーターでよいが、構
成プロモーターが多くの本発明の実施態様に好適であり、少なくとも、熟練者で
あればポジティブ選択遺伝子プロモーターの機能に注意を払う必要がないことが
理解されるであろう。
成プロモーターが多くの本発明の実施態様に好適であり、少なくとも、熟練者で
あればポジティブ選択遺伝子プロモーターの機能に注意を払う必要がないことが
理解されるであろう。
【００２０】 ポジティブ選択遺伝子プロモーターは、好ましくはネガティブ選択遺伝子産物
をコードするRNAの転写を促進しない（すなわちネガティブ選択遺伝子のセンス 鎖RNAの転写を促進しない）ように位置および／または方向付けられる。これは 、図1に描写されるように、ポジティブおよびネガティブ遺伝子プロモーターを5
'−5'（もしくはバック−バック）方向で配置し、転写が各々のプロモーターで 開始し、他方から離れるよう進行させることによって達成することができる。
をコードするRNAの転写を促進しない（すなわちネガティブ選択遺伝子のセンス 鎖RNAの転写を促進しない）ように位置および／または方向付けられる。これは 、図1に描写されるように、ポジティブおよびネガティブ遺伝子プロモーターを5
'−5'（もしくはバック−バック）方向で配置し、転写が各々のプロモーターで 開始し、他方から離れるよう進行させることによって達成することができる。
【００２１】 プロモーターによっては、随意、1つの遺伝子がポジティブおよびネガティブ 選択遺伝子の両方として機能することができる。例えば、EM-7プロモーターを含
み、ゼオシン耐性タンパク質またはlacZ-ゼオシン耐性融合タンパク質をコード するDSCを、本発明のベクターに組み入れることができる。実際、EM-7プロモー ターを含むDNA断片は、2つのプロモーターを有している。プロモーターの１つは
、細菌宿主細胞のポリメラーゼによって認識される構成プロモーターである。T7
RNAポリメラーゼにのみ認識されるT7プロモーターが、EM-7プロモーターを含むD
NA断片内に埋め込まれている。T7RNAポリメラーゼを欠く細胞内では、ゼオシン またはゼオシン類似体の存在下で強力なポジティブ選択圧が存在する。すなわち
該遺伝子がポジティブ選択遺伝子として機能している。しかしながら、T7RNAポ リメラーゼを発現している細胞内では、該細胞は極めてゆっくりと増殖するかあ
るいは死ぬ。T7ポリメラーゼは、該細胞内で、細菌ゲノムまたはプラスミドから
構成的もしくは誘導的に発現させることができ、あるいはファージを用いた重感
染によって提供することができる。T7ポリメラーゼ存在下では、該遺伝子がネガ
ティブ選択遺伝子として機能している。すなわち、ゼオシンまたはゼオシン類似
体を増殖培地に添加することによって細胞を選択するのに、そして細胞内でT7RN
Aポリメラーゼを確実に発現させることによって細胞を逆選択するのにこのDSCを
用いることができる。
み、ゼオシン耐性タンパク質またはlacZ-ゼオシン耐性融合タンパク質をコード するDSCを、本発明のベクターに組み入れることができる。実際、EM-7プロモー ターを含むDNA断片は、2つのプロモーターを有している。プロモーターの１つは
、細菌宿主細胞のポリメラーゼによって認識される構成プロモーターである。T7
RNAポリメラーゼにのみ認識されるT7プロモーターが、EM-7プロモーターを含むD
NA断片内に埋め込まれている。T7RNAポリメラーゼを欠く細胞内では、ゼオシン またはゼオシン類似体の存在下で強力なポジティブ選択圧が存在する。すなわち
該遺伝子がポジティブ選択遺伝子として機能している。しかしながら、T7RNAポ リメラーゼを発現している細胞内では、該細胞は極めてゆっくりと増殖するかあ
るいは死ぬ。T7ポリメラーゼは、該細胞内で、細菌ゲノムまたはプラスミドから
構成的もしくは誘導的に発現させることができ、あるいはファージを用いた重感
染によって提供することができる。T7ポリメラーゼ存在下では、該遺伝子がネガ
ティブ選択遺伝子として機能している。すなわち、ゼオシンまたはゼオシン類似
体を増殖培地に添加することによって細胞を選択するのに、そして細胞内でT7RN
Aポリメラーゼを確実に発現させることによって細胞を逆選択するのにこのDSCを
用いることができる。
【００２２】 いかなる特定の説に束縛されるものではないが、ストリンジェントなRNAポリ メラーゼ（例えばT7）は宿主のRNAポリメラーゼに比べてヌクレオチドに対する 親和性が実質的により高いと信じられている。DSCの発現をT7RNAポリメラーゼが
指示すると、宿主細胞の代謝過程が枯渇し細胞の増殖速度が厳しく抑えられる。
この作用は、T7ポリメラーゼのRNA転写物が実質的な読み取り枠(ORF)〔少なくと
も15アミノ酸の長さを持つが、好ましくは約30または約100アミノ酸よりも長い 〕の翻訳を指示する場合、および該ORFの前にシャイン・ダルガルノ配列が存在 する場合にはより強まると思われる。
指示すると、宿主細胞の代謝過程が枯渇し細胞の増殖速度が厳しく抑えられる。
この作用は、T7ポリメラーゼのRNA転写物が実質的な読み取り枠(ORF)〔少なくと
も15アミノ酸の長さを持つが、好ましくは約30または約100アミノ酸よりも長い 〕の翻訳を指示する場合、および該ORFの前にシャイン・ダルガルノ配列が存在 する場合にはより強まると思われる。
【００２３】 二重選択カセットは最適にはまたユニーク制限酵素部位(URES)を含む。該URES
での該DNAの切断により、ネガティブ選択遺伝子によって提供されるネガティブ 選択圧は実質的に減弱されるかあるいは排除される（DSCを含有する細菌がネガ ティブ選択遺伝子または遺伝子産物が活性な状態におかれている場合）。pN/Pプ
ラスミドのこのような改変は、技術者が、それらのDNAポリメラーゼに変異を有 する細菌株（図７に描写する先行技術の方法では必要とされる）を頼らずに、真
核生物ウイルス遺伝子導入ベクターを迅速に調製するために相同組換えを利用す
ることを可能にする。むしろDSC内にURESを有するpN/Pプラスミドを使用するこ とで、熟練者は、事実上任意の細菌株やこれらの株の各々が提供すべき特別な遺
伝形質を利用することができる。
での該DNAの切断により、ネガティブ選択遺伝子によって提供されるネガティブ 選択圧は実質的に減弱されるかあるいは排除される（DSCを含有する細菌がネガ ティブ選択遺伝子または遺伝子産物が活性な状態におかれている場合）。pN/Pプ
ラスミドのこのような改変は、技術者が、それらのDNAポリメラーゼに変異を有 する細菌株（図７に描写する先行技術の方法では必要とされる）を頼らずに、真
核生物ウイルス遺伝子導入ベクターを迅速に調製するために相同組換えを利用す
ることを可能にする。むしろDSC内にURESを有するpN/Pプラスミドを使用するこ とで、熟練者は、事実上任意の細菌株やこれらの株の各々が提供すべき特別な遺
伝形質を利用することができる。
【００２４】 DSCのURESの好ましい位置の一つは、ネガティブ選択遺伝子プロモーターとネ ガティブ選択遺伝子の間であり、そうすると、pN/Pが二重選択カセットに含めら
れるユニーク制限部位で切断されると、該ネガティブ選択遺伝子がそのプロモー
ターから機能的に連繋しなくなる。OmpA/NP-1をネガティブ選択遺伝子として使 用する場合、ユニーク制限部位もまた、OmpAシグナル配列をコードするDNAとNP-
1ポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとの間に配置することができ、
そうすると制限部位が切断されると、得られる遺伝子産物は、宿主細菌上でネガ
ティブ選択圧を発揮しないであろう。当業者であれば、多様な適当な同等のURES
の設置が存在し、任意の個々の実施態様で使用される実際のネガティブ選択遺伝
子の状況に基づいてこれらの多くを容易に同定できることを認識するであろう。
本発明のいかなる個々の実施態様についても、そのDSC内に1以上のURESが存在し
ても差し支えない（例えばネガティブ選択遺伝子プロモーターの前後両方）。
れるユニーク制限部位で切断されると、該ネガティブ選択遺伝子がそのプロモー
ターから機能的に連繋しなくなる。OmpA/NP-1をネガティブ選択遺伝子として使 用する場合、ユニーク制限部位もまた、OmpAシグナル配列をコードするDNAとNP-
1ポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとの間に配置することができ、
そうすると制限部位が切断されると、得られる遺伝子産物は、宿主細菌上でネガ
ティブ選択圧を発揮しないであろう。当業者であれば、多様な適当な同等のURES
の設置が存在し、任意の個々の実施態様で使用される実際のネガティブ選択遺伝
子の状況に基づいてこれらの多くを容易に同定できることを認識するであろう。
本発明のいかなる個々の実施態様についても、そのDSC内に1以上のURESが存在し
ても差し支えない（例えばネガティブ選択遺伝子プロモーターの前後両方）。
【００２５】 pN/Pは好ましくは少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つの真核生物ウ
イルスITRを有する（図１に描写するように）。一方、あるいは両方のITRは（必
要ではないが）二重選択カセットの一部を形成することができる。pN/Pの一具体
例がpN/P1である。pN/P1は、DSCの末端に位置する1または2以上のΨRec部位、お
よび最終的には産物遺伝子導入ベクター内で表現されるであろう他の任意のpN/P
内に存在するウイルスベクター要素を含む。
イルスITRを有する（図１に描写するように）。一方、あるいは両方のITRは（必
要ではないが）二重選択カセットの一部を形成することができる。pN/Pの一具体
例がpN/P1である。pN/P1は、DSCの末端に位置する1または2以上のΨRec部位、お
よび最終的には産物遺伝子導入ベクター内で表現されるであろう他の任意のpN/P
内に存在するウイルスベクター要素を含む。
【００２６】 便宜上、以下の定義をpN/P1およびpN/P2を含むpN/Pプラスミドに適用する（本
発明の目的上）。DNA断片が、複製開始点および独立した第1ポジティブ選択遺伝
子マーカーを含有するDNAの一部である場合、pN/Pのプラスミド断片上に含有さ れるものと定義される。DNA断片が、残りのDNA断片上にある場合には、pN/Pのウ
イルス断片上にあるものと定義される。上述の要素のうち、第1マーカー遺伝子 と複製開始点のみがプラスミド断片上に担持され、他の要素はpN/Pのウイルス断
片上に存在する。
発明の目的上）。DNA断片が、複製開始点および独立した第1ポジティブ選択遺伝
子マーカーを含有するDNAの一部である場合、pN/Pのプラスミド断片上に含有さ れるものと定義される。DNA断片が、残りのDNA断片上にある場合には、pN/Pのウ
イルス断片上にあるものと定義される。上述の要素のうち、第1マーカー遺伝子 と複製開始点のみがプラスミド断片上に担持され、他の要素はpN/Pのウイルス断
片上に存在する。
【００２７】 pN/P1のΨRec部位は任意の方向性で設置することができる。仮にパラレルな2 つのΨRec部位が存在する場合には、環状DNAを適当な位置指定相同組換えに付す
と、第2、第3の（より小さい）環状DNAがpN/Pまたは適当なpN/Pの変異体から得 られる。
と、第2、第3の（より小さい）環状DNAがpN/Pまたは適当なpN/Pの変異体から得 られる。
【００２８】サイレンシング状態にある二重選択カセット 本発明のいくつかの実施態様においては、ネガティブ遺伝子の必須要素を除去
する以外の方法で、あるいはプロモーターと該遺伝子産物をコードするDNAとを 引き離すこと（例えば制限消化）によってDSCのネガティブ選択遺伝子の作用を 条件付きで妨害することが望ましい。条件付きでサイレンシング状態にあるネガ
ティブ選択遺伝子を含有する二重選択カセットは条件付きでサイレンシング状態
にあるDSCである。仮にネガティブ選択遺伝子プロモーターを十分に抑制するこ とができない、もしくは一時的にできない細胞内でDSCを含むプラスミドの操作 を行うことが望まれる場合には、条件付きでサイレンシング状態にあるDSCを使 用することが有利である。
する以外の方法で、あるいはプロモーターと該遺伝子産物をコードするDNAとを 引き離すこと（例えば制限消化）によってDSCのネガティブ選択遺伝子の作用を 条件付きで妨害することが望ましい。条件付きでサイレンシング状態にあるネガ
ティブ選択遺伝子を含有する二重選択カセットは条件付きでサイレンシング状態
にあるDSCである。仮にネガティブ選択遺伝子プロモーターを十分に抑制するこ とができない、もしくは一時的にできない細胞内でDSCを含むプラスミドの操作 を行うことが望まれる場合には、条件付きでサイレンシング状態にあるDSCを使 用することが有利である。
【００２９】 とりわけ、DSC内のネガティブ選択遺伝子プロモーターとネガティブ選択遺伝 子産物をコードするDNAとの間に位置するURES対の間に、転写ブロッキング配列(
transcription blocking sequence)または翻訳ミスセンス産生配列(translation
al missense generating sequence)を挿入することによって、条件付きでサイレ
ンシング状態にあるDSCを調製することができる（例えば図８参照）。例えば、D
SCは、第1および第2のユニーク制限酵素部位（本実施態様では、必要はないが、
第1および第2のURESは同一かあるいはアイソシゾマーであってもよい）の近傍に
翻訳ミスセンス産生ブロッキング配列を含むことができる。この場合、翻訳（タ
ンパク質合成）が、該ブロッキング配列内で開始し、ネガティブ選択遺伝子産物
をコードするDNAの読み取り枠以外の別の読み枠内にあるように、該ブロッキン グ配列をシャイン・ダルガルノ配列（またはその等価物）の下流で且つネガティ
ブ選択遺伝子産物をコードするDNAの翻訳開始コドンの上流に設ける。好ましく は、該ブロッキング配列の読み枠は、翻訳終結コドンがネガティブ選択遺伝子産
物をコードするDNAのコグネイト翻訳開始部位に先行することがないように選択 される。すなわち、ネガティブ選択遺伝子プロモーターからの意図しない転写は
、結果としてネガティブ選択遺伝子産物以外のタンパク質産物を生じる。
transcription blocking sequence)または翻訳ミスセンス産生配列(translation
al missense generating sequence)を挿入することによって、条件付きでサイレ
ンシング状態にあるDSCを調製することができる（例えば図８参照）。例えば、D
SCは、第1および第2のユニーク制限酵素部位（本実施態様では、必要はないが、
第1および第2のURESは同一かあるいはアイソシゾマーであってもよい）の近傍に
翻訳ミスセンス産生ブロッキング配列を含むことができる。この場合、翻訳（タ
ンパク質合成）が、該ブロッキング配列内で開始し、ネガティブ選択遺伝子産物
をコードするDNAの読み取り枠以外の別の読み枠内にあるように、該ブロッキン グ配列をシャイン・ダルガルノ配列（またはその等価物）の下流で且つネガティ
ブ選択遺伝子産物をコードするDNAの翻訳開始コドンの上流に設ける。好ましく は、該ブロッキング配列の読み枠は、翻訳終結コドンがネガティブ選択遺伝子産
物をコードするDNAのコグネイト翻訳開始部位に先行することがないように選択 される。すなわち、ネガティブ選択遺伝子プロモーターからの意図しない転写は
、結果としてネガティブ選択遺伝子産物以外のタンパク質産物を生じる。
【００３０】 代替的なブロッキング配列はRho依存性の（もしくは別の）転写終結配列であ る。すなわち、ネガティブ選択遺伝子プロモーターからかなりのレベルで開始す
る転写は、ネガティブ選択遺伝子産物の産生前に終結し、サイレンシング状態に
あるDSCを保有している細胞をネガティブ選択遺伝子の致死効果から防ぐ。
る転写は、ネガティブ選択遺伝子産物の産生前に終結し、サイレンシング状態に
あるDSCを保有している細胞をネガティブ選択遺伝子の致死効果から防ぐ。
【００３１】 好ましくは、サイレンシング状態にあるDSCが制限消化および再ライゲーショ ンによって容易に活性のあるDSCへと変換され得、結果としてブロッキング配列 がなくなるように、該ブロッキング配列近傍のURESは、互換性のある粘着末端を
作り出す。勿論、熟練者であれば、ネガティブ選択遺伝子がブロッキング配列を
含まない第2の機構（DSCを制御するのに使用される機構とは独立している）によ
ってサイレンシング状態となり得るように、多数のサイレンシング配列をDSC内 へと挿入し得ることが認識できるであろう。
作り出す。勿論、熟練者であれば、ネガティブ選択遺伝子がブロッキング配列を
含まない第2の機構（DSCを制御するのに使用される機構とは独立している）によ
ってサイレンシング状態となり得るように、多数のサイレンシング配列をDSC内 へと挿入し得ることが認識できるであろう。
【００３２】 サイレンシング状態にあるDSCのブロッキング配列が除去されると、ネガティ ブ選択遺伝子が活性な状態となり得る。つまり、ネガティブ選択遺伝子産物が製
造され得る。勿論、該ブロッキング配列の除去は、ネガティブ選択遺伝子プロモ
ーターの制御、ネガティブ選択遺伝子産物用の基質の非供給もしくはネガティブ
選択遺伝子を制御するその他の手段を排除するものではない。
造され得る。勿論、該ブロッキング配列の除去は、ネガティブ選択遺伝子プロモ
ーターの制御、ネガティブ選択遺伝子産物用の基質の非供給もしくはネガティブ
選択遺伝子を制御するその他の手段を排除するものではない。
【００３３】pN/P1のΨRec部位 ΨRec部位は任意の適当な位置指定相同組換えDNA結合部位である。ΨRec部位 は好ましくはlox部位である。他の適当なΨRec部位としては、例えばFLP-FRT系 のFRT部位、R-Rs系のRs部位が挙げられる。
【００３４】pN/P2の制限酵素部位 pN/Pの今ひとつの実施態様はpN/P2であり、これは、pN/P1のΨRec部位が1また
は2以上の制限酵素部位(pRES)（もしDSCがURESを含み、且つ好ましくはpDesired
のウイルス断片中に含まれない場合には、DSCのURESとは異なることが好ましい ）で置換されたpN/Pプラスミドである。好都合なことに、仮に2つの制限部位（ すなわち一対）がある場合、pN/P2から製せられたpDesiredプラスミドからウイ ルスベクターを1つの制限酵素で完全に遊離することができるように、それらは 同じものであってもよいが、これらの部位がまた異なっていてもよいことは容易
に認識されるであろう。Pac Iは、pN/P2での使用にしばしば適当な1種のURESの 実例となるものである。簡便にするため、特に断りのない場合、pN/PはpN/P1お よびpN/P2の両方を言及するために使用するものとする。
は2以上の制限酵素部位(pRES)（もしDSCがURESを含み、且つ好ましくはpDesired
のウイルス断片中に含まれない場合には、DSCのURESとは異なることが好ましい ）で置換されたpN/Pプラスミドである。好都合なことに、仮に2つの制限部位（ すなわち一対）がある場合、pN/P2から製せられたpDesiredプラスミドからウイ ルスベクターを1つの制限酵素で完全に遊離することができるように、それらは 同じものであってもよいが、これらの部位がまた異なっていてもよいことは容易
に認識されるであろう。Pac Iは、pN/P2での使用にしばしば適当な1種のURESの 実例となるものである。簡便にするため、特に断りのない場合、pN/PはpN/P1お よびpN/P2の両方を言及するために使用するものとする。
【００３５】 プラスミドpN/P2BはpN/P2のさらなる一実施態様である。pN/P2Bでは、DSCの第
1および第2の相同領域の一方、あるいはその両方がITRを含んでいる。さらに、D
SC内またはpN/P2Bを用いて製せられる個々のpDesired プラスミドのウイルス断 片内を切断しない制限酵素によって開裂され得る制限酵素部位（つまりURES）は
、DSCの相対する末端の第1または第2の相同領域のITRに適当に近い場所に位置し
ている。この実施態様では、図3で述べた方法論に従ってpDesiredプラスミドを 調製し、URESに特異的な酵素で切断し、pDesired中に含まれるウイルスベクター
の増殖を許容する真核細胞にトランスフェクトすることができる。該制限消化に
より、ITRが、DNA末端に適当に近い位置（すなわち約2000bp以内、好ましくは約
300bp以内、より好ましくは約100bp以内、最も好ましくは約35bp以内）となるの
で、ウイルスベクターが複製することができる。
1および第2の相同領域の一方、あるいはその両方がITRを含んでいる。さらに、D
SC内またはpN/P2Bを用いて製せられる個々のpDesired プラスミドのウイルス断 片内を切断しない制限酵素によって開裂され得る制限酵素部位（つまりURES）は
、DSCの相対する末端の第1または第2の相同領域のITRに適当に近い場所に位置し
ている。この実施態様では、図3で述べた方法論に従ってpDesiredプラスミドを 調製し、URESに特異的な酵素で切断し、pDesired中に含まれるウイルスベクター
の増殖を許容する真核細胞にトランスフェクトすることができる。該制限消化に
より、ITRが、DNA末端に適当に近い位置（すなわち約2000bp以内、好ましくは約
300bp以内、より好ましくは約100bp以内、最も好ましくは約35bp以内）となるの
で、ウイルスベクターが複製することができる。
【００３６】ファージパッケージング部位pN/P φ pN/Pの今ひとつの実施態様はpN/Pφである。pN/Pφは、pN/Pのプラスミド断片
上に、ファージパッケージング部位（例えばラムダcos部位あるいはファージP1 パッケージング部位）を含み、コスミドライブラリー等を作製することができる
。ファージパッケージングプロセスの多くは、ファージパッケージング配列で、
もしくはその極めて近くでエンキャプシデート(encapsidate)されるようにDNAを
線状化する。さらに、ウイルスゲノム（例えばアデノウイルスゲノム）のITRが 、そのDNAの末端に適当に近い位置（すなわち約2000bp以内、好ましくは約300bp
以内、より好ましくは約100bp以内、最も好ましくは約35bp以内）にある場合、 該ITRは、反対側のITRが末端と適当に近接していない場合でも、許容細胞内での
ウイルスゲノム（もしくはウイルスベクターDNA）の複製開始を仲介することが できる。従って、該ファージパッケージング部位は好ましくは（適当には）pN/P
φに含まれるウイルスベクターの1つのITRに近接している。
上に、ファージパッケージング部位（例えばラムダcos部位あるいはファージP1 パッケージング部位）を含み、コスミドライブラリー等を作製することができる
。ファージパッケージングプロセスの多くは、ファージパッケージング配列で、
もしくはその極めて近くでエンキャプシデート(encapsidate)されるようにDNAを
線状化する。さらに、ウイルスゲノム（例えばアデノウイルスゲノム）のITRが 、そのDNAの末端に適当に近い位置（すなわち約2000bp以内、好ましくは約300bp
以内、より好ましくは約100bp以内、最も好ましくは約35bp以内）にある場合、 該ITRは、反対側のITRが末端と適当に近接していない場合でも、許容細胞内での
ウイルスゲノム（もしくはウイルスベクターDNA）の複製開始を仲介することが できる。従って、該ファージパッケージング部位は好ましくは（適当には）pN/P
φに含まれるウイルスベクターの1つのITRに近接している。
【００３７】 pN/Pφは、pDesired（図3参照）にプロセッシングすることができ、このpDesi
redプラスミド（簡便にpDesired-φという）を、適切な大きさのDNAをファージ キャプシドへとエンキャプシデートすることができる細胞もしくはエキストラク
ト内でインキュベートしてもよい。次いでエンキャプシデートされたpDesired- φを直接真核細胞に、特にインビトロでトランスフェクトすることができる。勿
論、線状化pDesired-φを含有するファージ様粒子を抽出して外被で覆われてい ないpDesired-φを得ることもでき、またこの外被で覆われていないpDesired-φ
を用いて当分野で公知の任意の適当な方法によって標的細胞へトランスフェクト
することもできる。すなわち、pN/Pφに存在するエンキャプシデーション部位を
使用することにより、直接、特にインビトロで使用できる、pDesired中の真核生
物ウイルスベクターの迅速な産生が可能となる。
redプラスミド（簡便にpDesired-φという）を、適切な大きさのDNAをファージ キャプシドへとエンキャプシデートすることができる細胞もしくはエキストラク
ト内でインキュベートしてもよい。次いでエンキャプシデートされたpDesired- φを直接真核細胞に、特にインビトロでトランスフェクトすることができる。勿
論、線状化pDesired-φを含有するファージ様粒子を抽出して外被で覆われてい ないpDesired-φを得ることもでき、またこの外被で覆われていないpDesired-φ
を用いて当分野で公知の任意の適当な方法によって標的細胞へトランスフェクト
することもできる。すなわち、pN/Pφに存在するエンキャプシデーション部位を
使用することにより、直接、特にインビトロで使用できる、pDesired中の真核生
物ウイルスベクターの迅速な産生が可能となる。
【００３８】 pDesired-φはまた、改変外被タンパク質を含むファージキャプシドにパッケ ージングすることができる。改変外被タンパク質は、米国特許5,559,099 (Wickh
amら)、米国特許5,712,136 (Wickhamら)、国際特許出願 WO 98/07877 (GenVec,
Inc.)、国際特許出願 WO 98/07865 (GenVec, Inc.)および国際特許出願 WO 97/2
0051 (GenVec, Inc.)に記載されている改変外被タンパク質と同様に、pDesired/
ファージ粒子の標的細胞（例えば真核生物（例えばヒト）内に見られる、もしく
はそこから得られる細胞）へのターゲッティングを指示することができる。
amら)、米国特許5,712,136 (Wickhamら)、国際特許出願 WO 98/07877 (GenVec,
Inc.)、国際特許出願 WO 98/07865 (GenVec, Inc.)および国際特許出願 WO 97/2
0051 (GenVec, Inc.)に記載されている改変外被タンパク質と同様に、pDesired/
ファージ粒子の標的細胞（例えば真核生物（例えばヒト）内に見られる、もしく
はそこから得られる細胞）へのターゲッティングを指示することができる。
【００３９】 例えば、ラムダのDタンパク質をコードする遺伝子は、細胞表面構造、受容体 （細胞表面リポ多糖等を含む）、抗体もしくはアミノおよび／またはカルボキシ
ル末端エピトープ（すなわち、両末端の約10個以内、好ましくは約3個以内のア ミノ酸）に特異的なアミノ酸配列をコードするDNAを挿入することによって改変 することができる。もしくは、ラムダD外被タンパク質を化学的に（すなわち共 有結合で）もしくは一過的に（例えば非共有結合的）、ラムダ外被タンパク質と
(i)細胞表面構造、(ii)受容体（細胞表面リポ多糖等を含む）、(iii)抗体、もし
くは(iv)エピトープ、とに親和性を有する二重特異性分子によって改変すること
ができる。次いで、この改変Dタンパク質を、再ターゲティング(re-targeted)さ
れたラムダキャプシドにエンキャプシデートされているpDesired-φの調製に使 用することができる。
ル末端エピトープ（すなわち、両末端の約10個以内、好ましくは約3個以内のア ミノ酸）に特異的なアミノ酸配列をコードするDNAを挿入することによって改変 することができる。もしくは、ラムダD外被タンパク質を化学的に（すなわち共 有結合で）もしくは一過的に（例えば非共有結合的）、ラムダ外被タンパク質と
(i)細胞表面構造、(ii)受容体（細胞表面リポ多糖等を含む）、(iii)抗体、もし
くは(iv)エピトープ、とに親和性を有する二重特異性分子によって改変すること
ができる。次いで、この改変Dタンパク質を、再ターゲティング(re-targeted)さ
れたラムダキャプシドにエンキャプシデートされているpDesired-φの調製に使 用することができる。
【００４０】 T7パッケージング系の改変もまた本発明において有用である。この実施例では
、カルボキシ末端が改変されたタンパク質10をコードする組換えT7遺伝子10のタ
ンパク質産物、もしくはカルボキシ末端改変野生型タンパク質10をT7パッケージ
ングエキストラクト中で使用して、再ターゲティングされたT7キャプシド中にエ
ンキャプシデートされたpDesired-φを調製する。
、カルボキシ末端が改変されたタンパク質10をコードする組換えT7遺伝子10のタ
ンパク質産物、もしくはカルボキシ末端改変野生型タンパク質10をT7パッケージ
ングエキストラクト中で使用して、再ターゲティングされたT7キャプシド中にエ
ンキャプシデートされたpDesired-φを調製する。
【００４１】 野生型もしくは改変型ファージキャプシドにパッケージングされたpDesired- φを用いて標的細胞へ導入遺伝子を送達することができる。パッケージングされ
たpDesired-φを真核細胞に接触させる。真核細胞はエンキャプシデートされたp
Desired-φを内部へと移行させる。この内部移行(internalization)過程の間に 、エンキャプシデートされたDNAは実質的にそれをとりまくキャプシドタンパク 質を持たないようになり、そうして標的真核細胞で発現され得るpDesired-φの 各遺伝子が転写、翻訳され、そしてウイルスベクターが複製することができる。
好ましくは、ターゲティングされたpDesired-φファージは、エンドソーム溶解 剤(endosomolytic agent)とともに内部移行され、該エンドソーム溶解剤とpDesi
red-φとを含有するエンドソームを該剤が壊す。そのような破壊が遺伝子導入ベ
クターの発現効率を著しく増加させることが知られている。本発明でエンドソー
ム溶解剤として有効なものにクロロキン、リン酸カルシウム粒子、アデノウイル
ス外被タンパク質（アデノウイルスビリオンを含む）およびアデノ随伴ウイルス
外被タンパク質（AAVビリオンを含む）が例示される。
たpDesired-φを真核細胞に接触させる。真核細胞はエンキャプシデートされたp
Desired-φを内部へと移行させる。この内部移行(internalization)過程の間に 、エンキャプシデートされたDNAは実質的にそれをとりまくキャプシドタンパク 質を持たないようになり、そうして標的真核細胞で発現され得るpDesired-φの 各遺伝子が転写、翻訳され、そしてウイルスベクターが複製することができる。
好ましくは、ターゲティングされたpDesired-φファージは、エンドソーム溶解 剤(endosomolytic agent)とともに内部移行され、該エンドソーム溶解剤とpDesi
red-φとを含有するエンドソームを該剤が壊す。そのような破壊が遺伝子導入ベ
クターの発現効率を著しく増加させることが知られている。本発明でエンドソー
ム溶解剤として有効なものにクロロキン、リン酸カルシウム粒子、アデノウイル
ス外被タンパク質（アデノウイルスビリオンを含む）およびアデノ随伴ウイルス
外被タンパク質（AAVビリオンを含む）が例示される。
【００４２】pN/Pプラスミドの合成 pN/Pは、任意の適当な手段によって調製することができる。pN/Pを調製する方
法の一つに、いわゆるレシピエントウイルスプラスミドといわゆる二重選択カセ
ットドナープラスミドとの間の二重組換えを利用する方法がある（図4参照）。 レシピエントウイルスプラスミドは、第1マーカー遺伝子、ΨRecもしくはURES部
位、および真核生物ウイルスと高い相同性を有する1または２以上のDNA断片を含
む。pN/P産物プラスミドが任意の真核生物ウイルスITRをも含有している場合に は、該レシピエントウイルスプラスミドもまた、しばしばこれらのITRを含有し ている。任意のITRならびに真核生物ウイルスと相同性を有するDNAは、レシピエ
ントウイルスプラスミド内のΨRec部位と、独立したポジティブ選択マーカー遺 伝子の反対側ということで定義されるDNA断片上に位置している。
法の一つに、いわゆるレシピエントウイルスプラスミドといわゆる二重選択カセ
ットドナープラスミドとの間の二重組換えを利用する方法がある（図4参照）。 レシピエントウイルスプラスミドは、第1マーカー遺伝子、ΨRecもしくはURES部
位、および真核生物ウイルスと高い相同性を有する1または２以上のDNA断片を含
む。pN/P産物プラスミドが任意の真核生物ウイルスITRをも含有している場合に は、該レシピエントウイルスプラスミドもまた、しばしばこれらのITRを含有し ている。任意のITRならびに真核生物ウイルスと相同性を有するDNAは、レシピエ
ントウイルスプラスミド内のΨRec部位と、独立したポジティブ選択マーカー遺 伝子の反対側ということで定義されるDNA断片上に位置している。
【００４３】 二重選択カセットドナープラスミドは、二重選択カセット（最適には上述の6 つの遺伝的要素を含む）を含む。二重選択カセットは大抵最終的には所望のpN/P
プラスミドに備わるであろう二重選択カセットと同一のものである。ウイルス レシピエントプラスミドにとって好ましい方法が環状であるのに対し、DSCドナ ープラスミドは線状である。
プラスミドに備わるであろう二重選択カセットと同一のものである。ウイルス レシピエントプラスミドにとって好ましい方法が環状であるのに対し、DSCドナ ープラスミドは線状である。
【００４４】 トランスフェクションならびに二重組換え事象の後、所望のpN/Pプラスミドを
含むコロニーを、pN/Pの独立したポジティブ選択マーカー遺伝子と二重選択カセ
ットのポジティブ選択遺伝子の両方への、それらの耐性に従って選択することが
できる。すなわち、所望のpN/Pプラスミドを含む細菌コロニーは、産物であるpN
/Pプラスミドを使用することができるので容易に同定することができる。さらに
、2つの予め存在しているpN/Pプラスミド実施態様の相同組換え等によって、ま たルーチンな分子生物学的方法（pN/Pプラスミドまたは他のプラスミドの、制限
消化産物のライゲーション、および位置指定もしくは領域特異的突然変異を含む
）によって等、pN/Pプラスミドのさらなる実施態様を作りだす多くの他の方法が
存在することが認識されるであろう。
含むコロニーを、pN/Pの独立したポジティブ選択マーカー遺伝子と二重選択カセ
ットのポジティブ選択遺伝子の両方への、それらの耐性に従って選択することが
できる。すなわち、所望のpN/Pプラスミドを含む細菌コロニーは、産物であるpN
/Pプラスミドを使用することができるので容易に同定することができる。さらに
、2つの予め存在しているpN/Pプラスミド実施態様の相同組換え等によって、ま たルーチンな分子生物学的方法（pN/Pプラスミドまたは他のプラスミドの、制限
消化産物のライゲーション、および位置指定もしくは領域特異的突然変異を含む
）によって等、pN/Pプラスミドのさらなる実施態様を作りだす多くの他の方法が
存在することが認識されるであろう。
【００４５】 勿論、当業者であれば、個々の所望のpN/Pプラスミドを得るための多数の技術
が存在することを認識するであろう。従って、pN/Pプラスミドの合成についての
以下の考察は、発明を明らかにするために示されるものであって、発明の範囲の
いかなる限定をも意図するものではない。
が存在することを認識するであろう。従って、pN/Pプラスミドの合成についての
以下の考察は、発明を明らかにするために示されるものであって、発明の範囲の
いかなる限定をも意図するものではない。
【００４６】pN/Pプラスミドの使用 本発明の任意の個々のpN/Pベクターを、1または２以上の、以下の一般的な方 法に従って利用することができる（図3参照）。
【００４７】 第1の方法（図3の「方法1」）は、二重選択カセット内にあるユニーク制限酵 素部位を切断する制限酵素を用いたpN/Pの線状化を含む。第1および第2の相同領
域に高い相同性を有するDNA断片を含む第2のDNA（線状または環状）を、線状化p
N/Pベクターと一緒に細菌宿主に同時形質転換する。ある実施態様では、pN/Pを 制限消化に付さず、むしろ第2のDNAが線状であるのに対し環状プラスミドのまま
残しておく。細菌宿主へのDNAのトランスフェクションの後、宿主によって供せ られる酵素が2つの相同組換えを仲介する。今ひとつの実施態様では、第2のDNA は線状であり、プラスミド中に相同的に組換えられるのではなくユニーク制限部
位でpN/Pに連結される。
域に高い相同性を有するDNA断片を含む第2のDNA（線状または環状）を、線状化p
N/Pベクターと一緒に細菌宿主に同時形質転換する。ある実施態様では、pN/Pを 制限消化に付さず、むしろ第2のDNAが線状であるのに対し環状プラスミドのまま
残しておく。細菌宿主へのDNAのトランスフェクションの後、宿主によって供せ られる酵素が2つの相同組換えを仲介する。今ひとつの実施態様では、第2のDNA は線状であり、プラスミド中に相同的に組換えられるのではなくユニーク制限部
位でpN/Pに連結される。
【００４８】 次いで、宿主は適当な期間（例えば2-24時間）、二重選択カセットの第1ポジ ティブ選択マーカー遺伝子に選択性のある条件下で維持される。その後、形質転
換された細菌宿主は、ネガティブ選択遺伝子プロモーターが活性となる（すなわ
ちネガティブ選択遺伝子プロモーターが誘導および／または脱抑制(derepress) されるか、あるいはまたネガティブ選択遺伝子プロモーターとして構成プロモー
ターが使用されている場合には、ネガティブ選択遺伝子産物の基質を増殖培地ま
たは基質に添加する）ような条件下で生育させる。次いで個々の生存細胞を単離
し、増殖させ、そして所望のベクター、pDesiredをスクリーニングする。プラス
ミドpDesiredは、本来は、所望の真核生物ウイルス構築物を含有するようなやり
方で第2DNAと相同的に組換えられたpN/Pベクターである。本発明の方法では、得
られた細菌コロニーはポジティブ選択遺伝子を有しているはずであり、且つ二重
選択カセットのネガティブ選択遺伝子を有していていないはずなので、pDesired
を含む個々の細胞単離物を標準的な技術によって同定することは、（所望の構築
物の構築ならびに同定について）従来の技術に比べて非常に簡単である。
換された細菌宿主は、ネガティブ選択遺伝子プロモーターが活性となる（すなわ
ちネガティブ選択遺伝子プロモーターが誘導および／または脱抑制(derepress) されるか、あるいはまたネガティブ選択遺伝子プロモーターとして構成プロモー
ターが使用されている場合には、ネガティブ選択遺伝子産物の基質を増殖培地ま
たは基質に添加する）ような条件下で生育させる。次いで個々の生存細胞を単離
し、増殖させ、そして所望のベクター、pDesiredをスクリーニングする。プラス
ミドpDesiredは、本来は、所望の真核生物ウイルス構築物を含有するようなやり
方で第2DNAと相同的に組換えられたpN/Pベクターである。本発明の方法では、得
られた細菌コロニーはポジティブ選択遺伝子を有しているはずであり、且つ二重
選択カセットのネガティブ選択遺伝子を有していていないはずなので、pDesired
を含む個々の細胞単離物を標準的な技術によって同定することは、（所望の構築
物の構築ならびに同定について）従来の技術に比べて非常に簡単である。
【００４９】 pN/Pを利用する、第2、第3の一般的な方法（それぞれ図3の「方法2」、「方法
3」）は、同様の方法で開始し、第2DNA（第2の方法では、第2DNAは線状であって
もよいが好ましくは環状）と一緒にpN/Pをトランスフェクトすることを含む。第
2DNA（図3に示すように）は、pN/Pによって担持されるものとは異なる、また、D
SCのポジティブ選択遺伝子とは異なる、第2ポジティブ選択マーカー遺伝子（例 えばアンピシリン耐性遺伝子）を含む。細菌宿主を2つのプラスミドで同時形質 転換し、第1（pN/Pの）および第2（第2DNAベクターの）ポジティブ選択マーカー
遺伝子の両方に選択的な条件下（例えばカナマイシンおよびアンピシリン存在下
）で増殖させる。2つの組換え産物は、この時点で起こり得る多数の可能な組換 え事象から恐らく生じるものであろう。まず、第1及び第2の相同領域を両方とも
利用した二重組換え事象が比較的稀に生じ得、所望のベクターが産生される。第
2に、よりありそうなことには、単組換え事象が起こり、両方の出発ベクターを 含む単一ベクターを生み出すことができる。所望の構築物を含むコロニーを直接
スクリーニング（例えばPCR解析もしくはコロニーリフト）すること無しに、所 望の構築物を含むそれらの細菌を、適当な増殖条件の使用を通じて選択すること
ができる。次いで、形質転換した培養物を、有糸分裂および組換え事象が起こる
、適当な期間インキュベートする。この時点で、第2、第3の一般的な方法が枝分
かれする。
3」）は、同様の方法で開始し、第2DNA（第2の方法では、第2DNAは線状であって
もよいが好ましくは環状）と一緒にpN/Pをトランスフェクトすることを含む。第
2DNA（図3に示すように）は、pN/Pによって担持されるものとは異なる、また、D
SCのポジティブ選択遺伝子とは異なる、第2ポジティブ選択マーカー遺伝子（例 えばアンピシリン耐性遺伝子）を含む。細菌宿主を2つのプラスミドで同時形質 転換し、第1（pN/Pの）および第2（第2DNAベクターの）ポジティブ選択マーカー
遺伝子の両方に選択的な条件下（例えばカナマイシンおよびアンピシリン存在下
）で増殖させる。2つの組換え産物は、この時点で起こり得る多数の可能な組換 え事象から恐らく生じるものであろう。まず、第1及び第2の相同領域を両方とも
利用した二重組換え事象が比較的稀に生じ得、所望のベクターが産生される。第
2に、よりありそうなことには、単組換え事象が起こり、両方の出発ベクターを 含む単一ベクターを生み出すことができる。所望の構築物を含むコロニーを直接
スクリーニング（例えばPCR解析もしくはコロニーリフト）すること無しに、所 望の構築物を含むそれらの細菌を、適当な増殖条件の使用を通じて選択すること
ができる。次いで、形質転換した培養物を、有糸分裂および組換え事象が起こる
、適当な期間インキュベートする。この時点で、第2、第3の一般的な方法が枝分
かれする。
【００５０】 第2の方法は、pDesiredを製造するために、まず二重組換え事象を頼るもので ある。結果として得られる二重組換え事象のプラスミド産物は、pDesired、およ
びネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子を含む新規プラスミドを含んでい
る。従って、活性のあるネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子とを含むプ
ラスミドを含まない細胞に、pDesiredが付与される、あるいは該細胞内に分離(s
egrate)されるように、細菌培養を適当な数の世代、拡大（あるいは倍加）する 。この拡大は、第1ポジティブ選択マーカー遺伝子は選別する（すなわちpN/Pとp
Desiredの選択）が第2ポジティブ選択マーカー遺伝子を選別しない（ドナープラ
スミドを選択しない）条件下で行われる。プラスミドを分離するのに用いられる
最小平均倍加数は、約1と少なくてもよいが、好ましくは約20である。最大倍加 数は、好ましくは約40であるが、200もしくはそれ以上と多くてもよい。いった ん、pDesiredがネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子を含むプラスミドを
持たない細胞に分離されたら、ネガティブ選択遺伝子を誘導し、生き残った細胞
を単離する（例えばコロニーの平板培養）。これらの条件下で生育した単離物は
、所望の産物ベクター(pDesired)を含んでいる可能性が極めて高く、従ってpDes
iredの存在が容易に、また効率的にスクリーニングされる。
びネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子を含む新規プラスミドを含んでい
る。従って、活性のあるネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子とを含むプ
ラスミドを含まない細胞に、pDesiredが付与される、あるいは該細胞内に分離(s
egrate)されるように、細菌培養を適当な数の世代、拡大（あるいは倍加）する 。この拡大は、第1ポジティブ選択マーカー遺伝子は選別する（すなわちpN/Pとp
Desiredの選択）が第2ポジティブ選択マーカー遺伝子を選別しない（ドナープラ
スミドを選択しない）条件下で行われる。プラスミドを分離するのに用いられる
最小平均倍加数は、約1と少なくてもよいが、好ましくは約20である。最大倍加 数は、好ましくは約40であるが、200もしくはそれ以上と多くてもよい。いった ん、pDesiredがネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子を含むプラスミドを
持たない細胞に分離されたら、ネガティブ選択遺伝子を誘導し、生き残った細胞
を単離する（例えばコロニーの平板培養）。これらの条件下で生育した単離物は
、所望の産物ベクター(pDesired)を含んでいる可能性が極めて高く、従ってpDes
iredの存在が容易に、また効率的にスクリーニングされる。
【００５１】 第3の方法は、はじめに二重組換え事象を得ることに頼るものではなく、その 代わりにより頻繁に生じる単組換え事象を利用する。この単組換え事象のプラス
ミド中間体（および他のプラスミド）はスクリーニングを必要とすることなく増
殖する。次いで、増殖したベクター（所望の中間ベクターを含む）は、二重選択
カセットに含まれるユニーク制限酵素認識部位で線状化される。
ミド中間体（および他のプラスミド）はスクリーニングを必要とすることなく増
殖する。次いで、増殖したベクター（所望の中間ベクターを含む）は、二重選択
カセットに含まれるユニーク制限酵素認識部位で線状化される。
【００５２】 制限消化は、インビボあるいはインビトロのどちらでも起こり得る（その場合
、ベクターが再ライゲーションするのを防ぐためにホスファターゼもまた可能で
ある）。インビボ制限消化反応を利用する場合、構成的にユニーク制限酵素を発
現している細胞内に該プラスミドを同時形質転換することができ、あるいはまた
ユニーク制限部位を切断する酵素を制御的に発現している細菌宿主を用いること
ができる。
、ベクターが再ライゲーションするのを防ぐためにホスファターゼもまた可能で
ある）。インビボ制限消化反応を利用する場合、構成的にユニーク制限酵素を発
現している細胞内に該プラスミドを同時形質転換することができ、あるいはまた
ユニーク制限部位を切断する酵素を制御的に発現している細菌宿主を用いること
ができる。
【００５３】 URES切断後、第1ポジティブ選択マーカー遺伝子に選択的な条件下、細菌細胞 内で線状化プラスミドをインキュベートし、ネガティブ選択遺伝子を活性な状態
にして第3の方法を続ける。第1ポジティブ選択マーカー遺伝子を含む環状化プラ
スミドを含み、且つ活性なネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子を含まな
いものでなければ、これらの条件下で細菌細胞が生き残ることはできないであろ
うということが認識されるであろう。これは、大抵、pDesiredを製造するのに必
要とされる第2の相同組換えによって成し遂げられる。
にして第3の方法を続ける。第1ポジティブ選択マーカー遺伝子を含む環状化プラ
スミドを含み、且つ活性なネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子を含まな
いものでなければ、これらの条件下で細菌細胞が生き残ることはできないであろ
うということが認識されるであろう。これは、大抵、pDesiredを製造するのに必
要とされる第2の相同組換えによって成し遂げられる。
【００５４】 たとえ線状化pN/Pプラスミドのかなりの部分が細菌の酵素によって再ライゲー
ションされたとしても、これらの「混入物」を含む細胞は排除される。なぜなら
当該細胞がネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子に導入された欠損を制限
消化によって修復するからである。
ションされたとしても、これらの「混入物」を含む細胞は排除される。なぜなら
当該細胞がネガティブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子に導入された欠損を制限
消化によって修復するからである。
【００５５】 相同組換え反応は比較的低い頻度で起こり、多数の反応産物をもたらす。第3 の方法は、pDesiredを製造するために必要とされる2つの組換え事象の各々を時 間的に分け隔てることによってこの効率の悪さを有効に減じる。さらに、相同組
換えは、産物を消費して反応物の蓄積をもたらす可逆的な反応である。3つの方 法は全て、第1ポジティブ選択マーカー遺伝子が存在することと活性なネガティ ブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子とが存在しないこととを同時に要求すること
によって、逆相同組換えにより得られたプラスミドを有する細胞にとって、ある
いは未反応プラスミドを有する細胞にとって不利な選択をする。
換えは、産物を消費して反応物の蓄積をもたらす可逆的な反応である。3つの方 法は全て、第1ポジティブ選択マーカー遺伝子が存在することと活性なネガティ ブ選択遺伝子プロモーターと遺伝子とが存在しないこととを同時に要求すること
によって、逆相同組換えにより得られたプラスミドを有する細胞にとって、ある
いは未反応プラスミドを有する細胞にとって不利な選択をする。
【００５６】pN/Pとの使用の為の第2DNAの選択 上述の3つの方法の各々において、第2DNAは個々のpN/Pベクターに挿入される 。別の好ましい実施態様では、該pN/Pは、さらに二重選択カセットを含む真核生
物ウイルスベクターを含む。この実施態様により、パッセンジャー遺伝子あるい
は新しいウイルス遺伝子は、二重選択カセットによって占拠されているベクター
の一部へと工作される。この結果を遂行するために、第2DNAは、pDesiredから得
られる真核生物ウイルスベクターの意図する標的細胞内で機能的なプロモーター
を含んでいてもよい。機能的プロモーターは、パッセンジャー遺伝子あるいは新
しいウイルス遺伝子に機能的に連結している。あるいはまた、該パッセンジャー
遺伝子を、該ウイルスベクターにもとから存在するようなプロモーターの制御下
となるように該ベクター内に挿入してもよい（例えば、DSCの2つの相同領域のう
ちの１つがプロモーターであるか、または機能的プロモーターの一部を含む実施
態様を参照）。勿論、該パッセンジャー遺伝子は、熟練者にとって興味あるRNA やタンパク質をコードしている任意の遺伝子でもよい。治療遺伝子、インビトロ
および／またはインビボで研究されるべきタンパク質をコードしている遺伝子、
触媒RNAをコードしている遺伝子、アンチセンスRNAをコードしている遺伝子、お
よび改変したウイルス遺伝子が興味あるパッセンジャー遺伝子の可能なものとし
て例示される。
物ウイルスベクターを含む。この実施態様により、パッセンジャー遺伝子あるい
は新しいウイルス遺伝子は、二重選択カセットによって占拠されているベクター
の一部へと工作される。この結果を遂行するために、第2DNAは、pDesiredから得
られる真核生物ウイルスベクターの意図する標的細胞内で機能的なプロモーター
を含んでいてもよい。機能的プロモーターは、パッセンジャー遺伝子あるいは新
しいウイルス遺伝子に機能的に連結している。あるいはまた、該パッセンジャー
遺伝子を、該ウイルスベクターにもとから存在するようなプロモーターの制御下
となるように該ベクター内に挿入してもよい（例えば、DSCの2つの相同領域のう
ちの１つがプロモーターであるか、または機能的プロモーターの一部を含む実施
態様を参照）。勿論、該パッセンジャー遺伝子は、熟練者にとって興味あるRNA やタンパク質をコードしている任意の遺伝子でもよい。治療遺伝子、インビトロ
および／またはインビボで研究されるべきタンパク質をコードしている遺伝子、
触媒RNAをコードしている遺伝子、アンチセンスRNAをコードしている遺伝子、お
よび改変したウイルス遺伝子が興味あるパッセンジャー遺伝子の可能なものとし
て例示される。
【００５７】 多数のパッセンジャー遺伝子を含有するウイルスベクターライブラリーもまた
得ることができる。該ライブラリーはまた、相同組換えによって調製される中間
ベクターのコスミドクローニングの使用を通じて作ることもできる。該ライブラ
リーは、同一または異なってもよく一回の反応で同時にアッセンブリされる多数
の遺伝的要素からなる。これらのライブラリーは、機能的ゲノムの研究（例えば
ゲノムおよび相補DNA配列の機能や特性の同定）、ウイルスベクター設計、個々 の遺伝子あるいは遺伝子産物の構造−機能研究を含め、多数の有用性を有するが
、これらに限定されるものではないことが認識されるであろう。
得ることができる。該ライブラリーはまた、相同組換えによって調製される中間
ベクターのコスミドクローニングの使用を通じて作ることもできる。該ライブラ
リーは、同一または異なってもよく一回の反応で同時にアッセンブリされる多数
の遺伝的要素からなる。これらのライブラリーは、機能的ゲノムの研究（例えば
ゲノムおよび相補DNA配列の機能や特性の同定）、ウイルスベクター設計、個々 の遺伝子あるいは遺伝子産物の構造−機能研究を含め、多数の有用性を有するが
、これらに限定されるものではないことが認識されるであろう。
【００５８】 第2DNAでは、プロモーターを有するかあるいは有さないパッセンジャー遺伝子
が、真核生物ウイルスベクターの所望の設計に従って選択される第1および第2の
相同領域の近傍に位置する。つまり、第1相同領域は、パッセンジャー遺伝子の 左側の真核生物ウイルスベクターの一部の領域に相同性があり、第2相同領域は 、パッセンジャー遺伝子の右側の領域に相同性がある。従ってpN/Pプラスミドと
第2DNAとの、第1および第2相同領域での二重相同組換えにより、ネガティブ選択
遺伝子を含有する二重選択カセットを含めて、第1および第2の相同組換え領域間
のウイルスベクター配列の全部がベクターから除去される。
が、真核生物ウイルスベクターの所望の設計に従って選択される第1および第2の
相同領域の近傍に位置する。つまり、第1相同領域は、パッセンジャー遺伝子の 左側の真核生物ウイルスベクターの一部の領域に相同性があり、第2相同領域は 、パッセンジャー遺伝子の右側の領域に相同性がある。従ってpN/Pプラスミドと
第2DNAとの、第1および第2相同領域での二重相同組換えにより、ネガティブ選択
遺伝子を含有する二重選択カセットを含めて、第1および第2の相同組換え領域間
のウイルスベクター配列の全部がベクターから除去される。
【００５９】 ネガティブ選択遺伝子および（特に）ポジティブ選択遺伝子の一部が、第1お よび／または第2の相同領域の一部を構成してもよいことが認識されるであろう 。つまり、pDesiredの製造において、二重選択カセットの全てが、必ずしもpN/P
の範囲外で組換えられる必要はないのである。加えて、二重選択カセットの遠位
のDNA断片が、第1および／または第2の相同領域として使用され得ることが認識 されるであろう（例えばアデノウイルスのITRは、アデノウイルスゲノムのE2A領
域にさらに二重選択カセットを含むアデノウイルスベクターを含むpN/Pプラスミ
ドとの相同組換えについて、第1および第2の相同領域として働く）。本実施態様
では、ITRを含まない全ウイルス配列が、第2DNAとの組換えによって該ベクター から排除されている、真核生物ウイルスレプリコンが作り出される。勿論、該レ
プリコンはそれがまたウイルスパッケージング部位を含むように作り出されても
よく、それによって該レプリコンは、必要なパッケージング構成要素を含む溶液
中（インビトロ）あるいは細胞内（インビボ）でパッケージングされ得る。すな
わち、pN/Pと第2DNAとの間の相同組換えは、真核生物ウイルスベクター内へ配列
を同時に挿入し、そして真核生物ウイルスベクター内に欠失を形成させるために
使用することもできる。
の範囲外で組換えられる必要はないのである。加えて、二重選択カセットの遠位
のDNA断片が、第1および／または第2の相同領域として使用され得ることが認識 されるであろう（例えばアデノウイルスのITRは、アデノウイルスゲノムのE2A領
域にさらに二重選択カセットを含むアデノウイルスベクターを含むpN/Pプラスミ
ドとの相同組換えについて、第1および第2の相同領域として働く）。本実施態様
では、ITRを含まない全ウイルス配列が、第2DNAとの組換えによって該ベクター から排除されている、真核生物ウイルスレプリコンが作り出される。勿論、該レ
プリコンはそれがまたウイルスパッケージング部位を含むように作り出されても
よく、それによって該レプリコンは、必要なパッケージング構成要素を含む溶液
中（インビトロ）あるいは細胞内（インビボ）でパッケージングされ得る。すな
わち、pN/Pと第2DNAとの間の相同組換えは、真核生物ウイルスベクター内へ配列
を同時に挿入し、そして真核生物ウイルスベクター内に欠失を形成させるために
使用することもできる。
【００６０】pDesiredの使用 所望のプラスミドpDesiredは、pN/Pを利用する上述の3つの方法のいずれかの ような任意の適当な方法によって、あるいはこれら一般的な方法の任意の適当な
変法によって得ることができる。これらのプラスミドに含まれる真核生物ウイル
スベクターは、少なくとも1つのITRがDNAの自由末端に適当に近いところに位置 していれば（約2000 bp以内、好ましくは約300bp以内、より好ましくは約100bp 以内、最も好ましくは約35bp以内）、許容真核細胞内で複製することができる。
そのような自由末端は、適当な制限部位が利用でき、制限酵素との接触が完全に
ウイルスベクターを破壊するということがなければ、該制限酵素での切断によっ
て創製することができる（pN/P2を用いてpDesiredを形成する場合のように）。 あるいはまた、適切なリコンビナーゼ（例えばCre）と少なくとも1つの適切なΨ
Rec部位（例えばlox部位）を含有するオリゴヌクレオチドを含む溶液（インビト
ロ）あるいは細胞（インビボ）内にpDesiredを置くことによって、機能的真核生
物ウイルスゲノムをpDesiredから単離することができる。リコンビナーゼ反応（
例えばCre-lox）により、末端に近位の（すなわち両末端の約2000bp以内、好ま しくは300bp以内、より好ましくは約100bp以内、最も好ましくは約35bp以内；図
5参照）ITRを有する真核生物ウイルスベクターが得られる。リコンビナーゼ反応
はインビトロあるいはインビボで実施することができる。2つの描写されている ΨRec部位が、ともに機能的ではあるが互換性がない場合には（そのような部位 は当分野で公知である；図6も参照）、当該系にさらに柔軟性を与えることがで きる。そのようにして製せられた該組換え真核生物ウイルスベクターは、許容真
核細胞にトランスフェクトすることができ、該細胞内で複製することができる。
pDesiredによって構成される該真核生物ウイルスベクターはパッセンジャー遺伝
子をインビボあるいはインビトロで標的細胞に運搬することができる。
変法によって得ることができる。これらのプラスミドに含まれる真核生物ウイル
スベクターは、少なくとも1つのITRがDNAの自由末端に適当に近いところに位置 していれば（約2000 bp以内、好ましくは約300bp以内、より好ましくは約100bp 以内、最も好ましくは約35bp以内）、許容真核細胞内で複製することができる。
そのような自由末端は、適当な制限部位が利用でき、制限酵素との接触が完全に
ウイルスベクターを破壊するということがなければ、該制限酵素での切断によっ
て創製することができる（pN/P2を用いてpDesiredを形成する場合のように）。 あるいはまた、適切なリコンビナーゼ（例えばCre）と少なくとも1つの適切なΨ
Rec部位（例えばlox部位）を含有するオリゴヌクレオチドを含む溶液（インビト
ロ）あるいは細胞（インビボ）内にpDesiredを置くことによって、機能的真核生
物ウイルスゲノムをpDesiredから単離することができる。リコンビナーゼ反応（
例えばCre-lox）により、末端に近位の（すなわち両末端の約2000bp以内、好ま しくは300bp以内、より好ましくは約100bp以内、最も好ましくは約35bp以内；図
5参照）ITRを有する真核生物ウイルスベクターが得られる。リコンビナーゼ反応
はインビトロあるいはインビボで実施することができる。2つの描写されている ΨRec部位が、ともに機能的ではあるが互換性がない場合には（そのような部位 は当分野で公知である；図6も参照）、当該系にさらに柔軟性を与えることがで きる。そのようにして製せられた該組換え真核生物ウイルスベクターは、許容真
核細胞にトランスフェクトすることができ、該細胞内で複製することができる。
pDesiredによって構成される該真核生物ウイルスベクターはパッセンジャー遺伝
子をインビボあるいはインビトロで標的細胞に運搬することができる。
【００６１】 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、勿論、それらは本発明
の範囲を何ら限定するように解釈されるべきではない。 実施例実施例1 本実施例において、pN/Pの好ましい調製方法を説明する。本方法は、比較的多
数のpN/P含有コロニーを産生するので、好ましい方法である。
の範囲を何ら限定するように解釈されるべきではない。 実施例実施例1 本実施例において、pN/Pの好ましい調製方法を説明する。本方法は、比較的多
数のpN/P含有コロニーを産生するので、好ましい方法である。
【００６２】 本方法ではレシピエントウイルスプラスミドと二重選択カセットドナープラス
ミドとの間の二重相同組換えを利用した。レシピエントウイルスプラスミドは、
適当なポジティブ選択遺伝子（すなわちカナマイシン耐性遺伝子）と、適当な複
製開始点（すなわちp15複製開始点）とを含有していた。加えて、レシピエント プラスミドは、真核生物ウイルスに高い相同性を有するDSCの2つの領域と相同性
のある2つの断片を含有していた。DSCドナープラスミドは、別のポジティブ選択
遺伝子（すなわちアンピシリン耐性遺伝子）と二重選択カセットを含有していた
。
ミドとの間の二重相同組換えを利用した。レシピエントウイルスプラスミドは、
適当なポジティブ選択遺伝子（すなわちカナマイシン耐性遺伝子）と、適当な複
製開始点（すなわちp15複製開始点）とを含有していた。加えて、レシピエント プラスミドは、真核生物ウイルスに高い相同性を有するDSCの2つの領域と相同性
のある2つの断片を含有していた。DSCドナープラスミドは、別のポジティブ選択
遺伝子（すなわちアンピシリン耐性遺伝子）と二重選択カセットを含有していた
。
【００６３】 組換えは種々の条件：(1) 4 ng の切断レシピエントウイルスプラスミドを3 n
g の切断DSCドナープラスミドと組み合わせた；(2) 40 ng の切断レシピエント プラスミドを30 ng の切断ドナープラスミドと組み合わせた；(3) 4 ng の非切 断レシピエントプラスミドを3 ng の切断ドナープラスミドと組み合わせた；(4)
4 ng の非切断レシピエントプラスミドを30 ng の切断ドナープラスミドと組み
合わせた；(5) 4 ng の非切断レシピエントプラスミドを6 ng の非切断ドナープ
ラスミドと組み合わせた；および(6) 4 ng の非切断レシピエントプラスミドを6
0 ng の非切断ドナープラスミドと組み合わせた のもとで行った。各組換えを形質転換容量50μlで行った。種々の組換えの結果 を下記の表1に述べる。
g の切断DSCドナープラスミドと組み合わせた；(2) 40 ng の切断レシピエント プラスミドを30 ng の切断ドナープラスミドと組み合わせた；(3) 4 ng の非切 断レシピエントプラスミドを3 ng の切断ドナープラスミドと組み合わせた；(4)
4 ng の非切断レシピエントプラスミドを30 ng の切断ドナープラスミドと組み
合わせた；(5) 4 ng の非切断レシピエントプラスミドを6 ng の非切断ドナープ
ラスミドと組み合わせた；および(6) 4 ng の非切断レシピエントプラスミドを6
0 ng の非切断ドナープラスミドと組み合わせた のもとで行った。各組換えを形質転換容量50μlで行った。種々の組換えの結果 を下記の表1に述べる。
【００６４】
【表１】
【００６５】 表1の結果から明らかなように、低濃度の切断あるいは非切断のレシピエント プラスミドは、低濃度の切断あるいは非切断のドナープラスミドと一緒では、全
くコロニーを産生しなかった（組換え反応1、3および5参照）。対照的に、高濃 度の切断レシピエントプラスミドおよび低濃度の非切断レシピエントプラスミド
は、高濃度の切断ドナープラスミドと一緒では、それぞれ2コロニー、および26 コロニーを産生し、それらのいくつかはポジティブ（すなわちpN/Pを含有するコ
ロニー）であった（組換え反応2および4参照）。低濃度の非切断レシピエントプ
ラスミドは、高濃度の非切断ドナープラスミドと一緒では、29コロニーを産生し
たものの、これらのコロニーのうちポジティブ（すなわちpN/Pを含有するコロニ
ー）なものはなかった（組換え反応6参照）。
くコロニーを産生しなかった（組換え反応1、3および5参照）。対照的に、高濃 度の切断レシピエントプラスミドおよび低濃度の非切断レシピエントプラスミド
は、高濃度の切断ドナープラスミドと一緒では、それぞれ2コロニー、および26 コロニーを産生し、それらのいくつかはポジティブ（すなわちpN/Pを含有するコ
ロニー）であった（組換え反応2および4参照）。低濃度の非切断レシピエントプ
ラスミドは、高濃度の非切断ドナープラスミドと一緒では、29コロニーを産生し
たものの、これらのコロニーのうちポジティブ（すなわちpN/Pを含有するコロニ
ー）なものはなかった（組換え反応6参照）。
【００６６】 pN/Pを調製するのに好ましい条件は、低濃度の非切断レシピエントウイルスプ
ラスミドおよび高濃度の切断DSCドナープラスミドである。これらの条件下では 、全26コロニーが産生された。これらのコロニーの85パーセントはポジティブで
あり、結果として、全22コロニーがpN/Pを含有していた（組換え反応4参照）。 その他のレシピエントプラスミドとドナープラスミドの組み合わせでは、実質的
な数のポジティブコロニーは産生されなかった。
ラスミドおよび高濃度の切断DSCドナープラスミドである。これらの条件下では 、全26コロニーが産生された。これらのコロニーの85パーセントはポジティブで
あり、結果として、全22コロニーがpN/Pを含有していた（組換え反応4参照）。 その他のレシピエントプラスミドとドナープラスミドの組み合わせでは、実質的
な数のポジティブコロニーは産生されなかった。
【００６７】実施例2 本実施例において、アデノウイルスゲノムのE1およびE4領域の1または2以上の
必須の遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクターを調製するためのpN/P
の1実施態様の使用について説明する。本実施例で製造されるアデノウイルスベ クターは、アデノウイルスゲノムのE3領域をもまた欠損している。
必須の遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクターを調製するためのpN/P
の1実施態様の使用について説明する。本実施例で製造されるアデノウイルスベ クターは、アデノウイルスゲノムのE3領域をもまた欠損している。
【００６８】 血清型5アデノウイルスの変異体AdE1/IX(B/N)E3(10)E4(BgGus)を、公然に入手
可能なpACYC177(New England BioLabs)のBan I 部位とDrd I 部位との間にクロ ーニングした〔それによりアンピシリン耐性遺伝子は破壊されるが、p15開始点 （複製）、ならびにカナマイシン耐性遺伝子は完全なまま残される〕。AdE1/IX(
B/N)E3(10)E4(BgGus)は、356-4120配列(E1-IX；アデノウイルスゲノムのE1 およ
びpIX 領域を欠失させる)、28592-30470配列(E3；領域E3遺伝子産物の発現を不 可能にする、Xba I 消化結果物)、および32832-35564配列 (E4)を除くAd5の野生
型の配列を有する。構成的に発現される（すなわちEM-7プロモーター）ble遺伝 子（ゼオシン耐性）およびTacプロモーター（すなわちIPTGで制御可能なTrp/lac
ハイブリッドプロモーター）を含む二重選択カセットは、OmpA/Flag/NP-1 キメ ラ遺伝子の発現を、ble遺伝子とは反対の方向に推し進める。ユニークなSwa I部
位がTacプロモーターとキメラ遺伝子の間に存在する。E4領域内の欠失した配列 を、ヒトベータ−グロビンポリアデニル化配列、β−グルクロニダーゼのコード
配列およびSV40初期ポリアデニル化配列で置き換える（右から左）。β−グルク
ロニダーゼ遺伝子はアデノウイルスゲノムについて3'-5'に方向付けられている 。β−グルクロニダーゼ遺伝子の近傍にある2つのポリアデニル化配列がβ−グ ルクロニダーゼ遺伝子の発現を妨げる。
可能なpACYC177(New England BioLabs)のBan I 部位とDrd I 部位との間にクロ ーニングした〔それによりアンピシリン耐性遺伝子は破壊されるが、p15開始点 （複製）、ならびにカナマイシン耐性遺伝子は完全なまま残される〕。AdE1/IX(
B/N)E3(10)E4(BgGus)は、356-4120配列(E1-IX；アデノウイルスゲノムのE1 およ
びpIX 領域を欠失させる)、28592-30470配列(E3；領域E3遺伝子産物の発現を不 可能にする、Xba I 消化結果物)、および32832-35564配列 (E4)を除くAd5の野生
型の配列を有する。構成的に発現される（すなわちEM-7プロモーター）ble遺伝 子（ゼオシン耐性）およびTacプロモーター（すなわちIPTGで制御可能なTrp/lac
ハイブリッドプロモーター）を含む二重選択カセットは、OmpA/Flag/NP-1 キメ ラ遺伝子の発現を、ble遺伝子とは反対の方向に推し進める。ユニークなSwa I部
位がTacプロモーターとキメラ遺伝子の間に存在する。E4領域内の欠失した配列 を、ヒトベータ−グロビンポリアデニル化配列、β−グルクロニダーゼのコード
配列およびSV40初期ポリアデニル化配列で置き換える（右から左）。β−グルク
ロニダーゼ遺伝子はアデノウイルスゲノムについて3'-5'に方向付けられている 。β−グルクロニダーゼ遺伝子の近傍にある2つのポリアデニル化配列がβ−グ ルクロニダーゼ遺伝子の発現を妨げる。
【００６９】 次いで、pN/P構築物を、任意の所望のパッセンジャー遺伝子を含むように改変
することができる。適当なパッセンジャー遺伝子の2つは、CMV前初期プロモータ
ーおよびSV40ポリアデニル化配列の制御下にある、VEGF121あるいはiNOS cDNAで
ある。
することができる。適当なパッセンジャー遺伝子の2つは、CMV前初期プロモータ
ーおよびSV40ポリアデニル化配列の制御下にある、VEGF121あるいはiNOS cDNAで
ある。
【００７０】 そのような結果物を得るために、VEGF121コード配列およびiNOSコード配列を 、プラスミド（Ad5の1-355配列と3333-5792配列をも発現シグナルの反対側に含 む）内の、CMVプロモーターとSV40初期ポリアデニル化シグナルの間にクローニ ングした。CMVプロモーターは、Ad5座標3333に隣接しており、以下のように調製
されるアデノウイルスベクターについて、発現カセットが左を指すようにAd5配 列に関して左側に発現を推し進める。該プラスミドは、必要であれば(pGEM2のよ
うに)、Asc IやPac I等の適当な制限部位を含むよう改変され、且つアンピシリ ン耐性遺伝子を含有する。
されるアデノウイルスベクターについて、発現カセットが左を指すようにAd5配 列に関して左側に発現を推し進める。該プラスミドは、必要であれば(pGEM2のよ
うに)、Asc IやPac I等の適当な制限部位を含むよう改変され、且つアンピシリ ン耐性遺伝子を含有する。
【００７１】 上述のpN/P プラスミドと、少なくとも1つの、上述のVEGF121またはiNOSを含 有するプラスミドとをBJ5183（Dr. Douglas Hanahan、カリフォルニア大学、サ ンフランシスコ、の好意による）等の適当な細菌株に形質転換する。BJ5183は報
告によればRecBC sbc, laq IQ 細菌株である。形質転換されたBJ5183は、グルコ
ース、カナマイシンおよびゼオシンを含有する培地上で生育させる。小スケール
のプラスミド調製（例えばミニプレップ）を実施する。得られる結合プラスミド
調製物をSwa I（キメラNP-1遺伝子からTacプロモーターを分離する）で消化する
。線状化DNAを第2の細菌株（必要ではないが、当該株は第1の株と別のものでも よい）に形質転換させ、カナマイシンおよびグルコースを含有する培地上で一晩
、適当な温度と適当なレベルの通気で生育させる。翌日、該細胞を軽く遠心にか
けて集め、グルコースと抗生物質を含まない培地で洗浄し、グルコースを含まず
、IPTGとカナマイシンを含有する第3の増殖培地（固相）上で平板培養する。得 られたコロニーを標準の技術を用い、所望の構築物についてスクリーニングする
。所望の構築物を含む少なくとも1つのコロニー由来のプラスミドを単離する。 該DNAを線状化して2つのアデノウイルスITRのうち少なくとも1つがDNA末端の近 傍にあるようにする。それを293/ORF6細胞にトランスフェクトする。トランスフ
ェクトした細胞を100mm組織培養皿で平板培養する。
告によればRecBC sbc, laq IQ 細菌株である。形質転換されたBJ5183は、グルコ
ース、カナマイシンおよびゼオシンを含有する培地上で生育させる。小スケール
のプラスミド調製（例えばミニプレップ）を実施する。得られる結合プラスミド
調製物をSwa I（キメラNP-1遺伝子からTacプロモーターを分離する）で消化する
。線状化DNAを第2の細菌株（必要ではないが、当該株は第1の株と別のものでも よい）に形質転換させ、カナマイシンおよびグルコースを含有する培地上で一晩
、適当な温度と適当なレベルの通気で生育させる。翌日、該細胞を軽く遠心にか
けて集め、グルコースと抗生物質を含まない培地で洗浄し、グルコースを含まず
、IPTGとカナマイシンを含有する第3の増殖培地（固相）上で平板培養する。得 られたコロニーを標準の技術を用い、所望の構築物についてスクリーニングする
。所望の構築物を含む少なくとも1つのコロニー由来のプラスミドを単離する。 該DNAを線状化して2つのアデノウイルスITRのうち少なくとも1つがDNA末端の近 傍にあるようにする。それを293/ORF6細胞にトランスフェクトする。トランスフ
ェクトした細胞を100mm組織培養皿で平板培養する。
【００７２】 該トランスフェクション物を293/ORF6細胞を用いて継代し、アデノウイルスベ
クターを増幅する。該増幅したアデノウイルスベクターを細胞から、細胞破壊（
例えば凍結融解溶解）によって遊離させ、該細胞破壊残渣を遠心によりペレット
化する。得られた上清液は、アデノウイルスゲノムのE1領域内に所望の導入遺伝
子を含み、E3領域と、E1およびE4領域の必須の遺伝子機能の全てを欠損している
新しいアデノウイルスベクターを成分とする。
クターを増幅する。該増幅したアデノウイルスベクターを細胞から、細胞破壊（
例えば凍結融解溶解）によって遊離させ、該細胞破壊残渣を遠心によりペレット
化する。得られた上清液は、アデノウイルスゲノムのE1領域内に所望の導入遺伝
子を含み、E3領域と、E1およびE4領域の必須の遺伝子機能の全てを欠損している
新しいアデノウイルスベクターを成分とする。
【００７３】 ここに述べられた特許、特許出願、および刊行物を含めた全ての引例は、引用
により、そっくりそのまま組み入れられるものである。 本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい実施態様の
変更が使用され得ること、且つ本発明がここで詳細に記載された以外の方法で実
行され得ることを意図するものであることが当業者には明白であろう。したがっ
て、本発明は添付の請求の範囲に定義される該発明の精神と範囲に包含されるす
べての変更を含むものである。
により、そっくりそのまま組み入れられるものである。 本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい実施態様の
変更が使用され得ること、且つ本発明がここで詳細に記載された以外の方法で実
行され得ることを意図するものであることが当業者には明白であろう。したがっ
て、本発明は添付の請求の範囲に定義される該発明の精神と範囲に包含されるす
べての変更を含むものである。
【図１】 図１は、プラスミド pN/P の実施態様を描写するものである。
【図２】 図２は、いくつかの好ましい要素を含む pN/P プラスミドの実施態様を描写す
るものである。
るものである。
【図３】 図３は、所望の真核生物ウイルスベクターを含むプラスミド(pDesired)を調製
するためにpN/Pが使用され得る３つの工程を図示するものである。
するためにpN/Pが使用され得る３つの工程を図示するものである。
【図４】 図４は、pN/Pを調製し得る工程の1つをを図示するものである。
【図５】 図５は、pDesired がpN/P1（後述）から部分的に産生される際、所望の真核生
物ウイルスベクターをpDesiredから遊離させることができる工程の1つを描写す るものである。
物ウイルスベクターをpDesiredから遊離させることができる工程の1つを描写す るものである。
【図６】 図６は、pDesired がpN/P1から部分的に産生される際、所望のウイルスベクタ
ーをpDesiredから遊離させることができる代替的な工程を描写するものである。
ーをpDesiredから遊離させることができる代替的な工程を描写するものである。
【図７】 図７は、細菌内でアデノウイルスベクターを産生する先行技術の方法を描写す
るものである。
るものである。
【図８】 図８は、ネガティブ選択遺伝子が条件付きでサイレンシング状態にあるpN/Pの
実施態様を描写するものである。
実施態様を描写するものである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２３日（２０００．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コウベスディ、イムリ アメリカ合衆国、メリーランド州 20855、 ロックヴィル、ウォーブラー レイン 7713 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 DA02 EA02 FA02 GA11 HA20 4B065 AA90X AA95Y AC10 CA23 CA60
Claims (45)
- 【請求項１】 (a)第1位置指定相同組換え部位、および(b)第2位置指定相同
組換え部位、および(c)二重選択カセットを含むDNAであって、当該二重選択カセ
ットが(i)真核生物ウイルスまたはベクターに相同性を有する第1DNA断片および(
ii)当該真核生物ウイルスまたは真核生物ウイルスベクターに相同性を有する第2
DNA断片；(iii)ポジティブ選択遺伝子プロモーター、およびそれに機能的に連結
して、(iv)ポジティブ選択遺伝子産物をコードするDNAを含むポジティブ選択遺 伝子；(v)ネガティブ選択遺伝子プロモーター、およびそれに機能的に連結して 、(vi)ネガティブ選択遺伝子産物をコードするDNAを含むネガティブ選択遺伝子 、を含むものであるDNA。 - 【請求項２】 ファージパッケージング部位および二重選択カセットを含む
DNAであって、当該二重選択カセットは(i)真核生物ウイルスまたは真核生物ウイ
ルスベクターに相同性を有する第1DNA断片および(ii)当該真核生物ウイルスまた
は真核生物ウイルスベクターに相同性を有する第2DNA断片；(iii)ポジティブ選 択遺伝子プロモーター、およびそれに機能的に連結して、(iv)ポジティブ選択遺
伝子産物をコードするDNAを含むポジティブ選択遺伝子；(v)ネガティブ選択遺伝
子プロモーター、およびそれに機能的に連結して、(vi)ネガティブ選択遺伝子産
物をコードするDNAを含むネガティブ選択遺伝子を含み、真核生物ウイルスまた は真核生物ウイルスベクターに対し相同性を有する当該第1および第2DNA断片の うち少なくとも1つが真核生物ウイルスITRを含むものであるDNA。 - 【請求項３】 当該ファージパッケージング部位がラムダcos部位またはP1 パッケージング部位である、請求項２記載のDNA。
- 【請求項４】 (i)真核生物ウイルスまたは真核生物ウイルスベクターに相 同性を有する第1DNA断片および(ii)当該真核生物ウイルスまたは真核生物ウイル
スベクターに相同性を有する第2DNA断片；(iii)ポジティブ選択遺伝子プロモー ター、およびそれに機能的に連結して、(iv)ポジティブ選択遺伝子産物をコード
するDNA；(v)ネガティブ選択遺伝子プロモーター、およびそれに機能的に連結し
て、(vi)ネガティブ選択遺伝子産物をコードするDNAを含む二重選択カセット。 - 【請求項５】 さらにユニーク制限酵素部位を含む、請求項４記載の二重選
択カセットであって、該ユニーク制限酵素部位が当該ユニーク制限酵素部位に特
異的な制限酵素によって切断された場合、当該ネガティブ選択遺伝子産物の選択
機能が減弱化されるか排除されるように位置する該二重選択カセット。 - 【請求項６】 当該ユニーク制限酵素部位が、ネガティブ選択遺伝子プロモ
ーターの転写開始部位と当該ネガティブ選択遺伝子産物の翻訳開始部位をコード
するDNAとの間に位置する、請求項５記載の二重選択カセット。 - 【請求項７】 請求項４〜６のいずれかに記載の二重選択カセットを含むDN
Aであって、1または2以上の位置指定相同組換え部位を含み、該位置指定相同組 換えDNA結合部位が当該二重選択カセットの末端に位置するものであるDNA。 - 【請求項８】 当該位置指定相同組換えDNA結合部位が、lox部位、FRT部位 およびRs部位からなる群より選択されるものである、請求項７記載のDNA。
- 【請求項９】 請求項４〜６のいずれかに記載の二重選択カセットを含むDN
Aであって、1または2以上の制限酵素部位を含み、当該制限酵素部位が当該二重 選択カセットの末端に位置するものであるDNA。 - 【請求項１０】 当該DNAが、同一で当該二重選択カセットの両端に位置し 、Pac Iで切断される当該制限酵素部位を2つ含むものである、請求項９記載のDN
A。 - 【請求項１１】 当該第1および第2DNA断片の一方あるいは両方が、真核生 物ウイルスまたは真核生物ウイルスベクターに対して相同性を有するか、あるい
は真核生物ウイルスITRを含むものである、請求項１〜１０のいずれかに記載の 二重選択カセットまたはDNA。 - 【請求項１２】 当該第1および第2DNA断片の両方が、真核生物ウイルスま たは真核生物ウイルスベクターに対して相同性を有するか、あるいは真核生物ウ
イルスITRを含み、且つ当該真核生物ウイルスまたは真核生物ウイルスベクター に対して相同性を有する第1および第2DNA断片のうちの少なくとも1つが真核生物
ウイルスパッケージング部位を含むものである、請求項１１記載の二重選択カセ
ットまたはDNA。 - 【請求項１３】 当該ポジティブ選択遺伝子プロモーターがEM-7プロモータ
ーであって、当該ネガティブ選択遺伝子プロモーターが当該EM-7 プロモーター に埋め込まれているT7プロモーターである、請求項１〜１２のいずれかに記載の
二重選択カセットまたはDNA。 - 【請求項１４】 複製開始点、および独立したポジティブ選択マーカー遺伝
子、および請求項１〜１３のいずれかに記載の二重選択カセットまたはDNAを含 むプラスミド。 - 【請求項１５】 真核生物ウイルスまたは真核生物ウイルスベクターに対し
て相同性を有する当該第1および第2DNA断片が、アデノウイルスベクター、アデ ノウイルス随伴ベクターおよびヘルペスウイルスベクターからなる群から選択さ
れるタイプのウイルスベクターに相同性を有するものである、請求項１４記載の
プラスミド。 - 【請求項１６】 少なくとも2つのITRを有する組換え真核生物ウイルスベク
ターを作製する方法であって、請求項１４または１５記載のプラスミドの第2DNA
との相同組換えを誘導して相同組換えDNAを製造し、当該相同組換えDNAを当該ネ
ガティブ選択遺伝子産物が活性な条件下で増殖させて選択されるDNAを得、当該 選択されたDNAを線状化し、当該線状化し選択されたDNAの少なくとも一部を当該
真核生物ウイルスベクターの増殖を許容する真核細胞に導入し、そして当該真核
細胞を培養することを含む方法。 - 【請求項１７】 当該方法がさらに、当該相同組換えDNAをネガティブ選択 遺伝子産物が活性な条件下で増殖させる前に、当該二重選択カセットの当該ユニ
ーク制限酵素部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼを含む溶液中もしくは細胞
内で当該相同組換えDNAをインキュベートすることによって当該相同組換えDNAを
線状化することを含む、請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 当該選択されたDNAの当該線状化が、当該選択されたDNAを
、位置指定相同リコンビナーゼおよびオリゴヌクレオチド（当該リコンビナーゼ
は位置指定相同組換え部位に特異的であり、当該オリゴヌクレオチドもまた当該
位置指定相同組換え部位を含む）を含む溶液中または細胞内でインキュベートす
ることを含むものである、請求項１６記載の方法。 - 【請求項１９】 当該相同組換えよりも前に請求項１４または１５記載のプ
ラスミドおよび当該第2DNAを細菌内に形質転換し、当該ネガティブ選択遺伝子プ
ロモーターがlacリプレッサーで制御され、且つ当該二重選択カセットまたは当 該二重選択カセットと当該第2DNAとの相同組換え産物を含む当該細菌がlacリプ レッサータンパク質を発現するものである、請求項１６記載の方法。 - 【請求項２０】 さらに、多数の第2DNA（当該多数の第2DNAは、同一または
異なって多数の遺伝的要素を含むDNA集団から得られる）を含むものである、請 求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２１】 二重選択カセットを含むDNAであって、当該二重選択カセ ットが、(i)真核生物ウイルスまたはベクターに相同性を有する第1DNA断片およ び(ii)当該真核生物ウイルスまたは真核生物ウイルスベクターに相同性を有する
第2DNA断片；(iii)ポジティブ選択遺伝子プロモーター、およびそれに機能的に 連結して、(iv)ポジティブ選択遺伝子産物をコードするDNAを含むポジティブ選 択遺伝子；(v)ネガティブ選択遺伝子プロモーター、およびそれに機能的に連結 して、(vi)ネガティブ選択遺伝子産物をコードするDNAを含むネガティブ選択遺 伝子、(vii)当該ネガティブ選択遺伝子プロモーターと当該ネガティブ選択遺伝 子産物をコードするDNAとの間の位置に配置されているサイレンシング配列を含 み、そうして当該サイレンシング配列が除去されると当該ネガティブ選択遺伝子
が活性となるものであるDNA。 - 【請求項２２】 当該サイレンシング配列が、制限消化および再ライゲーシ
ョンによって当該DNAから除去され得るものであり、当該再ライゲーションの結 果、当該ネガティブ選択遺伝子プロモーターと当該ネガティブ選択遺伝子産物を
コードするDNAとが機能的に連結されるものである、請求項２１記載のDNA。 - 【請求項２３】 当該制限消化が、当該サイレンシング配列の両末端を除い
ては該DNAを切断するものでない、請求項２１または２２記載のDNA。 - 【請求項２４】 当該サイレンシング配列が、位置指定相同組換えDNA結合 部位の近傍にあり、当該配列が当該DNAを位置指定リコンビナーゼと接触させる ことによって除去され得るものであり、当該サイレンシング配列の除去の結果、
当該ネガティブ選択遺伝子プロモーターと当該ネガティブ選択遺伝子産物をコー
ドするDNAとが機能的に連結されるものである、請求項２１〜２３のいずれかに 記載のDNA。 - 【請求項２５】 当該サイレンシング配列が、当該ネガティブ選択遺伝子産
物がコードされているRNAが転写される前に、当該ネガティブ選択遺伝子によっ てコードされているRNAの転写を終結させるものである、請求項２１〜２４のい ずれかに記載のDNA。 - 【請求項２６】 当該サイレンシング配列が、当該ネガティブ選択遺伝子に
よってコードされているRNAの翻訳を当該ネガティブ選択遺伝子産物の読み取り 枠以外の読み枠で開始するものである、請求項２１〜２５のいずれかに記載のDN
A。 - 【請求項２７】 ウイルスベクターの製造方法であって、(a)細胞を第1およ
び第2DNAでトランスフェクトすること（当該第1DNAは、相同組換えが起こってフ
ァージパッケージング部位および真核生物ウイルスベクターを含む中間ベクター
が製造されるように、当該第2DNA内のDNA断片に相同性のあるDNA断片を含む）、
および(b)線状の第3DNAを当該中間ベクターに連結して当該ウイルスベクターを 製造することを含む方法。 - 【請求項２８】 当該中間ベクターが、ファージ複製開始点を含むものであ
る、請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 当該方法が、(a)当該中間ベクターを細菌中で増殖させて 当該中間ベクターのストックを作製すること、(b)当該中間ベクターストックの 一部を線状化すること、および(c)線状の第3DNAを当該中間ベクターストックに 連結して当該ウイルスベクターを製造することをさらに含む請求項２７または２
８記載の方法。 - 【請求項３０】 当該方法が、さらに当該ウイルスベクターのファージキャ
プシドへのパッケージングを含む、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３１】 当該中間ベクターが当該真核生物ウイルスベクターを含む
領域内で線状化される、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３２】 当該線状の第3DNAが当該真核生物ウイルスベクターを含む
領域に連結される、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３３】 当該中間ベクターがアデノウイルスベクター、アデノウイ
ルス随伴ベクターおよびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択されるも
のである、請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３４】 当該ファージパッケージング部位がcosパッケージング部 位である、請求項２７〜３３のいずれかに記載の方法。
- 【請求項３５】 当該方法が、さらに多数の第3DNA（当該多数の第3DNAは、
同一または異なって多数の遺伝的要素を含むDNA集団から得られる）を含むもの である、請求項２７〜３４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３６】 組換えDNAを選択する方法であって、(a)T7プロモーター、
および、それに機能的に連結した、翻訳され得る読み取り枠を有する第1DNAを提
供すること、(b)第2DNA断片を当該第1DNAに導入して当該読み取り枠が翻訳され ない産物DNAベクターを製造するること、(c)当該T7プロモーターを誘導し、それ
によって顕著な増殖における不利を生じさせること、および(d)当該産物DNAベク
ターを単離して組換えDNAを選択することを含む方法。 - 【請求項３７】 当該T7プロモーターがEM-7プロモーターに埋め込まれてい
る、請求項３６記載の方法。 - 【請求項３８】 当該読み取り枠が少なくとも約７アミノ酸残基のポリペプ
チドをコードするものである、請求項３６または３７記載の方法。 - 【請求項３９】 当該読み取り枠が少なくとも約30アミノ酸残基のポリペプ
チドをコードするものである、請求項３８記載の方法。 - 【請求項４０】 当該読み取り枠が、該読み取り枠の産物を細胞が発現する
ことにより、ポジティブな増殖における有利さを付与することができるポジティ
ブ選択遺伝子をコードするものである、請求項３７〜３９のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項４１】 当該ポジティブ選択遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子また
はアンピシリン耐性遺伝子である、請求項４０記載の方法。 - 【請求項４２】 当該ポジティブ選択遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子
またはゼオシン耐性遺伝子である、請求項４０記載の方法。 - 【請求項４３】 当該読み取り枠が、lacZ-bleo融合読み取り枠である、請 求項３６、３７または４０記載の方法。
- 【請求項４４】 当該読み取り枠が、ネガティブ選択遺伝子をコードするも
のである、請求項３６記載の方法。 - 【請求項４５】 当該ネガティブ選択遺伝子が、ccdB、NP-1、およびNP-1の
活性断片からなる群より選択されるものである、請求項４４記載の方法。
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| WO2001059071A2 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-16 | Genvec, Inc. | Methods of preparing and using a viral vector library |
| CA2398571A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating ocular-related disorders |
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| FR2820146B1 (fr) * | 2001-01-29 | 2003-06-27 | Centre Nat Rech Scient | Procede d'obtention de cellules d'encapsidation fortement productrices de retrovirus par elimination, au sein de la culture, des cellules permissives a l'infection par le retro virus produit |
| US20040166091A1 (en) * | 2003-02-24 | 2004-08-26 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating disorders of the ear |
| WO2005012537A2 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based vaccines |
| DE602004025726D1 (de) * | 2003-11-14 | 2010-04-08 | Genvec Inc | Pharmazeutische verbindung zur behandlung von lokal fortgeschrittenem primär inoperablen pankreaskarzinom (lapc). |
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| JP2008511336A (ja) * | 2004-09-01 | 2008-04-17 | アメリカ合衆国 | 免疫原性が増加したアデノウイルスベクターをインビボで用いる方法 |
| RS59399B1 (sr) | 2005-03-23 | 2019-11-29 | Genmab As | Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma |
| KR100658534B1 (ko) | 2005-04-28 | 2006-12-19 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 제한효소 절단에 의한 클로닝에 기반을 둔 표적 유전자파쇄방법 |
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| US9651543B2 (en) | 2005-08-31 | 2017-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Malaria antigen screening method |
| US8450055B2 (en) * | 2005-08-31 | 2013-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Malaria antigen screening method |
| AU2006284756B2 (en) | 2005-08-31 | 2012-06-07 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| CA2629163C (en) | 2005-11-10 | 2017-03-21 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine |
| WO2008086386A2 (en) * | 2007-01-09 | 2008-07-17 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| EP2385065A1 (en) | 2007-11-01 | 2011-11-09 | Perseid Therapeutics LLC | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
| CN103038343A (zh) | 2010-03-23 | 2013-04-10 | 英特瑞克斯顿股份有限公司 | 条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用 |
| JP2011078436A (ja) * | 2011-01-27 | 2011-04-21 | National Institute Of Infectious Diseases | プロテアーゼ活性の測定方法 |
| CA2828411A1 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Intrexon Corporation | Vectors conditionally expressing protein |
| AU2015311708A1 (en) | 2014-09-07 | 2017-02-02 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating exon skipping anti-viral transfer vector immune responses |
| TWI710635B (zh) | 2014-10-09 | 2020-11-21 | 美商珍維克公司 | 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體 |
| CA3081687A1 (en) * | 2016-11-03 | 2018-08-09 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dna plasmids for the fast generation of homologous recombination vectors for cell line development |
| CN110325203A (zh) | 2017-01-07 | 2019-10-11 | 西莱克塔生物科技公司 | 与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的模式化给药 |
| BR112020007157A2 (pt) | 2017-10-13 | 2020-09-24 | Selecta Biosciences, Inc. | métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral |
| GB2584211B (en) | 2017-11-16 | 2023-05-24 | Synthex Inc | Selective modulation of protein-protein interactions |
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| BR112021023594A2 (pt) | 2019-05-28 | 2022-02-08 | Selecta Biosciences Inc | Métodos e composições para resposta imune de vetor de transferência antiviral atenuada |
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| US20230141563A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-11 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
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Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4769331A (en) | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
| IL87394A0 (en) | 1987-08-12 | 1989-12-15 | Natural Environment Res | Expression vectors for the synthesis of proteins and plasmid replicons and sequence cassettes for use in constructing said vectors |
| US5876962A (en) | 1987-08-12 | 1999-03-02 | Natural Environment Research Council | Expression vectors for the synthesis of proteins and plasmid replicons and sequence cassettes for use in constructing such vectors |
| US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| FR2727689A1 (fr) | 1994-12-01 | 1996-06-07 | Transgene Sa | Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral |
| FR2730504B1 (fr) * | 1995-02-13 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| EP0927263A1 (en) | 1996-01-05 | 1999-07-07 | Genetic Therapy, Inc. | Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors |
| DE69820450T2 (de) * | 1997-06-09 | 2004-05-27 | Genvec, Inc. | Chimäre vektoren, die die verpackungsregion eines phagengenoms und einen teil des genoms eines eukaryontischen virus enthalten |
| WO2001059071A2 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-16 | Genvec, Inc. | Methods of preparing and using a viral vector library |
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