JP3299761B2 - 相補的なアデノウィルスベクター系と細胞株 - Google Patents

相補的なアデノウィルスベクター系と細胞株

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、複製欠損アデノウイルス領域の少なくとも
１つにスペーサーを有する組換え多重複製欠損アデノウ
イルスベクター、並びにそのようなベクターの治療用途
に関する。
発明の背景 1952〜1953年の冬から春にかけて、国立衛生研究所
（NIH）のロウとその共同研究者らは、ワシントン特別
区に住む幼児から外科的に切除されたアデノイド（腺様
増殖組織）を取得し、組織培養を行った（Roweら,Proc.
Soc.Exp.Biol.Med.,84,570−573（1953））。数週間
後、該培養の多くが上皮細胞の破壊を特徴とする進行性
の変性を示し始めた。この細胞変性効果は培養濾液によ
って、樹立されたヒト細胞株の組織培養物に連続的に伝
達することができた。この細胞変性作用因は「アデノイ
ド変性」ｕ（Ad）作用因と呼ばれた。「アデノウイル
ス」の名前は、最終的に、これらの作用因に一般的に使
われる名称になった。アデノウイルスの多くの原型株−
その中の幾つかは呼吸疾患を引き起こす−の発見がこれ
ら最初の発見に続いた［Roweら，上述;Dingleら,Am.Re
v.Respir.Dis.,97,1−65（1968）;Horwitz,「アデノウ
イルス科とそれらの複製」（Adenoviridae and Their R
eplication），ウイルス学（Virology）（Fieldsら編，
レイヴン出版社，ニューヨーク，第２版,1990年）,1679
−1721頁に総説］。
ヒトから40を越すアデノウイルスサブタイプが単離さ
れており、さらに加えて50を越すサブタイプが他の哺乳
類または鳥類から単離されている（Ishibashiら，「動
物のアデノウイルス」（Adenoviruses of animals），
アデノウイルス（The Adenoviruses）,Ginsberg編，プ
レナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州,497−562
頁，（1984年）;Strauss,「ヒトにおけるアデノウイル
ス感染」（Adenovirus infections in humans），アデ
ノウイルス（The Adenoviruses）,Ginsberg編，プレナ
ム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州,451−596頁，
（1984年））。これらのサブタイプは全てアデノウイル
ス科に属し、現在のところ２つの属、すなわちマストア
デノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられて
いる。
全てのアデノウイルスは形態的および構造的に類似し
ている。しかしながら、ヒトにおいては、アデノウイル
スは互いに異なる免疫学的特性を有するがために、血清
型で分けられている。２つのヒトアデノウイルス血清
型、すなわち、Ad2とAd5は徹底的に研究されてきた。こ
れらの研究によりアデノウイルス一般についての情報の
大部分が提供された。Ad2およびAd5のゲノムは完全に配
列決定されており、他の血清型由来のゲノムの領域を選
択してもその配列も入手可能である。アデノウイルスゲ
ノムの全体的な構造は血清型に共通して保たれており、
特定の機能は同様の位置に付与されている。
一般に、アデノウイルスはエンベロープを有さず、直
径約65〜80ナノメートルの正二十面体で、外部キャプシ
ドと内部コアから成る。キャプシドは、20の三角形の表
面すなわち切子面と12の頂点から成る（Horneら,J.Mol.
Biol.,1,84−86（1959））。切子面はヘキソンで、頂点
はペントンで構成されている。各頂点からファイバーが
突出している。ヘキソン、ペントンおよびファイバーに
加えて、８つの微量の構造ポリペプチドがあるが、それ
らの大多数の正確な位置は不明である。ある微量ポリペ
プチド成分、すなわち、ポリペプチドIXは、各切子面の
「９群」中心（“the group−of−nine"center）といわ
れる場所において、ヘキソン−ヘキソンの接点を安定化
させ得る位置で結合している（Furcinittiら,EMBO,8,35
63−3570（1989））。微量ポリペプチドVIおよびVIII
は、隣接する切子面間のヘキソン−ヘキソンの接点を安
定化させると信じられている。微量ポリペプチドIII A
は、頂点の領域に位置することが知られているが、キャ
プシドとコアとを繋いでいることがStewartら（Cell,6
7,145−154（1991））によって示唆されている。
ウイルスコアは、単離物によっては長さが103塩基対
〜163塩基対と変化することが観察されている逆位末端
反復配列（ITRs）を有する直鎖状の二本鎖DNA分子を含
有すると言われている（Garonら,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,69,2391−2394（1972）;Wolfsonら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,69,3054−3057（1972）;Arrandら,J.Mol.Bio
l.,128,577−594（1973）;Steenbergら,Nucleic Acids
Res.,4,4371−4389（1977）；およびTooze,DNA腫瘍ウイ
ルス（DNA Tumor Viruses），第２版，コールドスプリ
ングハーバー，ニューヨーク：コールドスプリングハー
バー研究所,943−1054頁，（1981年））。ITRはDNAの複
製起点を担持する（Garonら，上述;Wolfsonら，上述;Ar
randら，上述;Steenbergら，上述）。
ウイルスDNAは４つのポリペプチド、すなわち、V,VI
I,μおよび末端ポリペプチド（TP）と結合している。55
キロダルトンのTPはdCMPを介してDNAの5'末端に共有結
合している（Rekoshら,Cell,11,283−295（1977）;Robi
nsonら,Virology,56,54−69（1973））。他の３つのポ
リペプチドはDNAに非共有結合的に結合してキャプシド
の小さな容量に合うようにDNAを折り畳んでいる。DNAは
ヌクレアーゼ消化パターンからわかるように細胞のヌク
レオソームに類似した構造にパッケージングされている
らしい（Cordenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,73,401−40
4（1976）;Tateら,Nucleic Acids Res.,6,2769−2785
（1979）;Mirzaら,Biochim.Biophys.Acta,696,76−86
（1982））。
アデノウイルスは、細胞膜上の特定の受容体にファイ
バーを接着させることにより細胞に感染する［Londberg
−Holmら,J.Virol.,4,323−338（1969）;Morganら,J.Vi
rol.,4,777−796（1969）;Pastanら，「アデノウイルス
の細胞への侵入：古い問題に関するいくつかの新しい観
察」（Adenovirus entry into cells:some new observa
tions on an old problem），ウイルス病原の概念（Con
cepts in Viral Pathogenesis）,Notkinsら編，シュプ
リンガー−フェアラーク，ニューヨーク，ニューヨーク
州,141−146頁，（1987年）］。次いで、ペントンベー
スがアデノウイルスインテグリン受容体に結合する。そ
れから、受容体と結合したウイルスは原形質膜から、エ
ンドサイトーシス小胞またはレセプトソームを形成す
る、クラスリンで被覆された窪みに移動し、そこでpHが
5.5に落ちる［Pastanら，ウイルス病原の概念（Concept
s in Viral Pathogenesis）,NotkinsとOldstone編，シ
ュプリンガー−フェアラーク，ニューヨーク,141−146
頁，（1987年）］。pHの降下がウイルス表面の外形を変
化させ、その結果レセプトソームが破裂してウイルスが
細胞の細胞質中に放出されると信じられている。ウイル
スDNAは、核に輸送される間、細胞質中では部分的に被
覆されていない、すなわち、部分的に結合タンパク質が
外れている。
ウイルスが核孔に達すると、ウイルスDNAは、残りの
タンパク質のほとんどを細胞質に残して核に入る（Phil
ipsonら,J.Virol.,2,1064−1075（1968））。しかしな
がら、ウイルスDNAは完全にタンパク質を持たないわけ
ではなく、少なくともウイルスDNAの一部は少なくとも
４つのウイルスポリペプチド、すなわち、V,VII,TPおよ
びμと結合しており、ウイルスDNA−細胞ヒストン複合
体に転化される（Tateら,Nucleic Acids Res.,6,2769−
2785（1979））。
細胞感染からウイルス粒子産生へのサイクルは１〜２
日続き、結果として細胞あたり約１万に達する感染性粒
子が産生される（Greenら,Virology,13,169−176（196
1））。アデノウイルスの感染過程はウイルスDNAの複製
によって分けられる、初期（Ｅ）および後期（Ｌ）の相
に区分される。もっとも、初期相の間に起こる事のいく
つかは後期相の間にも起こり、その逆もある。ウイルス
遺伝子の一時的な発現を十分に記述するためにさらに下
位区分がなされている。
初期相の間に、細胞内に存在する全RNAのうちの小さ
な割合を占めているウイルスmRNAが、細胞核に存在する
アデノウイルスDNAの両方の鎖から合成される。少なく
とも、E1、E2、E3、E4およびMLP−L1と命名された５つ
の領域が転写される「Leowisら,Cell,7,141−151（197
6）;Sharpら,Virology,75,442−456（1976）;Sharp,
「アデノウイルスの転写」（Adenovirus transcriptio
n），アデノウイルス（The Adenoviruses）,Ginsberg
編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州,173
−204頁,1984年）］。それぞれの領域は少なくとも１つ
の明瞭なプロモーターを有し、プロセッシングされて複
数のmRNA種を生じる。
初期（Ｅ）領域の産物は、（１）他のウイルス成分の
発現に制御的な役割を果たし、（２）細胞のDNA複製お
よびタンパク質合成の一般的な停止に関与し、および
（３）ウイルスDNAの複製に必要である。初期mRNAの転
写を調節する複雑な一連の出来事は、E1A、L1および13.
5キロダルトン遺伝子を含むある特定の前初期領域の発
現で始まる［Sharp（1984），上述，に総説されている;
Horwitz（1990），上述］。後初期領域であるE1B、E2
A、E2B、E3およびE4の発現はE1A遺伝子産物に依存す
る。３つのプロモーター、72マップ単位（mu）にあるE2
プロモーター、タンパク質IXプロモーターおよびIV aプ
ロモーターは、DNA複製の開始によりエンハンスされる
がそれに依存しない（Wilsonら、Virology,94,175−184
（1979））。それらの発現はウイルスの遺伝子発現の移
行期を特徴づける。初期遺伝子発現のカスケードの結
果、ウイルスDNAの複製が開始される。
ウイルスDNAの複製の開始が後期相に入るのに必須の
ように思われる。ウイルス感染の後期相はウイルス構造
ポリペプチドおよびキャプシドの構築に関わる非構造タ
ンパク質の大量産生によって特徴付けられる。主要後期
プロモーター（MLP）が十分に活性となり、16.5muで始
まりゲノムの末端付近で終結する転写産物を産生する。
この長い転写産物の転写後のプロセッシングは後期mRNA
の５つの系統をもたらし、それぞれL1からL5と命名され
る（Shawら,Cell,22,905−916（1980））。初期相から
後期相への変遷を制御し、また、結果としてそのような
転写産物の利用における劇的な変遷を生じる機構は明ら
かでない。一次感染ウイルスの後期の転写が活性である
時は、後期転写は重感染ウイルスからは起こらないの
で、DNA複製の条件はDNA鋳型のシス特性であるかもしれ
ない（Thomasら,Cell,22,523−533（1980））。
ある種の組換えアデノウイルスベクターが遺伝子治療
に用いられている。１つあるいはそれ以上の組換え遺伝
子を運搬するための組換えアデノウイルスベクターの使
用は、治療を必要とする器官、組織あるいは細胞への１
つまたはそれ以上の遺伝子の目的とする送達を可能に
し、それにより体細胞の遺伝子治療のほとんどの場合に
遭遇する送達に関する問題が克服される。さらに、組換
えアデノウイルスベクターはアデノウイルスタンパク質
の発現に宿主細胞の増殖を必要としない［Horwitzら，
ウイルス学（Virology），レイヴン出版，ニューヨー
ク,2,1679−1721,（1990年）;Berkner,BioTechniques,
6,616（1988）］。さらに、もし治療が必要な疾病器官
が肺であれば、遺伝情報の運び屋としてのアデノウイル
スの使用は、アデノウイルスが通常気道上皮指向性であ
るという点でさらに有利である［Straus,アデノウイル
ス（Adenoviruses），プレナム出版，ニューヨーク,451
−496頁，（1984年）］。
ヒトの遺伝子治療に使用可能なベクターとしてのアデ
ノウイルスの他の長所は以下の通りである：（ｉ）組換
えが稀であり；（ii）ヒトがアデノウイルスに感染する
ことが頻繁にあるにもかかわらず、アデノウイルス感染
からヒトへの悪影響に関連するものが今のところなく；
（iii）現在、アデノウイルスゲノム（直鎖状で二本鎖D
NA）は、長さにして7.0〜7.5kbまでの範囲の外来遺伝子
を収容するように操作でき；（iv）アデノウイルスベク
ターはそれ自身のDNAを細胞の染色体には挿入せず、そ
のためその効果は一時的で細胞の正常な機能を妨害する
ことはありそうにもなく；（ｖ）アデノウイルスは脳や
肺の細胞の様な、非分裂の、つまり最終分化を遂げた細
胞に感染することができ；（vi）生アデノウイルス−必
須の特徴として複製する能力を有している−がヒトワク
チンとして安全に利用されている（Horwitzら，上述;Be
rknerら,J.Virol.,61,1213−1220（1987）;Straus,上
述;Chanockら,JAMA,195,151（1966）;Haj−Ahmadら,J.V
irol.,57,267（1986）；およびBallayら,EMBO,4,3861
（1985））。
発現ベクターとして使うために、外来遺伝子をアデノ
ウイルスゲノムの２つの主要な領域、すなわちE1および
E3領域に挿入して、単欠損アデノウイルスおよびそれ由
来のベクターを得ている。E1領域への挿入は、相補的な
細胞内での増殖あるいは完全なヘルパーウイルスの存在
を必要とする欠損のある子孫を生み出す。それらは、損
傷を受けたあるいは消失したE1領域の機能を代替する
（Berknerら，上述;Davidsonら,J.Virol.,61,1226−123
9（1987）；およびMansourら,Mol.Cell Biol.,6,2684−
2694（1986））。ゲノムのこの領域は外来遺伝子の発現
に最も頻繁に利用されている。
E1領域に挿入された遺伝子は種々のプロモーターの制
御下におかれ、そのほとんどが、発現カセットによって
は大量に外来遺伝子産物を産生する。しかしながら、こ
れらのアデノウイルスベクターは非相補的な細胞株中で
は増殖しない。現在のところ、単欠損アデノウイルスに
欠けている必須機能を相補する細胞株は２、３存在する
のみである。それらの細胞株の例としては、HEK−293
（Grahamら,Cold Spring Harbor Sym.Quant.Biol.,39,6
37−650（1975））やW162（Weinbergら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,80,5383−5386（1983））およびgMDBP（Kles
sigら,Mol.Cell Biol.,4,1354−1362（1984）;Brough
ら,Virology,190,624−634（1992））が含まれる。
これと比較して、E3領域は組織培養中でのウイルスの
増殖（すなわち、ウイルス産生）には必須ではないの
で、この領域を外来遺伝子発現カセットで置換すると、
非相補的な細胞株においても豊富に増殖できるウイルス
が得られる。例えば、E3領域中へのＢ型肝炎表面抗原の
挿入および発現と、それに続くハムスターへの接種およ
び抗体の形成が報告されている（Morinら,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,84,4626−4630（1987））。
単欠損アデノウイルスベクターの使用に付随する問題
点の１つは、外来遺伝子の挿入や発現に利用できるアデ
ノウイルス内のスペース量を制限してしまうことであ
る。さらに、現在存在している単欠損アデノウイルスベ
クターと相補的な細胞株とに含まれているウイルス配列
に類似性あるいは重複がある為に、そのように繁殖した
ベクターストック中において、組換え現象が起こり複製
可能なウイルスを生み出すことがあり得る。この現象
が、ベクターのストックを遺伝子治療の目的で利用でき
ないようにしている。
この問題を克服せんと努力して、多重複製欠損ベクタ
ー（すなわち、少なくとも２つの、ウイルス産生に必要
な領域に欠損のあるベクター）が誘き出された（PCT特
許出願WO 94/28152（Imlerら））。しかしながら、E2
またはE4領域に欠失のうちの少なくとも１つを有するそ
のようなベクターは、相補的な細胞株中でファイバーの
発現の減少およびウイルス増殖の減少を示す。特に、E4
領域は、ウイルスDNA複製、後期mRNA合成、宿主タンパ
ク質合成の遮断およびウイルスのアセンブリにおいてあ
る役割を有するのではないかと推測されている。最近、
E4領域を欠損したベクターの、相補的な細胞株中での増
殖の減少を正すべく、E4の欠失を有し且つE4領域の不可
欠なオープンリーディングフレーム、特にORF6またはOR
F3を保持するアデノウイルスベクターがデザインされた
（PCT特許出願WO 94/12649（Gregoryら））。
ところが、オープンリーディングフレーム３または６
のいずれでも、インビトロでのウイルス増殖に必要なE4
の機能を供給し得るが、ORF3の産物の方がその効率は劣
る（Armentanoら,Human Gene Therapy,6,1343−1353（1
995））。さらに、インビボで機能するかもしれないORF
に付随した幾つかの特性が記載されている（例えば、Ar
mentanoら，上述、を参照）。例えば、ORF6/7の産物
は、細胞の転写因子E2fとの複合体形成およびE2fの刺激
を通して、E2Aプロモーターの活性化に関与している。
同様に、ORF3とORF6の両方が、主要後期トリパタイト
（tripatite）リーダーのスプライシングにおけるイン
トロンの包含／排除の調節に関与している。しかしなが
ら、ORF6ですらアデノウイルスE4欠失変異体に野生型の
ウイルス複製を与えることはできない。特に、ORF6を含
むアデノウイルスE1-E4-欠失変異体は、E4の欠失を持た
ないアデノウイルスと比較して、ファイバー合成が10培
減少し、インビトロでのウイルス複製が遅れ、インビト
ロでのプラーク形成が緩慢になり、また、インビボウイ
ルス複製が減少し且つ遅れる（Armentanoら，上述）。
したがって、本発明の目的は、比較的大きな外来DNA
のフラグメントの挿入および発現に適応可能な、インビ
トロでは十分に複製、すなわちウイルス産生し得る多重
複製欠損アデノウイルスベクターを提供することであ
る。本発明の目的はまた、そのような多重複製欠損アデ
ノウイルスベクターの組換え体およびそのような組換え
体を用いる治療方法、特に遺伝子治療、予防接種などに
関する治療方法を提供することである。本発明のこれら
の、また他の目的および本発明の利点、並びに発明のさ
らなる特徴は、以下の詳細な説明から明確になるであろ
う。
発明の簡単な要約 本発明は多重複製欠損アデノウイルスベクターおよび
相補的な細胞株を提供する。該多重複製欠損アデノウイ
ルスベクターは、複製欠損アデノウイルス領域の少なく
とも１つにスペーサーを有する。これらの多重複製欠損
アデノウイルスベクターは、単複製欠損アデノウイルス
ベクターで可能とされる以上の、より大きな外来DNAの
フラグメントの挿入および発現に適応可能であり、その
上、単複製欠損アデノウイルスベクターにおいて見られ
るのと同様のファイバーの発現およびウイルス増殖を提
供する。本発明はまた、組換え多重複製欠損アデノウイ
ルスベクターおよびそのような組換え体の使用を含む治
療方法、例えば遺伝子治療、予防接種などに関する治療
方法を提供する。
図面の簡単な説明 図１は、AdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.10Rウイルスベ
クターの一連の概略図である。
図２は、AdGVCFTR.11ウイルスベクターの概略図であ
る。
図３は、AdGVCFTR.13ウイルスベクターの概略図であ
る。
図４は、E2A発現ベクターの概略図である。
図５は、あるクローン化293/E2A細胞株における誘導
されたDBP発現の程度をスクリーニングする為に用いら
れたイムノブロット像である。
図６は、あるクローン化293/E2A細胞株による、誘導
の最初の24時間の間にわたるDBPの蓄積を解析する為に
用いられたイムノブロット像である。
図７は、AdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.12Bウイルスベ
クターの一連の概略図である。
図８は、エチジウムブロマイドで染色したDNAゲルの
写真であり、継代したトランスフェクション溶解物から
のAdGVCFTR.12BウイルスベクターのPCR検出に関するデ
ータを示す。
図９は、AdGVLuc;E2GUSウイルスベクターの概略図で
ある。
図10は、E4−ORF6発現ベクターの概略図である。
図11は、エチジウムブロマイドで染色したDNAゲルの
写真であり、継代したAdGVβgal.11の溶解物におけるE4
欠失領域のPCR検出に関するデータを示す。
図12は、さまざまな細胞に感染した後の、E1の機能を
保持するE4欠失ウイルスのウイルス産生量（PFU/細胞
ｙ軸）を示す棒グラフである。
図13は、AdGVβgal.11ウイルスベクターの概略図であ
る。
図14A〜Ｃは、E4配列が完全に欠失し、L5ファイバー
配列が右側のITRに融合したベクター（図14A）、E4コー
ド配列が欠失し、L5ファイバー配列がE4プロモーターお
よび右側のITRに融合してAdGV.11ベクターを生じるベク
ター（図14B）、並びにE4コード配列が欠失し、L5ファ
イバー領域と右側のITRとの間に配列（SV40ポリアデニ
ル化配列を含めて）が付加されてAdGV.11Sをベースにし
たベクターAdGVCFTR.11Sを生じるベクター（図14C）
の、ファイバー/E4領域を比較した模式図である。記号:
ITR,逆位末端反復;Mfe I（Mun Iのイソシゾマー）,Pac
I,Eag I,これらの酵素のパリンドローム様認識部位;GU
S,β−グルクロニダーゼコード配列;SV40 polyA,シミ
アンウイルス40 ポリアデニル化部位;E4p,E4プロモー
ター。
図15は、ベクターなし（すなわち、偽（mock）感染）
（レーン１）、E1欠失AdGVβgal.10ベクター（レーン
２）もしくはE1およびE4欠失AdGVBgal.11ベクター（レ
ーン３）のいずれかを感染させた種々の293/ORF6の細胞
溶解物のイムノブロット像である。イムノブロットは、
アデノウイルスキャプシドのすべての構造タンパク質を
認識するウサギ血清を用いて実施した。
図16は、E1およびE3欠失AdGVβgal.10ベクター（レー
ン１）もしくはE1およびE4欠失AdGVβgal.11ベクター
（レーン２）のいずれかを感染させた種々の293/ORF6の
細胞溶解物から得られた精製キャプシドのイムノブロッ
ト像である。イムノブロットは、アデノウイルスファイ
バータンパク質に対する抗体を用いて実施した。
図17は、ベクターなし（すなわち、偽感染）（レーン
１）、E1およびE3欠失AdGVβgal.10ベクター（レーン
２）、E1およびE4欠失AdGVβgal.11ベクター（レーン
３）もしくは、E4欠失の領域中にスペーサーを含有す
る、E1、E3およびE4を欠失したAdGV.11Sをベースとする
ベクターAdGVCFTR.11S（レーン４）のいずれかを感染さ
せた種々の293/ORF6の細胞溶解物のイムノブロット像で
ある。イムノブロットは、アデノウイルスファイバータ
ンパク質に対する抗体を用いて実施した。
図18は、E1およびE3を欠失したAdGV.10をベースとす
るベクターAdGVβgal.10（黒四角）、E1およびE4を欠失
したAdGV.11をベースとするベクターAdGVβgal.11（白
い菱形）もしくは、E4欠失の領域中にスペーサーを含有
する、E1、E3およびE4を欠失したAdGV.11Sをベースとす
るベクターAdGVCFTR.11S（白丸）のいずれかを感染させ
たA232細胞についての、感染後の時間に対する細胞あた
りの活性なベクター量（フォーカス形成単位;ffu）のグ
ラフである。
図19は、野生型E2Aタンパク質に翻訳されたE2a遺伝
子、およびアデノウイルス欠失ベクターdl801,dl802お
よびdl803中で翻訳された対応領域、並びに増殖の挙動
に及ぼすそのような翻訳の効果の模式図である。略語お
よび記号:Nt,核局在化および後期遺伝子発現が示すE2A
遺伝子産物の領域;Ct,DNA複製、ssDNAの結合およびmRNA
の結合が示すE2A遺伝子産物の領域;DBP,E2A遺伝子産物
（すなわち、一本鎖DNA結合タンパク質）；直線，欠失
ベクター中のインフレームに翻訳されるE2Aコード配列
の領域；ジグザグ線,E2A配列の欠失の結果として、欠失
ベクター中でフレームからはずれて翻訳されるE2Aコー
ド配列の領域；＋＋＋，野生型の増殖の挙動；＋，減少
したウイルス増殖；−／＋，小さなプラークによって実
証されるようなより大きく減少したウイルス増殖。
発明の詳細な説明 本発明は、特に、遺伝子のクローニングおよび発現の
ための多重複製欠損アデノウイルスベクターを提供す
る。本発明の多重複製欠損アデノウイルスベクターは、
現在、入手可能な単複製欠損アデノウイルスベクターと
は、アデノウイルスゲノムの少なくとも２つの領域に欠
損があるという点で、また、外来DNAのより大きなフラ
グメントを受け入れ、発現させ得るという点で異なって
いる。ここで用いられる「外来DNA」もしくは「パッセ
ンジャー遺伝子」という術語は、アデノウイルスゲノム
にとって外来の、本発明のベクター（すなわち、導入ベ
クター）に挿入されたいかなるDNA配列をも意味する。
そのような外来DNAは遺伝子、遺伝子の一部あるいはそ
の他のいかなるDNA配列を構成してもよく、RNA、アンチ
センスRNA、および／またはポリペプチドをコードする
配列を含むが、それらに限定されない。本発明の多重複
製欠損アデノウイルスベクターはまた、アデノウイルス
領域の少なくとも１つに、転写の遮断を引き起こし、そ
れによって転写が最後まで読み進むのを防ぐスペーサー
が存在することによって、相補的な細胞株中で単複製欠
損ベクターと同様のファイバー発現およびウイルス増殖
を達成し得るという点で、最近発見された多重複製欠損
アデノウイルスベクターとは異なる。
アデノウイルスゲノムの領域は１つあるいはそれ以上
の遺伝子からなる。そのような遺伝子は接着、浸透、脱
外皮、複製、コアタンパク質、ヘキソン、ファイバー、
ヘキソン関連タンパク質などのアデノウイルスの種々の
構成成分や活性を仲介、促進、引き起こし、あるいはそ
のものである遺伝子産物をコードしている。例えば、前
述の構成成分や活性のいくつかに、あるいは全てに関与
するかもしれない欠損領域による一つの影響は、アデノ
ウイルスの増殖が不能であることである。ここでは前述
の構成成分や活性を遺伝子機能と呼ぶこととする。
ここで用いられる、遺伝子あるいは遺伝子機能におけ
る欠損、すなわち、欠損した遺伝子、遺伝子領域もしく
は領域とは、ウイルスゲノムの遺伝的な材料の欠失とし
て定義され、DNA配列が全体にもしくは部分的に欠失し
た遺伝子の機能を減ずるかもしくは抹消するように、ま
た、ウイルスゲノムにとって外来のDNAを挿入するため
にウイルスゲノム内に余地もしくは容量を与えるように
働く。そのような欠損は、非相補的な細胞宿主の組織培
養中におけるアデノウイルスベクターの繁殖に必須な遺
伝子内にあっても、また、必須でない遺伝子内にあって
もよいが、該発明のウイルスベクターの欠損した遺伝子
の、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なく
とも２つがウイルスの増殖に必須な遺伝子の欠損であ
る。
いかなるサブタイプ、サブタイプの混合物またはキメ
ラアデノウイルスを多重欠損アデノウイルスベクターの
作製のためのDNAの原料として用いてもよい。しかしな
がら、Ad5ゲノムは完全に配列が決定されているので、
本発明ではAd5血清型について記載する。
本発明のアデノウイルスベクターは、多重複製欠損、
すなわち、ウイルス複製（つまり、インビトロでのウイ
ルス複製）に必要な少なくとも２つの領域に欠損がある
ことが望ましい。そのような領域としては、初期領域１
（E1）、初期領域2A（E2A）、初期領域2B（E2B）、初期
領域４（E4）、後期領域１（L1）、後期領域２（L2）、
後期領域３（L3）、後期領域４（L4）および後期領域５
（L5）が挙げられる。E1領域は初期領域1A（E1A）およ
び初期領域1B（E1B）からなるとみなすこともできる
が、本発明においては、E1Aおよび／またはE1B領域のい
ずれか一方または両方における欠失は単一の欠失とみな
す。さらに、そのようなベクターはウイルス産生に必要
ではない１つまたはそれ以上の領域に欠損があってもよ
く、例えば、初期領域３（E3）にさらに欠損があっても
よい。
本発明のアデノウイルスベクターは、E4領域およびウ
イルス産生に必要な１つまたはそれ以上のさらなる領域
（特に、ウイルス産生に必要な他の初期領域）に欠損が
あることが望ましく、保持されたL5ファイバー領域と右
側のITRとの間のポリアデニル化配列は除くかもしれな
いが、それ以外はE4領域全体がアデノウイルスベクター
から欠失したものであることが好ましいだろう。より好
ましくは、ウイルス産生に必要な領域でさらに欠損して
いるものは、E1および／またはE2A領域であり、いっそ
う好ましくは、E3領域をも取り除かれたベクターであろ
う。したがって、本発明のアデノウイルスベクターの好
ましい態様は、E1-E2A-、E1-E2A-E4-、E1-E4-およびE2A
-E4-アデノウイルスベクターであり、それらはまたE3-
であってもよい。最も好ましくは、後期領域の除去を伴
うかもしくは伴わないで、好ましくはL5ファイバー領域
を少なくとも保持しながら、保持されたL5ファイバー領
域と右側のITRとの間の前述のE4ポリアデニル化配列は
除くかもしれないが、それ以外は初期領域のすべてがア
デノウイルスベクターから取り除かれる。
本発明のアデノウイルスベクターは、単複製欠損アデ
ノウイルスベクター、特にE1欠損単複製欠損アデノウイ
ルスベクター、により達成されるのと同様のウイルス増
殖を相補的な細胞株中で提供するスペーサーを含む。L5
ファイバー領域を保持する本発明の好適なE4-アデノウ
イルスベクターでは、スペーサーはL5ファイバー領域と
右側のITRの間に位置することが望ましい。より好まし
くは、そのようなアデノウイルスベクターでは、保持さ
れているL5ファイバー領域を右側のITRから十分に離す
ように、E4ポリアデニル化配列のみが、あるいは最も好
ましくは、別の配列と組み合わせた該配列が、L5ファイ
バー領域と右側のITRの間に存在し、それによってその
ようなベクターのウイルス産生を単複製欠損アデノウイ
ルスベクター、特にE1欠損単複製欠損アデノウイルスベ
クターのそれに近づく。
スペーサーがないと、多重複製欠損アデノウイルスベ
クターのファイバータンパク質の産生および／またはウ
イルス増殖は、単複製欠損アデノウイルスベクターのそ
れと比べて減少する。しかしながら、欠損したアデノウ
イルス領域の少なくとも１つ、好ましくはE4領域、にス
ペーサーが含まれると、増殖およびファイバー発現にお
けるこの欠点が打ち消される。
複製欠損領域の機能は相補的な細胞株によって提供さ
れる。結果として、スペーサーは欠損した機能を提供す
る必要がないので、いかなる配列であってもよく、ベク
ターが収容するであろうインサートのサイズによっての
み制限される。スペーサーは単独で、多重複製欠損アデ
ノウイルスベクターにみられる増殖の欠陥およびファイ
バー発現の減少を修復する機能を持つ。スペーサーは適
当なサイズであればいかなるものでもよいが、望ましく
は少なくとも約15塩基対（例えば、約15塩基対と約12,0
00塩基対の間）、好ましくは約100塩基対〜約10,000塩
基対、より好ましくは約500塩基対〜約8,000塩基対、い
っそう好ましくは約1,500塩基対〜約6,000塩基対、およ
び最も好ましくは約2,000〜約3,000塩基対である。
スペーサーは、所望の長さの、いかなる１つまたは複
数の配列を含んでいてもよい。スペーサー配列は、コー
ド配列であっても非コード配列であってもよく、また、
アデノウイルスゲノムについて生来のものであっても生
来のものでなくてもよいが、欠損領域に複製機能を復元
させないものである。スペーサーはまた、プロモーター
可変の発現カセットを含むこともできる。より好ましく
は、スペーサーは付加的なポリアデニル化配列および／
またはパッセンジャー遺伝子を含む。E4を欠損する領域
に挿入されるスペーサーの場合、E4ポリアデニル化配列
と、アデノウイルスゲノムのE4プロモーターもしくは他
のいずれかの（細胞もしくはウイルスの）プロモーター
の両方が残っていることが好ましい。スペーサーはE4ポ
リアデニル化部位とE4プロモーターの間に位置するか、
あるいはE4プロモーターがベクター中になければ、該ス
ペーサーは右側のITRに隣接する。
スペーサーは適当なポリアデニル化配列は何でも含ん
でもよい。適当なポリアデニル化配列の例としては、至
適化された合成配列、BGH（ウシ成長ホルモン）、ポリ
オーマウイルス、TK（チミジンキナーゼ）、EBV（エプ
スタインバールウイルス）、並びにヒトパピローマウイ
ルスおよびBPV（ウシパピローマウイルス）を含むパピ
ローマウイルスが挙げられる。特にE4欠損領域では、ス
ペーサーはSV40ポリアデニル化配列を含むことが好まし
い。SV40ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウ
イルスベクターのより高レベルのウイルス産生を可能に
する。
パッセンジャー遺伝子は、通常アデノウイルスゲノム
のE1欠損領域中に挿入されるが、パッセンジャー遺伝子
はまた、アデノウイルスゲノムのE4欠損領域中でスペー
サーとしても機能し得る。パッセンジャー遺伝子は、ベ
クターが収容できるフラグメントのサイズによってのみ
制限され、いかなる適当な遺伝子であってもよい。適切
なパッセンジャー遺伝子の例としては、pGUS、分泌型ア
ルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ−ガラクト
シダーゼおよびヒトアンチトリプシンのようなマーカー
遺伝子配列、嚢胞性線維症膜貫通調節因子遺伝子（CFT
R）のような目的の治療遺伝子、並びにB3−19K、E3−1
4.7、ICP47、Fasリガンド遺伝子およびCTLA4遺伝子のよ
うな免疫修飾因子の可能性のあるものが挙げられる。
E2A領域に欠損のある本発明の多重複製欠損アデノウ
イルスベクターは、E2A欠損領域中に、長さにして約230
塩基対よりも小さい、アデノウイルスゲノムのE2A領域
の一部をさらに含むことが好ましい。一般に、アデノウ
イルスのE2A領域は、DNA複製に必要なポリペプチドであ
るDBP（DNA結合タンパク質）をコードしている。DBPは
ウイルスの血清型によって、473〜529のアミノ酸で構成
される。DBPは、延長されたNtドメインと球状のCtから
なる扁長の楕円体として存在する非対称のタンパク質で
あると信じられている。Ctドメインのせいで、DBPが核
酸に結合し、亜鉛に結合して、DNA鎖伸長のレベルでDNA
合成に機能するという能力を持つことが研究により示さ
れている。しかしながら、Ntドメインは、後期遺伝子の
発現に、転写レベルおよび転写後レベルの両方で機能す
ると信じられており、このタンパク質の効率よい核局在
化をもたらすのであり、また、このタンパク質自身の発
現の増大にも役割を果たしているかもしれない。アミノ
酸２〜38の間のNtドメインにおける欠失により、この領
域がDBPの機能に重要であることがわかった（Broughら,
Virology,196,269−281（1993））。DBPのCt領域をコー
ドするE2A領域中の欠失はウイルス産生に影響を及ぼさ
ないが、DBPのNtドメインのアミノ酸２〜38をコードす
るE2A領域中の欠失はウイルス産生を損なう。それ故、
いかなる多重複製欠損アデノウイルスベクターもアデノ
ウイルスゲノムのE2A領域のこの部分を含んでいること
が好ましい。
特に、保持することが望まれるE2A領域部分は、例え
ば、E2A領域の5'末端により定義されるアデノウイルス
ゲノムE2A領域の部分であり、特に、血清型Ad5のアデノ
ウイルスゲノムE2A領域の位置Ad5（23816）〜Ad5（2403
2）が、相補的な細胞株中でベクターを、複製可能にす
るために必要とされる。アデノウイルスゲノムのこの部
分は現在のE2A細胞株では相補されないので、該部分は
アデノウイルスベクター中に含まれなければならず、そ
れがない場合には、相補的な細胞株中では必要なレベル
のウイルス産生およびファイバー発現が得られない。
欠失した領域のいかなる１つも、アデノウイルスにと
って外来である外来遺伝子産物を生み出すためにプロモ
ーター可変の発現カセットで置換することができる。例
えば、外来遺伝子のE2A領域への挿入は、ユニークな制
限部位の導入によって容易になされ、外来遺伝子産物は
E2Aプロモーターから発現され得る。
本発明は、ゲノムの初期領域においてのみ遺伝子機能
を欠損したアデノウイルスベクターに限定されない。ゲ
ノムの後期領域に欠損のあるアデノウイルスベクター、
ゲノムの初期および後期領域に欠損のあるアデノウイル
スベクター、本質的に全てのゲノムが除かれているベク
ターもまた包含される。この場合、少なくともウイルス
の逆位末端反復配列およびいくらかのプロモーターある
いはウイルスの逆位末端反復配列およびパッケージング
シグナルのいずれかが完全に残されていることが好まし
い。当業者であれば排除されるアデノウイルスゲノムの
領域が大きいほど、より大きな外因性DNAのフラグメン
トがゲノムに挿入できるということが認識できるであろ
う。例えば、36kbのアデノウイルスゲノムであれば、ウ
イルスの逆位末端反復配列といくらかのプロモーターを
完全な形で残すと、アデノウイルスの許容量はおよそ35
kbである。あるいは、ITRとパッケージングシグナルの
みを有する多重欠損アデノウイルスベクターを作製する
こともできる。これにより、このベクターから37〜38kb
の外来DNAの発現が効果的に予測されよう。もちろん、
欠損したアデノウイルス領域のいずれかもしくはすべて
にスペーサー配列を含ませれば、該スペーサー配列のサ
イズに相当するサイズだけアデノウイルスベクターの容
量は減少するだろう。
一般的に、ウイルスベクターは細胞内でのアデノウイ
ルスDNAフラグメント間での高レベルの組換えを期待し
て構築される。フラグメント間で類似（あるいは重複）
している領域を有しゲノムの完全長を構成しているアデ
ノウイルスベクターの２つまたは３つのフラグメントを
細胞にトランスフェクションする。宿主細胞の組換え機
構は前述のフラグメントを組換えることによって完全長
のウイルスベクターゲノムを構成する。種々の単一領域
における改変を含む、ウイルスを構築するための他の好
適な手法が以前に報告されており（Berknerら,Nucleic
Acids Res.,12,925−941（1984）;Berknerら,Nucleic A
cids Res.,11,6003−6020（1983）;Broughら,Virol.,19
0,624−634（1992））、これらは多重欠損ウイルスの構
築のために用いることができる。さらに他の好適な手法
は、例えばインビトロでの組換えや連結も含む。
ウイルスベクター構築の最初の工程は、標準的な分子
生物学的な技術を用いて、プラスミドカセット内でアデ
ノウイルスゲノムの特定の領域の欠失あるいは改変（欠
失した領域にスペーサーを付加するような）を構築する
ことである。示量解析の後、この変化させたDNA（欠失
あるいは改変を含む）は、それからアデノウイルスゲノ
ムの1/2までを含むより大きなプラスミドに移される。
次の工程は、該プラスミドDNA（欠失あるいは改変を含
む）およびアデノウイルスゲノムの大きなフラグメント
を受容細胞にトランスフェクトすることである。これら
２つのDNAフラグメントを合わせると、アデノウイルス
ゲノムの全てと類似領域を包含する。この類似領域内で
組換え現象が起こり、欠失または改変を含んでいる組換
えウイルスゲノムが造られる。多重複製欠損ベクターの
場合、受容細胞は組換え機能だけではなく、トランスフ
ェクトされたウイルスゲノムには含まれていない失われ
たウイルス機能の全てを提供、すなわち組換えウイルス
ゲノムの全ての欠損を相補する。多重複製欠損ベクター
は、例えばITRおよび／またはパッケージングシグナル
の改造によってもさらに改変され、そのような多重複製
欠損ベクターのみが相補的な細胞株において機能し、ま
た増殖する。
加えて、本発明は、本発明の多重欠損アデノウイルス
ベクターの繁殖あるいは増殖のための相補的な細胞株を
も提供する。本発明の好ましい細胞株は、アデノウイル
スゲノムのE1、E2およびE4領域を含む遺伝子機能の内の
少なくとも１つの遺伝子機能を相補することで特徴付け
られる。他の細胞株としては、後期領域を含む遺伝子機
能由来の少なくとも１つの遺伝子機能において欠損があ
るアデノウイルスベクターを相補するもの、初期および
後期の遺伝子機能の組合わせを相補するもの、および全
てのアデノウイルス機能を相補するものが含まれる。当
業者であれば、選択する細胞株は、目的の組換え多重欠
損アデノウイルスベクターから消失したそれらの機能を
特異的に相補するものであり、標準的な分子生物学的技
術を用いて製せられるものであることがわかるであろ
う。該細胞株はさらに相補的遺伝子を重複しないように
含んでおり、それがベクターゲノムが細胞DNAと組換え
を起こす可能性を最小限に、実質的には排除するという
ことによってさらに特徴付けられる。従って、複製可能
なアデノウイルスはベクターストックからは排除され、
従って特定の治療目的、特に遺伝子治療の目的に好適で
ある。これはまた非相補的な細胞におけるアデノウイル
スの複製をも排除する。
相補的な細胞株は、組換えアデノウイルスベクターの
高力価ストックを製する為には、２以上の欠損アデノウ
イルス遺伝子機能の産物を、それらの産物にとって適切
なレベルで発現することが可能なものでなければならな
い。例えば、E2A産物であるDBPは、アデノウイルスDNA
の複製のためには、化学量論的なレベル、すなわちかな
り高レベルで発現する必要があるが、E2B産物であるAd
polはアデノウイルスDNAの複製のためには、触媒レベ
ル、すなわち比較的低レベルでのみ発現する必要があ
る。組換えアデノウイルスベクターの高力価ストックを
確実にするためには、産物のレベルを適切にしなければ
ならないだけでなく、産物の時間的な発現を細胞の通常
のウイルス感染において見られるものと矛盾がないよう
にしなければならない。例えば、ウイルスのDNA複製に
必要な構成成分はウイルス粒子の構築に必要な構成成分
よりも前に発現されなければならない。ウイルス産物の
高レベルの発現にしばしば伴う細胞毒性を回避するため
に、また、産物の時間的発現を調節するために、誘導プ
ロモーター系が使用される。例えば、ヒツジのメタロチ
オネイン誘導プロモーター系が、完全なE4領域、E4領域
のオープンリーディングフレーム６、およびE2A領域を
発現するのに使用できる。他の好適な誘導プロモーター
系の例には、細菌のlacオペロン、テトラサイクリンオ
ペロン、T7ポリメラーゼ系、および真核生物と原核生物
の転写因子、抑制因子やその他の構成成分を組み合わせ
たものやキメラ構築物があるが、これらのものに限定さ
れない。発現されるべきウイルス産物に高い毒性がある
ときは、２つに分かれた誘導系を用いることが好まし
く、ここでインデューサーはウイルスベクター内に保持
され、誘導産物は相補的な細胞株の染色質内に保持され
る。テトラサイクリン発現系やlac発現系のような、抑
制性／誘導性発現系もまた使用してよい。
トランスフェクトされた細胞の少しの部分に入り込む
DNAは、より小さな分画内でさえも安定に維持されるよ
うになる。１つまたはそれ以上のトランスフェクトされ
た遺伝子を発現している細胞株の単離は、例えば抗生物
質、薬物あるいはその他の化合物に対する耐性を与える
第２の遺伝子（マーカー遺伝子）を同じ細胞に導入する
ことによって達成される。この選別は、抗生物質、薬物
あるいはその他の化合物の存在下では、移入された遺伝
子を有しない細胞は死に、一方で移入された遺伝子を含
む細胞は生き残るという事実に基づいている。そして生
き残った細胞はクローン単離され個々の細胞株として拡
大される。これらの細胞株ではマーカー遺伝子と目的の
１つまたはそれ以上の遺伝子の両方を発現するものが含
まれる。細胞の繁殖は親細胞株および選別の方法に依存
している。細胞のトランスフェクションもまた細胞のタ
イプに依存している。トランスフェクションに使用され
る最も一般的な技術は、リン酸カルシウム沈澱、リポソ
ーム、DEAEデキストランにより仲介されるDNA導入であ
る。
ここで具体的に説明されるDNA配列およびプラスミド
の、多くの修飾や変異が可能である。例えば、遺伝子コ
ードの縮重により、コードされたポリペプチドコード配
列の変更することなく、ポリペプチドの全コード領域に
わたって、また、翻訳終止シグナル中で、ヌクレオチド
を置換することが可能である。そのような置換可能な配
列は、特定の遺伝子の既知のアミノ酸あるいはDNA配列
から演繹することができ、常套の合成あるいは部位特異
的変異導入法によって構築され得る。合成DNA法はItaku
raらの方法,Science,198,1056（1977）およびCreaらの
方法,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,5765（1987）に実質
的に一致して行われ得る。部位特異的変異導入法はMani
atisら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー
マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（第
２版1989年）に記載されている。従って、本発明はここ
で特に例示されたDNA配列およびプラスミドに決して限
定されない。例示されたベクターは嚢胞性線維症の遺伝
子治療の為のものであるので、嚢胞性線維症膜貫通調節
因子（CFTR）遺伝子を有し、発現するが、しかしながら
記載されたベクターは他の疾病−気腫、喘息、成人呼吸
促進症候群および慢性気管支炎のような慢性の肺疾患、
癌や冠状動脈性心臓病や遺伝子治療や予防接種などによ
って好適に治療あるいは予防されるその他の疾患が含め
られるがそれらに限定されない−を治療するために容易
に改造される。従って、いかなる遺伝子あるいはDNA配
列も多重欠損アデノウイルスベクターに挿入され得る。
遺伝子あるいはDNA配列の選択は、例えば遺伝子治療、
予防接種などの状況において治療および／または予防効
果をなし遂げるものである。
当業者であれば、本発明の多重欠損アデノウイルスベ
クターを治療や予防、すなわち遺伝子治療、予防接種な
ど（例えばRosenfeldら,Science,252,431−434（199
1）,Jaffeら,Clin.Res.,39（２）,302A（1991）,Rosenf
eldら、Clin.Res.,39（２）,311A（1991）,Berkner,Bio
Techniques,6,616−629（1988）参照）の目的で動物に
投与する好適な方法があることが理解できよう。またベ
クターの投与には複数の経路を用いることができるが、
特別な経路が別の経路に比べてより迅速、且つより効果
的な反応を可能にするということがわかるだろう。医薬
上許容し得る賦形剤もまた当業者によく知られているも
のであり容易に入手できるものである。賦形剤の選択
は、組成物を投与するのに用いられる個々の方法によっ
て部分的に決まる。従って、本発明の医薬組成物の好適
な製剤は広く、多様である。以下の製剤および方法は単
なる例示であって何らこれに限定されるものではない。
しかしながら経口、注射およびエアロゾル製剤が好まし
い。
経口投与に好適な製剤は（ａ）水、生理食塩水あるい
はオレンジジュースのような希釈液に有効量の化合物を
溶解させた液状溶液剤；（ｂ）各々、特定量の活性成分
を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤
あるいは錠剤；（ｃ）適当な液体での懸濁液剤および
（ｄ）好適な乳剤からなる。錠剤にはラクトース、マン
ニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプ
ン、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド
性二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、タ
ルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および
その他の賦形剤、着色剤、希釈液、緩衝剤、給湿剤、防
腐剤、芳香剤および医薬上適合し得る賦形剤を１つある
いはそれ以上含めることができる。ロゼンジ剤は、活性
成分を通常シュクロースやアカシアあるいはトラガカン
トといった香味料に含めることができ、また、ゼラチン
やグリセリン、あるいはシュクロースやアカシアのよう
な不活性な基剤に活性成分を含めている香錠剤や、乳
剤、ゲル剤などは活性成分に加え、この分野で公知の賦
形剤が含められる。
本発明のベクターは、単独であるいは他の好適な成分
と組み合わせて、吸入によって投与されエアロゾル製剤
に製せられる。これらのエアロゾル製剤はジクロロジフ
ロロメタン、プロパン、窒素などのような圧縮された許
容しうる抛射薬内に入れることができる。それらはまた
ネブライザーやアトマイザーのような非圧縮性製剤用医
薬品して製剤化してもよい。
非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非
水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化
剤、緩衝液、制菌剤および予定された被投与者の血液と
製剤を等張にするための溶質が含まれていても良く、ま
た水性および非水性の無菌の懸濁液剤があり、これには
懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤および防腐剤が含
まれていてもよい。製剤はアンプルやバイアルのように
単位投与量あるいは多投与量で容器に封入され、フリー
ズドライ（凍結乾燥）され、注射するためには使用直前
に例えば水のような注射用の無菌の液体の希釈液を添加
するだけでよい状態で保存され得る。即席の注射液剤や
懸濁液剤は前述の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤か
ら調製される。
さらに、本発明において用いられるベクターは乳化基
剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することによ
り座剤に製することができる。
膣内投与に好適な製剤にはペッサリー、タンポン、ク
リーム、ゲル、パスタ、泡あるいはスプレー形態が挙げ
られ、それらには活性成分に加え、当分野で適当である
ことが知られている担体が含められる。
本発明において、動物、とくにヒトに投与される量は
重要な遺伝子または他の配列、用いた組成、投与の方法
および治療される特定の部位および生物によって変化す
る。投与量は好ましい応答、例えば、治療あるいは予防
応答を好ましい時間枠内でもたらすに十分であるべきで
ある。
本発明の多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補
的細胞株はまた、インビトロでも利用可能性がある。例
えば、アデノウイルスの遺伝子機能および構築、あるい
は好適な標的細胞における外来DNAの発現を研究するの
に用いることができる。当業者であれば、本発明のアデ
ノウイルスベクターでトランスフェクトされ得る、およ
び／またはアデノウイルス粒子に感染させて、結果とし
て挿入されたアデノウイルスDNA補充成分の発現を生じ
る細胞を選択することによって、好適な標的細胞を同定
することができる。好ましくは、好適な標的細胞はアデ
ノウイルスの細胞への接着および侵入のための受容体を
有するものが選択される。そのような細胞は全ての哺乳
類からはじめに単離されたものをも含むが、それらに限
定されるものではない。一旦好適な標的細胞を選抜すれ
ば、該標的細胞を、本発明の外来のDNAを有する組換え
多重欠損アデノウイルスベクターあるいはアデノウイル
ス粒子に接触させて、それぞれトランスフェクションあ
るいは感染させる。発現、毒性および標的細胞での外来
DNAの挿入および活性に関連する他のパラメーターは当
分野でよく知られている通常の方法を用いて測定する。
その際、研究者らは、種々の生物から外植され組織培養
で研究されている種々の細胞種における該発明のベクタ
ーによって導入された外来DNAの種々の配列の発現の効
能や効果と同様に、アデノウイルス感染に関する現象論
について学び、解明にすることができる。
さらに遺伝子治療において好適に治療される疾患を有
する患者からの外植あるいは除去された細胞が、本発明
において有用にインビトロで操作される。例えば、イン
ビトロで培養されたそのような個体由来の細胞を、本発
明のアデノウイルスベクターと、トランスフェクション
するのに好適な条件下で接触させるが、その条件は当業
者であれば容易に決定できるものであり、該ベクター
は、好適な外来DNAを含む。そのような接触は好適には
培養細胞へのベクターのトランスフェクションをもたら
し、トランスフェクトされた細胞は好適なマーカーおよ
び選択的な培養条件によって選択される。その際、標準
的な方法を用いて細胞の生存性を調べ、すなわち毒性を
測定し、目的のベクターの１つまたはそれ以上の外来遺
伝子の遺伝子産物の存在を調べる、すなわち発現を測定
し、個々の細胞について、目的の外来遺伝子を有するベ
クターとの適合性、その発現およびその毒性について調
べる。それによって、そのようにして調べたベクター／
外来DNA系をを用いて、個体の治療の妥当性や効能につ
いての情報が得られる。そのような外植およびトランス
フェクトされた細胞、用いた遺伝子治療法の可能な効能
／毒性を調べるのに役立つのに加えて、またその個体内
のインビボの位置に戻すことが出来る。そのような個体
に戻される細胞は、それについてのインビトロでのトラ
ンスフェクション、あるいは個体体内の他の組織や細胞
と隔てるマトリックスによって包まれるかあるいは埋め
込まれるのを除いては、改変せず、装飾せずに戻される
かもしれない。そのような基質としてはコラーゲンやセ
ルロースなどの生体適合性物質であってもよい。勿論そ
れとは別に、あるいはそれに加えて、インビトロでの試
験で一旦陽性の反応を観察したら、上に詳細に記載した
投与方法によって生体内のそのままの位置でトランスフ
ェクションを実行することができる。
以下の実施例にさらに本発明を説明するが、勿論、ど
のような場合にもその範囲を限定するものと解釈すべき
ではない。本実施例で言及される酵素類は特に指定し示
さない限りベセスダリサーチラボラトリーズ（BRL），
ゲイダースバーグ，メリーランド州20877,ニューイング
ランドバイオラブス社（NMB），ベバリー，マサチュー
セッツ州01915あるいはベーリンガーマンハイムバイオ
ケミカルズ（BMB）,7941 キャッスルウェイドライブ，
インディアナポリス，インディアナ州 46250 より入
手可能であり、製造元の推奨に実質的に従って用いる。
ここで用いる技術の多くは当業者によく知られたもので
ある。分子生物学的な技術は、Maniatisら，モレキュラ
ークローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual），コールドスプ
リングハーバー，ニューヨーク（第２版,1989年）およ
びカレント プロトコール イン モレキュラー バイ
オロジー（Current Protocols in Molecular Biolog
y），（Ausubelら編,1987年）のような好適な実験マニ
ュアルに詳細に記載されている。当業者であれば、以下
に示した種々の方法をそれに代わる別の方法に置換でき
ることを認識するであろう。実施例および図は、、例え
ば、AdGVCFTR.10、AdGVCFTR.11、AdGVGUS.11S、AdGVCFT
R.12およびAdGVCFTR.13を含む、例えば、リポーター遺
伝子または嚢胞性線維症膜貫通調節因子遺伝子（CFTR）
のような治療遺伝子を有するAdGV.10、AdGV.11、AdGV.1
1S、AdGV.12およびAdGV.13に関するものであるが、これ
らのベクターはCFTR遺伝子の発現に限定されるものでは
なく、他の遺伝子およびDNA配列の発現にも利用でき
る。従って、例えば本発明は、外来遺伝子、そのフラグ
メントである好適なDNA配列あるいはその他のDNA配列か
らなるようなベクターをも包含する。そのような好適な
DNA配列は遺伝子治療によって好適に治療される疾患を
治療するための遺伝子治療において効果を有するであろ
う。あるいは好適なDNA配列はまた、DNA配列が哺乳類中
で発現され、結果として例えばポリペプチド−該ポリペ
プチドに対する免疫反応を引き起こすことができる−を
生じ、予防接種に用いるような時など予防効果も有する
であろう。さらに哺乳類で発現し得る好適なDNA配列の
さらに別の使途は、アンチセンス分子、特にmRNAおよび
合成オリゴヌクレオチドからなる群より選択されるアン
チセンス分子のような、何か他の好適な治療および／ま
たは予防剤を提供することである。
実施例１ この実施例においてE1およびE3領域に欠損のあるA
DGV.10に関する１つの実施態様、すなわちAdGVCFTR.10
の作製について述べる。
AdGVCFTR.10はサイトメガロウイルス（CMV）の初期プ
ロモーターからCFTR遺伝子を発現する。このベクターの
２つの作製例を構築し、図１−AdGVCFTR.10LおよびAdGV
CFTR.10Rの一連の概略図である−に示されるようにベク
ターゲノムのE1領域にCFTR発現カセットが置かれる方向
によってAdGVCFTR.10LおよびAdGVCFTR.10Rと命名した。
CFTR発現カセットは以下のようにして構築した。pRK5
（ジェネンテック社，サウスサンフランシスコ，カリフ
ォルニア州）をKpn I（ニューイングランドバイオラブ
ズ（NEB），ベバリー，マンハッタン州）で消化し、マ
ングビーンヌクレアーゼ（NEB）で平滑末端化し、Xho I
リンカー（NEB）をKpn Iサイトの位置で連結させた。得
られたベクターをpRK5−Xho Iと命名した。そしてpRK5
−Xho IをSma I（NEB）とHind III（NEB）で消化し、マ
ングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。CFTR遺伝子
を含むプラスミド、pBQ4.7（Lap−Chee Tsui博士，ホス
ピタル・フォー・シック・チルドレン，トロント，カナ
ダ）を有するプラスミドはAva I（NEB）およびSac I（N
EB）で消化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化
した。これら２つのフラグメントを単離し相互に連結さ
せてCFTR発現カセットであるpRK5−CFTR1を作成した。
pRK5−CFTR1をSpe I（NEB）およびXho Iで消化し、ク
レノウ（NEB）で平滑末端化した。１−454/3325−5788
由来のAd5配列を含むpAd60.454（L.E.Babiss博士，ロッ
クフェラー大学，ニューヨーク，ニューヨーク州）をBg
l II（NEB）で消化し、クレノウで平滑末端化した。こ
れら２つのフラグメントは低融点アガロース技術（Mani
atisら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー
マニュアル（Molecular Cloning:a Laboratory Manua
l），コールドスプリングハーバー研究所，コールドス
プリングハーバー，ニューヨーク州（第２版1989年））
によってベクター配列から精製し、相互に連結させてpG
VCFTR.10LおよびpGVCFTR.10Rの左アームプラスミドを作
成した。
pGVCFTR.10LあるいはpGVCFTR.10R由来の左アームプラ
スミドをNhe I（NEB）で消化した。ウイルスの右アーム
はAd5d1324（Thomas E.Shenk博士，プリンストン大学，
プリンストン，ニュージャージー州）をCla I（NEB）で
消化することによって作製した。２つのフラグメント−
小さい918塩基対フラグメントおよび大きい、およそ32,
800塩基対フラグメント−をショ糖密度勾配遠心（Mania
tisら，上述）によって分離した。大きい方のフラグメ
ントを左アームプラスミドフラグメントと混合し、常套
のリン酸カルシウム法（Grahamら,Virology,52,456（19
73））によって293細胞にトランスフェクトした。得ら
れた組換えウイルスを293細胞上でプラーク精製し、常
套のウイルス技術（例えばBerknerら，（1983）および
（1984），上述）を用いてウイルスのストックを樹立し
た。
実施例２ この実施例においてE1、E3およびE4領域に欠損のある
AdGV.11の一態様、すなわちAdGVCFTR.11の創製について
述べる。
AdGV.11は、E4領域の完全な除去によって特徴づけら
れる。この大きな欠失により、約10kbの大きさまで外因
性DNAの挿入が可能となる。より重要なことは、AdGVCFT
R.11ベクターを用いて、ゲノムの別の領域が外来DNA発
現カセットの導入に利用できるということである。この
欠失は、他の産物のためのより大きな発現カセットの組
込みを可能にする。例えば、炎症や免疫応答を消し去る
ための、可溶性の受容体、例えば膜貫通ドメインのな
い、従ってもはや膜に接着しないTNFまたはIL−６、並
びにアンチセンス分子、例えば、cdc2、cdkキナーゼ、
サイクリン、すなわちサイクリンＥもしくはサイクリン
Ｄ、および転写因子、すなわちE2Fもしくはｃ−mycのよ
うな細胞周期調節産物に対するアンチセンス分子であ
る。
AdGVCFTR.11はAdGVCFTR.10の１−27082、すなわち左
アームとBamH I（NEB）およびSal I（NEB）で線状化さ
れたAd5の21562−35935、すなわち右アームを含むプラ
スミド（pGV11A,pGV11B,pGV11CあるいはpGV11D;後で詳
細に述べる）との間での単一のインビボ組換えによって
構築され、それに後述の種々のE3およびE4の改変物を導
入した。
完全なAdGVCFTR.10をSpe I（NEB）およびSrf I（スト
ラタジーン社，ラ ホラ，カリフォルニア州）で消化し
て１−27082塩基対のフラグメントを得た後、AdGVCFTR.
10由来の左アームを全溶液の1/4が40％である凹型10−4
0％ショ糖密度勾配で単離した。
右アームは改変pGEMベクター（pGBS）のBamH I−Sal
I消化によって得られた。pGBSは以下のようにして作製
した。pGem I（プロメガ社，マディソン，ウイスコンシ
ン州）をEcoR Iで消化してクレノウで平滑末端化し、そ
してSal Iリンカーを該ベクターに連結させた。そし
て、得られたDNAをSal Iで消化し再び連結させ、それに
よりEcoR IサイトをSal Iサイトで置換して２つのSal I
サイト間の配列を欠如させ、Hind IIIで消化されクレノ
ウで平滑末端化したpGEMH/P/Sを作製し、BamH Iリンカ
ーを該ベクターに連結させてpGEMS/Bを作製した。pGEMS
/BをBamH IおよびSal Iで消化し、p50−100（Paul Frei
muth博士，コロンビア大学，ニューヨーク州）と呼ばれ
るpBRプラスミド由来の約14kbのBamH I−Sal Iフラグメ
ント（Ad5由来の21562−35935）と連結させ、pGBSを作
製した。
pGBSΔE3を改変してE4領域全体を欠失した右アームプ
ラスミドを作製する。得られる、E3およびE4領域全体を
欠失したプラスミドをpGV11（０）と命名する。これ
は、32811にあるAfl IIIサイトと35640にあるBsg Iサイ
トにPac I制限サイトを導入することによりなされる。
これら２つのサイト間のPac Iフラグメントの欠失によ
り、E4プロモーター内のE4 TATAエレメントとE4 ポリ
Ａサイトを含むE4配列のすべてが効果的に除去される。
抗免疫性および抗炎症性の特性を有する２つのAd E3
遺伝子産物をアデノウイルスベクターに導入するために
３つの異なった様式の右アームプラスミドを構築した。
pGV11（０）（実施例７）と命名されたpGBS△E3ORF6で
の大きなE3欠失を、5'末端にAd2 E3 19kDaの抗免疫性
遺伝子産物、および3'末端にAd5 E3 14.7Kdaの抗炎症
性遺伝子産物を有するジシストロン性のmRNAの発現を駆
動するラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピート
（RSV−LTR）プロモーターを有する発現カセットの３つ
の異った様式のもので必須的に置換した。BstB I（NE
B）フラグメントの欠失によって19kDaのcDNAフラグメン
トを欠失させることによりさらに１つのウイルスを構築
した。AdGVCFTR.11（Ｄ）と命名されたこのウイルス
は、E3 14.7kDaの抗炎症性遺伝子産物のみを有する単
シストロン性のmRNAの発現を駆動するRSV−LTRプロモー
ターを有する。
まず、EcoR I（27331）−Nde I（31089）フラグメン
トをPUC19ポリリンカーの同一サイトにクローニングす
ることによりpGBS△E3（実施例５）由来のSpe I（2708
2）−Nde I（31089）フラグメントをpUC19にサブクロー
ニングした。pGBSから生成されたHind III（26328）−E
coR I（27331）フラグメントをこのクローンのEcoR Iサ
イトにクローニングして、pHN△E3を作製した。適切な
プライマーを用いて、RSV−LTRプロモーター、Ad2 E3
19kDaの遺伝子産物およびAd5 E3 14.7kDaの遺伝子
産物を有する、フランキングXba Iサイトを持つPCRフラ
グメントを作製した。増幅したフラグメントをXba Iで
消化し、pUC19にサブクローニングしてpXAを作製した。
Xba Iフラグメントの解析後、該フラグメントをpHN△E3
に連結させpHNRAを作製した。
適当なプライマーを用いて、それらを含むmRNAの翻訳
を増強させることが知られている（Joblingら,Nature,3
25,622−625（1987）;Jangら,Genes and Development,
4,1560−1572（1990））内部リボーゾーム導入部位（IR
ES）をコードしているフランキングBstB Iサイトを持つ
２つのPCRフラグメントを作製した。１つのフラグメン
ト（様式Ｂ）にはアルファルファモザイクウイルスの外
皮タンパク質mRNAの非翻訳リーダー（AMV RNA ４ リ
ーダー）（Joblingら，上述）由来の34塩基対のIRESが
含まれる。もう１つのフラグメント（様式Ｃ）には脳心
筋炎ウイルス（エンセファロマイオカルディティスウイ
ルス）（EMCV）mRNA（Jangら，上述）の5'非翻訳領域由
来の570塩基対のIRESが含まれる。様式ＢあるいはＣ由
来の各々のBstB IフラグメントをpXAにおいてBstB Iフ
ラグメントの代わりにクローニングした。得られたプラ
スミド−それぞれpXB、pXCと命名される−をXba Iフラ
グメントの配列解析の後、それぞれpHN△E3に移し、pHN
RBおよびpHNRCを作製した。
pGBS△E3ORF6由来のSpe I（27082）−Nde I（31089）
フラグメントを、pHNRA、pHNRB、pHNRCおよびpHNRD由来
のSpe I−Nde Iフラグメントで置換し、それぞれpGV11
A、pGV11B、pGV11CおよびpGV11Dを作製した。
pGVxプラスミドDNAをBamH IおよびSal Iで線状化し、
精製した左アームDNAフラグメントと20μｇ全DNAまでで
種々に濃度を変えて混合し、必要に応じてサケ精子ある
いはウシ胸腺DNA（ライフテクノロジー社，ゲイダース
バーグ，マサチューセッツ州）でDNA量を約20μｇにな
るように用いた。混合したフラグメントを常法のリン酸
カルシウム技術（Grahamら，上述）を用いて293細胞に
トランスフェクトした。293/ORF6細胞株のいずれかの29
3/E4細胞株を使用することができる。
トランスフェクトして５日後、細胞単層を３回の凍結
融解により回収した。得られたハイブリッドウイルスは
293細胞上で力価検定し、単離されたプラークを選び取
った。最初のプラーク保存株中に単一の組換えウイルス
が存在するのを確実にするためにプラーク単離の工程を
２回以上繰り返した。単離プラーク保存株をBurlseson
ら、ヴィロロジー：ア ラボラトリー マニュアル（Vi
rology:a Laboratory Manual）、アカデミック出版社、
（1992年）に記載されている常套のウイルス技術に従っ
て大容量のウイルス保存株に増幅した。
E4はウイルス増殖に必要な不可欠の遺伝子産物を含む
ので、得られるE4欠失変異体ウイルスは外因性のE4発現
なしには増殖できない。それ故、ウイルス構築に関する
すべての操作は新しい293/E4細胞株または293/ORF6細胞
株中で行われる（実施例６に記載）。得られるウイルス
はADGVCFTR.11であり、図２に、比較の為ADGVCFTR.10L
と模式的に示される。
実施例３ この実施例においてE1、E2A、E3およびE4領域に欠損
のあるAdGV.13の一態様、すなわちAdGVCFTR.13の作製に
ついて述べる。
AdGV.13は、E1およびE4領域の完全な排除（ADGV.11の
ように）だけでなくE2Aの完全な排除によっても特徴付
けられる。E2Aの完全なコード領域は、オープンリーデ
ィングフレーム（Vosら,Virology,172,634−642（198
9）;Broughら,Virology,190,624−634（1992））の両末
端でのCla I制限サイトの挿入を有するH5in800およびH5
in804という２つのE2A変異ウイルス由来のDNAを相互に
融合させることによって欠失させる。H5in800のCla Iサ
イトは遺伝子のコドン２および３の間にあり、H5in804
のCla IサイトはE2A遺伝子の停止コドン内にある。結果
として生ずるウイルスはE2Aリーディングフレームと類
似点を持たない23アミノ酸からなるオープンリーディン
グフレームを含む。さらに重要なことに、このカセット
はウイルスゲノムの他の領域に特徴的な遺伝子を導入す
ることができる。これは目的の遺伝子を小ORFが存在す
る適切なリーディングフレームに挿入することにより、
あるいは目的の遺伝子に加えてそれ自身のプロモーター
配列、ポリアデニル化シグナルおよび終止コドンを有す
る他の発現カセットを導入することによって成し得る。
アデノウイルスDNAをH5in800およびH5in804から調製
した。制限酵素Hind III（NEB）で消化した後、両H5in8
00およびH5in804由来のHind III AフラグメントをpKS＋
（ストラタジーン社）にクローニングする。得られたプ
ラスミドをpKS＋H5in800Hind III AおよびpKS＋H5in804
Hind III Aとそれぞれ命名した。そしてpKS＋H5in800Hi
nd III A由来のCla I（NEB）フラグメントを単離し、pK
S＋H5in804Hind III A由来の同一のCla Iフラグメント
の代わりにクローニングする。このキメラプラスミド、
pHind III A E2Aは上に述べたように全てのE2Aリーデ
ィングフレームを効果的に排除している。この点で、E2
Aの欠失をBamH I（NEB）およびSpe I（NEB）制限サイト
に移し、pGV12（０）中の野生型の配列を置換してpGV13
（０）を構築した。
AdGVCFTR.13ウイルス（図３参照）をAdGVCFTR.10左ア
ームDNAおよびpGV13（０）右アームプラスミドDNAを用
いることによって既に述べた様にして構築する。しかし
ながら、このウイルス構築物の宿主細胞株は３重の相補
的細胞株293/E4/E2Aである。図３はAdGVCFTR.13ウイル
スベクターの概略図である。図は比較の為にAdGVCFTR.1
0Lの図と一列に並べてある。
実施例４ この実施例においてpGBSΔE3の作製について述べる。
このプラスミドは、E3プロモーターおよび現存するE3
遺伝子を含めた、pGBS内のE3領域の大部分を除去するた
め、他の構築物のために場所を空けるため、そしてE3発
現カセットの導入を容易にするために製せられる。この
プラスミドは28331から30469までの欠失を含んでいる。
PCRフラグメントは、Ad5s（27324）およびA5a（2833
0）Ｘをプライマーとして、そしてpGBSを鋳型として用
いて製せられる。得られたフラグメントをEcoR I（2733
1）およびXba I（28330）で消化し、ゲル精製した。そ
して、このフラグメントをEcoR Iサイト（27331）およ
びXba I（30470）サイトでpGBSに導入した。
実施例５ この実施例においてpGBSΔE3ΔE4の作製について述べ
る。
さらなる外来性の配列をアデノウイルスゲノム内に移
すのを容易にするためにAd5 E4領域の大きな欠失をpGB
SΔE3に導入した。32830−35566E4コーティング配列を
欠失させた。
pGBSをMun Iで消化したDNAフラグメントをクレノウで
処理して該フラグメントを平滑末端化し、これにPac I
リンカーを連結させることによって、32830の位置でMun
Iサイトの代わりにPac Iサイトを製した。その改変し
たDNAをNde Iで消化し、得られた1736塩基対フラグメン
ト（Nde I31089−Pac I32830）をゲル精製した。PCRフ
ラグメントを、A5（35564）Ｐ（IDT、コーラルビル、ア
イオワ州）およびT7プライマー（IDT、コーラルビル、
アイオワ州）、並びに鋳型としてpGBSを用いて調製し
た。得られたフラグメントをPac IおよびSal Iで消化
し、Pac I35566−Sal I35935を作製した。pUC19のポリ
リンカー領域内のSma IサイトをPac Iリンカーに連結さ
せることによってPac Iサイトに改変した。Pac I35566
−Sal I35935フラグメントを改変させたpUC19ベクター
にポリリンカー領域内のPac IおよびSal Iサイトの位置
でそれぞれ移した。改変したNde I31089−Pac I32830フ
ラグメントを、Pac I35566−Sal I35935フラグメントが
既に挿入されているpUC19に、Nde IおよびPac Iサイト
の位置でそれぞれ移した。pUC19プラスミド由来のNde I
31089−Sal I35935フラグメントをゲル精製によって精
製し、pGBSΔE3内の各Nde IおよびSal Iサイトに置き換
えてクローニングしてpGBSΔE3ΔE4を得た。
実施例６ この実施例において293/E4細胞株の作製について述べ
る。
pSMT/E4は以下の様にして作製した。2752塩基対のMun
I（Ad2のサイト32825）−Sph I（ポリリンカー）フラ
グメントを、Ad2由来の領域32264−35577がサブクロー
ニングされたpUC19プラスミドであるpE4（89−99）から
単離、クレノウで平滑末端化し、ホスファターゼ（NE
B）で処理した。発現カセットプラスミドpSMT/E4を作製
するために、2752塩基対のMun I−Sph Iフラグメント
を、BamH Iで線状化しクレノウで平滑末端化しホスファ
ターゼで処理したpMT010/A+（McNeallら,Gene,76,81−8
9（1989））に連結させた。
細胞株293は（ATCC CRL 1573;アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション，ロックビル，メリーランド州）
は10％ウシ胎児血清ダルベッコの改変イーグル培地（ラ
イフテクノロージ社，ゲイダースバーグ，メリーランド
州）で培養した。ついで293細胞をEcoR Iで線状化したp
SMT/E4にリン酸カルシウム法（Sambrookら，モレキュラ
ークローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Mole
cular Cloning:a Laboratory Manual），コールドスプ
リングハーバー研究所出版（1989年））によりトランス
フェクトした。トランスフェクション後、約24−48時間
で100μＭメトトレキサートおよびアメソプテリン（シ
グマ化学社，セントルイス，ミズーリ州）を含有する培
地（上記）を添加した。培地中のメトトレキサートの存
在はpSMT/E4プラスミドにおける選択マーカーであるジ
ヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子の発現を選択する。
正常の細胞のDHFR遺伝子は与えるメトトレキサートの
濃度によって阻害され（細胞種特異的）、細胞死を引き
起こす。pSMT/E4を有するトランスフェクトされた細胞
におけるさらなるDHFR遺伝子の発現はメトトレキサート
に対する耐性を与える。従って、新しい遺伝子を有する
トランスフェクトされた細胞のみがこれらの条件下で生
育する細胞である（総説としては、Sambrookら，上述，
を参照）。
選択マーカーを保持している最初の１つの細胞から細
胞の小コロニーが形成されると、それらをクローンごと
に単離し回収した（総説としては、Sambrookら，上述，
を参照）。これらのクローンは細胞株を生成するまで拡
大した。これらの細胞株はその産物−−この場合E4−−
の発現でスクリーニングされる、また欠損のあるウイル
ス−−この場合E1およびE4の両方を欠損したウイルス−
−を相補する機能性でスクリーニングされる。
この工程の結果、がAdGVCFTR.11のようなE1およびE4
の機能の両方を欠損しているアデノウイルスベクターを
相補することが可能な最初の293/E4細胞株が産生され
た。
実施例７ この実施例では293/E4/E2A細胞株の作製について述べ
る。該293/E4/E2A細胞株によりE1、E4およびE2Aを欠損
したウイルスベクターが増殖できる。
293/E4細胞に導入するためのE2A発現カセット（図４
参照）は以下のように製する。最初の段階は、E2Aの効
率的な発現のためにE2AのATGのまわりの塩基を完全なコ
ザックのコンセンサス（コザックら,J.Molec.Biol.,19
6,947−950（1987））を形成するように改造することで
ある。E2A遺伝子の5'末端を改造するために２つのプラ
イマーを設計した。18塩基対のオリゴヌクレオチド（5'
GCCGCCTCATCCGCTTTT3'）（配列番号３）であるAd5s（23
884）をE2A遺伝子のSma Iサイトの隣にある内部領域を
始点とするよに設計した。32塩基対のオリゴヌクレオチ
ド（5'CCGGAATTCCACCATGGCGAGTCGGGAAGAGG3'）（配列番
号４）であるDBP（ATG）R1を、クローニングを容易にす
るために、これを改造しているE2A遺伝子のATGのまわり
の翻訳コンセンサス配列を完全なコザック拡張コンセン
サス配列を導入するように、および丁度5'のEcoR Iサイ
トを導入するように設計した。上記のプライマーを用い
て得られたPCR産物をEcoR IおよびSma I（NEB）で消化
し、pBluescript II KS＋（ストラタジーン社，ラ ホ
ラ，カリフォルニア州）の同一のポリリンカーサイトに
クローニングした。得られたプラスミドをpKS/ESDBPと
命名した。
Sma I−Xba IフラグメントをpHRKauffman（Morinら,M
ol.Cell Biol.,9,4372−4380（1989））から単離し、E2
Aのリーディングフレームを補うためにpKS/ESDBPの対応
するSma IおよびXba Iサイトにクローニングした。得ら
れたプラスミドはpKSDBPと命名した。発現カセット内に
含まれるベクター由来のすべての相同配列を排除するた
めに、ポリリンカー内のEcoR Iサイトが破壊されている
（ジェンベク，ロックビル，メリーランド州）PNEB193
（NEB）の対応するKpn IおよびPme Iサイトに、pKSDBP
由来のKpn I−Dra Iフラグメントを移した。得られたク
ローンpE2Aは実施例３のE2Aを欠失したベクターに相同
するどんな余分な配列も有さずE2Aのリーディングフレ
ームの全てを含んでいる。
適切にmRNAが核でプロセッシングされるように、ま
た、E2Aの発現がさらにエンハンスされるように5'スプ
ライスカセットをpE2Aに移した。このことを行うため
に、実施例１に記載したpRK5をSac II（NEB）で消化
し、マングビーンヌクレアーゼ（NEB）で平滑末端化
し、そしてEcoR I（NEB）で消化した。得られた、スプ
ライシングシグナルを含む、およそ240塩基対の重要な
フラグメントをpE2AのCla I（クレノウにより平滑末端
化された）−EcoR Iサイトにクローニングし、p5'E2Aを
製する。E2A配列を有するp5'E2A由来の平滑末端化され
た（クレノウ）Sal I−Hind IIIフラグメントをpSM す。
全てのE2A遺伝子を含んだpKSE2A由来のXba Iフラグメ
ントをpSMT/pu ミド、pSMT/E2A/puroおよびpSMT/E2A/neoをそれぞれ293
/E4および203/ORF−６細胞にトランスフェクトした。pS
MT/E2A/puroでトランスフェクトされた細胞は標準培地
＋ピューロマイシン中の生育で選択され、pSMT/E2A/neo
でトランスフェクトされた細胞は標準培地＋ジュネティ
シン（G418;ライフテクノロジー社、ゲイダースバー
グ、メリーランド州）中の生育で選択される。単離した
コロニーのクローンの拡大は実施例６に記載のとおりで
ある。得られた細胞株はそのE1、E4およびE2A欠損ウイ
ルスベクターを相補する能力により選別される。
これらの細胞株は、ウイルスベクターのAdGVCFTR.13
シリーズに記載されたもののようにウイルスのE1、E4お
よびE2A領域を欠損しているウイルスベクターを相補す
るのに好適である。
実施例８ この実施例では細胞株A549（ATCC）を親株として用い
た相補的細胞株の作製について述べる。
Ad2ウイルスDNAは前述の技術によって調製される。ゲ
ノムDNAはSsp IおよびXho Iで消化し、5438塩基対のフ
ラグメントを精製しpKS＋（ストラタジーン）のEcoR V/
Xho IサイトにクローニングしてpKS341−5778を作製し
た。クローンの特徴測定の後、Xho I（クレノウを用い
て平滑末端化された）−EcoR IフラグメントをpRC/CMVn
eoのNru I（平滑）−EcoR Iサイトに移し、pE1neoを製
した。このクローンを用いてA549細胞を形質転換して相
補的細胞株（293同様）を製する。該細胞では、293細胞
の際に記載したのと同じ方法で、さらなる発現カセット
が導入され、優れたプラーク形成能をもつ多相補的細胞
株を製する。
実施例９ この実施例では293/E2A細胞株の作製の方法およびE2
およびE4の両領域を欠損しているアデノウイルスベクタ
ーの構築のためのその利用について述べる。
実施例７に記載および図４に描写されるように、E2A
発現カセットベクターが得られた。E2A発現カセットベ
クターはトランスフェクトされた細胞のマーカーとして
ネオマイシン耐性を与える遺伝子を含んでいる。
また、実施例７に記載したように、293細胞はpSMT/E2
A/neoでトランスフェクトされ、トランスフェクトされ
た細胞は標準培地＋G418中での増殖で選別された。選別
された細胞のクローン拡大は実施例６に記載されたよう
にして行われた。得られた細胞株は誘導時のそのDNA結
合タンパク質（DBP;E2A遺伝子産物）を発現するそれら
の能力およびE1およびE2A欠損ウイルスベクターを相補
するそれらの能力でスクリーニングした。
DBP発現能力に対する293/E2A細胞株のネオマイシン陽
性（neo+;すなわち、ネオマイシン耐性）の単離クロー
ンの能力を調べるために、細胞をG418存在下で生育させ
て選別を続けた。独立した単離クローンからの樹立した
単層を100μＭのZnCl2で24時間誘導させ、DBP遺伝子の
発現を常法を用いてイムノブロッティングで検出した。
調べた62株の内、42％のneo+細胞株がDPB発現に陽性（D
PB+）であり、DPB+細胞株の全ては誘導性のDBP発現を示
した。以下の表１にはDBP発現によるスクリーニングか
らのデータを表す： 続いてBroughら，上述，の方法を用いたイムノブロッ
ティングによって誘導されたDBPの発現の程度でクロー
ン化293/E2A細胞株をスクリーニングし、標識されたオ
ートラジオグラフィー図で描写された結果を図５および
６に示す。HeLaに基づくgmDBP2細胞のそれと同様程度に
DBPを蓄積した細胞をさらに解析した。図５に示す様
に、誘導された細胞の溶解物によると、誘導されたDBP
の発現の程度は単離クローンによって大きく異なってい
る。例えば上述のように、細胞株104、112および216は
誘導するとかなりの量のDBPを産生する、その一方で細
胞株19および61はgmDBP2細胞によって産生されるほども
産生しない。
誘導して最初の24時間にわたってDBPを蓄積する能力
を、また再び、Broughらの方法、上述、を用いてクロー
ン化293/E2A細胞株について解析した。図６に示す様
に、誘導後、０、２、16および24時間で回収した細胞の
溶解物によると、いくつかの株にインキュベーション時
間にわたる累進的なDBPの蓄積がウイルスの増殖と矛盾
無く見られた。
得られた293/E2A細胞株による相補性を調べるため
に、常套の手法を用いてこれらの細胞株における増殖に
ついてE2A欠失ウイルスを調べた。当業者にはよく知ら
れているように、ウイルス増殖は宿主細胞の単層におけ
るプラーク形成の単純な観察によって半定量的に測定で
き、ここでもそれを行った。同じ株についてE2A遺伝子
の相対的な発現、すなわちDBPの相対的な発現をBrough
ら,Virology,190,624−634（1992）、に従ってイムノブ
ロットにより測定した。各々の細胞株の前述のパラメー
ター（最も低い＋／−〜最も高い＋＋＋＋＋）に関し
て、発現あるいは増殖の相対的な程度を表２に述べる： 表２に反映されるように、この研究の結果は２つの29
3/E2A細胞株（すなわち54および112）はE2A欠失ウイル
スのプラーク形成および、従って増殖を補助することを
示した。
選別された細胞株はまた当分野には慣例の細胞培養法
を用いてウイルスのE1およびE2A領域を欠損しているベ
クターを相補することも示された。そのような２重に欠
損を有するベクターは実施例１および２に開示された方
法を用いて製することができる。図７は、E1およびE2A
領域を欠損しているアデノウイルスベクターであるAdGV
CFTR.12Bの構造を示している。細胞継代後の、トランス
フェクトされた細胞の３つの異なる溶解物におけるAdGV
CFTR.12Bベクターの存在は常套のPCRアッセイによっ
て、ベクターに関連したDNA配列を検出することにより
示された。CFTR配列（図８において“A"と標記したカラ
ム）の存在、E2A配列の不在、すなわち欠失の根拠
（“B"と標記したカラム）および野生型のE2A配列
（“C"と標記したカラム）の存在について３つの異なっ
た溶解物を別々に調べた。その実験は常套の方法を用い
てなされた、図８に示された臭化エチジウムで染色され
た、ゲル分離されたDNA断片の逆コントラスト写真から
解析され得る。
結果は、３つの溶解物全てがAdGVCFTR.12Bベクターの
構造に一致したCFTRおよびE2A欠失配列を含んでいるこ
とを示している。これらの溶解物には野生型のE2A配列
は検出されなかった。図８において“M"は産物のサイズ
を確かめるためのDNAマーカーを表し、“＋”は与えら
れたプライマーセットに正の鋳型を用いた場合のサンプ
ルの印であり、“−”は与えられたプライマーセットに
負の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、そして上
述のＡ、ＢおよびＣは試した３つのウイルス溶解物を表
す。
それによって、E1およびE2領域に欠失を有するアデノ
ウイルスベクターが作製され、２重の欠損ベクターを相
補する能力を有する細胞株を確認した。
実施例10 この実施例では、外来DNAの発現のためのE2A欠失プラ
スミドの使用を説明する。
実施例３に述べたように、E2A欠失プラスミドpGV13
（０）をpGV12Bベクターシリーズの構築に用いた。pGV1
3（０）の改変には、ユニークなSce I制限サイトをCla
Iサイトと置換し、E2A遺伝子のATGのまわりの領域を能
率的なコザックのコンセンサス配列に変更することが含
められる。フランキングなSce I制限サイトを有するマ
ーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ）をE2A遺伝子に
挿入し、そのマーカー遺伝子は最も豊富な初期遺伝子、
すなわちDBPの発現に用いられるシグナルの全てに応答
して発現する。トランスフェクションおよび続いてβ−
グルクロニダーゼ活性を評価することによって、得られ
たプラスミド（pGBSE2GUS）が機能することを調べた；
調べた全てのトランスフェクトした細胞株は、高いβ−
グルクロニダーゼの発現レベルを示し、これはβ−グル
クロニダーゼが基質Ｘ−gluとの反応を触媒するときに
青色を産生することによって検出される。
図９で描写されるような他のウイルスベクター（AdGV
Luc;E2GUS）は、例えば遺伝子治療目的のための外来DNA
の配置への欠失したE2領域の利用を説明するために構築
される。AdGVLuc;E2GUSベクターはE1領域にCMVルシフェ
ラーゼマーカーを含み、E2A領域にβ−グルクロニダー
ゼを含む。前ベクター（AdGVLUC.10）は293/E2A細胞を
トランスフェクトするのに用いられ、得られたウイルス
プラークのその後のＸ−gluを用いたβ−グルクロニダ
ーゼについての染色では実際、青色は示されなかった、
すなわちβ−グルクロニダーゼ活性は検出されなかっ
た。AdGVLuc;E2GUSベクターでトランスフェクトされた2
93/E2A細胞から形成されたプラークは、Ｘ−galの添加
によって、かなりの量の青色を産生した。
従って、アデノウイルスベクターのE2A領域で置換さ
れた外来DNAは機能できる。
実施例11 この実施例では、293/ORF6細胞株の作製方法およびE1
およびE4領域の両方を欠損しているアデノウイルスベク
ターを構築するためのその利用について説明する。
図10に描写されるE4−ORF6発現カセットは、プライマ
ーA5s（33190）ＰとA5a（34084）Ｐを用いて、Ad5 E4
のORF−６遺伝子を増幅し且つクローニング用に両端にP
ac Iサイトを生じさせるためのポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）（PCRプロトコール，方法と応用への指針（PCR
Protocols,A guide to Methods and Applications）,In
nisら編，アカデミック出版社（1990年））で構築され
た。増幅されたフラグメントをクレノウで平滑末端化
し、pCR−Script SK（＋）（ストラタジーン，ラ ホ
ラ，カリフォルニア州）にクローニングした。得られた
プラスミド、pCR/ORF−６の配列を決定し、次いで、pRC
puro中の平滑末端化されたMlu I−Hind IIIサイトに、S
MTプロモーターを含む平滑末端化されたEcoR I−Hind I
IIフラグメントを連結することにより作製されたpSMT/p
uro発現ベクターに、ORF−６インサートを移してpSMT/O
RF−６を作製した。
293細胞のトランスフェクションはpSMT/ORF6/puroで
なされ、トランスフェクトされた細胞は標準の培地＋ピ
ューロマイシン中での生育によって選別された。クロー
ンの拡大は実施例６に記載されたようにして行った。得
られた細胞株は誘導の際のそれらのE4−ORF6の発現能力
およびE1およびE4を欠損したウイルスベクターを補う能
力で選別した。
293/ORF6細胞株のピューロマイシン耐性（puro+、す
なわちピューロマイシン耐性）の単離クローンはそれら
のORF6の発現能力で選別した。選別を維持するためにピ
ューロマイシン存在下で細胞を生育させた。個々の単離
クローンからの確立した単層を100μＭのZnCl2で24時間
かけて誘導した。ORF6遺伝子の発現はノザンブロッティ
ング、それによるRNA転写を確認することによって検出
した。試した各々の細胞株の発現の相対的な程度（最も
低い（＋）〜最も高い＋＋＋＋＋）を表３に示す。
ORF6遺伝子の発現を調べた結果は、ピューロマイシン
耐性細胞株の53％がORF6転写陽性であり、そのようなOR
F陽性細胞株はすべてORF発現を誘導し得ることが示され
た。
またPCRは、アデノウイスベクターのE4欠失領域での
遺伝子の挿入を検出するために用いられ、その結果は図
11に描写される。AdGVβgal.11でトランスフェクトされ
た、継代された細胞の溶解物を、野生型E4に関連したあ
る遺伝子配列、すなわち3087塩基対および367塩基対の
フラグメントを増幅するPCRに付した。偽（mock）感染
させた293/ORF6細胞（レーン１）、AdGVβgal.10で感染
させた細胞（レーン２）およびAdGVβgal.11で感染させ
た細胞（レーン３）を、ゲル電気泳動および臭化エチジ
ウム染色に付した。図11に示される、得られた染色ゲル
写真は、AdGVβgal.10ベクターが367塩基対の配列を含
むE4領域の部分を欠いていること、およびAdGVβgal.11
ベクターが3087塩基対の配列を含むE4領域の部分を欠い
ていることを示している。
293/ORF6細胞株においてE4を欠失したベクターの増殖
を観察した。細胞を10感染多重度（moi）で感染させる
と、生育５日後でかなりの量のウイルス増殖が相補性プ
ラーク解析によって観察された。結果を、細胞あたりの
プラーク形成単位（PFU）をｙ軸に、調べた細胞株をｘ
軸に示した棒グラフである図12に描写する。増殖の陽性
コントロールとしては、E4の機能を相補することが知ら
れている細胞株W162を用いた。陰性コントロールとして
は、E1の機能のみを相補することが知られている293細
胞株を用いた。細胞株A2、B8、216および406は、E4欠失
ウイルス（dl366）の、定量的に異なる相補性を示す293
/ORF6細胞株の独立した単離物である。つまり、該293/O
RF6細胞株はE4の機能を相補する。
したがって、細胞株がE4機能を相補する−それによっ
てE4欠失ウイルスの増殖を可能にし、機能を有する外来
DNAを担持することが可能であることが示される−と確
認された。これらの細胞株は、ウイルスのE1およびE4領
域を二重に欠損した、上記のAdGVβgal.11シリーズに記
載されるような、あるいはAdGVβgal.11の図説である図
13に示されるような、ベクターを相補するのに好適であ
る。AdGVβgal.11ベクターはE1領域に挿入されたβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子と欠失のあるE4領域を有してい
る。
実施例12 この実施例では、E1およびE4欠失を有するアデノウイ
ルスベクターの利用を説明する。
E4欠失プラスミドであるpGBSΔE4は、幾つかのユニー
クな制限サイトを含むように改変されている。これらの
サイトは、この領域に好適な外来DNAをクローニングす
るために用いられ、発現のためにはアデノウイルスE4プ
ロモーターが用いられる。上述のように、この領域での
β−グルクロニダーゼのクローニングによって、完全に
機能的であり且つ外来DNAを発現しているウイルスベク
ターが得られた。したがって、E1領域な配置された好適
な外来DNAおよびE4領域での他の好適な外来DNA、これら
はともに同一ウイルスベクター上にあり、それぞれの外
来DNAをE1およびE4プロモーターあるいは必要とされる
他のプロモーターの制御を利用して発現することができ
る。
E4領域の２番目の改変により、種々の異種調節因子か
らの、好適な外来DNAの発現が可能となる。プラスミド
構築物は多数の交換が都合よくなされ得るようにして作
られる。マルチプラスミドpGV.11Sは都合よく交換され
得る次のような特徴を有する： 1.相同組換えに使用されるアデノウイルスセグメント−
ベクターのE1末端およびE4末端に外来DNAを配置するた
めに結合している； 2.プロモーターセグメント； 3.スプライスシグナルセグメント； 4.外来DNAセグメント； 5.ポリアデニル化セグメント； 6.アデノウイルスパッケージング配列； 7.アデノウイルスITR;および 8.哺乳動物の組織培養と同様に、細菌においてもプラス
ミドを選択および増殖させるのに必要なすべてのプラス
ミドDNA配列。
実施例13 この実施例では、AdGV.11に存在するE4欠失領域中に
挿入されたスペーサー配列を含むAdGV.11Sに関する一態
様、すなわちAdGVCFTR.11Sの作製について述べる。同様
に、スペーサーは、例えばAdGV.12SおよびAdGV.13SのE4
欠失の領域中に組み込むこともでき、それぞれAdGVCFT
R.12SおよびAdGVCFTR.13Sが誘導される。
AdGVCFTR.11S組換えウイルスは、実施例２に記載され
たAdGVCFTR.11の作製について述べられた手順を用い
て、構築、単離および増殖された。AdGVCFTR.11Sは、Ad
GVCFTR.10の１〜27082、すなわち左アームと、BamH I
（NEB）とSal I（NEB）とで線状化したプラスミドpGV11
S、つまり右アーム、の間での単一のインビボ組換えに
よって構築された。したがって、得られたAdGVCFTR.11S
ベクターはE1およびE4を欠損し、且つE4欠失領域中のス
ペーサー、並びにSV40ポリアデニル化配列を組込んでい
る。もちろん、該ベクターはまた、アデノウイルスゲノ
ムのE4領域由来のE4ポリアデニル化配列およびE4プロモ
ーターも含む。
AdGVCFTR.11Sベクターのファイバー/E4領域を図14Cに
示す。比較の目的で、種々の本発明の他のベクターを図
14Aおよび14Bに示す。図14Aのベクターは、E4が完全に
欠失してL5ファイバーが右側のITRに融合している。そ
のようなベクターは、野生型アデノウイルスと比較して
およそ2.5kbのE4領域の欠失を含む。AdGV.11をベースと
したベクター（図14B）および他のベクターと比較した
際のAdGVCFTR.11S（図14C）の種々の特徴は、以下の実
施例に記載されている。
実施例14 この実施例では、E1を欠損するが野生型E4領域を保持
するベクターと比較した際の、E1およびE4を欠損するベ
クターの増殖の挙動およびファイバータンパク質の産生
に関する特性解析を述べる。
これらの実験のために、E1およびE3欠損AdGVβgal.10
ベクター並びにE1およびE4欠損ベクターAdGVβgal.11を
用いた。ベクターを相補的な293/ORF−６細胞株に感染
させた。実施例９に記載されるように、293/ORF−６細
胞溶解物についてイムノブロット分析を実施した。この
実験では、全アデノウイルスキャプシドに対するウサギ
血清を用いた。この抗体はアデノウイルスキャプシドの
すべての構造タンパク質を認識する。
図15に描写されるように、E1-E4-多重複製欠損アデノ
ウイルスベクターは、E1欠失単複製欠損アデノウイルス
ベクターと比較するとファイバー発現の減少およびウイ
ルス増殖の減少を示す。すなわち、E1-E4+ベクター（す
なわちAdGVβgal.10ベクター；レーン２）で感染させた
細胞に比べて、E1およびE4に欠失を含むベクター（すな
わちAdGVβgal.11ベクター；レーン３）で感染させた細
胞では、いくつかの後期タンパク質、特にファイバータ
ンパク質の産生に不足が生じる。E1-E4-ベクターにおけ
るファイバータンパク質の減少は約50倍に相当する。
成熟ビリオン産生におけるこの不足への影響を、精製
キャプシド中に存在するファイバータンパク質のレベル
を評価することによって調べた。ウイルス粒子（キャプ
シド）は、標準的なベクター生産プロトコールを用いて
３回の逐次塩化セシウム勾配により単離した。キャプシ
ドを煮沸破砕し、SDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動
した後、アデノウイルスファイバータンパク質に対する
抗体を用いたイムノブロット分析を実施した。
これらの実験結果を図16に示す。図16からわかるよう
に、E1-E4-ベクター（すなわちAdGVβgal.11ベクター；
レーン２）で感染させた細胞に比べてE1欠失ベクター
（すなわちAdGVβgal.10ベクター；レーン１）で感染さ
せた細胞では、同様のレベルのファイバータンパク質が
産生される。
実施例15 この実施例では、E4領域中にスペーサーを含むE4欠失
ベクターで細胞を感染させた際に観察されるファイバー
タンパク質の産生について、アデノウイルスゲノム中に
そのようなスペーサーを欠くE4欠失ベクターで細胞を感
染させた場合と比較して述べる。
これらの実験のために、実施例14に記載されたベクタ
ーを用い、その特性解析は実施例14に記載されたように
実施した。さらに、E1およびE4を欠損したAdGV.11Sをベ
ースとするベクターAdGVCFTR.11Sについても調べた。こ
のベクターは、実施例13に記載されたように、E3欠失
と、AdGV.11に存在するE4欠失の領域中に挿入されたス
ペーサーをさらに含む。
これらの研究結果を図17に示す。図17からわかるよう
に、E4欠失の領域へのスペーサーの組込みにより、単複
製欠損アデノウイルスベクターにより得られるのに近い
レベルのL5ファイバータンパク質の産生が可能となる。
つまり、E1およびE4欠損ベクターAdGVβgal.11（レーン
３）で感染させた細胞ではファイバーの産生が止まって
しまったが、スペーサーを含むE1-E4-多重複製欠損ベク
ター、すなわちAdGVCFTR.11S（レーン４）で感染させた
細胞について観察されるファイバーのレベルは、E1-単
複製欠損ベクターAdGVβgal.10（レーン２）で感染させ
た細胞について観察されるファイバーのレベルに近づい
た。
したがって、これらの結果から、E1-E4-ベクター、特
にE4欠失の領域へのスペーサーの組込みが、E1欠失のみ
を有するベクターで細胞を感染させた際に観察されるの
と同様の適切なファイバー産生を提供することが確認さ
れた。
実施例16 この実施例では、E4領域にスペーサーを含むE4欠損ベ
クターの増殖の挙動について、アデノウイルスゲノム中
にそのようなスペーサーを欠くE4欠失ベクターと比較し
て述べる。
これらの実験では、少なくとも１つの欠失領域へのス
ペーサーの付加が多重欠損アデノウイルスベクターの増
殖不足を修復する能力が調査された。すなわち、細胞あ
たりの活性なウイルス粒子の産生（フォーカス形成単
位;ffu）を、E1およびE3を欠損したAdGV.10をベースと
するベクターAdGVβgal.10、E1およびE4を欠損したA
dGV.11をベースとするベクターAdGVLacZ.11、あるいはE
4欠失領域中にスペーサー配列を含む、E1、E3およびE4
を欠損したAdGV.11SをベースとするベクターAdGVCFTR.1
1SのいずれかでA232細胞を感染させた後の時間の関数と
して調べた。A232細胞は、この系統の細胞がE1およびE4
欠失ウイルスを産生する能力に基づいて使用された。A2
32細胞は、標準的な培地中で生育し、100μＭ ZnCl2で
インフェクションするとORF6の産生が誘導される293/OR
F6細胞である。フォーカス形成単位は、ウイルスストッ
クを系列希釈して単層の相補的な細胞上に感染させるこ
とにより測定した。感染細胞の数は、DBPまたはE2A遺伝
子産物に対する抗体を用いた免疫化学的な検出によって
計数した。感染後約20、40、60および80時間の活性ウイ
ルス粒子の産生を調べた。
これらの実験結果を図18に示す。E1およびE3欠損A
dGV.10ベクター（黒四角）と、E4欠失の領域中にスペー
サーを含む、E1、E3およびE4欠損AdGV.11Sベクター（白
丸）との間には、みかけ上カイネティックスの相違はな
い。最も低いビリオン産生のレベルは、感染後16〜20時
間での100倍の差によってわかるように、スペーサーを
含まないE1、E3およびE4欠損AdGV.11ベクター（白い菱
形）でみられる。
さらに、産生収量も測定した。このときベクターキャ
プシドを精製するのに３つの塩化セシウム勾配を用い
た。ベクターキャプシドの精製には、ウイルスを厳密な
精製プロトコールに付さねばならない。このため、いか
なる精製手順によっても全収量に損失を生じる。それ
故、この実験に関しては、重要なデータは図18における
増殖曲線のプラトー点ではなく、むしろ産生レベルであ
る。種々のベクターで感染させた細胞についての産生収
量（細胞あたりの活性ウイルス粒子における）を表４に
詳説する。
これらのデータに示されるように、E1-E4-多重複製欠
損ベクター中にスペーサーを組込むことによって、ウイ
ルス粒子の産生は、E1欠失単複製欠損ベクターで観察さ
れるウイルス産生レベルまで増加する（そして、おそら
くそれを越える）。
したがって、これらの結果から、スペーサー配列は、
E1-E4-多重複製欠損アデノウイルスベクターで観察され
る増殖不足とファイバー発現の減少を打ち消すことがで
きることが確認される。さらに、全体として考えると、
この結果から、E1およびE4欠失を含むアデノウイルスの
ゲノム中への、特にE4欠失の領域中へのこのスペーサー
の組込みが、E1欠失単複製欠損ベクターと同様の適切な
ファイバー産生およびウイルス増殖の増大を提供するこ
とが確認される。
実施例17 この実施例では、アデノウイルスゲノムのE2領域、特
にE2A領域に欠失を含むベクターの特徴について説明す
る。
E4変異体で観察されるのと同様、E2A領域に変異を含
む単および多重複製欠損アデノウイルスも増殖の挙動が
損なわれる。そこで、野生型E1配列を含む種々のE2A欠
失変異体が、本発明の細胞株により相補され得るかを調
べた。特に、以前に記載されたE2Aに欠失を含むアデノ
ウイルスベクター、dl801、dl802、dl803およびdl807
（Riceら,J.Virol.,56,767−778（1985）;Vosら,Virolo
gy,172,634−632（1988））を研究した。
該E2Aオープンリーディングフレームは、Ad5ヌクレオ
チド22,443からAd5ヌクレオチド24,032までを含む。E2A
遺伝子産物は一本鎖のDNA結合タンパク質（すなわちDB
P）である。ウイルスdl803は、Ad5ヌクレオチド22,542
からAd5ヌクレオチド23,816までのE2A ORFの欠失を含
み、Ad5ヌクレオチド23,816からAd5ヌクレオチド24,032
までのE2A ORFを含む。したがって、dl803のE2A領域の
遺伝子産物（およびその変種）は、欠失の後に続く代替
のリーディングフレームの使用の結果生じるさらなるタ
ンパク質配列に連結した、正常の（すなわち野生型の）
リーディングフレームの翻訳の結果生じるDBPタンパク
質の一部からなるキメラタンパク質を含む。欠失により
キメラタンパク質中で欠けているDBPタンパク質の領域
（すなわち「Ct」領域）は、DNA複製、ssDNAの結合およ
びmRNAの結合で暗示されている（Broughら,Virology,19
6,269−281（1993））。これに比べて、部分的にベクタ
ーに保持された領域（すなわち「Nt」領域）は、核局在
化および後期遺伝子の発現で暗示されている（Brough
ら，上述）。
ウイルスdl801およびdl802はdl803ウイルスに改変を
含む。つまり、dl802は、Ad5ヌクレオチド23,816からAd
5ヌクレオチド23,969までのE2A ORFの欠失をさらに含
み、そのため結果として得られる欠失ウイルスはAd5ヌ
クレオチド23,969からAd5ヌクレオチド24,032までのE2A
ORFを含む。同様に、dl801は、Ad5ヌクレオチド23,81
6からAd5ヌクレオチド24,011までのE2A ORFのインフレ
ームの欠失をさらに含み、そのため結果として得られる
欠失ベクターはAd5ヌクレオチド24,011からAd5ヌクレオ
チド24,032までのE2a ORFを含む。これに比べて、dl80
7はAd5ヌクレオチド23,882からAd5ヌクレオチド23,954
までのE2A ORFのインフレームの欠失を含む。
これら種々の欠失ベクターの増殖の挙動を研究するこ
とによって、アデノウイルスゲノムのE2A領域のあるセ
グメントは相補され得ず、ウイルスの増殖を可能にする
にはアデノウイルスベクターにこのセグメントが保持さ
れなければならない（あるいは付加し直さなければなら
ない）ことが見出された。これらの実験結果を図19にま
とめる。すなわち、欠失変異体dl803（それは部分的にN
t領域を保持し且つ野生型Ct領域を欠く）は完全に機能
的であり、相補的なE2A細胞株中で増殖不足を示さな
い。これに比べて、dl807、dl802（データは示さない）
およびdl801は、E2Aを発現する細胞株中で相補され得な
い衰弱した表現型を示す。特に、dl801ベクターは、き
わめて小さなプラークの表現型［−／＋］を示す。した
がって、これらの結果から、Ad5ヌクレオチド23,816か
らAd5ヌクレオチド24,032までを含む、dl803中に残って
いる領域が、現在入手できる相補的な細胞株中でE2A欠
失を改善し、E2A欠失ベクターを複製させるのに必要で
あることが確認される。
ここで述べられた刊行物および特許を含めたすべての
引例は、ここに言及したことで、引用により組み込まれ
るべく、個々に、詳細に示され、ここにそのすべてが明
示されたと同程度に、明細書中に組み込まれるものであ
る。
本発明は、好適な具体例を強調して記載したものであ
るが、好適な具体例を変更してもよいことは当業者には
明白である。ここで詳細に記載された以外の方法で該発
明を実行してもよい。したがって、本発明は添付の請求
の範囲の精神および範囲内に包含されるすべての変更を
含むものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ｂ (72)発明者 マクヴェイ、ダンカン エル. アメリカ合衆国、メリーランド州 20855、ダーウッド、マンカスターミル ロード、6016 (72)発明者 ブルーダー、ジョゼフ ティー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20879、ニュー マーケット、 ビーチ ドライブ、6644 (72)発明者 リゾノワ、アレナ アメリカ合衆国、メリーランド州 20852、ロックヴィル、ランドルフロー ド、5329 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 31/70 A61K 35/76 A61K 48/00 ABD C12N 5/10 C12N 7/00 G01N 33/15 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アデノウイルスゲノムのE4領域の、１つま
    たはそれ以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるアデノウ
    イルスベクターであって、アデノウイルスゲノムのE4領
    域中に少なくとも約15塩基対のスペーサー配列を含む該
    アデノウイルスベクター。
  2. 【請求項２】該スペーサーがポリアデニル化配列を含む
    請求の範囲１のアデノウイルスベクター。
  3. 【請求項３】アデノウイルスゲノムのE4領域のすべての
    オープンリーディングフレームが欠失した請求の範囲１
    または２のアデノウイルスベクター。
  4. 【請求項４】該アデノウイルスベクターの該E4領域が欠
    失し、該スペーサー配列がゲノムの右側のITRと該ゲノ
    ムの残りとの間に位置する請求の範囲１または２のアデ
    ノウイルスベクター。
  5. 【請求項５】該アデノウイルスベクターが、アデノウイ
    ルスゲノムのE1領域の、１つまたはそれ以上の不可欠の
    遺伝子機能に欠損のあるものである請求の範囲１〜４の
    いずれかのアデノウイルスベクター。
  6. 【請求項６】該アデノウイルスベクターが、アデノウイ
    ルスゲノムのE2A領域の、１つまたはそれ以上の不可欠
    の遺伝子機能に欠損のあるものである請求の範囲１〜５
    のいずれかのアデノウイルスベクター。
  7. 【請求項７】該アデノウイルスベクターが、アデノウイ
    ルスゲノムのE1領域の、すべての不可欠の遺伝子機能に
    欠損のあるものである請求の範囲１〜６のいずれかのア
    デノウイルスベクター。
  8. 【請求項８】該アデノウイルスベクターが、アデノウイ
    ルスゲノムのE1およびE2A領域の、すべての不可欠の遺
    伝子機能に欠損のあるものである請求の範囲１〜７のい
    ずれかのアデノウイルスベクター。
  9. 【請求項９】該アデノウイルスベクターが、アデノウイ
    ルスゲノムのE3領域に欠損のあるものである請求の範囲
    １〜８のいずれかのアデノウイルスベクター。
  10. 【請求項１０】該ベクターが、DBPをコードするORF以外
    のアデノウイルスゲノムのE2A領域のすべてのORFを欠失
    し、且つ該アデノウイルスベクターが、DBP ORFの約23
    0未満の塩基対を含む請求の範囲１〜９のいずれかのア
    デノウイルスベクターであって、DBP ORFの該配列が、
    DBP ORFの欠損を相補しない細胞株中でのウイルスの増
    殖を可能にするのに十分な、DBPのNtドメインの一部を
    コードするものである該ベクター。
  11. 【請求項１１】該アデノウイルスベクターが、該アデノ
    ウイルスベクターの欠損した不可欠の遺伝子機能をトラ
    ンスに相補し得る細胞株中で調製されたものである請求
    の範囲１〜10のいずれかのアデノウイルスベクター。
  12. 【請求項１２】該アデノウイルスベクターが、アデノウ
    イルスゲノムの右側のITRと該ゲノムの残りとの間に、
    ポリアデニル化配列を含む配列を組込むことによって改
    変されたAdGV.11である請求の範囲１のアデノウイルス
    ベクター。
  13. 【請求項１３】該アデノウイルスベクターが、外来遺伝
    子を含むものである請求の範囲１〜12のいずれかのアデ
    ノウイルスベクター。
  14. 【請求項１４】該外来遺伝子が治療剤をコードする請求
    の範囲13のアデノウイルスベクター。
  15. 【請求項１５】該外来遺伝子が嚢胞性線維症膜貫通調節
    因子遺伝子である請求の範囲13のアデノウイルスベクタ
    ー。
  16. 【請求項１６】該外来遺伝子がアンチセンスRNAをコー
    ドする請求の範囲13のアデノウイルスベクター。
  17. 【請求項１７】該外来遺伝子が免疫応答を誘発し得るポ
    リペプチドをコードする請求の範囲13のアデノウイルス
    ベクター。
  18. 【請求項１８】該アデノウイルスベクターが、ヘルパー
    ウイルスの非存在下に細胞中で調製されるものである請
    求の範囲１〜17のいずれかのアデノウイルスベクター。
  19. 【請求項１９】請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウ
    イルスベクターを有効成分とする医薬組成物。
  20. 【請求項２０】複製能力のあるアデノウイルスを含まな
    い、請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウイルスベク
    ターのストック。
  21. 【請求項２１】該アデノウイルスベクターが、該アデノ
    ウイルスベクターの増殖を支援し得る細胞株中で調製さ
    れる請求の範囲20のストックであって、該細胞株のゲノ
    ムが、結果として複製能力のあるアデノウイルスベクタ
    ーを生じる組換えが起こるのを仲介するのに十分な、該
    アデノウイルスベクターと重複する配列を有しないもの
    である該ストック。
  22. 【請求項２２】該アデノウイルスベクターが、該アデノ
    ウイルスベクターの増殖を支援し得る細胞株中で調製さ
    れる請求の範囲20または21のストックであって、該アデ
    ノウイルスベクターのゲノムと該細胞のゲノムとの間の
    単一の組換えが起こった後に、複製能力のあるアデノウ
    イルスを有しない該ストック。
  23. 【請求項２３】請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウ
    イルスベクターの調製方法であって、該アデノウイルス
    ベクターをトランスに相補し得る細胞株中で、ヘルパー
    ウイルスの非存在下に該アデノウイルスベクターを繁殖
    させることを含む方法。
  24. 【請求項２４】アデノウイルスゲノムのE4領域を欠失し
    たアデノウイルスベクターの、相補的な細胞株中での繁
    殖を増大させる方法であって、ゲノムの右側のITRと該
    ゲノムの残りとの間に、少なくとも約15塩基対の配列で
    あるスペーサー配列を組込むことを含む方法。
  25. 【請求項２５】該スペーサー配列が、アデノウイルスゲ
    ノムの右側のITRと該ゲノムの残りとの間のポリアデニ
    ル化配列である請求の範囲24の方法。
  26. 【請求項２６】細胞を遺伝的に改変する方法であって、
    該細胞に、請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウイル
    スベクターを接触させることを含む方法。
  27. 【請求項２７】請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウ
    イルスベクターを含む組成物。
  28. 【請求項２８】請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウ
    イルスベクターを含む宿主細胞。
  29. 【請求項２９】請求の範囲１〜18のいずれかのアデノウ
    イルスベクターの、標的細胞に対する毒性の試験方法で
    あって、（１）該標的細胞のアリコートを培養に付し、
    （２）該標的細胞に該ベクターを接触させ、および
    （３）該培養標的細胞の活力を測定することを含む方
    法。
  30. 【請求項３０】標的細胞にトランスフェクトした後の、
    請求の範囲13〜17のいずれかのアデノウイルスベクター
    の外来遺伝子発現を試験する方法であって、（１）該標
    的細胞のアリコートを培養に付し、（２）該標的細胞に
    該ベクターを接触させ、および（３）該標的細胞中での
    該外来遺伝子の発現を測定することを含む方法。
  31. 【請求項３１】標的細胞にトランスフェクトした後の、
    請求の範囲13〜17のいずれかのアデノウイルスベクター
    のパッセンジャー遺伝子発現を試験する方法であって、
    （１）該標的細胞のアリコートを培養に付し、（２）該
    標的細胞に該ベクターを接触させ、および（３）該標的
    細胞中での該パッセンジャー遺伝子の発現を測定するこ
    とを含む方法。
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