JP6887955B2 - 組換え体発現系のアッセイ - Google Patents
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Description
本発明の方法により、ユーザは、核酸ワクチン組成物、ウイルスベクターワクチン組成物など(例えば、細菌又は酵母ベクターワクチン)が細胞内でタンパク質発現を誘導する能力を評価し、これにより、ワクチン組成物を医薬剤として生存被験者に投与した場合、それがどれ程度有効となるかを推測することができる。
細胞ベースの組換え体発現系には、組換えタンパク質が、蓄積し得る2つのおおまかな箇所:細胞の一部として、又は細胞の外部(すなわち、培地中)がある。細胞内部では、タンパク質は、細胞質、又は膜タンパク質などにおける可溶性タンパク質であり得る。本発明の方法による分析の対象である発現された組換えタンパク質は、当技術分野で公知の方法に従って細胞から回収することができる。
本発明は、MSに基づく手法を使用して、核酸ワクチン成分若しくは組成物又はウイルスベクターワクチン成分若しくは組成物が導入された細胞培養物などの組換え体発現系中のタンパク質の発現レベルを評価する。本発明は、任意の発現系により発現されるいずれの組換えタンパク質にも適用することができ、本明細書で論じる方法をどのように組換え体発現系に一般的に適用し得るかは直ちに明らかになるであろう。本発明で使用されるMSに基づく手法の原理を以下に説明する。
この段階は、ボトムアッププロテオミクスアプローチであり、全サンプル中で可能な限り多くのペプチドを同定する。次に、MS分析からのデータを使用して、目的の組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の相対発現レベルを確立する。このようにして、組換えタンパク質の相対発現レベルを推定することができ、これは、本明細書の他の箇所で論じるように、特定のワクチンの効力評価に特に有用である。段階1は、例えば、核酸ワクチン又はウイルスベクターワクチンの様々なバッチ同士で、ワクチンの様々なバッチの発現挙動を比較するうえで特に有用である。
このステップは、検査対象のサンプルにおける広範囲のペプチド同定を達成するために、高速ボトムアッププロテオミクス技術を使用する。このステップは、サンプル中のタンパク質の全部又は実質的に全部のタンパク質の同定を可能にする。
それぞれ同定されたタンパク質の相対発現レベルを取得するために、MSスペクトルデータ特性を変換して、準絶対(semi−absolute)発現レベルを表示する。例えば、あるタンパク質の分子量に対するその同定MS/MSスペクトルの比など、当技術分野で公知の複数の方法を使用することができる。続いて、これらの比をデータセットにおける全ての比の合計に正規化し、百万分率(ppm)で表すことができる。
段階2では、段階1で得られたデータを用いて、目的の組換えタンパク質を明瞭に同定する特定のタンパク質特異的ペプチをマイニングする。続いて、これらのペプチドを用いて、タンパク質発現の絶対定量(例えば、ng/細胞又はng/mL)のためのMSに基づくアッセイを開始する。段階2は、複数の組換えタンパク質の発現を比較するうえで特に有用であり、又はより正確な定量情報が必要な場合、トリプル四重極計器がこの段階で有用である。
段階1で得られた詳細な配列情報をマイニングする。このステップの目標は、目的の組換えタンパク質のみに固有のタンパク質特異的ペプチド(すなわち、サンプル中に存在するいずれか他のタンパク質中に存在しないペプチドの配列)を同定することである。
目的のタンパク質特異的ペプチドの検出及びモニタリングが確立されると、同位体希釈手法などのペプチド定量技術を使用することができる。これは、当技術分野で十分に確立されている技術である[22、23]。同位体希釈手法は、目的のペプチドに相同的な既知の濃度の同位体標識ペプチドを添加することに基づく。リシン又はアルギニンアミノ酸残基の「重い」バージョン(例えば、13C、15Nなど)は、ペプチド合成中に組み込まれて、内在性形態のペプチドに対し、それぞれ8及び10Daの質量差を生じる。従って、「重い」ペプチドは化学的に同一であり、クロマトグラフィー、イオン化及び断片化に関して同様に挙動することになる。これは、検査対象のタンパク質特異的ペプチドの有用な定量内標準であることを意味する。重いペプチド同士の唯一の違いは、その前駆体質量(Q1での)及びその断片質量(Q3での)であることから、サンプル中の組換えタンパク質に由来する「軽い」バージョンとは別にモニターすることができる。
本発明の方法は、ウイルスベクターワクチン組成物又は成分からの発現を定量し、その効力を評価するうえで特に有用である。この目的のために多くの異なるウイルスがベクターとして採用されており、本発明の方法は、それらの全てに適用することができる。
ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター(rAd)であってよい。アデノウイルスベクターは、細胞免疫応答の強力な誘導物質であることから、ウイルスベクターワクチン中の有用な成分として役立つようになり、レンチウイルス及びフィロウイルス、並びにその他の非ウイルス病原体からのタンパク質抗原をコードするのに使用されている[例えば、58、59、24、25、26、27を参照]。
ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターであってよい。AAVは、複製するために別のウイルス(アデノウイルス及び特定のヘルペスウイルス)の存在に依存するウイルスである。これは、極めて軽度の免疫応答を起こす(病原性の欠如を示す)小さいウイルスである。AAVは、分裂及び静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で残存する。
ウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターであってもよい。ポックスウイルスは、大きいゲノムを有し、複数の遺伝子を含む多様な遺伝子材料を送達する(すなわち、多価ベクターとして作用させる)ために容易に使用することができる。
本発明の方法は、細菌若しくは酵母ベクターワクチン組成物又は成分などの他のベクターワクチン組成物又は成分からの発現を定量し、その効力を評価するうえでも有用である。
多くのウイルスベクターワクチン成分が複製欠損であり、これらがコードする遺伝子は、被験者に投与されたときに一時的にのみ発現される。これは、ワクチンによりコードされるタンパク質に対して短時間の曝露のみが必要とされる状況において、例えば、ワクチン接種スケジュールの一環としてタンパク質標的に対して免疫応答を生成する目的で有用である。しかしながら、一部の事例では、遺伝子療法として知られるプロセスにおいて、被験者の欠損遺伝子を補完するために、タンパク質の持続的な発現が要望される。遺伝子療法構築物は、前述したウイルスベクターワクチンと全く同じように本発明の方法を用いて試験することができる。
本発明は、組換え体発現系によるタンパク質発現のレベルを決定する方法を提供し、これは、質量分析法を用いて、発現系により発現された組換えタンパク質を定量するステップを含み、任意選択で、組換え体発現系は細胞培養物であり、細胞培養物が溶解されて細胞溶解物を形成し、この細胞溶解物が質量分析法によって分析されて組換えタンパク質を定量し、任意選択で、細胞溶解物は清澄化された細胞溶解物である。組換え体発現系は、(i)組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物に感染した細胞培養物、又は(ii)組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物により形質転換した細胞培養物であってよく、任意選択でウイルスベクターワクチン組成物は、組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分を含み、例えば、ウイルスベクターワクチン組成物は、少なくとも2つの組換えタンパク質をコードし、例えば、ウイルスベクターワクチン組成物は、(i)少なくとも2つの組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分及び/又は(ii)異なる組換えタンパク質をコードする複数の異なるアデノウイルスベクターワクチン成分を含む。場合により、ウイルスベクターワクチン組成物は、組換えタンパク質をコードするポックスウイルスベクターワクチン成分を含む。場合により、質量分析法を用いて2つ以上の組換えタンパク質を定量する。場合により、組換え体発現系中の別のタンパク質は、組換えタンパク質に対して少なくとも85%の同一性を有する。この方法は、質量分析法により組換えタンパク質を定量するステップの前に、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞培養物に導入して組換え体発現系を生成し、組換えタンパク質を発現するステップを含み、任意選択で、この定量は、組換えタンパク質の相対又は絶対発現レベルを決定することであり、任意選択で、この決定は、(i)組換えタンパク質の相対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の相対発現レベルを決定するステップとを含み、任意選択で、相対的な決定は、細胞マーカタンパク質に対して組換えタンパク質の発現を決定することにより実施される、決定すること;又は(ii)組換えタンパク質の絶対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の相対発現レベルを決定するステップと;(c)組換えタンパク質のタンパク質特異的ペプチドを検出するステップと;(d)タンパク質特異的ペプチドの検出量を既知の標準と比較することにより、組換えタンパク質の絶対発現レベルを決定するステップとを含む、決定することである。
被験者において免疫応答を誘発することができる抗原、又はその抗原決定基を発現するために、核酸及びウイルスベクター(すなわち、前述した通りの核酸及びウイルスベクターワクチン)が最もよく使用される。この抗原は、感染因子由来であってもよく、又は腫瘍に特有のものであってもよい。しかし、場合により、ベクターは、別の治療目標を達成するために、別のタンパク質をコードするように設計される。同様に、遺伝子療法構築物によりコードされたタンパク質は、これらの構築物の目標が安定的な長期発現をもたらすことであるため、ワクチンによりコードされたものと異なる。そのため、ここでは、組換えタンパク質は、治療対象の被験者に不足している細胞酵素であることが多い。
抗原は、感染症を引き起こし得る細菌、ウイルス、酵母又は寄生体に由来するものでよい。
開発中の分野は、身体の免疫系を刺激して癌細胞を見出し、殺傷することを目的とするワクチンの使用に関する。従って、腫瘍抗原核酸又はウイルスベクターワクチン成分は、腫瘍細胞に発現されるが、正常細胞には発現されない腫瘍抗原(典型的には、タンパク質若しくはタンパク質の変異体)をコードする。この手法の目標は、免疫系を初期免疫して癌細胞を攻撃する(通常、免疫応答を促進するために他の薬剤、例えば、抗CTLA4抗体などの投与と一緒に)ことである。
典型的な組換えタンパク質としては、アデノシンデアミナーゼ、IX因子、β−グロビン、リポタンパク質リパーゼ、ドーパミン、及びIL2RGが挙げられる。
前述したように、本発明の方法は、核酸ワクチン及びベクターワクチンの発現を定量するために特に有用であるが、任意の組換え体発現系により組換えタンパク質発現を定量するために適用することもできる。
「含む」という用語は、「含む」並びに「構成される」を包含し、例えば、X「を含む」組成物は、Xのみから構成される場合もあり、又はさらに別のもの、例えば、X+Yを含む場合もある。
HIVワクチン製剤(Ad26.HIV DP)は、3つの異なるAd26アデノウイルスのブレンドから構成され、これらの各々は、投与時にヒト細胞に発現され、続いて免疫応答を誘導するように設計された異なるトランスジーンをコードする。この実施例では、最終Ad26.HIV DP中において、Ad26.Env、Ad26.Mos1GagPol及びAd26.Mos2GagPolのブレンドがウイルス粒子の量に基づいて2:1:1の比で存在した。これらのトランスジーンから発現される組換えタンパク質の配列は、配列表に記載されている:Env(配列番号1)、Mos1GagPol(配列番号2)及びMos2GagPol(配列番号3)。Mos1GagPol(配列番号2)及びMos2GagPol(配列番号3)の両方とも、HIV Gag及びPolタンパク質に基づくエピトープのモザイクを含み、Env(配列番号1)は、HIV Envに基づくエピトープのモザイクを含む[5]。
4.5×106の密度まで増殖したA549細胞(ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞)を50,000のMOIでAd26.HIV DPに感染させた。感染から48時間後に細胞を採取した。実験は2回繰り返して実施した。接着細胞を氷冷PBSで3回洗浄した後、50mM重炭酸アンモニウム及びロシュ(Roche)コンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテル中の8M尿素で溶解させた。溶解物を音波処理してから遠心分離した。上清を回収し、清澄化された細胞溶解物(250μgの全タンパク質)をLys−C(1:100w/w)での溶液中消化に37℃で4時間付した後、2M尿素まで4×希釈し、トリプシン(1:100w/w)を添加した。得られたペプチド混合物をC18 Seppakカラムで脱塩した後、真空下で乾燥させた。
Acclaim PepMap100 C18(3μm、100Å;Thermo Scientific)を充填したNano Trap pre−Columnと、EASY−Spray Column(PepMap RSLC、C18、2μm、100Å、75μm×50cm)とを装備したUltimate3000 nanoLC(Thermo Scientific)をqExactive Orbitrap質量分析計(Thermo Scientific)に直接接続した。それぞれ500ngの前述した完全細胞消化物を、100%バッファーA(0.1%ギ酸)を用いてプレカラムに5μL/分の流量で10分間ロードした。続いて、200nL/分で作動するnanoLCに対する以下の勾配設定を用いてペプチドをプレカラムから分析EASY−Sprayカラムへと溶離した:1%バッファー(80%アセトニトリル、0.1%FA)で0〜15分、8〜19.2%バッファーBの勾配で15〜120分、19.2〜40%バッファーBで120〜165分;40〜80%バッファーBで165〜168分、80%バッファーBで168〜169、80〜1%バッファーBで169〜170分、及び1%バッファーBで170〜185分。これは、参照文献76から改変した。上記のLC−MS/MS設定で各消化物を2回繰り返して分析した。
これにより、8つのデータセットが得られ、これらを組換えタンパク質発現について分析した。各データセットにおいて、MSデータを用いて、データベース検索アルゴリズム(例えば、Sequest[7])によりサンプル中に存在するタンパク質を同定した。MS及びMS/MSモードでの精度の点から、典型的なq−Exactive検索パラメータを用いて、アデノウイルスタンパク質及び3つの異なる組換えタンパク質の配列を補足した全ヒトプロテオームに対してデータを検索した。また、偽発見率も好適なアルゴリズム(例えば、Percolator[9])によって推定した。好適な偽陽性のレベル、この場合、同定されたMS/MSスペクトルレベルで1%までデータをフィルタリングした。
MSに基づく定量の精度を高めるために、各サンプルの2回のLC−MS/MSランの結果を組み合わせた。これにより、図2に示す2つのデータセットが得られた(ラン1及び2)。これらの2つのデータセットは、同定されたタンパク質の量及びMS/MSスペクトル(PMS)に関して、極めて同等であることを示した。観測されたわずかな差異はこの手法に典型的であり、本方法の検出限界に近い差が認められた。
アデノウイルス26ウイルスにおいてエボラ(Ebola)株由来の単一組換えタンパク質をコードする一価エボラ(Ebola)(Ad26.ZEBOV)ワクチンのいくつかのバッチの効力を試験した。
A549細胞をAd26.ZEBOVワクチンの5つの異なるバッチに25,000のMOIで3回繰り返して感染させた。感染から48時間後に細胞を採取し、実施例1に記載した方法で溶解させた。q−Exactive Orbitrapに対するサンプルワークアップを実施例1と同様に実施した。実施例1と同じプロトコルを用いて、ペプチド混合物を分析した。Orbitrap LC−MS/MSデータを、異なるエボラ(Ebola)株由来の組換えタンパク質の3つのバージョンを補足したヒトデータベースに対して検索した。
データベース検索後、他の類似エボラ(Ebola)タンパク質の同定を妨害することなく、Ad26ウイルスによりコードされたエボラ(Ebola)組換えタンパク質をいくつかの固有のペプチド配列によって容易に同定することができ、これは、本手法の特異性を示すものである。続いて、スペクトルカウントに基づく相対定量を用いて、細胞溶解物に関連してエボラ(Ebola)トランスジーンの発現レベルを推定した(図6及び7)。平均して、組み合わせたデータの全てが1027ppmの発現レベルを示し、エボラ(Ebola)組換えタンパク質をA549細胞培養物において300番目に最も豊富に発現されたタンパク質の間にランク付けした(ランク#247)。
この実施例の目標は、MSによるタンパク質の絶対定量のための内部基準としての安定した同位体標識類似体の合成のために有用なタンパク質特異的ペプチドを同定することである。
表1及び2からの合成ペプチドをJPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)から取得した。ペプチドを10%ギ酸に溶解させて、0.1mg/mLのストック濃度を取得した。10%ギ酸中に合わせた希釈標準溶液を、全てのペプチドについて推定出発濃度1000ng/mLで調製した。0.1〜1000ng/mLの検量線を作成した。
上記の各タンパク質特異的ペプチドについて決定したSRMパラメータを用いて、トランスジーン発現の最初の推定を実施することができる。実施例1に記載したように、HIVワクチン製剤Ad26.HIV DPの異なるバッチによるサンプル(実施例1を参照;サンプル1及び2)でA549細胞を個別にトランスフェクトした。空のアデノウイルスベクター(すなわち、いずれの組換えタンパク質もコードしない相同性アデノウイルスベクター)でトランスフェクトしたA549細胞、同じプロトコルを用いたAd26.DE3.5ORF6(対照1)及び非感染A549細胞抽出物(対照2)を負の対照として使用した。本方法が、高度に類似する組換えタンパク質を特異的且つ正確に定量し得ることを証明するために、Envのみ、Mos1GagPolのみ及びMos2GagPolのみをコードするアデノウイルスベクターも対照(それぞれ対照3〜5)として使用した。
サンプルをトリプル四重極質量分析計API−6500(AB Sciex)に注入し、陰イオン及び陽イオンモードのTurbo−Ionspray(商標)Interface(AB Sciex)を用いてデータを分析した。表1に記載するSRM設定を使用した。
細胞タンパク質及びウイルスベクタータンパク質(ウイルス粒子のキャプシドタンパク質)の組換えタンパク質(ENV、Mos1GagPol及びMos2GagPol)のタンパク質特異的ペプチドの量を決定し、その結果を表3〜7に示す。
この実施例は、多くの選択されたタンパク質特異的ペプチドのトランジションが、目的のタンパク質を同定し、定量するのに高度に特異的であることを証明している。特に、トランスフェクト細胞中には具体的な組換えタンパク質をそれぞれ検出したが、ウイルス空ベクター構築物でトランスフェクトした細胞中に組換えタンパク質は全く検出されなかった。表3〜5の対照3〜5は、個別に発現されたとき、それらのタンパク質特異的ペプチドに基づく関連組換えタンパク質の特異的検出を示す。ウイルスタンパク質は、全てのトランスフェクト細胞に検出された。
・Env:Env1及びEnv2。
・Mos1GagPol:Mos1.4、及びMos1.2又はMos1.3。
・Mos2GagPol:Mos2.4、及びMos2.5又はMos2.3。
・ウイルスベクタータンパク質:Hex1。
・細胞タンパク質:Act及びG3P2。
実施例3に記載した方法により、トランスジーン発現の定量を達成した。
この実施例では、24ウェルプレートでの細胞密度の影響、及びHIVトランスジーンMos1.Env(配列番号1)を担持するアデノウイルスベクターワクチン成分を含むアデノウイルスウイルスワクチン組成物の感染多重度をさらに調べるために、実施例3及び4に記載した方法を修正した。この実施例では、24ウェルプレート内に3つの異なる密度、すなわち7500/ウェル、15,000/ウェル又は1ウェル当たり30,000で細胞を接種した。接種後、細胞を放置して72時間増殖させてから、3つの異なるMOI、すなわち30,000ウイルス粒子(VP)/細胞、50,000VP/細胞又は75,000VP/細胞(72時間後、15,000細胞/ウェルで達成された細胞数に基づく)で感染させた。換言すると、細胞密度とは関係なく、等量のウイルス粒子/ウェルに細胞を感染させた。実施例4と同様に、これらの実験も細胞感染のレベルで3回繰り返して実施した。実施例4に記載したのと同じサンプル調製後、実施例4で使用したのと同じMS設定を用いて各ウェルからのスパイクペプチド混合物を分析した。結果を図9に表示する。発現レベルは、1ウェル(サンプル)当たりpmolのトランスジーンで表す。これらのデータは、細胞密度がトランスジーン発現レベルに明らかな影響をもたらすことを示している。これらの実験から、ウェル内で同数のウイルス粒子に曝露された場合、細胞密度が高いほど発現も高くなると結論付けた。このような実験は、試験品目を基準バッチと比較する相対効力実験のために最適な細胞接種及び感染条件を設定するうえで有用である。
本発明は以下の態様を含む。
<1>
組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物又は組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物の効力を試験する方法であって、
(i)細胞培養物を前記ウイルスベクターワクチン組成物又は核酸ワクチン組成物に感染させるステップと;
(ii)質量分析法を用いて、細胞培養物に発現される、前記ウイルスベクターワクチン組成物又は前記核酸ワクチン組成物によりコードされた前記組換えタンパク質を定量するステップと
を含む方法。
<2>
前記細胞培養物が溶解されて細胞溶解物を形成し、前記細胞溶解物が質量分析法によって分析されて前記組換えタンパク質を定量し、任意選択で、前記細胞溶解物が清澄化された細胞溶解物である、<1>に記載の方法。
<3>
前記ウイルスベクターワクチン組成物が、前記組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分を含み、例えば、前記ウイルスベクターワクチン組成物が少なくとも2つの組換えタンパク質をコードする、<1>又は<2>に記載の方法。
<4>
前記ウイルスベクターワクチン組成物が、(i)少なくとも2つの組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分及び/又は(ii)異なる組換えタンパク質をコードする複数の異なるアデノウイルスベクターワクチン成分を含む、<3>に記載の方法。
<5>
前記ウイルスベクターワクチン組成物が、前記組換えタンパク質をコードするポックスウイルスベクターワクチン成分を含む、<1>又は<2>に記載の方法。
<6>
(i)質量分析法を用いて2つ以上の組換えタンパク質が定量され;
(ii)前記細胞培養物中の別のタンパク質が前記組換えタンパク質と少なくとも85%の同一性を有し、例えば、前記別のタンパク質も前記ウイルスベクターワクチン組成物若しくは前記核酸ワクチン組成物によりコードされるか、又は前記ウイルスベクターワクチン組成物若しくは前記核酸ワクチン組成物に感染した前記細胞培養物中の細胞由来のタンパク質であり;及び/又は
(iii)前記定量が前記組換えタンパク質の相対又は絶対発現レベルを決定することである、<1>〜<5>のいずれかに記載の方法。
<7>
ステップ(iii)の前記決定が、
(i)前記組換えタンパク質の前記相対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)前記組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップとを含み、任意選択で、前記相対的な決定が細胞マーカタンパク質に対して前記組換えタンパク質の発現を決定することによって実施される、決定すること;又は
(ii)前記組換えタンパク質の前記絶対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)前記組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップと;(c)前記組換えタンパク質のタンパク質特異的ペプチドを検出するステップと;(d)前記タンパク質特異的ペプチドの検出量を既知の標準と比較することにより、前記組換えタンパク質の前記絶対発現レベルを決定するステップとを含む、決定すること
である、<6>に記載の方法。
<8>
ウイルスベクターワクチン組成物の感染力を決定する方法であって、
(i)細胞培養物をウイルスベクターワクチン組成物に感染させるステップと;
(ii)質量分析法を用いて、前記細胞培養物中の前記ウイルスベクターワクチン組成物のウイルスベクター成分のタンパク質の細胞内レベルを定量するステップと
を含む方法。
<9>
前記細胞培養物が溶解されて細胞溶解物を形成し、前記細胞溶解物が質量分析法によって分析されてウイルスベクター成分の前記タンパク質を定量し、任意選択で、前記細胞溶解物が清澄化された細胞溶解物である、<8>に記載の方法。
<10>
前記ウイルスベクターワクチン成分がアデノウイルスベクターワクチン成分である、<8>又は<9>に記載の方法。
<11>
前記ウイルスベクターワクチン組成物が、(i)少なくとも2つの組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分及び/又は(ii)異なる組換えタンパク質をコードする複数の異なるアデノウイルスベクターワクチン成分を含む、<10>に記載の方法。
<12>
前記ウイルスベクターワクチン成分がポックスウイルスベクターワクチンである、<8>又は<9>に記載の方法。
<13>
(i)質量分析法を用いて2つ以上の組換えタンパク質が定量され;
(ii)前記細胞培養物中の別のタンパク質がウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質と少なくとも85%の同一性を有し、例えば、前記別のタンパク質が前記ウイルスベクターワクチン組成物の別のウイルスベクターワクチン成分のタンパク質であるか、前記ウイルスベクターワクチン組成物によりコードされるか、又は前記ウイルスベクターワクチン組成物に感染した前記細胞培養物中の細胞由来のタンパク質であり;及び/又は
(iii)前記定量がウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の相対又は絶対発現レベルを決定することである、<8>〜<12>のいずれかに記載の方法。
<14>
ステップ(iii)の前記決定が、
(i)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の前記相対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップとを含み、任意選択で、前記相対的な決定が細胞マーカタンパク質に対して前記組換えタンパク質の発現を決定することにより実施される、決定すること;又は
(ii)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の前記絶対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップと;(c)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質のタンパク質特異的ペプチドを検出するステップと;(d)前記タンパク質特異的ペプチドの検出量を既知の標準と比較することにより、ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の前記絶対発現レベルを決定するステップとを含む、決定すること
である、<13>に記載の方法。
<15>
ウイルスベクターワクチン組成物の効力及び感染力を試験する方法であって、<1>〜<7>のいずれかに記載の方法により効力を決定するステップと、任意選択で同じ質量分析法において、<8>〜<14>のいずれかに記載の方法により前記感染力を決定するステップとを含む方法。
<16>
組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物又は組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物を製造する方法であって、<1>〜<7>のいずれかに記載の方法を用いてワクチンの効力を試験するステップ、<8>〜<14>のいずれかに記載の方法を用いてウイルスベクターワクチン組成物の感染力を決定するステップ、又は<15>に記載の方法を用いてウイルスベクターワクチン組成物の効力及び感染力の両方を決定するステップを含む方法。
<17>
組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物又は組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物の単回用量ワクチン製剤を製造する方法であって、(i)<1>〜<7>のいずれかに記載の方法を用いてワクチンのバルク中の前記ワクチンの相対効力をアッセイするステップ、<8>〜<14>のいずれかに記載の方法を用いてワクチンのバルク中のウイルスベクターワクチンの感染力を決定するステップ、又は<15>に記載の方法を用いてワクチンのバルク中のウイルスベクターワクチンの効力及び感染力の両方を決定するステップと;ステップ(i)の結果が許容可能な相対効力及び/又は感染力を示す場合、(ii)前記バルクワクチンを1回用量に分配するステップとを含む方法。
<18>
<16>に記載の方法に従って調製されるワクチン又は<17>に記載の方法に従って調製される単回用量ワクチン製剤。
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Claims (24)
- 組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物又は組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物の効力を試験する方法であって、
(i)細胞培養物を前記ウイルスベクターワクチン組成物又は核酸ワクチン組成物に感染させるステップと;
(ii)前記細胞培養物を溶解することにより細胞溶解物を形成するステップと;
(iii)質量分析法を用いて、細胞培養物に発現される、前記ウイルスベクターワクチン組成物又は前記核酸ワクチン組成物によりコードされた前記組換えタンパク質を定量するステップと
を含み、
前記方法が、組換え体発現系からの複数の組換えタンパク質の発現レベルを同時に定量することができ、
前記方法は、前記細胞溶解物中の他のタンパク質から組換えタンパク質を精製するための追加ステップを必要としない、
方法。 - 前記細胞溶解物が清澄化された細胞溶解物である、請求項1に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターワクチン組成物が、前記組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分を含み、前記ウイルスベクターワクチン組成物が少なくとも2つの組換えタンパク質をコードする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターワクチン組成物が、(i)少なくとも2つの組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分及び/又は(ii)異なる組換えタンパク質をコードする複数の異なるアデノウイルスベクターワクチン成分を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターワクチン組成物が、前記組換えタンパク質をコードするポックスウイルスベクターワクチン成分を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- (i)質量分析法を用いて2つ以上の組換えタンパク質が定量され;
(ii)前記細胞培養物中の別のタンパク質が前記組換えタンパク質と少なくとも85%の同一性を有し;及び/又は
(iii)前記定量が前記組換えタンパク質の相対又は絶対発現レベルを決定することである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記別のタンパク質もまた、前記ウイルスベクターワクチン組成物若しくは前記核酸ワクチン組成物によりコードされるか、又は前記ウイルスベクターワクチン組成物若しくは前記核酸ワクチン組成物に感染した前記細胞培養物中の細胞由来のタンパク質である、請求項6に記載の方法。
- ステップ(iii)の前記決定が、
(i)前記組換えタンパク質の前記相対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)前記組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップとを含む、決定すること;又は
(ii)前記組換えタンパク質の前記絶対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)前記組換えタンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップと;(c)前記組換えタンパク質のタンパク質特異的ペプチドを検出するステップと;(d)前記タンパク質特異的ペプチドの検出量を既知の標準と比較することにより、前記組換えタンパク質の前記絶対発現レベルを決定するステップとを含む、決定すること
である、請求項6又は7に記載の方法。 - 前記相対的な決定が、細胞マーカタンパク質に対して前記組換えタンパク質の発現を決定することによって実施される、請求項8に記載の方法。
- ウイルスベクターワクチン組成物の感染力を決定する方法であって、
(i)細胞培養物をウイルスベクターワクチン組成物に感染させるステップと;
(ii)前記細胞培養物を溶解することにより細胞溶解物を形成するステップと;
(iii)質量分析法を用いて、前記細胞培養物中の前記ウイルスベクターワクチン組成物のウイルスベクター成分のタンパク質の細胞内レベルを定量するステップと
を含み、
前記方法が、組換え体発現系からの複数の組換えタンパク質の発現レベルを同時に定量することができ、
前記方法は、前記細胞溶解物中の他のタンパク質から組換えタンパク質を精製するための追加ステップを必要としない、
方法。 - 前記細胞溶解物が清澄化された細胞溶解物である、請求項10に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターワクチン成分がアデノウイルスベクターワクチン成分である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターワクチン組成物が、(i)少なくとも2つの組換えタンパク質をコードするアデノウイルスベクターワクチン成分及び/又は(ii)異なる組換えタンパク質をコードする複数の異なるアデノウイルスベクターワクチン成分を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターワクチン成分がポックスウイルスベクターワクチン成分である、請求項10又は11に記載の方法。
- (i)質量分析法を用いて2つ以上の組換えタンパク質が定量され;
(ii)前記細胞培養物中の別のタンパク質がウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質と少なくとも85%の同一性を有し、;及び/又は
(iii)前記定量がウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の相対又は絶対発現レベルを決定することである、請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記別のタンパク質が前記ウイルスベクターワクチン組成物の別のウイルスベクターワクチン成分のタンパク質であるか、前記ウイルスベクターワクチン組成物によりコードされるか、又は前記ウイルスベクターワクチン組成物に感染した前記細胞培養物中の細胞由来のタンパク質である、請求項15に記載の方法。
- ステップ(iii)の前記決定が、
(i)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の前記相対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップとを含む、決定すること;又は
(ii)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の前記絶対発現レベルを決定することであって、(a)質量分析解析によりサンプル中のタンパク質を同定するステップと;(b)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質を含む同定された各タンパク質の前記相対発現レベルを決定するステップと;(c)ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質のタンパク質特異的ペプチドを検出するステップと;(d)前記タンパク質特異的ペプチドの検出量を既知の標準と比較することにより、ウイルスベクターワクチン成分の前記タンパク質の前記絶対発現レベルを決定するステップとを含む、決定すること
である、請求項15又は16に記載の方法。 - 前記相対的な決定が細胞マーカタンパク質に対して前記組換えタンパク質の発現を決定することにより実施される、請求項17に記載の方法。
- ウイルスベクターワクチン組成物の効力及び感染力を試験する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法により効力を決定するステップと、請求項10〜18のいずれか一項に記載の方法により前記感染力を決定するステップとを含む方法。
- 前記効力を決定するステップと前記感染力を決定するステップが、同じ質量分析法において実施される、請求項19に記載の方法。
- 組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物又は組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物を製造する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を用いてワクチンの効力を試験するステップ、請求項10〜18のいずれか一項に記載の方法を用いてウイルスベクターワクチン組成物の感染力を決定するステップ、又は請求項19又は20に記載の方法を用いてウイルスベクターワクチン組成物の効力及び感染力の両方を決定するステップを含む方法。
- 組換えタンパク質をコードするウイルスベクターワクチン組成物又は組換えタンパク質をコードする核酸ワクチン組成物の単回用量ワクチン製剤を製造する方法であって、(i)請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を用いてワクチンのバルク中の前記ワクチンの相対効力をアッセイするステップ、請求項10〜18のいずれか一項に記載の方法を用いてワクチンのバルク中のウイルスベクターワクチンの感染力を決定するステップ、又は請求項19又は20に記載の方法を用いてワクチンのバルク中のウイルスベクターワクチンの効力及び感染力の両方を決定するステップと;ステップ(i)の結果が許容可能な相対効力及び/又は感染力を示す場合、(ii)前記バルクワクチンを1回用量に分配するステップとを含む方法。
- 請求項21に記載の方法に従って調製されるワクチン組成物。
- 請求項22に記載の方法に従って調製される単回用量ワクチン製剤。
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