JP7010601B2 - タンパク質の酵素消化方法 - Google Patents
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Description
(1) タンパク質を第一変性剤の存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第一ペプチド断片の溶液を得る工程と、
前記第一ペプチド断片の溶液中の前記第一変性剤を第二変性剤に置換する工程と、
前記第一ペプチド断片を第二変性剤存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第二ペプチド断片の溶液を得る工程と、
を含むタンパク質の消化ペプチド断片を取得する方法。
前記第二変性剤が、カオトロープ剤、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群から選ばれるものであり、
前記第一変性剤と前記第二変性剤とは互いに異なる物質である、上記(1)又は(2)のタンパク質の消化ペプチド断片を取得する方法。
前記第二ペプチド断片の溶液中の前記第二変性剤を第三変性剤に置換する工程と、
前記第二ペプチド断片を第三変性剤存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第三ペプチド断片の溶液を得る工程、
を含む、上記(1)~(3)のいずれかのタンパク質の消化ペプチド断片を取得する方法。
前記第三変性剤が、前記第一変性剤及び前記第二変性剤のいずれとも異なる物質である、上記(4)のタンパク質の消化ペプチド断片を取得する方法。
取得したペプチド断片を質量分析で検出する方法。
前記第一ペプチド断片の溶液中の前記第一変性剤を第二変性剤に置換する工程と、
前記第一ペプチド断片を第二変性剤存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第二ペプチド断片の溶液を得る工程と、
を含むタンパク質の消化ペプチド断片を取得する方法である。
第一消化工程において、変性剤として有機溶媒を用いて、第二消化工程において、変性剤としてカオトロープ剤又は界面活性剤を用いる形態;
第一消化工程において、変性剤として界面活性剤を用いて、第二消化工程において、変性剤としてカオトロープ剤又は有機溶媒を用いる形態
が挙げられる。ただし、第一消化工程及び第二消化工程双方において、変性剤として、カオトロープ剤の範疇に属する異なる物質、有機溶媒の範疇に属する異なる物質、又は、界面活性剤の範疇に属する異なる物質を用いることを除外しない。
前記第二ペプチド断片の溶液中の前記第二変性剤を第三変性剤に置換する工程と、
前記第二ペプチド断片を第三変性剤存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第三ペプチド断片の溶液を得る工程を行ってもよい。前記第三変性剤は、カオトロープ剤、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群から選ばれるものであり、前記第三変性剤は、前記第一変性剤及び前記第二変性剤のいずれとも異なる物質である。
Recombinant tau-441(SIGMA) 100 ngに対して、5μLの8M Urea含有還元溶液(5mM dithiothreitol(DTT), 50 mM NH4HCO3)で37℃、1時間インキュベーションすることで還元を行った。その後、1μLのアルキル化溶液(66 mM iodoacetamide(IAA), 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることでシステイン側鎖のアルキル化を行った。さらに、1μLのクエンチ溶液(17.5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることで未反応IAAのクエンチを行った。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを2μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm (Hudson Surface Technology, Inc.)上へ滴下し、乾固させた。
4時間インキュベーションした後に10%TFAを2μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後、20 ng/μL Trypsin (promega) in 50 mM NH4HCO3を1μL加えて、さらに2時間インキュベーションした。その溶液に10%TFAを2μL添加した後、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを0.5 μL添加し、SpeedVacで乾固させることでACNを含む溶媒を揮発させた。0.1%TFA 10 μLで再溶解した後に、ZipTipで約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを2μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約10 μLの溶液に濃縮した。SpeedVacで乾固させた後、9μLの10% ACN in 50 mM NH4HCO3で溶解した。Trypsin溶液(20 ng/μL Trypsin, 50 mM NH4HCO3)を1μL加えて、37℃で2時間インキュベーションした。SpeedVacで乾固させることでACNを含む溶媒を揮発させ、0.1%TFA 10 μLで再溶解した後に、ZipTipで約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
Recombinant tau-441(SIGMA) 100 ngに対して、5μLの変性剤含有還元溶液(5 mM dithiothreitol(DTT), 50 mM NH4HCO3)で37℃、1時間インキュベーションすることで還元を行った。変性剤として、以下の手順[1],及び[2]において0.02% ProteaseMAX(promega)を使用し、手順[3]では8M Ureaを用いた。その後、1μLのアルキル化溶液(66 mM iodoacetamide(IAA), 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることでシステイン側鎖のアルキル化を行った。さらに、1μLのクエンチ溶液(17.5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることで未反応IAAのクエンチを行った。以下の手順[1],及び[2]においては、50 mM NH4HCO3を2μL加えた後にTrypsin溶液(20 ng/μL Trypsin, 0.01% ProteaseMAX, 50 mM NH4HCO3)を1μL加えて、37℃でインキュベーションした。以下の手順[3]においては、50 mM NH4HCO3を32μL加えた後にTrypsin溶液(20 ng/μL Trypsin, 50 mM NH4HCO3)を1μL加えて、37℃でインキュベーションした。消化については、次の各手順で処理を行った。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを0.5 μL添加してProteaseMAXを分解し、14000 x gで10分間、遠心してProteaseMAX分解物を沈殿させた。上清を別のチューブに移した後、ZipTipで脱塩とProteaseMAX分解物の除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを0.5 μL添加してProteaseMAXを分解し、14000 x gで10分間、遠心してProteaseMAX分解物を沈殿させた。上清を別のチューブに移した後、ZipTipで脱塩とProteaseMAX分解物の除去を行い、約10μLの溶液に濃縮した。SpeedVacで乾固させた後、9μLの1M Urea in 50 mM NH4HCO3で溶解した。Trypsin溶液(20 ng/μL Trypsin, 50 mM NH4HCO3)を1μL加えて、37℃で2時間インキュベーションした。10%TFAを0.5 μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを2μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。この操作は、実験例1の消化処理[1]:Urea-2hと同じである。
Recombinant tau-441(Wako) 500 ngに対して、5μLの変性剤含有還元溶液(5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)で37℃、1時間インキュベーションすることで還元を行った。変性剤として、以下の手順[1],及び[2]において0.1% SDSを使用し、手順[3]では8M Ureaを用いた。その後、1μLのアルキル化溶液(66 mM IAA, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることでシステイン側鎖のアルキル化を行った。さらに、1μLのクエンチ溶液(17.5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることで未反応IAAのクエンチを行った。50 mM NH4HCO3を2μL加えた後にTrypsin溶液(20 ng/μL Trypsin, 50 mM NH4HCO3)を1μL加えて、37℃でインキュベーションした。消化については、次の各手順で処理を行った。
2時間インキュベーションした後に、4 M KClを10 μL添加して14000 x gで10分間、遠心してSDSを沈殿させた。上清を別のチューブに移した後、10%TFAを1μL添加し、ZipTipで脱塩を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後に、4 M KClを10 μL添加して14000 x gで10分間、遠心してSDSを沈殿させた。上清を別のチューブに移した後、10%TFAを1μL添加し、ZipTipで脱塩を行い、10μLの溶液に濃縮した。SpeedVacで乾固させた後、9μLの1M Urea in 50 mM NH4HCO3で溶解した。Trypsin溶液(20 ng/μL Trypsin, 50 mM NH4HCO3)を1μL加えて、37℃で2時間インキュベーションした。10%TFAを0.5 μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。
2時間インキュベーションした後に10%TFAを2μL添加し、ZipTipで脱塩とUreaの除去を行い、約2μLの溶液に濃縮した。その溶液1μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm上へ滴下し、乾固させた。この操作は、実験例1の消化処理[1]:Urea-2hと同じである。
Recombinant tau-441(SIGMA) 100 ngに対して、5μLの8M Urea含有還元溶液(5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)で37℃、1時間インキュベーションすることで還元を行った。その後、1μLのアルキル化溶液(66 mM IAA, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることでシステイン側鎖のアルキル化を行った。さらに、1μLのクエンチ溶液(17.5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることで未反応IAAのクエンチを行い、クエンチされた溶液を得た。
Recombinant tau-441(SIGMA) 100 ngに対して、5μLの0.02% ProteaseMAX(promega)含有還元溶液(5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)で37℃、1時間インキュベーションすることで還元を行った。その後、1μLのアルキル化溶液(66 mM IAA, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることでシステイン側鎖のアルキル化を行った。さらに、1μLのクエンチ溶液(17.5 mM DTT, 50 mM NH4HCO3)を加え、室温、暗所で30分間インキュベーションすることで未反応IAAのクエンチを行った。50 mM NH4HCO3を2μL加えた後にTrypsin溶液を1μL加えて、37℃で2時間インキュベーションした。その後に、10%TFAを0.5 μL添加してProteaseMAXを分解し、14000 x gで10分間、遠心してProteaseMAX分解物を沈殿させ、上清を別のチューブに移した。その後、脱塩とProteaseMAX分解物の除去するためのZipTip処理を実施した手順と、ZipTip処理を実施しない手順の2通りの条件下で二段目の消化を実施した。具体的には次の各手順であった。
ZipTip処理して脱塩とProteaseMAX分解物の除去を行い、約10μLの溶液に濃縮した。SpeedVacで乾固させた後、9μLの1M Urea in 50 mM NH4HCO3で溶解した。
2 M Urea in 500 mM NH4HCO3 10 μLを添加した。
156-180(配列番号1):GAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPK
164-180(配列番号2):GQANATRIPAKTPPAPK
171-180(配列番号3):IPAKTPPAPK
175-180(配列番号4):TPPAPK
175-194(配列番号5):TPPAPKTPPSSGEPPKSGDR
181-190(配列番号6):TPPSSGEPPK
181-194(配列番号7):TPPSSGEPPKSGDR
181-209(配列番号8):TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSR
191-209(配列番号9):SGDRSGYSSPGSPGTPGSR
195-209(配列番号10):SGYSSPGSPGTPGSR
210-221(配列番号11):SRTPSLPTPPTR
210-224(配列番号12):SRTPSLPTPPTREPK
212-221(配列番号13):TPSLPTPPTR
Claims (5)
- タンパク質を第一変性剤の存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第一ペプチド断片の溶液を得る工程と、
前記第一ペプチド断片の溶液中の前記第一変性剤を第二変性剤に置換する工程と、
前記第二変性剤への置換工程で得られた第一ペプチド断片を第二変性剤存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第二ペプチド断片の溶液を得る工程と、
を含み、
前記第一変性剤と前記第二変性剤とは互いに異なる物質である、タンパク質の消化ペプチド断片を取得する方法によって、タンパク質の消化ペプチド断片を取得して、
取得したタンパク質の消化ペプチド断片を質量分析で検出する方法。 - 前記プロテアーゼが、Trypsin、Lys-C、Asp-N、Glu-C、Arg-C、Chymotrypsin、及びThermolysinからなる群から選ばれる、請求項1のタンパク質の消化ペプチド断片を質量分析する方法。
- 前記第一変性剤が、カオトロープ剤、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群から選ばれるものであり、
前記第二変性剤が、カオトロープ剤、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群から選ばれるものである、請求項1又は2のタンパク質の消化ペプチド断片を質量分析する方法。 - 前記第二ペプチド断片の溶液を得る工程の後、さらに、
前記第二ペプチド断片の溶液中の前記第二変性剤を第三変性剤に置換する工程と、
前記第三変性剤への置換工程で得られた第二ペプチド断片を第三変性剤存在下でプロテアーゼによる消化に供し、第三ペプチド断片の溶液を得る工程、
を含む、請求項1~3のいずれかのタンパク質の消化ペプチド断片を質量分析する方法。 - 前記第三変性剤が、カオトロープ剤、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群から選ばれるものであり、
前記第三変性剤が、前記第一変性剤及び前記第二変性剤のいずれとも異なる物質である、請求項4のタンパク質の消化ペプチド断片を質量分析する方法。
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