JP2014215187A - ペプチドの解析法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＭＳ／ＭＳイオンサーチにより高いスコアが得られ同定率の向上したペプチドの解析法を提供する。とりわけ、翻訳後修飾ペプチドの同定率向上のために有用なペプチドの解析法を提供する。【解決手段】解析すべきペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与する工程と、前記塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供し、ＭＳn（ｎ≧２）解析を行う工程と、ＭＳn（ｎ≧２）解析により得られたフラグメントイオンデータと、アミノ酸配列データベースとの照合を行う工程とを含む、ペプチド解析法。前記解析すべきペプチドは、翻訳後修飾が付加していてもよい。【選択図】図３

Description

本発明は、ライフサイエンス分野及び質量分析分野に属する。具体的には、本発明は、ペプチドの質量分析による解析法に関する。特に本発明は、翻訳後修飾ペプチドの同定率向上のために有用なペプチドの質量分析による解析法に関する。
糖ペプチドの構造解析においては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳによって糖鎖構造解析を行い、ＭＳ3解析により糖鎖に結合しているペプチド鎖の配列情報の取得を行う。例えば、Nature Protocols, Vol.6, 253-269 (2011)（非特許文献１）によれば、生体サンプルの解析を行うに際して、まず、二次元クロマトグラフィによりタンパク質をある程度分離精製し、トリプシン(Trypsin)消化の後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでフラクションごとのタンパク質の同定を行う。その後に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析により糖ペプチドの配列情報由来のフラグメントを取得し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで同定したタンパク質の情報と組み合わせて糖ペプチドの同定を行う。データベースとの照合・検索によるアミノ酸配列同定手法は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法と呼ばれている。
上記のＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析については、糖ペプチドをＭＳ／ＭＳに供して糖鎖開裂由来のフラグメントイオンを検出し、Ｎ−グリカン結合ペプチドの特徴的な開裂を示すトリプレットピーク（１２０Ｄａ及び８３Ｄａの質量差で出現する３本のピーク）によって、ＧｌｃＮＡｃのみが結合した糖ペプチドのイオンを認識し、このイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ3に供してペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンを検出することによって、ペプチド配列情報を取得する。
Hong Wang, Chee-Hong Wong, Alice Chin, Ayumu Taguchi, Allen Taylor, Samir Hanash, Sadanori Sekiya, Hidenori Takahashi, Masaki Murase, Shigeki Kajihara, Shinichi Iwamoto and Koichi Tanaka. "Integrated mass spectrometry-based analysis of plasma glycoproteins and their glycan modifications", Nature Protocols, Vol.6, 253-269 (2011)
図１は、上記のＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析を説明するための図であって、トリプシン消化物由来糖ペプチドについて模式的に表す。図１において、ＭＳ測定において検出される糖ペプチドイオンすなわち分子量関連イオン（Ａ）、ＭＳ測定によって得られたスペクトル（ａ）、分子量関連イオン（Ａ）をプリカーサとして実施したＭＳ／ＭＳ測定における糖ペプチドイオンの開裂（Ｂ）、ＭＳ／ＭＳ測定によって得られたスペクトル（ｂ）、ＭＳ／ＭＳ測定において得られた、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサとして実施したＭＳ３測定における糖ペプチドイオンの開裂（Ｃ）、及びＭＳ３測定によって得られたスペクトル（ｃ）を示す。図１においては、糖鎖部分、及びペプチド鎖部分を模式的に示しており、Ｃ末端側のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在する。
（Ｂ）に示すように、モバイルプロトンはＭＳ／ＭＳ測定において糖鎖部分に移動し、開裂に必要なプロトンが糖鎖部分に供給される。その結果、（ｂ）に示すように、ＭＳ／ＭＳ解析では糖鎖開裂由来のフラグメントイオンを得て、糖鎖構造の解析が可能になる。さらに（Ｃ）に示すように、モバイルプロトンはＭＳ３測定においてペプチド部分に移動し、開裂に必要なプロトンがペプチド鎖部分に供給される。その結果、（ｃ）に示すように、ＭＳ３解析ではペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンを得て、アミノ酸配列の解析が可能になる。
糖ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析のフラグメントデータからＭＳ／ＭＳイオンサーチを行ってもスコアが低く同定に至らないという問題がある。このため、上記非特許文献１では、前もって二次元クロマトグラフィによりタンパクを単離して、消化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでタンパク質同定を行わなければならない。ここで、スコアとは、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにおいて、試料イオンと、データベース中のペプチドとの一致度を表す数値であり、スコアが高いほど、その一致度が高いことを表している。
図１（Ｃ）を参照して、例えば、トリプシンを用いた消化物由来糖ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ3スペクトルでは、Ｃ末端側のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在するため、出現するイオン種がｙ系列に偏りやすい。そのため、配列情報に起因するイオン種が少なくなり、結果としてＭＳ／ＭＳイオンサーチのスコアが低くなる傾向がある。さらに、糖鎖結合位置がＣ末端側に近い場合、ＧｌｃＮＡｃはＭＳ／ＭＳで外れやすいため、ＧｌｃＮＡｃの外れたフラグメントイオンが増加してフラグメントイオンが複雑となり、結果としてスコアがさらに低下して、ペプチド配列及び翻訳後結合位置の同定が困難となる問題がある。
そこで、本発明の目的は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにより高いスコアが得られ同定率の向上したペプチドの解析法を提供することにある。とりわけ、本発明の目的は、翻訳後修飾ペプチドの同定率向上のために有用なペプチドの解析法を提供することにある。
本発明者らは、解析すべきペプチド鎖の末端に塩基を付与し、前記塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供することにより、ＭＳ／ＭＳイオンサーチのスコアが向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）解析すべきペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与する工程と、
前記塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供し、ＭＳn （ｎ≧２）解析を行う工程と、
ＭＳn （ｎ≧２）解析により得られたフラグメントイオンデータと、アミノ酸配列データベースとの照合を行う工程とを含む、ペプチド解析法。
ここで、ペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与するとは、Ｎ末端又はＣ末端に塩基を含む修飾試薬（すなわち、ラベル化剤）を導入すること、あるいは、Ｎ末端又はＣ末端の塩基性を高めることをも含む意味である。
また、質量分析におけるＭＳn （ｎは２以上の整数）分析は当業者によく知られている。質量分析装置によって行われる分析において、試料の1回目の分析をＭＳ分析とし、ＭＳ分析において得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとして２回目の分析を行うことをＭＳ／ＭＳ分析又はＭＳ2分析と表記する。同様に、ＭＳ2分析において得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとして３回目の分析を行うことをＭＳ３分析と表記する。同様に、ＭＳn-1分析において得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとしてｎ回目の分析を行うことをＭＳn分析と表記する。
（２）前記解析すべきペプチドは、翻訳後修飾が付加しているものである、上記（１）に記載のペプチド解析法。
（３）前記翻訳後修飾が、糖、糖鎖、シトルリン残基、ニトロシル基、ニトロ基、硫酸化又はリン酸基である、上記（２）に記載のペプチド解析法。
（４）前記糖鎖が、Ｎ結合型糖鎖である、上記（３）に記載のペプチド解析法。
（５）前記塩基を付与する工程は、アミノ基を標的として行われる、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド解析法。
（６）前記アミノ基は、α−アミノ基である、上記（５）に記載のペプチド解析法。
（７）前記解析すべきペプチドは、タンパク質のトリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｒｇＣを用いた消化物である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチド解析法。
（８）前記質量分析を、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）法を用いて行う、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のペプチド解析法。
本発明において、解析すべきペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与し、前記塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供する。Ｎ末端又はＣ末端に塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供すると、フラグメントイオンの強度が高くなり、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにより高いスコアが得られ、ペプチドの同定率が向上する。これによりペプチド鎖のアミノ酸配列を決定することができ、消化前の元のタンパク質を同定することができる。
ペプチド鎖のＮ末端に塩基を導入する場合、タンパク質のプロテアーゼ処理により生成したペプチド鎖には、切断により生じたＮ末端にα−アミノ基が出現するため、Ｎ末端α−アミノ基に、塩基を含むラベル化剤により塩基が付加される。そうすると、ＭＳ／ＭＳフラグメントにおいてＮ末端の塩基にプロトンが付加するため、ｙ系列のイオンに加えてｂ系列のイオンも出現するようになる。その結果、配列情報を含むイオン種が増加するためＭＳ／ＭＳイオンサーチによりスコアが高くなり、より正確なペプチドの同定及びタンパク質同定を行うことができる。
また、解析すべきペプチドが糖鎖付加ペプチドであり、その糖鎖結合位置がＣ末端側に偏っている場合は、ｂ系列のイオンは糖鎖の脱落したイオンがほとんど出現しないため、配列決定に有効なフラグメントイオンを補完することができる。
このように、本発明によれば、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにより高いスコアが得られ同定率の向上したペプチドの解析法が提供される。とりわけ、本発明は、解析すべきペプチドが翻訳後修飾ペプチドの場合に有用である。
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析を説明するための図であって、トリプシン消化物由来糖ペプチドについて模式的に表す。図１において、ＭＳ測定において検出される糖ペプチドイオンすなわち分子量関連イオン（Ａ）、ＭＳスペクトル（ａ）、分子量関連イオン（Ａ）をプリカーサとして実施したＭＳ／ＭＳ測定における糖ペプチドイオンの開裂（Ｂ）、ＭＳ／ＭＳスペクトル（ｂ）、ＭＳ／ＭＳ測定において得られた、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサとして実施したＭＳ３測定における糖ペプチドイオンの開裂（Ｃ）、及びＭＳ３スペクトル（ｃ）を示す。 解析すべきペプチド鎖のＮ末端に塩基を付与しないで質量分析を行う場合（比較）を模式的に表す図である。 解析すべきペプチド鎖のＮ末端に塩基を付与して、その後、質量分析を行う場合（本発明）を模式的に表す図である。 実施例１で得られた結果を示す。図４（ａ）は、ＭＡＳＣＯＴを用いたＭＳ／ＭＳイオンサーチによる結果（縦軸：ヒット数、横軸：タンパク質スコア）を表す。図４（ｂ）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3スペクトルを表す。 比較例１で得られた結果を示す。図５（ａ）は、ＭＡＳＣＯＴを用いたＭＳ／ＭＳイオンサーチによる結果（縦軸：ヒット数、横軸：タンパク質スコア）を表す。図５（ｂ）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3スペクトルを表す。 実施例２において、7種の各糖ペプチドについて、ＴＭＴラベル化の有無でのＭＡＳＣＯＴスコアの比較を示す図である。
［１．解析対象ペプチド］
本発明において、解析対象とされるペプチドには、翻訳後修飾が付加していない通常のペプチド、及び翻訳後修飾が付加しているペプチドの両者が含まれる。前記翻訳後修飾としては、糖、糖鎖、リン酸化、硫酸化、アルキル化、カルバミル化、ニトロシル化、ニトロ化、シトルリン残基化等が含まれる。前記糖鎖としては、Ｏ結合型糖鎖（セリン残基又はスレオニン残基結合型）、及びＮ結合型糖鎖（アスパラギン残基結合型）が含まれる。本発明は、複雑な構造であるＮ結合型糖鎖にも、好適に適用される。
本発明において、解析対象とされるペプチドは、通常、同定したいタンパク質の酵素消化物である。消化に用いられる酵素は、特に限定されるものではないが、本発明は、解析対象とされるペプチドが、トリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｒｇＣを用いた消化物である場合にも好適に適用される。解析対象とされるペプチドが、トリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｒｇＣを用いた消化物である場合には、Ｃ末端側のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在する。そのため、消化物由来ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ3スペクトルでは、出現するイオン種がｙ系列に偏りやすい。しかしながら、本発明によれば、このような場合にも、ｂ系列イオン種を出現させることができ、結果としてＭＳ／ＭＳイオンサーチのスコアを高くすることができる。
［２．塩基の付与］
まず、解析対象とされるペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与する。ここで、ペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与するとは、Ｎ末端又はＣ末端に塩基を含む修飾試薬（すなわち、ラベル化剤）を導入すること、あるいは、Ｎ末端又はＣ末端の塩基性を高めることをも含む意味である。
ペプチド鎖のＮ末端に塩基を導入する場合、タンパク質のプロテアーゼ処理により生成したペプチド鎖には、切断により生じたＮ末端にα−アミノ基が出現するため、Ｎ末端α−アミノ基に、塩基を含むラベル化剤を反応させることにより塩基が付加される。
塩基を含むラベル化剤としては、特に限定されるものではないが、サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific)社のタンデムマスタグ試薬 (ＴＭＴ；Tandem Mass Tag Reagent) を用いることができる。ＴＭＴは、マスレポーター(Mass reporter)部と、開裂リンカー(Cleavable linker)部と、マスノーマライザー(Mass normalizer)部と、反応基(Reactive group)とから構成されている化合物である。開裂リンカー(Cleavable linker)部は、ＭＳ／ＭＳ分析において優先的に切断され、レポーターイオン(Mass reporter ion)を生成する。反応基(Reactive group)は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルであり、ペプチド鎖のアミノ基に対して高い効率で反応し脱離する。ペプチド鎖Ｎ末端のα−アミノ基とアミド結合が形成される。
ＴＭＴ：
N-succinimidyl 4-aza-6-(2,6-Dimethyl-1-piperidinyl)-5-oxohexanoate
上記ＴＭＴに限らず、ペプチド鎖のＮ末端α−アミノ基に、塩基を導入し得る試薬を用いることができる。例えば、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬、４−アミノベンゾイルオキシスクシンイミド(4-midinobenzoyloxysuccinimide)、5-FAM Succinimidylester、ダンシルクロライドなどが挙げられる。
上記のようにペプチド鎖のＮ末端に塩基を導入する場合の他に、ペプチド鎖のＮ末端の塩基性を高くするには、例えば、Ｎ末端α−アミノ基のＨをアルキル基（例えば、メチル基、エチル基）で置換してアミノ基自体の塩基性を高くしてもよい。
ペプチド鎖のＣ末端に塩基を導入する場合、例えば、脱水縮合剤（ＷＳＣ:水溶性カルボジイミド(Water Soluble Carbodiimide)など）を用いてジラールＤ試薬（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンヒドラジド・塩酸塩）を反応させると、Ｃ末端のカルボキシル基に三級アミンを付与することができる。
あるいは、ペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端の側鎖アミノ基に塩基を導入することも考えられる。例えば、リジン残基のε−アミノ基への塩基の導入が考えられる。また、アルギニン側鎖のグアジニノ基をアセチルアセトンなどで修飾し、修飾後に生じたアミノ基に塩基導入ラベル化反応を行うことも考えられる。
塩基の付与における反応条件は、当業者が適宜決定することができる。
プロトコルとしては、同定したいタンパク質を酵素（例えば、トリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｒｇＣ）を用いて消化して、消化物ペプチド混合物を得る。消化物ペプチド混合物をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて精製を行う。消化物ペプチドの分取を行い、得られたペプチドをＮａＨＣＯ3に溶解する。この溶液に塩基を含む修飾試薬溶液（例えば、ＴＭＴ溶液）を加え、例えば超音波処理によって反応させる。この反応溶液をＺｉｐ−Ｔｉｐ処理や逆相クロマトグラフィによって脱塩精製し、その後、マトリックス（例えば、ＤＨＢ）溶液と混合し、以下に説明するＭＡＬＤＩ−ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析を行う。
［３．質量分析］
上記の方法によって得られた塩基が付与されたペプチドを質量分析工程ＭＳn （ｎは２以上の整数）に供する。ペプチドが糖ペプチドの場合には、質量分析工程においては、糖鎖開裂由来のフラグメントイオンと、ペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンとを得る。
［３−１．イオン化法］
質量分析におけるイオン化法としては、具体的には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization; MALDI）法及びエレクトロスプレーイオン化（Electrospray ionization; ESI）法が挙げられる。マトリックスとしては、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）等が用いられる。
［３−２．開裂法］
質量分析における開裂法としては、具体的にはポストソース型である。イオン化法に応じて当業者によって適宜選択されるが、より具体的には、ポストソース分解（Post Source Decay; PSD）、衝突誘起解離（Collision Induced Dissociation; CID）、高エネルギー衝突解離（High energy Collision Dissociation; HCD）、赤外多光子解離（infraredmultiphoton dissociation；IRMPD）、及び光誘起解離（photo-induced dissociation；PID）によるものが挙げられる。
CID、HCD、IRMPD及びPIDを実施可能な質量分析装置としては、衝突室、又は、衝突室の機能を持つ四重極、イオントラップ、もしくはHCDコリジョンセルを有する質量分析装置が挙げられる。具体的には、イオントラップ型質量分析計、三連四重極型質量分析計、四重極飛行時間型質量分析計、四重極−イオントラップ型質量分析計、四重極−フーリエ変換型質量分析計、四重極−オービトラップ型質量分析計が挙げられる。PSDを実施可能な質量分析装置としては、具体的には飛行時間型質量分析計が挙げられる。
［３−３．質量分析適用例］
本発明において、質量分析及びＭＳ／ＭＳイオンサーチは、とりわけ糖ペプチドの構造解析に適用されることが好ましい。糖ペプチド構造解析においては、アミノ酸配列決定及び／又は糖鎖配列決定が行われる。一方、本発明の質量分析及びＭＳ／ＭＳイオンサーチは、糖ペプチドの構造解析を行わない分析にも適用されることができる。そのような分析としては、Multiple Reaction Monitoring (MRM)による定量等、種々の定量分析が挙げられる。
［３−４．糖鎖開裂由来フラグメントイオン］
［３−４−１．糖鎖開裂由来フラグメントイオンの具体例］
糖鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンから生じる。糖鎖開裂由来のフラグメントイオンは、分子量関連イオンのペプチド鎖全体を少なくとも含む。ペプチド鎖全体を少なくとも含むプロダクトイオンは、分子量関連イオンのペプチド鎖部分で切断が生じていないプロダクトイオンであり、分子量関連イオンにおけるアミノ酸残基数と同じ数のアミノ酸残基を有する。
ペプチド鎖全体を少なくとも含むプロダクトイオンの具体例として、まず、糖鎖構造を決定するためのプロダクトイオンが挙げられる。これは、分子量関連イオンにおける構成糖間の結合が切断されることにより生じるものであり、ペプチド鎖に糖が１個、２個、３個、及び／又は（ｎ−１）個（ｎは分子量関連イオンが有する構成糖の数を表す整数）結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンである。このような糖ペプチドプロダクトイオンにおいては、糖の環構造が開裂していてもよい。好ましい態様においては、糖鎖部分から構成糖が１個ずつ脱落し構成糖間のすべての結合が切断されることにより、糖鎖構造決定に必要なすべてのプロダクトイオンを得ることができる。
ペプチド鎖全体を少なくとも含むプロダクトイオンの具体例として、次に、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンを識別するための指標となるプロダクトイオンが挙げられる。具体的には、ペプチド鎖に糖（一例を挙げるとＮ−アセチルグルコサミン）が１個結合したプロダクトイオンの低質量側に検出されうる、当該糖が環開裂した構造がペプチド鎖に結合したプロダクトイオン、及び糖鎖を含まないペプチド鎖のみからなるプロダクトイオンである。
ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンと、その低質量側の２種のプロダクトイオンとを含む合計３種のプロダクトイオンが、トリプレットピークとして、特定の質量差で生じる特徴的なパターンで検出されうる。この特徴的なパターンで検出されたトリプレットピークを指標として、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンを識別し、識別された当該プロダクトイオンの相対的な検出強度を考慮して、アミノ酸配列決定のためのプリカーサイオンとして選択されるべきプロダクトイオンを決定することができる。
あるいは、当該トリプレットピークを構成するプロダクトイオンのうち、糖が環開裂した構造がペプチド鎖に結合したプロダクトイオンが十分な強度で検出されない場合がある。この場合、ペプチド鎖に糖が１つ結合した糖ペプチドイオンと、ペプチド鎖のみからなるプロダクトイオンとの合計２種のイオンを指標とすることもできる。すなわちこの合計２種のイオンを指標として、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンを識別し、識別された当該プロダクトイオンの相対的な検出強度を考慮して、アミノ酸配列決定のためのプリカーサイオンを選択することができる。
なお、ペプチド鎖に糖が１個結合したプロダクトイオンが、糖が２個以上結合した他のプロダクトイオンに比べて十分に強い強度で検出されている場合、糖が１個結合したプロダクトイオンをプリカーサイオンとして選択することができる。ペプチド鎖に糖が１個結合したプロダクトイオンよりも、糖が２個以上（２個〜（ｎ−１）個）結合した他のプロダクトイオンの方が十分に強い強度で検出されている場合、糖が２個以上結合した他のプロダクトイオンをプリカーサイオンとして選択することができる。
［３−５．ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオン］
ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンの開裂により、上記の糖鎖開裂由来フラグメントイオンと同時に生じることができる。この場合におけるペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンのペプチド鎖の一部と、１個又は２個の糖と、を有する。ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンにおいては、糖の環構造が開裂していてもよい。
上記の場合におけるペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、糖の数が１個又は２個と少ないため、同時に検出されている糖鎖開裂由来フラグメントイオンの質量域より低質量側に検出される。このため、上記のペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、糖鎖開裂由来フラグメントイオンとはマススペクトル上で明確に区別されることができる。
ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンの開裂により生じた糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサイオンとして生じることもできる。より具体的には、ペプチド鎖由来フラグメントイオンは、プリカーサイオンのペプチド鎖の一部と、１個又は２個以上の糖とを有する。ペプチド鎖由来フラグメントイオンにおける糖の数は、プリカーサイオンにおける糖の数と同じであってもよいし、少なくてもよい。また、糖は、環構造が開裂していてもよい。
また、ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンとして、上記の他に、糖を有しないペプチド鎖のみのフラグメントイオンが生じることもある。
［４．アミノ酸配列データベースとの照合］
以上のペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンに基づいて、アミノ酸配列データベースとの照合（ＭＳ／ＭＳイオンサーチ）を行い、ペプチド鎖のアミノ酸配列決定を行うことができる。
アミノ酸配列データベースとしては、例えば、マトリクスサイエンス社が提供している検索エンジンであるタンパク質同定システム（商品名ＭＡＳＣＯＴ Ｓｅｒｖｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４）を用いることができる。データベースとの照合は、各データベースの手順に従って行うことができる。
ＭＡＳＣＯＴを用いて、ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析のフラグメントデータからＭＳ／ＭＳイオンサーチを行って、スコアを得る。スコアとは、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにおいて、試料イオンと、データベース中のペプチドとの一致度を表す数値であり、スコアが高いほど、その一致度が高いことを表している。ここで、ペプチドの同定効率の正確さを表す指標として、誤同定率の指標であるExpectation Valueが用いられる。
Expectation Value （Ｅ）は、
Ｅ＝Ｐthreshold * (１０ ** ((Ｓthreshold−Ｓｃｏｒｅ) ／１０))
で算出される。
Ｐthreshold は、Significance threshold (有意性の閾値)を表し、Ｓthresholdは、Score threshold （スコアの閾値）を表す。
Expectation Valueの値が小さいほど正確に同定されていることが示され、スコアがＸだけ大きくなると、同定の正確さは１０(X/10)倍上昇させられる。
本発明においては、上述のように、解析すべきペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与し、前記塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供し、ＭＳn （ｎ≧２）解析を行うので、ＭＳn（糖ペプチドにおいてはＭＳ3）解析のフラグメントデータから高いスコアを得ることができ、より正確なペプチドの同定及びタンパク質同定を行うことができる。
このことを、図２及び図３を参照しながら、トリプシン消化物由来糖ペプチドを例として説明する。図２は、解析すべきペプチド鎖のＮ末端に塩基を付与しないで質量分析を行う場合（比較）を模式的に表す図であり、図３、解析すべきペプチド鎖のＮ末端に塩基を付与して、その後、質量分析を行う場合（本発明）を模式的に表す図である。
図２（ａ）は、Ｎ末端が塩基ラベル化されていないペプチド鎖のＭＳ／ＭＳ測定において得られた、ペプチド鎖に糖（ＧｌｃＮＡｃ）が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサとして実施したＭＳ３測定における糖ペプチドイオンの開裂を表し［図１の（Ｃ）に相当する］、図２（ｂ）は、ＭＳ３測定によって得られたスペクトルを表し［図１の（ｃ）に相当する］、図２（ｃ）は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチによる結果（縦軸：ヒット数、横軸：タンパク質スコア）を表す。ペプチド鎖のＮ末端は塩基ラベル化されておらず、Ｃ末端のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在する。図２（ｂ）に示すように、Ｃ末端のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在するため、ＭＳ３スペクトルにおいて、出現するイオン種がｙ系列に偏りやすい。そのため、配列情報に起因するイオン種が少なくなり、結果としてＭＳ／ＭＳイオンサーチのスコアが低くなる傾向がある。さらに、糖鎖結合位置がＣ末端側に近い場合、ＧｌｃＮＡｃはＭＳ／ＭＳで外れやすいため、ＧｌｃＮＡｃの外れたフラグメントイオンが増加してフラグメントイオンが複雑となり、結果としてスコアがさらに低下して、ペプチド配列及び翻訳後結合位置の同定が困難となる問題がある。
図３（ａ）は、Ｎ末端が塩基ラベル化されたペプチド鎖のＭＳ／ＭＳ測定において得られた、ペプチド鎖に糖（ＧｌｃＮＡｃ）が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサとして実施したＭＳ３測定における糖ペプチドイオンの開裂を表し、図３（ｂ）は、ＭＳ３測定によって得られたスペクトルを表し、図３（ｃ）は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチによる結果（縦軸：ヒット数、横軸：タンパク質スコア）を表す。ペプチド鎖のＮ末端は塩基ラベル化されており、Ｃ末端のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在する。図３（ｂ）に示すように、Ｃ末端のみにリジン（Ｋ）残基もしくはアルギニン（Ｒ）残基が存在するが、一方で、ペプチド鎖のＮ末端に導入された塩基にもプロトンが付加するため、ＭＳ３スペクトルにおいて、ｙ系列イオン種に加えて、ｂ系列イオン種も出現する。その結果、配列情報を含むイオン種が増加するためＭＳ／ＭＳイオンサーチによりスコアが高くなり、より正確なペプチドの同定及びタンパク質同定を行うことができる。
また、図３を参照して、解析すべきペプチドにおいてその糖鎖結合位置がＣ末端側に偏っている場合は、ｂ系列のイオンは糖鎖の脱落したイオンがほとんど出現しないため、配列決定に有効なフラグメントイオンをさらに補完することができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
標的とするタンパク質（牛由来フェチュイン）２０ｎｍｏｌを８Ｍ Ｕｒｅａ １５μＬ及び１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ７８．５μＬの溶液に溶解した。この溶液に、１μＬの１Ｍ ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加し、５６℃で２０分間反応させ、ジスルフィド結合の還元を行った。次に、５５０ｍＭ ＩＡＡ（インドール酢酸）溶液を２．７μＬ添加し、暗所で１５分間反応させ、チオールのカルバミドメチル化を行った。この溶液にTrypsinを滴下して、３７℃で一晩反応させ、酵素消化を実施した。この消化物からＳＥＣ (Size Exclusion Chromatography)を用いて糖ペプチドの分取を行い、分取溶液をSpeedVacで除去した。得られた糖ペプチド１ｎｍｏｌを１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3 溶液２５μＬに溶解した。
次に、得られた糖ペプチドの溶液に５７ｍＭのＴＭＴ（Tandem Mass Tag；サーモサイエンティフィック社）のアセトニトリル溶液を１．５μＬ滴下し、５分間超音波処理を行った後に、５０℃で３０分間反応させた（ＴＭＴラベル化）。この反応により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルオキシド基が脱離し、ペプチド鎖Ｎ末端のα−アミノ基にアミド結合によりＴＭＴが導入された。
この反応溶液をZip-Tip処理を行って脱塩精製した後、ＤＨＢをマトリックスとして用いて、AXIMA-Resonance（登録商標）（島津製作所製)を用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析を行った。取得したＭＳ3スペクトルについてはＭＡＳＣＯＴ検索を行い、糖ペプチドの同定を行った。
得られた結果を図４に示す。図４（ａ）は、ＭＡＳＣＯＴを用いたＭＳ／ＭＳイオンサーチによる結果（縦軸：ヒット数、横軸：タンパク質スコア）を表す。図４（ｂ）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3スペクトルを表す。ＭＡＳＣＯＴによる高いスコア５２が得られ、消化物ペプチドは、（ＴＭＴラベル化された）Fetuin glycopeptides(127-141)であると同定された。
ＴＭＴラベル化されたFetuin glycopeptides (127-141)の配列は、次のとおりである：
TMT-LCPDCPLLAPLNDSR（配列番号１；１番目のロイシン残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、１２番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
ここで、ＴＭＴの導入（ＴＭＴラベル化）とは、より正確には、3-[(2,6-Dimethyl-1-piperidinyl) acetyl amino] propanoyl-基の導入である。以下においても同じである。
［比較例１］
実施例１において、ＴＭＴのアセトニトリル溶液の滴下及び反応（ＴＭＴラベル化）を行わなかった以外は、実施例１と全く同様の操作を行った。
得られた結果を図５に示す。図５（ａ）は、ＭＡＳＣＯＴを用いたＭＳ／ＭＳイオンサーチによる結果（縦軸：ヒット数、横軸：タンパク質スコア）を表す。図５（ｂ）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3スペクトルを表す。消化物ペプチドは、Fetuin glycopeptides(127-141)であると同定されたが、スコアは１８と非常に低かった。
Fetuin glycopeptides (127-141)の配列は、次のとおりである：
LCPDCPLLAPLNDSR（配列番号２；１２番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
比較例１と実施例１とを比較すると、ＴＭＴラベル化によりＭＡＳＣＯＴスコアが１８から５２まで向上したことが確認された。このＭＡＳＣＯＴ結果について詳細な解析を行うと、ＴＭＴラベル化を行わないとｙ系列のイオンがヒットして同定が行われているのに対し、ＴＭＴラベル化を行うとTMT-Fetuin glycopeptides(127-141)ではｂ系列とｙ系列のイオン種が混在して同定が行われていることが分かる。しかも糖鎖結合部位がＣ末端に近い部位（Ｃ末端から４番目）にあるため、ｂ系列のイオン種の方が（ｙ系列のイオン種に比べて）糖鎖の外れたイオンが出現せず、有効なフラグメントが多く高いスコアが得られたと考えられる。
次の実施例２及び比較例２においては、標的とするヒト血漿α１酸性糖タンパク質オロソムコイドＡＧＰ(alpha 1-acid glycoprotein-1およびalpha 1-acid glycoprotein-2)由来の7種の糖ペプチドについて、ＴＭＴラベル化の有無でのＭＡＳＣＯＴスコアの比較を行った。
［実施例２］
標的とするタンパク質（ＡＧＰ）２０ｎｍｏｌを８Ｍ Ｕｒｅａ １５μＬ及び１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ７８．５μＬの溶液に溶解した。この溶液に、１μＬの１Ｍ ＤＴＴを添加し、５６℃で２０分間反応させ、ジスルフィド結合の還元を行った。次に、５５０ｍＭ ＩＡＡ溶液を２．７μＬ添加し、暗所で１５分間反応させ、チオールのカルバミドメチル化を行った。この溶液にTrypsinを滴下して、３７℃で一晩反応させ、酵素消化を実施した。この消化物からＳＥＣ(Size Exclusion Chromatography)を用いて糖ペプチド混合物の分取を行い、分取溶液をSpeedVacで除去した。得られた糖ペプチド混合物（各糖ペプチド１ｎｍｏｌ）を１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3 溶液２５μＬに溶解した。
次に、得られた糖ペプチド混合物の溶液に５７ｍＭのＴＭＴ（Tandem Mass Tag；サーモサイエンティフィック社）のアセトニトリル溶液を１．５μＬ滴下し、５分間超音波処理を行った後に、５０℃で３０分間反応させた（ＴＭＴラベル化）。
この反応溶液について、逆相クロマトグラフィを用いて各糖ペプチドの単離精製を行った。その後、各糖ペプチドについてＤＨＢをマトリックスとして用いて、AXIMA-Resonance（登録商標）（島津製作所製)を用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ3解析を行った。取得したＭＳ3スペクトルについてはＭＡＳＣＯＴ検索を行い、糖ペプチドの同定を行う共に、ＭＡＳＣＯＴスコアを得た。
［比較例２］
実施例２において、ＴＭＴのアセトニトリル溶液の滴下及び反応（ＴＭＴラベル化）を行わなかった以外は、実施例２と全く同様の操作を行った。
ＡＧＰ由来の７種の糖ペプチドの名称及び配列は以下のとおりである：
(Nは糖鎖結合アスパラギン残基を表す)
T1-1：
alpha 1-acid glycoprotein-1 (26-42): LVPVPITNATLDQITGK（配列番号４；８番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T2 ：
alpha 1-acid glycoprotein-1 (52-57): NEEYNK（配列番号６；５番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T4-1：
alpha 1-acid glycoprotein-1 (87-101): QDQCIYNTTYLNVQR（配列番号８；７番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T5-1：
alpha 1-acid glycoprotein-1 (102-108): ENGTISR（配列番号１０；２番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T1-2：
alpha 1-acid glycoprotein-2 (26-38): LVPVPITNATLDR（配列番号１２；８番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T4-2：
alpha 1-acid glycoprotein-2 (87-101): QNQCFYNSSYLNVQR（配列番号１４；７番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T5-2：
alpha 1-acid glycoprotein-2 (102-108): ENGTVSR（配列番号１６；２番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
なお、上記T2：alpha 1-acid glycoprotein-1 (52-57)については、alpha1-acid glycoprotein-1およびalpha 1-acid glycoprotein-2の消化物として同じ配列である。
ＴＭＴラベル化されたＡＧＰ由来の上記７種の糖ペプチドの配列は以下のとおりである：
(Nは糖鎖結合アスパラギン残基を表す)
T1-1：
TMT-LVPVPITNATLDQITGK（配列番号３；１番目のロイシン残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、８番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T2 ：
TMT-NEEYNK（配列番号５；１番目のアスパラギン残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、５番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T4-1：
TMT-QDQCIYNTTYLNVQR（配列番号７；１番目のグルタミン残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、７番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T5-1：
TMT-ENGTISR（配列番号９；１番目のグルタミン酸残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、２番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T1-2：
TMT-LVPVPITNATLDR（配列番号１１；１番目のロイシン残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、８番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T4-2：
TMT-QNQCFYNSSYLNVQR（配列番号１３；１番目のグルタミン残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、７番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
T5-2：
TMT-ENGTVSR（配列番号１５；１番目のグルタミン酸残基のＮ末端にはＴＭＴが導入されており、２番目のアスパラギン残基は糖鎖を有する）
結果を図６に示す。図６は、ＡＧＰ由来の７種の各糖ペプチドについて、ＴＭＴラベル化の有（実施例２; TMT Labeled）の場合と無（比較例２; No labeled）の場合とのＭＡＳＣＯＴスコアの比較を示す図である。図６より、いずれの糖ペプチドに対しても、ＴＭＴラベル化により４から４７のスコア上昇効果が見られた。

Claims (8)

  1. 解析すべきペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に塩基を付与する工程と、
    前記塩基が付与されたペプチド鎖を質量分析に供し、ＭＳn （ｎ≧２）解析を行う工程と、
    ＭＳn （ｎ≧２）解析により得られたフラグメントイオンデータと、アミノ酸配列データベースとの照合を行う工程とを含む、ペプチド解析法。
  2. 前記解析すべきペプチドは、翻訳後修飾が付加しているものである、請求項１に記載のペプチド解析法。
  3. 前記翻訳後修飾が、糖、糖鎖、ニトロシル基、ニトロ基、シトルリン残基、硫酸基又はリン酸基である、請求項２に記載のペプチド解析法。
  4. 前記糖鎖が、Ｎ結合型糖鎖である、請求項３に記載のペプチド解析法。
  5. 前記塩基を付与する工程は、アミノ基を標的として行われる、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド解析法。
  6. 前記アミノ基は、α-アミノ基である、請求項５に記載のペプチド解析法。
  7. 前記解析すべきペプチドは、タンパク質のトリプシン、ＬｙｓＣ、又はＡｒｇＣを用いた消化物である、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド解析法。
  8. 前記質量分析を、ＭＡＬＤＩ法を用いて行う、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド解析法。
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