JP2015178990A - 質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)タンパク質を断片化して質量分析用のペプチド混合物試料を調製する際に、該タンパク質の解析対象部位のアミノ酸残基(例えば、N末端又はC末端のアミノ酸残基)を、質量分析において感度を向上させることができる基を有する化合物(例えば、トリス(2,4,6−トリメトキシフェニル)ホスホニウム(TMPP)化合物)等により選択的(特異的)にラベル化(化学修飾)すると共に、アルギニン残基を除去又は改変すると、質量分析においてラベル化されたアミノ酸残基を含むペプチド断片(ラベル化されたペプチド断片)が選択的にイオン化されるため、ラベル化されたペプチド断片由来のイオンを質量分析で高感度に検出することができる。
(ii)上記の解析対象部位のアミノ酸残基のラベル化と、アルギニン残基の除去又は改変とを組み合わせることにより、解析対象のペプチド断片を高感度で検出することができるため、解析対象のラベル化されたペプチド断片とその他のペプチド断片とを含むペプチド混合物を質量分析に供することができる。つまり、質量分析用試料の調製において、解析対象のペプチド断片とその他のペプチド断片とを分離する必要がない。
(iii)解析対象部位のアミノ酸残基のラベル化と、アルギニン残基の除去又は改変とを組み合わせるペプチド混合物試料の調製方法は、N末端又はC末端の解析だけでなく、末端以外の部位へのラベル化(例えば、システイン残基に対するラベル化、リジン残基に対するラベル化、リン酸化若しくは糖鎖が結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖に対するラベル化)がされたペプチドを選択的にイオン化するための試料の調製方法としても有用である。
(iv)ペプチド混合物試料の調製において、アルギニン残基に加えてリジン残基を除去又は改変すると、質量分析においてラベル化されたペプチド断片をより高感度に検出することができる。
(v)ペプチド断片からアルギニン残基が除去又は改変されることにより、ラベル化されたペプチド断片のMS/MSフラグメントイオン(プロダクトイオン)スペクトル(以下、単に「MS/MSスペクトル」ともいう)において多数のフラグメントイオン(プロダクトイオン)が観察されるようになり、該ペプチド断片の構造解析が可能となる。
(vi)MS/MSスペクトルにおいて、ラベル化に用いた修飾用試薬に対応するm/z値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、プリカーサーイオンとして選択したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを容易に確認することができる。例えばラベル化にTMPP化合物を使用した場合には、ラベル化されたペプチド断片のMS/MSスペクトルにはTMPP特有のピーク(573Da)が出現する。このため、MS/MS分析に供したプリカーサーイオンがTMPPでラベル化されたペプチド由来のイオンであることを確認することができる。
本発明者らは、上記知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
(1)タンパク質から質量分析に供するペプチド混合物試料を調製するための方法であって、
(a)該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、
(b)該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び
(c)該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程
を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片と、その他のペプチド断片とを含むペプチド混合物試料を調製する方法。
(2)前記修飾用試薬が、正電荷を有する化合物又は塩基性基を有する化合物である、前記(1)に記載の方法。
(3)前記正電荷を有する化合物が、第四級ホスホニウム化合物又は第四級アンモニウム化合物である、前記(2)に記載の方法。
(4)前記第四級ホスホニウムが、トリス(2,4,6−トリメトキシフェニル)ホスホニウムである、前記(3)に記載の方法。
(5)前記塩基性基が、第三級アミノ基、イミダゾール基又はグアニジノ基である、前記(2)に記載の方法。
(6)工程(b)におけるタンパク質の切断が、アルギニンのC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われる、前記(1)〜(5)のいずれか一項に記載の方法。
(7)工程(c)におけるアルギニン残基の除去又は改変が、カルボキシペプチダーゼを用いるアルギニン残基の除去、又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いるグアニジノ基の脱イミン化若しくはグアニジノ基のヒドラジン分解によって行われる、前記(1)〜(6)のいずれか一項に記載の方法。
(8)工程(a)における標的アミノ酸残基のラベル化が、N末端のαアミノ基、C末端のαカルボキシル基、リジン残基の側鎖上のアミノ基、システイン残基の側鎖上のチオール基、又はリン酸基若しくはOグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖のラベル化である、前記(1)〜(7)のいずれか一項に記載の方法。
(9)工程(a)における標的アミノ酸残基のラベル化が、N末端のαアミノ基のラベル化である、前記(1)〜(8)のいずれか一項に記載の方法。
(10)工程(a)、工程(b)、及び工程(c)をこの順に行う、前記(9)に記載の方法。
(11)さらに、次の工程を含む、前記(1)に記載の方法。
(d)該タンパク質のリジン残基を除去又は改変する工程
(12)前記(1)〜(11)のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法。
(13)前記検出工程において、ペプチド混合物試料をイオン化し、生成したイオンの中からイオン強度が最も高いイオンをラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして選択する、前記(12)に記載の方法。
(14)さらに、選択したイオンをフラグメントイオンに解離させて、フラグメントイオンスペクトルを取得し、該フラグメントイオンスペクトルにおいてラベル化に用いた修飾用試薬に対応するm/z値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、該選択したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを確認する、前記(13)に記載の方法。
(15)前記(1)〜(11)のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程、及び該ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列決定方法。
本明細書中、「ペプチド断片」とは、後述する工程(b)でタンパク質を切断した断片である。「ペプチド混合物試料」とは、後述するラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むペプチド断片の混合物である。「ラベル化されたペプチド断片」は、後述する工程(a)で選択的にラベル化されたアミノ酸残基を含むペプチド断片である。ラベル化されたペプチド断片は、質量分析における解析対象のペプチド断片である。その他のペプチド断片は、前記のラベル化されたアミノ酸残基を含まないペプチド断片であり、以下、「非ラベル化ペプチド断片」ともいう。ペプチド混合物試料に含まれるその他のペプチド断片は、1種であってもよく、2種以上であってもよい。
(a)該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、
(b)該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び
(c)該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程
本発明において試料の調製に用いられるタンパク質は特に限定されないが、通常、少なくとも1個のアルギニン残基を有するものである。タンパク質は、天然から単離したタンパク質であってもよく、遺伝子工学を利用して製造したタンパク質であってもよい。また、有機合成で合成したタンパク質であってもよい。
工程(a)、工程(c)及び工程(b)の順に操作を行う場合には、工程(a)で得られたラベル化されたタンパク質からアルギニン残基を除去又は改変し(工程(c))、得られるアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質を切断して(工程(b))、ペプチド混合物試料を調製することになる。
工程(b)、工程(c)及び工程(a)の順に操作を行う場合には、工程(b)で得られるペプチド混合物について、アルギニン残基を除去又は改変する操作を行い(工程(c))、次いでアルギニン残基が除去又は改変されたペプチド混合物に修飾用試薬を作用させてペプチド断片中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化し(工程(a))、ペプチド混合物試料を調製することになる。
工程(c)、工程(b)及び工程(a)の順に操作を行う場合には、工程(c)で得られるアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質をペプチド断片に切断し(工程(b))、得られるペプチド混合物に修飾用試薬を作用させてペプチド断片中の標的アミノ酸残基をラベル化し(工程(a))、ペプチド混合物試料を調製することになる。
<工程(a)>
工程(a)では、タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する。
工程(a)において「タンパク質の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化する」とは、試料調製に用いたタンパク質中に存在した特定の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化することをいう。工程(a)を行うことによって、得られるペプチド混合物試料に含まれるペプチド断片中の前記特定の標的アミノ酸残基は、ラベル化されたものとなる。
より具体的には、工程(a)に供される対象は、工程(a)〜(c)を行う順番によって異なることになり、後述する工程(b)で切断される前のタンパク質、又は該タンパク質を切断したペプチド断片である。また、工程(c)を工程(a)より先に行う場合であれば、アルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質(切断前のタンパク質)、又は該タンパク質を切断したペプチド断片中の標的アミノ酸残基が工程(a)に供されてラベル化される。
例えば、本発明において、工程(a)を行った後に工程(b)を行う場合には、切断前のタンパク質に修飾用試薬を作用させて該タンパク質中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化する。また、工程(b)を行った後に工程(a)を行う場合には、タンパク質を切断したペプチド断片に修飾用試薬を作用させて該ペプチド断片中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化することになる。
修飾基として、例えば、正電荷を有する基又は塩基性基が好ましい。すなわち本発明における修飾用試薬は、正電荷を有する化合物又は塩基性基を有する化合物であることが好ましい。このような修飾用試薬によりラベル化されたペプチド断片は、質量分析に供された場合に、該断片が有する正電荷を有する基又は塩基性基により、該断片由来のイオン種の感度を上げることができる。その結果、ラベル化されたペプチド断片を質量分析によって、他のペプチド断片(非ラベル化ペプチド断片)から区別して選択的に検出することが容易となる。
第四級アンモニウムとして、例えば、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムが挙げられる。中でも、トリメチルアンモニウムが好ましい。
ラベル化は、通常溶媒中で修飾用試薬とタンパク質又はペプチド断片とを反応させることにより行われる。溶媒の種類及び反応条件は特に限定されず、標的アミノ酸、修飾用試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。修飾用試薬の使用量は、標的アミノ酸の種類、修飾用試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、溶媒として、重炭酸アンモニウム水溶液を使用することができる。修飾用試薬の使用量は、例えば、モル比で、試料調製に用いたタンパク質1に対して、通常1〜1000000であり、100〜10000が好ましい。反応条件は、修飾用試薬の種類により適宜選択することができる。例えば、タンパク質又はペプチド断片、及び修飾用試薬を含む溶媒のpHは通常6〜9であり、pH7〜8に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常20〜80℃、好ましくは30〜60℃であり、反応時間は、通常0.1〜2時間、好ましくは0.2〜0.6時間とする。
工程(b)に供されるタンパク質、すなわち切断されるタンパク質は、工程(a)〜(c)を行う順番によって異なることになるが、試料の調製に用いられたタンパク質、工程(a)でラベル化されたタンパク質又はこれらのタンパク質から工程(c)によってアルギニン残基を除去又は改変したタンパク質である。
例えば、工程(a)の後に工程(b)を行う場合であれば、標的アミノ残残基がラベル化されたタンパク質をペプチド断片に切断する。また、工程(c)の後に工程(b)を行う場合には、工程(c)によってアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質をペプチド断片に切断する。
工程(c)において「タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する」とは、試料調製に用いたタンパク質中に存在したアルギニン残基を除去又は改変することをいい、これにより本発明の方法により得られるペプチド混合物試料に含まれるペプチド断片は、アルギニン残基を含まないものとなる。
工程(c)に供される対象は、工程(a)〜(c)を行う順番によって異なることになるが、工程(b)で切断される前のタンパク質、及び該タンパク質を切断したペプチド断片である。また、工程(a)を工程(c)より先に行う場合であれば、ラベル化された切断前のタンパク質、又は該タンパク質を切断したペプチド断片を工程(c)に供することになる。
より具体的には、例えば、工程(c)の後で工程(b)を行う場合であれば、タンパク質中のアルギニン残基を除去又は改変する。また、工程(b)の後に工程(c)を行う場合には、ペプチド断片中のアルギニン残基を除去又は改変する。
本発明の方法は、本発明の効果を損なわない限り、工程(a)〜(c)以外の工程を含んでもよい。
例えば、タンパク質のリジン残基を除去又は改変する工程(d)を含むことが好ましい。かかる工程(d)でリジン残基を除去又は改変することにより、リジン残基残基を有していたペプチド断片のプロトンアフィニティが大幅に低下し、質量分析におけるそのイオン強度が低下する。その結果、ラベル化されたペプチド断片のみがより相対的に強い強度でイオン化され、該ペプチド断片由来のイオンをより選択的に検出することが可能となる。
工程(d)に供される対象は、工程(a)〜(d)を行う順番によって異なることになるが、工程(b)で切断される前のタンパク質、及び該タンパク質を切断したペプチド断片である。また、タンパク質は、工程(a)によってラベル化されたものであってもよく、工程(c)によりアルギニン残基が除去又は改変されたものであってもよい。なお、標的アミノ酸残基がリジン残基である場合には、通常工程(d)は行わないことが好ましい。
本発明の好ましい態様として、質量分析によりN末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。N末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料は、通常、ラベル化されたN末端ペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質1に対して、修飾用試薬を通常1倍〜10000倍、好ましくは修飾用試薬を10倍〜1000倍使用する。反応条件は、修飾用試薬の種類により適宜選択することができる。例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のpHは通常6〜9とすることができ、pH7〜8に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常20〜50℃、好ましくは30〜40℃であり、反応時間は、通常0.1〜1時間、好ましくは0.2〜0.6時間とする。
質量分析によりC末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。C末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料は、通常、ラベル化されたC末端ペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質1に対して、修飾用試薬を通常1倍〜100000倍、好ましくは10倍〜10000倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のpHを通常8〜12とすることができ、pH9〜11に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常40〜80℃、好ましくは55〜65℃であり、反応時間は、通常0.2〜4時間、好ましくは0.5〜2時間とする。
質量分析によりタンパク質中のリジン残基を解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。タンパク質中のリジン残基を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、リジン残基の側鎖上のアミノ基(εアミノ基)がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
工程(a)〜(c)を行う順番は特に限定されない。前記のリジン残基を除去又は改変する工程(d)は行わないことが好ましい
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質1に対して、修飾用試薬を通常1倍〜10000倍、好ましくは10倍〜1000倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のpHを通常6〜10とすることができ、pH7〜9に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常20〜60℃、好ましくは20〜50℃であり、反応時間は、通常0.1〜5時間、好ましくは0.2〜4時間とする。
工程(b)及び(c)における反応条件等は、上述と同様である。
質量分析によりタンパク質中のシステイン残基を解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。タンパク質中のシステイン残基を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、システイン残基の側鎖上のチオール基がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質1に対して、修飾用試薬を通常1倍〜100000倍、好ましくは10倍〜1000倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のpHを通常6〜9とすることができ、pH7〜8に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常0〜60℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間は、通常0.1〜1時間、好ましくは0.2〜0.5時間とする。
工程(b)、(c)及び(d)における反応条件等は、上述と同様である。
質量分析によりタンパク質のリン酸化部位又は糖鎖(Oグリカン)結合部位を解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。リン酸化部位を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、リン酸基が結合していたセリン又はスレオニン残基の側鎖がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含む。Oグリカン結合部位を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、Oグリカンが結合していたセリン又はスレオニン残基の側鎖がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含む。
例えば、モル比で、試料調製に用いたタンパク質1に対して、修飾用試薬を通常1倍〜1000000倍、好ましくは100倍〜10000倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のpHを通常1〜14とすることができ、pH7〜14に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常20〜50℃、好ましくは30〜40℃であり、反応時間は、通常0.5〜4時間、好ましくは1〜3時間とする。
工程(b)、工程(c)及び工程(d)における反応条件等は、上述と同様である。
上記の方法によって得られたペプチド混合物試料は、質量分析に供される。
本発明は、前記の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程を含む、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法も包含する。
上記の方法で調製されたペプチド混合物試料は、解析対象のラベル化されたペプチド断片及びその他のペプチド断片を含むが、解析対象のペプチド断片には、解析対象のペプチド断片の質量分析における検出感度を向上させる効果を有する修飾基(例えば、正電荷を有する基又は塩基性基)が結合している。
例えば、工程(a)においてTMPPを有する修飾用試薬を用いた場合には、解析対象のペプチド断片には強い正電荷を有するTMPPが結合していることになる。さらに、ペプチド混合物試料中にはアルギニン残基が存在しない。このため本発明によれば、解析対象のペプチド断片を質量分析において選択的にイオン化することが可能となる。
本発明は、前記方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程、及び該ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定する工程を含む、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列決定方法も包含する。
検出工程の好ましい態様等は、上述した通りである。前記第一の質量分析工程において検出した解析対象のペプチド断片由来のイオンをプリカーサーイオンとしてMS/MS解析に供すると、フラグメントイオンを検出することができるため、その配列を決定することができる。また、アミノ酸配列の決定に用いるMS/MS解析方法としては、ESI法を利用した質量分析装置によるMS/MS解析、MALDI−TOF型質量分析装置によるPSD解析、CID解析等の方法から当業者が適宜選択することができ、好ましくはPSD解析を用いる。
1.試薬
アセトニトリル、及び重炭酸ナトリウムは和光純薬社製のものを使用した。α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)は、島津GLC社製のものを使用した。メチレンジホスホン酸(MDPNA)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、ヨードアセトアミド、(N−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル)トリス(2,4,6−トリメトキシフェニル)ホスホニウムブロミド(実施例中、「TMPP」という)、ウシ血清アルブミン(BSA)、及びトリオースリン酸イソメラーゼ(TPIS)(ウサギ由来)は、シグマ・アルドリッチ社製のものを使用した。トリプシンは、プロメガ社より購入した。メタロプロテイナーゼLys−N(以下、単に「Lys−N」という)はU-Protein Express BV社(ユトレヒト、オランダ)のものを使用した。カルボキシペプチダーゼBは、Worthington Biomedical Corp.より購入した。SDS−PAGEには、インビトロジェン社のNu−PAGE(登録商標)キットを使用した(Life technologies)。CBB染色液は、ナカライテスク社より購入した。
2.タンパク質の還元アルキル化
タンパク質100pmol(BSAの場合には、7μg、TPISの場合には、2.7μg)を、100μLの78mM NaHCO3/1.2M 尿素溶液に溶解させた。これに1μLの0.1M TCEP溶液を添加して、37℃で1時間反応させた。この溶液に2.7μLの0.55M ヨードアセトアミド溶液を添加し、暗所条件で15分間反応させた。
還元アルキル化を行ったタンパク質の混合物に対して、200mM TMPP溶液を1μL添加した。この溶液に対し5分間超音波処理を行った後、50℃で30分間反応させてN末端のαアミノ基をTMPPで修飾した。反応させた溶液について、下記の4.に記載の方法でSDS−PAGEによりTMPPの未反応物などの不純物を除去した後、酵素処理を行った。
上記の3.で得られたTMPPでラベル化したタンパク質の溶液にSample bufferと還元剤(1M DTT)溶液を加えて混合し、70℃で10分間反応させた。このサンプルを遠心処理した後、ビスアクリルアミドゲルに搭載してMOPSバッファー(50mM MOPS、2.5mM Tris−base、0.1% SDS、及び1mM EDTA)を用いて50分間電気泳動を行った。泳動を行ったゲルをCBB染色でバンドを確認した後、ゲルを切り出した。切り出したゲルについて脱色液(50mM NaHCO3、50% アクリルアミド溶液)で脱染色処理を行った後、In−gelで酵素消化を行った。
SDS−PAGEによる精製を行ったタンパク質に対し、トリプシンを添加して37℃で一晩反応させた。ゲルから消化物ペプチドを回収した後、次にこの溶液にカルボキシペプチダーゼB溶液を添加し、37℃で1時間再び反応させた。さらにこの溶液にLysN溶液を添加し、1時間反応させた。反応させた溶液について、Zip−Tip(登録商標、ミリポア社製)を用いて脱塩処理を行って、サンプル溶液とした。このサンプル溶液を、後述するマトリックス溶液と混合してMALDI−MS解析を行った。
CHCAを、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)と10mg/mL MDPNAとを含む50%アセトニトリル溶液に、2mg/mLの濃度になるように溶解しマトリックス溶液とした。サンプル溶液0.5μLとマトリックス溶液0.5μLとをMALDIプレート上で混合し、自然乾燥させた。サンプルプレートには、μFocus MALDIプレート(μfocus MALDI plate(登録商標) 700μm、Hudson Surface Technology)を使用した。ラベル化ペプチドのMS及びMS/MSスペクトルの計測には、MALDI−QIT−TOF MS(AXIMA−Resonance、Shimadzu/Kratos、UK)のPositiveモードを使用した。
上述したように、BSA及びTPISのN末端をTMPPでラベル化した後、1)トリプシンによる断片化、2)カルボキシペプチダーゼBによるアルギニン残基とリジン残基の除去、3)切れ残ったリジン残基のLysNによる除去を行った。1)の操作、1)及び2)の操作、1)〜3)の操作を行って得られた各ペプチド混合物のMALDI−MSスペクトルを、図5に示す。
一方、カルボキシペプチダーゼB処理によりペプチド断片からアルギニン残基を除去することで(アルギニン除去後のアミノ酸配列:Ala-Pro-Ser)、本来のTMPPラベル化ペプチドで出現するピークが検出されるようになり、より多くのイオン種が確認された(図6の(b))。
図6の(a)及び(b)中に示されるアミノ酸配列(一文字表記)は、MS/MS分析に供したTMPPでラベル化したペプチド断片のアミノ酸配列である。
<例1>
<N末端解析プロトコール>
タンパク質に、100mM NaHCO3溶液16μLと8M 尿素溶液3μLを添加し溶解させる。ここに100mM TCEP溶液を2μL添加して、37℃で1時間反応させる。この後100mM ヨードアセトアミド溶液を2μL添加し、室温で1時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを100μL添加した後、氷中で1時間沈殿させる。1時間後にアセトンを取り除き、再び100μLのアセトンを加えて再び1時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。ここに10mM (N−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル)トリス(2,4,6−トリメトキシフェニル)ホスホニウムブロミド(TMPP−Ac−OSu)溶液(20%アセトニトリル/水)を20μL添加した後、超音波処理を5分間行った後、55℃で30分間反応させる。この反応液に氷冷したアセトンを再び100μL添加し、1時間沈殿させた後にアセトンを除去し、再度100μLのアセトンを加えて1時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去した後、100mM NaHCO3溶液を20μL添加する。ここに1pmolのトリプシンを添加した後、37℃で一晩反応させる。ここにさらに1pmolのカルボキシペプチダーゼB溶液を添加して37℃で1時間反応させる。この溶液を10倍希釈した後、CHCAとMDPNAの等量溶液と混合し、MALDI−TOF MSを用いた解析を実施する。
<C末端解析プロトコール>
タンパク質に、100mM NaHCO3溶液16μLと8M 尿素溶液3μLを添加し溶解させる。ここに100mM TCEP溶液を2μL添加して、37℃で1時間反応させる。この後100mM ヨードアセトアミド溶液を2μL添加し、室温で1時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを100μL添加した後、氷中で1時間沈殿させる。1時間後にアセトンを取り除き、再び100μLのアセトンを加えて再び1時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。この乾燥したサンプルにギ酸・無水酢酸・2,2,3,3,3−ペンタフルオロ−1−プロパノール(Pfp−OH)の混合溶液(1:1:1)を12μL添加する。このサンプルを遠心エバポレーター内部で60℃で20分間反応させる。この手順を2回繰り返した後、トルエン・Pfp−OH混合溶液(5:2)を14μL添加し、遠心エバポレーターによる溶媒除去を行う。乾燥したサンプルに、1umol/μLのTMPP−プロピルアミンを2μLと、トリエチルアミン・メタノール混合溶液(1:1)を4μL添加する。この溶液に対して5分間超音波処理を行った後、60℃で1時間反応させる。この混合液を、遠心エバポレーターを用いて溶媒除去を行った後、10μLのMilliQ水に溶解する。この反応液に氷冷したアセトンを再び100μL添加し、1時間沈殿させた後にアセトンを除去し、再度100μLのアセトンを加えて1時間沈殿させる。遠心分離を行った後にアセトンを再び除去して遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去した後、100mM NaHCO3溶液を20μL添加する。ここに1pmolのトリプシンを添加した後、37℃で一晩反応させる。ここにさらに1pmolのカルボキシペプチダーゼB溶液を添加して37℃で1時間反応させる。この溶液を10倍希釈した後、CHCAとMDPNAの等量溶液と混合し、MALDI−TOF MSを用いた解析を実施する。
<システイン解析プロトコール>
タンパク質に、100mM NaHCO3溶液16μLと8M 尿素溶液3μLを添加し溶解させる。ここに100mM TCEP溶液を2μL添加して、37℃で1時間反応させる。この後100mM TE−IAA(3−ヨードアセトアミドプロピルトリエチルアンモニウムヨージド)溶液を2μL添加し、室温で1時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを100μL添加した後、氷中で1時間沈殿させる。1時間後にアセトンを取り除き、再び100μLのアセトンを加えて再び1時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。このサンプルに100mM NaHCO3溶液を20μL添加する。ここに1pmolのトリプシンを添加した後、37℃で一晩反応させる。ここにさらに1pmolのカルボキシペプチダーゼB溶液を添加して37℃で1時間反応させる。この溶液を10倍希釈した後、CHCAとMDPNAの等量溶液と混合し、MALDI−TOF MSを用いた解析を実施する。
<リン酸化解析プロトコール>
タンパク質に、100mM NaHCO3溶液16μLと8M 尿素溶液3μLを添加し溶解させる。ここに100mM TCEP溶液を2μL添加して、37℃で1時間反応させる。この後100mMヨードアセトアミド溶液を2μL添加し、室温で1時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを100μL添加した後、氷中で1時間沈殿させる。1時間後にアセトンを取り除き、再び100μLのアセトンを加えて再び1時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。このサンプルを100mM NaHCO3溶液を20μL添加する。ここに1pmolのトリプシンを添加した後、37℃で一晩反応させる。ここにさらに1pmolのカルボキシペプチダーゼB溶液を添加して37℃で1時間反応させる。この反応液を、遠心エバポレーターを用いて溶媒を除去した後、Ba(OH)2飽和溶液を20μL添加する。さらに200mMのN−(2−メルカプトエチル)−6−メチルニコチンアミド溶液(50%アセトニトリル/水)を20μL添加して、37℃で2時間反応させる。反応後は10% TFA水溶液を10μL添加した後、MilliQ水を150μL添加する。この溶液をZip−Tip(登録商標、ミリポア社製)で脱塩処理を行った後、CHCAとMDPNAの等量溶液と混合し、MALDI−TOF MSを用いた解析を実施する。
<Oグリカン結合ペプチド解析プロトコール>
タンパク質を100mM NaHCO3溶液16μLと8M 尿素溶液3μLを添加し溶解させる。ここに100mM TCEP溶液を2μL添加して、37℃で1時間反応させる。この後100mMヨードアセトアミド溶液を2μL添加し、室温で1時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを100μL添加した後、氷中で1時間沈殿させる。1時間後にアセトンを取り除き、再び100μLのアセトンを加えて再び1時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。このサンプルを100mM NaHCO3溶液を20μL添加する。ここに1pmolのトリプシンを添加した後、37℃で一晩反応させる。ここにさらに1pmolのカルボキシペプチダーゼB溶液を添加して37℃で1時間反応させる。この反応液を、遠心エバポレーターを用いて溶媒を除去した後、1% トリエチルアミン、0.1% NaOH、20% エタノール混合溶液20μLを添加する。さらに200mMのN−(2−メルカプトエチル)−6−メチルニコチンアミド溶液(50%アセトニトリル/水)を20μL添加して、50℃で2.5時間反応させる。反応後は10% TFA水溶液を10μL添加した後、MilliQ水を150μL添加する。この溶液をZip−Tip(登録商標、ミリポア社製)で脱塩処理を行った後、CHCAとMDPNAの等量溶液と混合し、MALDI−TOF MSを用いた解析を実施する。
Claims (15)
- タンパク質から質量分析に供するペプチド混合物試料を調製するための方法であって、
(a)該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、
(b)該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び
(c)該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程
を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片と、その他のペプチド断片とを含むペプチド混合物試料を調製する方法。 - 前記修飾用試薬が、正電荷を有する化合物又は塩基性基を有する化合物である、請求項1に記載の方法。
- 前記正電荷を有する化合物が、第四級ホスホニウム化合物又は第四級アンモニウム化合物である、請求項2に記載の方法。
- 前記第四級ホスホニウムが、トリス(2,4,6−トリメトキシフェニル)ホスホニウムである、請求項3に記載の方法。
- 前記塩基性基が、第三級アミノ基、イミダゾール基又はグアニジノ基である、請求項2に記載の方法。
- 工程(b)におけるタンパク質の切断が、アルギニンのC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)におけるアルギニン残基の除去又は改変が、カルボキシペプチダーゼを用いるアルギニン残基の除去、又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いるグアニジノ基の脱イミン化若しくはグアニジノ基のヒドラジン分解によって行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)における標的アミノ酸残基のラベル化が、N末端のαアミノ基、C末端のαカルボキシル基、リジン残基の側鎖上のアミノ基、システイン残基の側鎖上のチオール基、又はリン酸基若しくはOグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖のラベル化である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)における標的アミノ酸残基のラベル化が、N末端のαアミノ基のラベル化である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)、工程(b)、及び工程(c)をこの順に行う、請求項9に記載の方法。
- さらに、次の工程を含む、請求項1に記載の方法。
(d)該タンパク質のリジン残基を除去又は改変する工程 - 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法。
- 前記検出工程において、ペプチド混合物試料をイオン化し、生成したイオンの中からイオン強度が最も高いイオンをラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして選択する、請求項12に記載の方法。
- さらに、選択したイオンをフラグメントイオンに解離させて、フラグメントイオンスペクトルを取得し、該フラグメントイオンスペクトルにおいてラベル化に用いた修飾用試薬に対応するm/z値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、該選択したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを確認する、請求項13に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程、及び該ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列決定方法。
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