JP2014005221A - タンパク質のｃ末端ペプチドを濃縮する方法及びタンパク質のｃ末端配列解析法 - Google Patents
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Abstract
【課題】多くのタンパク質に適用可能で、タンパク質のＣ末端修飾及びＮ末端修飾を必須としない、簡便なＣ末端ペプチド濃縮法を提供する。
【解決手段】タンパク質を、アルギニン残基のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いた消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、アルギニンへの結合能を有する固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
【選択図】図１
【解決手段】タンパク質を、アルギニン残基のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いた消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、アルギニンへの結合能を有する固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
【選択図】図１
Description
本発明は、ペプチド構造解析に関する。より具体的には、本発明はタンパク質からＣ末端ペプチド断片を分離することで濃縮する方法、及び濃縮したタンパク質Ｃ末端配列を解析する方法に関する。本発明は、医薬、食品及びタンパク質受託分析の分野で適用されうる。
タンパク質のＣ末端配列解析においては、タンパク質のＣ末端ペプチドの濃縮が行われることが多い。タンパク質のＣ末端ペプチドの濃縮方法は、一般的に、化学修飾、酵素消化及び分離の工程が組合せられている。濃縮されたＣ末端ペプチド断片は、質量分析等の分析に供される。例えば非特許文献１（Kuyama et al., Proteomics, 2008, 8, 1539-1550）においては、タンパク質を酵素消化（ＬｙｓＣを使用）及び化学修飾（スクシンイミジルオキシカルボニルメチルトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミドを使用）した後、Ｃ末端ペプチド断片を分離により濃縮し、質量分析に供している。
非特許文献２（Ishii, et al., Methods Enzymol., 1983, 91, 378-383）及び非特許文献３（Sechi et al., Anal.Biochem., 2000, 72, 3374-3378）においては、タンパク質を酵素消化した後、Ｃ末端ペプチド断片を分離（アンヒドロトリプシンを使用）により濃縮し、質量分析に供している。
非特許文献４（Shimizu, et al., Eur J Biochem., 2000, 267, 2380-2389）においては、タンパク質を消化し、Ｃ末端ペプチド断片を分離により濃縮した後、カルボキシペプチダーゼによる逐次分解法を用いたラダーシーケンシングに供している。
非特許文献５（Kosaka, et al., Anal Chem., 2000, 72, 1179-1185）においては、タンパク質を消化（５０％18Ｏラベル化水を含むバッファ使用）し、その後、18Ｏ／16Ｏラベルされたペプチド断片を質量分析に供している。
プロテオミクス（Proteomics）、２００８年、第８巻、ｐ．１５３９−１５５０
メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、１９８３年、第９１巻、ｐ．３７８−３８３
アナリティカル・バイオケミストリ（Analytical Biochemistry）、２０００年、第７２巻、ｐ．３３７４−３３７８
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（European Journal of Biochemistry）、２０００年、第２６７巻、ｐ．２３８０−２３８９
アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、２０００年、第７２巻、ｐ．１１７９−１１８５
非特許文献１の方法は、Ｃ末端がリジン残基であるタンパク質に適用することができない。また、化学修飾を行うことが必須であるため、サンプルロスの問題がある。
非特許文献２及び３の方法では、アンヒドロトリプシンを用いたＣ末端ペプチド断片捕捉の際の非特異吸着の問題がある。さらに、非特許文献２及び３の方法は、Ｃ末端がリジン残基であるタンパク質とＣ末端がアルギニン残基であるタンパク質との両方に適用できない。Ｃ末端がリジン残基であるタンパク質及びＣ末端がアルギニン残基であるタンパク質の総和が天然のタンパク質全体の２３％（Methanococcus jannasciiの場合）〜１３％（Homo sapiensの場合）を占めることを考慮すると、当該方法は、適用できないタンパク質がきわめて多い。
非特許文献４の方法においては、カルボキシペプチダーゼの基質特異性が非常に高いため、適用できないタンパク質がしばしばある。また、Ｃ末端からアミノ酸残基を１個ずつ開裂させることが必要になるが、アミノ酸残基の種類によって切断速度が異なるため、条件設定がきわめて難しい。
非特許文献５の方法によるPMFカバレッジは５０％未満である。従って、目的とするＣ末端ペプチドがスペクトル上で見つからない場合が多い。また、当該方法においては、消化酵素に通常トリプシンが用いられるが、この場合において、Ｃ末端がリジン残基であるタンパク質とＣ末端がアルギニン残基であるタンパク質との両方に適用できない。すなわち、非特許文献３における場合と同様に、適用できないタンパク質がきわめて多い。
そこで本発明の目的は、多くのタンパク質に適用可能で、タンパク質のＣ末端修飾及びＮ末端修飾を必須としない、簡便なＣ末端ペプチド濃縮法を提供することにある。
本発明者らは、タンパク質の消化をアルギニン残基Ｃ末端側で行い、Ｃ末端ペプチド断片以外のペプチド断片を、アルギニンを認識する固相担体を用いて除去することによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
タンパク質を、アルギニン残基のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いた消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、アルギニンへの結合能を有する固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
なお、本発明においては、「タンパク質のＣ末端ペプチド」と「タンパク質のＣ末端ペプチド断片」とは同じ意味で用いる。
（１）
タンパク質を、アルギニン残基のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いた消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、アルギニンへの結合能を有する固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
なお、本発明においては、「タンパク質のＣ末端ペプチド」と「タンパク質のＣ末端ペプチド断片」とは同じ意味で用いる。
（２）
前記アルギニンへの結合能を有する固相担体が、一般式−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２（Ｒ１は、二価の有機基である）で表される官能基を有するものであり、前記固相担体による前記ペプチド断片の捕捉を、一般式Ｒ２ＣＯＣＯＲ３（Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、同一又は異なっていてよい炭素数１〜８のアルキル基である）で表されるジケトン存在下で行う、（１）のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（３）
前記−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２基が、−ＮＨ−mＣ６Ｈ４−Ｂ（ＯＨ）２で表される基である、（２）のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
前記アルギニンへの結合能を有する固相担体が、一般式−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２（Ｒ１は、二価の有機基である）で表される官能基を有するものであり、前記固相担体による前記ペプチド断片の捕捉を、一般式Ｒ２ＣＯＣＯＲ３（Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、同一又は異なっていてよい炭素数１〜８のアルキル基である）で表されるジケトン存在下で行う、（１）のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（３）
前記−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２基が、−ＮＨ−mＣ６Ｈ４−Ｂ（ＯＨ）２で表される基である、（２）のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（４）
前記エンドプロテイナーゼがＡｒｇＣである、（１）〜（３）のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（５）
前記ＡｒｇＣがmouse submaxillary grand又はClostridium hystriticum由来の酵素である、（４）のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
前記エンドプロテイナーゼがＡｒｇＣである、（１）〜（３）のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（５）
前記ＡｒｇＣがmouse submaxillary grand又はClostridium hystriticum由来の酵素である、（４）のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（６）
前記タンパク質のＣ末端がリジン残基である、（１）〜（５）のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（７）
前記タンパク質のＮ末端アミノ基及び／又はＣ末端カルボキシル基がフリーであり、Ｎ末端修飾工程及びＣ末端修飾工程のいずれも行わない、（１）〜（６）のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
前記タンパク質のＣ末端がリジン残基である、（１）〜（５）のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（７）
前記タンパク質のＮ末端アミノ基及び／又はＣ末端カルボキシル基がフリーであり、Ｎ末端修飾工程及びＣ末端修飾工程のいずれも行わない、（１）〜（６）のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
（８）
（１）〜（７）のいずれかの方法によって、タンパク質からＣ末端ペプチド断片を濃縮する工程と、濃縮された前記Ｃ末端ペプチド断片を質量分析に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のＣ末端配列解析法。
（９）
前記質量分析に供される前に、電荷を有する求核基を有する化合物を用いて、前記濃縮されたペプチドの末端アミノ基の修飾が行われる、（８）のタンパク質のＣ末端配列解析法。
（１）〜（７）のいずれかの方法によって、タンパク質からＣ末端ペプチド断片を濃縮する工程と、濃縮された前記Ｃ末端ペプチド断片を質量分析に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のＣ末端配列解析法。
（９）
前記質量分析に供される前に、電荷を有する求核基を有する化合物を用いて、前記濃縮されたペプチドの末端アミノ基の修飾が行われる、（８）のタンパク質のＣ末端配列解析法。
本発明により、多くのタンパク質に適用可能で、タンパク質のＣ末端修飾及びＮ末端修飾を必須としない、簡便なＣ末端ペプチド濃縮法が可能になる。
本発明の概要を図１に示す。図１中、ペプチド鎖部分は模式的に示し、アルギニン残基をイタリック体のＲで示す。さらに、ペプチド鎖のＮ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基を具体的に表示している。図１挿入図内（四角囲み内）においては、アルギニン残基の側鎖構造を具体的に表示している。以下、図１を参照して本発明を説明する。
［１．タンパク質］
本発明におけるタンパク質（Protein）には、ポリペプチド全般が含まれ、具体的には、タンパク質（例えばアミノ酸残基数１，０００超、１，０００，０００以下）だけでなく、それより短い鎖長を有するペプチド（例えばアミノ酸残基数３０以上、１，０００以下）も含まれる。
本発明の方法に供されるタンパク質は、Ｃ末端残基がアルギニン残基でない限り、どのようなタンパク質であってもよい。
例えば、本発明におけるタンパク質は、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基のいずれも、フリーであるか否かを問わない。
また、本発明におけるタンパク質は、Ｃ末端残基がリジン残基であるか否かを問わない。
さらに、本発明におけるタンパク質は、通常の前処理として還元アルキル化等の処理を経たものであってよい。
本発明におけるタンパク質（Protein）には、ポリペプチド全般が含まれ、具体的には、タンパク質（例えばアミノ酸残基数１，０００超、１，０００，０００以下）だけでなく、それより短い鎖長を有するペプチド（例えばアミノ酸残基数３０以上、１，０００以下）も含まれる。
本発明の方法に供されるタンパク質は、Ｃ末端残基がアルギニン残基でない限り、どのようなタンパク質であってもよい。
例えば、本発明におけるタンパク質は、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基のいずれも、フリーであるか否かを問わない。
また、本発明におけるタンパク質は、Ｃ末端残基がリジン残基であるか否かを問わない。
さらに、本発明におけるタンパク質は、通常の前処理として還元アルキル化等の処理を経たものであってよい。
［２．消化］
本発明におけるタンパク質は、消化工程に供される。タンパク質のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれかがフリーである場合であっても、そのようなフリーのＮ末端（ＮＨ２基）及び／又はＣ末端（ＣＯ２Ｈ基）を修飾しておく必要はない。しかしながら本発明は、そのような修飾を事前に行っておくことを特に除外するものではない。
消化においては、アルギニン残基のＣ末端側での切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下に供され、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物が得られる。このようなエンドプロテイナーゼの具体例は、ＡｒｇＣである。ＡｒｇＣは、mouse submaxillary grand又はClostridium hystriticum由来の酵素であってよい。このようなエンドプロテイナーゼの使用により生じたＣ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とでは、前者がアルギニン残基を有さず、後者がアルギニン残基を有している点で構造上の相違がある。
本発明におけるタンパク質は、消化工程に供される。タンパク質のＮ末端及びＣ末端の少なくともいずれかがフリーである場合であっても、そのようなフリーのＮ末端（ＮＨ２基）及び／又はＣ末端（ＣＯ２Ｈ基）を修飾しておく必要はない。しかしながら本発明は、そのような修飾を事前に行っておくことを特に除外するものではない。
消化においては、アルギニン残基のＣ末端側での切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下に供され、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物が得られる。このようなエンドプロテイナーゼの具体例は、ＡｒｇＣである。ＡｒｇＣは、mouse submaxillary grand又はClostridium hystriticum由来の酵素であってよい。このようなエンドプロテイナーゼの使用により生じたＣ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とでは、前者がアルギニン残基を有さず、後者がアルギニン残基を有している点で構造上の相違がある。
［３．分離］
消化工程で得られたＣ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片との構造上の差は、分離工程における固相担体への結合能の有効な差として表れる。
分離工程においては、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物をアルギニン残基への結合能を有する固相担体に接触させ、その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉すること、すなわちアルギニン残基含有ペプチドをスカベンジングすること（Scavenging of Arg-containing peptides）によって、Ｃ末端ペプチド断片（C-terminal peptide）を分離する。
消化工程で得られたＣ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片との構造上の差は、分離工程における固相担体への結合能の有効な差として表れる。
分離工程においては、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物をアルギニン残基への結合能を有する固相担体に接触させ、その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉すること、すなわちアルギニン残基含有ペプチドをスカベンジングすること（Scavenging of Arg-containing peptides）によって、Ｃ末端ペプチド断片（C-terminal peptide）を分離する。
アルギニン残基への結合能を有する固相担体は、特異的にアルギニン残基と共有結合可能な官能基と担体部とを有するもの、すなわち当該官能基が担体部に固定されているものであればよい。アルギニン残基と当該官能基との結合は、直接的結合であってもよいし、他の構造を介した間接的結合であってもよい。
固相担体におけるアルギニン残基と共有結合可能な官能基が例えば一般式−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２で表される基である場合、当該官能基は、一般式Ｒ２ＣＯＣＯＲ３で表されるジケトン存在下及びアルカリ性条件下で、アルギニン残基と共有結合が可能である。上記官能基の一般式において、上記Ｒ１は、二価の有機基である。当該有機基は、例えば置換されていてもよいアリーレン基（好ましくはフェニレン基）を含有する基である。より具体的には、置換されていてもよいフェニレン基は、例えば一般式−Ｘ−Ｃ６Ｈ４−で表される基であってよい。この一般式において、Ｘは二価の連結基である。上記ジケトンの一般式において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、同一又は異なっていてよい炭素数１〜２０、好ましくは１〜３のアルキル基である。Ｒ２及びＲ３は同一であることが好ましい。
固相担体の担体部としては特に限定されないが、例えば、樹脂、多糖類及び二酸化ケイ素が挙げられる。樹脂の具体例としては、ポリ（メタ）アクリル酸及びポリスチレンが挙げられる。多糖類の具体例としてはアガロースが挙げられる。二酸化ケイ素の具体例としてはシリカゲル及び多孔質ガラスが挙げられる。
図１においては、アルギニン残基含有ペプチドのスカベンジング（Scavenging of Arg-containing peptides）をより具体的に説明するために、アルギニン捕捉反応（Arginine capture reaction）の機構（挿入図内）を例示する。この例示においては、ジケトンとして２，３−ブタンジオン（2,3-butanedione）、固相担体として固定化フェニルボロン酸（Immobilized phenylboronic acid）を用いている。Ｃ末端ペプチド断片以外のペプチド断片すなわちアルギニン残基含有ペプチド（Arg peptide）は、そのＣ末端にアルギニン残基を有する。アルギニン残基含有ペプチドにおけるアルギニン残基側鎖のグアニジノ基に、２，３−ブタンジオンをアルカリ性条件下で作用させることによって、イミダゾリン環中間体（ａ）が生じる。さらに、中間体（ａ）に、固定化フェニルボロン酸をアルカリ性条件下で作用させることによって、脱水縮合によりホウ酸エステル（ｂ）が生じる。このように、固相担体である固定化フェニルボロン酸が、２，３−ブタンジオン由来構造を介して特異的にアルギニン残基に結合する。
アルギニン捕捉反応を進行させるためのアルカリ条件は、例えばｐＨが８以上、好ましくはｐＨが１０以上である。使用するジケトンの量は、例えばペプチド５０〜５００００当量、好ましくは１００〜５０００当量である。また、反応温度条件は、例えば２０℃〜８０℃、好ましくは２５℃〜６０℃、反応時間は、例えば１５分〜２０時間、好ましくは３０分〜２時間である。
上述のように消化物を固相担体へ接触させることにより、消化物中の、Ｃ末端以外のペプチド断片（すなわちアルギニン残基を有するペプチド断片）がアルギニン残基を介して固相担体に結合し、Ｃ末端ペプチド断片（すなわちアルギニン残基を有しないペプチド断片）は固相担体に結合することなく溶出する。このように、Ｃ末端ペプチド断片が分離により濃縮される。
［４．濃縮されたＣ末端ペプチド断片の分析］
濃縮されたＣ末端ペプチド断片は、様々な分析に供されることができる。その際、Ｃ末端ペプチド断片がそのまま分析に供されてもよいし、分析に先立って、分析目的に適した処理に供されてもよい。
例えば、本発明で濃縮されたＣ末端ペプチド断片は、アミノ酸配列決定のために質量分析に供されることができる。この際、質量分析における感度向上の目的で、Ｃ末端ペプチド断片に修飾を行うことにより電荷を有する基を付与することがある。
濃縮されたＣ末端ペプチド断片は、様々な分析に供されることができる。その際、Ｃ末端ペプチド断片がそのまま分析に供されてもよいし、分析に先立って、分析目的に適した処理に供されてもよい。
例えば、本発明で濃縮されたＣ末端ペプチド断片は、アミノ酸配列決定のために質量分析に供されることができる。この際、質量分析における感度向上の目的で、Ｃ末端ペプチド断片に修飾を行うことにより電荷を有する基を付与することがある。
例えば、Ｃ末端ペプチド断片のＮ末端が修飾されることがある（なお、この場合のＮ末端修飾は、Ｃ末端ペプチド断片濃縮のためにて行われる分離工程より後に行われるものであり、分離工程より前に行われることがある非必須の修飾とは異なる）。Ｎ末端修飾法としては、アミノ基を修飾可能な方法を特に限定されることなく、当業者によって適宜選択される。好ましくは、Ｎ末端のαアミノ基が選択的に修飾される一方で、側鎖に存在しうるεアミノ基は修飾を受けない方法が用いられる。
Ｎ末端修飾工程において用いられる修飾試薬は、電荷を有する求核基を有する化合物である。例えば、修飾試薬の例として、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸、及びその誘導体が挙げられる。トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸の誘導体としては、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸のエステル、活性エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物、及び酸アジドなどが挙げられる。トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸の活性エステルとしては、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル（TMPP-Ac-OSu）、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸のスルホスクシンイミジルエステルなどが挙げられる。さらに具体的な修飾試薬の例として、（スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミドが挙げられる。
上記以外の修飾試薬の例として、５−ブロモニコチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BrNANHS）及び４−スルホフェニルイソチオシアネート（SPITC)も挙げられる。
上記以外の修飾試薬の例として、５−ブロモニコチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BrNANHS）及び４−スルホフェニルイソチオシアネート（SPITC)も挙げられる。
質量分析によるアミノ酸配列の同定を行うための解析の例としては、例えば、ＥＳＩ（Electrospray Ionization）法を利用した質量分析装置によるMS/MS解析、ＭＡＬＤＩ（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization）−ＴＯＦ（Time-Of-Flight）型質量分析装置によるＰＳＤ（Post-Source Decay）解析又はＣＩＤ（Collision-Induced Dissociation）解析、及びＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置によるＭＳ／ＭＳ以上の多段階解析が挙げられる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
実施例では、1D-PAGEにより精製した下記４種のタンパク質をそれぞれサンプルに用いた。
superoxide dismutase(SODC)
myoglobin(MYG)
carbonic anhydrase II(CAH2)
beta-lactalbumin(LACB)
superoxide dismutase(SODC)
myoglobin(MYG)
carbonic anhydrase II(CAH2)
beta-lactalbumin(LACB)
１レーンあたり10pmolのタンパク質を電気泳動した。切り取ったゲル片を定法により、塩酸トリス２−カルボキシエチルホスフィンを用いたSS結合の還元、及びヨードアセトアミドを用いたSH基のアルキル化を行った。その後、ゲル片を含水アセトニトリルで洗浄し、アセトニトリルで脱水した。SpeedVac（登録商標）でゲル片を乾燥させた後、ゲル片にＡｒｇＣ溶液（50mM NH4HCO3水溶液中100ng/mL）を加え（基質と酵素との重量比は１０：１）、３７℃で１２時間消化した。消化ペプチドを回収し、SpeedVacで乾燥し、0.1v/v%TFA水溶液に溶かしてZipTipC18で脱塩した。得られた消化ペプチドを再びSpeedVacで乾燥した後、50mM NH4HCO3水溶液(pH10.5)10μLに溶解し、消化ペプチド溶液を得た。
別途、ｍ−アミノフェニルボロン酸アガロースビーズ（Sigma）のサスペンジョン30μLをスピンダウンした後、上澄みを取り除き、水で洗浄を行った。
洗浄済みビーズに、上述の消化ペプチド溶液と、100mM２，３−ブタンジオン水溶液1μLとを加えて５０℃で一時間反応させた。上澄みの反応液を回収し、ビーズを洗浄液（50mM NH4OAc水溶液(pH10.5)、H2O及びMeCNの251:650:100（体積比）混合液中、4mMブチルアミン及び10mM２，３−ブタンジオン含む）を用いて洗浄した（２０μL×３回）。上澄みの反応液及びビーズ洗浄の溶出液を併せ、溶媒を除去し、Ｃ末端ペプチド断片を得た。得られたＣ末端ペプチド断片を質量分析装置AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所製）を用いて測定した。
洗浄済みビーズに、上述の消化ペプチド溶液と、100mM２，３−ブタンジオン水溶液1μLとを加えて５０℃で一時間反応させた。上澄みの反応液を回収し、ビーズを洗浄液（50mM NH4OAc水溶液(pH10.5)、H2O及びMeCNの251:650:100（体積比）混合液中、4mMブチルアミン及び10mM２，３−ブタンジオン含む）を用いて洗浄した（２０μL×３回）。上澄みの反応液及びビーズ洗浄の溶出液を併せ、溶媒を除去し、Ｃ末端ペプチド断片を得た。得られたＣ末端ペプチド断片を質量分析装置AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所製）を用いて測定した。
superoxide dismutase(SODC)及びmyoglobin(MYG)からそれぞれ得られたＣ末端ペプチド断片（C-terminal peptide）のスペクトルを、それぞれ図２（ａ）及び図２（ｂ）に示す。Carbonic anhydrase II(CAH2)及びbeta-lactalbumin(LACB)からそれぞれ得られたＣ末端ペプチド断片のスペクトルを、それぞれ図３（ｃ）及び図３（ｄ）に示す。なお、CHA2（図３（ｃ））のＣ末端ペプチド断片は、濃縮後スペクトル上でピークとして観測されなかったため、さらに、スクシンイミジルオキシカルボニルメチルトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（TMPP-Ac-OSu）によるTMPP化を行った後に測定した。
いずれの場合も、目的とするＣ末端ペプチドが好ましく濃縮されたことが確認された。
いずれの場合も、目的とするＣ末端ペプチドが好ましく濃縮されたことが確認された。
それぞれのＣ末端ペプチドの配列は、以下の通りである。
superoxide dismutase(SODC)由来：LACcamGVIGIAK（配列番号１；３番目のシステイン残基の側鎖はカルボキサミドメチル基を有する）
myoglobin(MYG)由来：NDIAAKYKELGFQG（配列番号２）
carbonic anhydrase II(CAH2)由来：TMPP-Ac-GFPK（配列番号３；１番目のグリシン残基のＮ末端は[トリス(2,4,6-トリメトキシフェニル)ホスホニオ]アセタト基を有する）
beta-lactalbumin(LACB)由来：LSFNPTQLEEQCcamHI（配列番号４；１２番目のシステイン残基の側鎖はカルボキサミドメチル基を有する）
superoxide dismutase(SODC)由来：LACcamGVIGIAK（配列番号１；３番目のシステイン残基の側鎖はカルボキサミドメチル基を有する）
myoglobin(MYG)由来：NDIAAKYKELGFQG（配列番号２）
carbonic anhydrase II(CAH2)由来：TMPP-Ac-GFPK（配列番号３；１番目のグリシン残基のＮ末端は[トリス(2,4,6-トリメトキシフェニル)ホスホニオ]アセタト基を有する）
beta-lactalbumin(LACB)由来：LSFNPTQLEEQCcamHI（配列番号４；１２番目のシステイン残基の側鎖はカルボキサミドメチル基を有する）
上述の４種のＣ末端ペプチドをMALDI-PSDにより解析して得られたスペクトルを、それぞれ、図４（ａ）、図４（ｂ）、図５（ｃ）及び図５（ｄ）に示す。これらのスペクトルから主なピークが帰属可能であり、アミノ酸配列を確認することができた。
Claims (9)
- タンパク質を、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いた消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、アルギニンへの結合能を有する固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。 - 前記アルギニンへの結合能を有する固相担体が、一般式−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２（Ｒ１は、二価の有機基である）で表される官能基を有するものであり、前記固相担体による前記ペプチド断片の捕捉を、一般式Ｒ２ＣＯＣＯＲ３（Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、同一又は異なっていてよい炭素数１〜８のアルキル基である）で表されるジケトン存在下で行う、請求項１のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
- 前記−Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２基が、−ＮＨ−mＣ６Ｈ４−Ｂ（ＯＨ）２で表される基である、請求項２のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
- 前記エンドプロテイナーゼがＡｒｇＣである、請求項１〜３のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
- 前記ＡｒｇＣがmouse submaxillary grand又はClostridium hystriticum由来の酵素である、請求項４のタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
- 前記タンパク質のＣ末端がリジン残基である、請求項１〜５のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
- 前記タンパク質のＮ末端アミノ基及び／又はＣ末端カルボキシル基がフリーであり、Ｎ末端修飾工程及びＣ末端修飾工程のいずれも行わない、請求項１〜６のいずれかのタンパク質のＣ末端ペプチドを濃縮する方法。
- 請求項１〜７のいずれかの方法によって、タンパク質からＣ末端ペプチド断片を濃縮する工程と、濃縮された前記Ｃ末端ペプチド断片を質量分析に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のＣ末端配列解析法。
- 前記質量分析に供される前に、電荷を有する求核基を有する化合物を用いて、前記濃縮されたペプチドの末端アミノ基の修飾が行われる、請求項８のタンパク質のＣ末端配列解析法。
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| JP2012140782A JP2014005221A (ja) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | タンパク質のｃ末端ペプチドを濃縮する方法及びタンパク質のｃ末端配列解析法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015178990A (ja) * | 2014-03-19 | 2015-10-08 | 株式会社島津製作所 | 質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法 |
-
2012
- 2012-06-22 JP JP2012140782A patent/JP2014005221A/ja active Pending
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