CN117417405B - 一种基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法及其在蛋白质检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法及其在蛋白质检测中的应用。所述方法包括：将含有酪氨酸的肽段与酪氨酸衍生化试剂混合，进行反应，得到标记后肽段；所述酪氨酸衍生化试剂含有具备酪氨酸反应活性的基团，以及带有正电荷或易于携带正电荷的碱性基团。本发明利用特定的酪氨酸衍生化试剂标记肽段，使得酪氨酸残基衍生化上带有正电荷或具有较高质子亲合能易于带上正电荷的碱性基团，提高肽段在质谱中的离子化和碎裂效率，显著提高其质谱鉴定灵敏度和谱图解析能力，实现对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效色谱分离和质谱鉴定，为提高质谱鉴定蛋白质的序列覆盖度提供重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于蛋白检测技术领域，涉及一种基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法及其在蛋白质检测中的应用。
背景技术
在后基因组学时代，蛋白质组学分析受到越来越广泛的关注。然而，蛋白质样品组成的极端复杂性、宽动态范围分布，使得其分析面临着巨大的挑战。以鸟枪法（Shotgun）为代表的自下而上（Bottom-Up）蛋白质样品预处理策略是复杂蛋白质样品分离鉴定最常采用的策略，这一策略首先将蛋白质样品经蛋白酶酶切，产生多肽混合物，经色谱分离后通过质谱进行多肽鉴定。可见，质谱技术是蛋白质组学研究必不可少的工具。
然而，基于质谱技术的肽段分析策略的主要缺陷在于不同的肽段的离子化程度具有显著的差异，其主要原因在于不同的肽段具有不同的氨基酸组成，分子量大小，带电荷状态以及亲疏水性的差异，使得不同肽段的质谱检测灵敏度具有显著的差异，特别是对于复杂蛋白质样品的分析。其中，疏水性强，难电离的肽段，特别是一些药物靶点蛋白质或生物标志物的酶切肽段的鉴定受到抑制，质谱检测仍旧存在较大的困难。因此，改进肽段的亲疏水性和质谱检测灵敏度具有重要的意义。
为了提高肽段的质谱离子化效率，近年来，通过化学衍生化技术在多肽中引入离子化标签的方法获得了广泛关注。Williams等合成了一系列的烷基化标签以改善半胱氨酸肽段的离子化效率（Journal of the American Chemical Society, 2008, 130: 2122-2123）。Vasicek等将季铵盐标签用于增强含半胱氨酸肽段在电子转移裂解质谱中的分析鉴定能力，实现了高可信度的蛋白质鉴定（Analytical Chemistry, 2009, 81, 7876-7884）。
酪氨酸（tyrosine，Tyr）是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，是人体的条件必需氨基酸，广泛存在于许多肽和蛋白质，例如肌红蛋白，重组人生长激素(r-hGH)和酪氨酸蛋白激酶中。芳香族氨基酸残基的氧化还原电位相似，C(sp2)-H功能化困难，鲜有提高含酪氨酸肽段质谱离子化效率的报道。CN108627647A公开了一种翻译后修饰蛋白质组学的检测和定量方法，对待检蛋白质样品及内标物进行等重串联质量标签标记，对标记后的混合物进行串联质谱分析，利用修饰标记试剂对所述初始蛋白或所述初始蛋白酶解后的肽段进行化学修饰，所述修饰标记试剂包括：酰化试剂、烷基化试剂、磷酸化试剂、糖基化试剂、泛素化试剂、硫酸化试剂、硒化试剂、腺苷酰化试剂、巯基亚硝基化、羟基化试剂和碘化试剂；可对含有待检测翻译后修饰肽段信号进行放大，从而在质谱灵敏度不变，且不需要对翻译后修饰肽段进行富集的情况下，提高翻译后修饰肽段被质谱检测并进行二级质谱分析的几率。
综上所述，开发新型的肽段标记方法，以便于进行色谱分离和质谱检测，对于蛋白质检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法及其在蛋白质检测中的应用，尤其涉及蛋白质在质谱检测中的应用。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法，所述方法包括：
将含有酪氨酸的肽段与酪氨酸衍生化试剂混合，进行反应，得到标记后的肽段；所述酪氨酸衍生化试剂含有具备酪氨酸反应活性的基团，以及带有正电荷或易于携带正电荷的碱性基团；所述酪氨酸衍生化试剂的结构式如式I所示。
式I
本发明中，利用特定的酪氨酸衍生化试剂标记肽段，使得酪氨酸残基衍生化上带有正电荷或具有较高质子亲合能易于带上正电荷的碱性基团，提高肽段在质谱中的离子化和碎裂效率，显著提高其质谱鉴定灵敏度和谱图解析能力，实现对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效色谱分离和质谱鉴定，为提高质谱鉴定蛋白质的序列覆盖度提供重要的技术支撑。
本发明中，所述含有酪氨酸的肽段中酪氨酸可位于肽段上的任意位置，如肽段的N端和/或C端。
可以理解，本发明中利用特定的酪氨酸衍生化试剂使得酪氨酸残基衍生化上带有正电荷或具有较高质子亲合能易于带上正电荷的碱性基团，实现降低肽段疏水性，提高肽段离子化效率，那么可以预期，能够实现与酪氨酸残基发生化学反应形成共价键的基团以及带有正电荷或具有较高质子亲合能易于带上正电荷的碱性基团均适用于本发明。
优选地，所述具备酪氨酸反应活性的基团包括与酪氨酸残基发生化学反应形成共价键的基团。
优选地，所述与酪氨酸残基发生化学反应形成共价键的基团选自1-甲基脲唑基团、脲唑基团、磺酰异氰酸酯基团或苯酚基团中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述带有正电荷或易于携带正电荷的碱性基团选自季铵盐、卟啉、氨基或胍基中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述酪氨酸衍生化试剂中具备酪氨酸反应活性的基团和带有正电荷或易于携带正电荷的碱性基团通过共价键连接。
优选地，所述酪氨酸的肽段和酪氨酸衍生化试剂的质量比为1:(0.0001~10000)，包括但不限于1:0.0002、1:0.0005、1:0.001、1:0.01、1:0.1、1:1、1:50、1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:7000、1:8000、或1:9000等等，肽段的浓度为0.0001 mg/mL~100mg/mL，包括但不限于0.0002 mg/mL、0.0003 mg/mL、0.0005 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005mg/mL、0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL、91 mg/mL、95 mg/mL、98 mg/mL或99 mg/mL等等。
优选地，所述反应的条件包括：反应温度为20~40℃（例如可以是21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或39℃），反应时间为1 min~72 h，包括但不限于2 min、3 min、4 min、10 min、20 min、50 min、1 h、2 h、4 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、20 h、25 h、30 h、35 h、40 h、50 h、60 h、65 h、68 h、69 h或70 h等等。
第二方面，本发明提供第一方面所述的基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法在蛋白质检测中的应用。
第三方面，本发明提供一种蛋白质质谱检测方法，所述方法包括：
对蛋白质样品进行预处理，利用蛋白酶对预处理后蛋白质样品进行酶切处理，得到肽段混合物，利用第一方面所述的基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法进行标记，得到标记后肽段混合物，对标记后肽段混合物进行质谱检测，获得蛋白质鉴定结果。
本发明中，首先通过自下而上的蛋白质样品预处理方法，使用特定的酪氨酸特异性蛋白酶将蛋白质酶切产生N端或C端是酪氨酸的肽段；同时使用特定的酪氨酸衍生化试剂，对产生的肽段进行酪氨酸衍生化反应，降低肽段疏水性，提高肽段离子化效率，利于实现对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效色谱分离和质谱鉴定，实验操作简单，仅需要在常规的蛋白质样品预处理流程中增加一步酪氨酸衍生化的步骤，即可以实现对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效色谱分离和质谱鉴定，提高质谱对疏水性强，难电离肽段的检测能力，为提高质谱鉴定蛋白质的序列覆盖度提供重要的技术支撑。
可以理解，本发明方法适用于不同来源的蛋白质如来自细胞、微生物、体液或血液，以及纯化的简单蛋白质或蛋白质复合物等等。
优选地，所述预处理的方法包括对蛋白质样品进行变性处理、还原处理和烷基化处理。
优选地，所述变性处理包括使用高温或高浓度的盐溶液处理。
优选地，所述还原处理使用的试剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐或二硫苏糖醇。
优选地，所述烷基化处理使用的试剂包括碘代乙酰胺。
优选地，所述蛋白酶包括酪氨酸特异性的蛋白酶或其他蛋白酶。
优选地，所述酪氨酸特异性的蛋白酶选自糜蛋白酶和/或胃蛋白酶等，其他蛋白酶选自如胰蛋白酶等。
优选地，所述质谱检测的方法包括液相色谱质谱联用。
优选地，所述获得蛋白质鉴定结果的方法包括对质谱检测数据进行数据检索和分析整理，对含有酪氨酸的肽段进行鉴定；进一步地，对酪氨酸衍生化肽段的保留时间和二级谱图与非酪氨酸衍生化的肽段进行对比分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明使用特定的酪氨酸衍生化试剂，能够使衍生化的肽段的疏水性显著降低，反相色谱分离肽段的保留时间左移，二级谱图中b离子或y离子的数目增加，肽段检测灵敏度提高，从而实现含有酪氨酸的疏水性肽段的高效色谱分离和质谱鉴定，提高质谱鉴定蛋白质的序列覆盖度，此外，实验操作步骤简单，只需在常规的蛋白质样品预处理流程的基础上，增加酪氨酸衍生化反应步骤。
附图说明
图1为酪氨酸衍生化标记肽段鉴定的实验流程图；
图2为酪氨酸衍生化试剂的合成路线图；
图3为糜蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图4为糜蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图5为胃蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图6为胃蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图7为胰蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图8为胰蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图9为糜蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图10为糜蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图11为胃蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图12为胃蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图13为胰蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图14为胰蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图15为糜蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图16为糜蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图17为胃蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图18为胃蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图19为胰蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图20为胰蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图21为糜蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图22为糜蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图23为胃蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图24为胃蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图；
图25为胰蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的反相色谱分离保留时间分布对比图；
图26为胰蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例对糜蛋白酶酶切的牛血清白蛋白的氨基酸序列组成进行鉴定，实验流程如图1所示。
（1）蛋白质变性、还原：牛血清白蛋白，0.5 μg/μL，100 μL（1×PBS），加入终浓度10mM的二硫苏糖醇，置于95℃反应15 min。
（2）蛋白质烷基化：向步骤（1）反应后体系中加入20 μL 0.5 M的IAA，25℃避光反应30 min。
（3）丙酮沉淀蛋白质：向步骤（1）反应后体系中加入1 mL于-20℃预冷的丙酮沉淀蛋白，置于-20℃沉淀2 h；于4℃，20000 g离心20 min，去除上清，抽干蛋白表面残留的溶液。
（4）沉淀蛋白质复溶：向蛋白沉淀中加入10 μL 4 M urea，90 μL H2O，于37℃孵育10 min。
（5）蛋白质酶切：使用糜蛋白酶酶切样品，向步骤（4）得到体系中加入295 μL 50mM 碳酸氢铵水溶液和5 μg 糜蛋白酶，置于37℃反应过夜。
（6）酪氨酸衍生化：向步骤（5）获得的酶切肽段中加入3 mL 100 mM PB，采用脲唑基团作为酪氨酸反应特异性基团，氨基作为具有较高质子亲合能易于带上正电荷的碱性基团的酪氨酸衍生化试剂（图2为所用酪氨酸衍生化试剂的合成路线图），于25℃，1 V反应4h，磁力搅拌，正极为玻碳电极，负极为铂丝电极。
（7）获得肽段样品：16000 g离心30 min，取上清，即为肽段样品。
（8）质谱鉴定：使用Orbitrap Eclipse质谱仪，HCD的质谱采集模式。
（9）将得到的质谱数据使用pFind3软件进行检索，获取肽段的色谱保留时间和二级质谱图。
此外，参照上述检测流程，仅取消酪氨酸衍生化的步骤对相同蛋白进行检测，作为对照。
图3为糜蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图4为糜蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例2
本实施例与实施例1区别仅在于步骤（5）蛋白质酶切：使用胃蛋白酶酶切样品，加入215 μL H2O，16 μL 1M HCl，5 μg胃蛋白酶，37℃反应60 min，95℃反应3 min，终止酶切。其余与实施例1相同。
图5为胃蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图6为胃蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例3
本实施例与实施例1区别仅在于步骤（5）蛋白质酶切：使用胰蛋白酶酶切样品。其余与实施例1相同。
图7为胰蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图8为胰蛋白酶酶切的牛血清白蛋白酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例4
本实施例与实施例1区别仅在于步骤（1）处理的蛋白为贝伐珠单抗。其余与实施例1相同。
图9为糜蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图10为糜蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例5
本实施例与实施例1区别在于步骤（1）处理的蛋白为贝伐珠单抗和步骤（5）蛋白质酶切：使用胃蛋白酶酶切样品，加入215 μL H2O，16 μL 1M HCl，5 μg胃蛋白酶，37℃反应60min，95℃反应3 min，终止酶切。其余与实施例1相同。
图11为胃蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图12为胃蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例6
本实施例与实施例1区别在于步骤（1）处理的蛋白为贝伐珠单抗和步骤（5）蛋白质酶切：使用胰蛋白酶酶切样品。其余与实施例1相同。
图13为胰蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图14为胰蛋白酶酶切的贝伐珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例7
本实施例与实施例1区别仅在于步骤（1）处理的蛋白为曲妥珠单抗。其余与实施例1相同。
图15为糜蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图16为糜蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例8
本实施例与实施例1区别在于步骤（1）处理的蛋白为曲妥珠单抗和步骤（5）蛋白质酶切：使用胃蛋白酶酶切样品，加入215 μL H2O，16 μL 1M HCl，5 μg胃蛋白酶，37℃反应60min，95℃反应3 min，终止酶切。其余与实施例1相同。
图17为胃蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图18为胃蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例9
本实施例与实施例1区别在于步骤（1）处理的蛋白为曲妥珠单抗和步骤（5）蛋白质酶切：使用胰蛋白酶酶切样品。其余与实施例1相同。
图19为胰蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图20为胰蛋白酶酶切的曲妥珠单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例10
本实施例与实施例1区别仅在于步骤（1）处理的蛋白为利妥昔单抗。其余与实施例1相同。
图21为糜蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图22为糜蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例11
本实施例与实施例1区别在于步骤（1）处理的蛋白为利妥昔单抗和步骤（5）蛋白质酶切：使用胃蛋白酶酶切样品，加入215 μL H2O，16 μL 1M HCl，5 μg胃蛋白酶，37℃反应60min，95℃反应3 min，终止酶切。其余与实施例1相同。
图23为胃蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图24为胃蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
实施例12
本实施例与实施例1区别在于步骤（1）处理的蛋白为利妥昔单抗和步骤（5）蛋白质酶切：使用胰蛋白酶酶切样品。其余与实施例1相同。
图25为胰蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段（Ymod）和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段（noYmod）的反相色谱分离保留时间分布图，图26为胰蛋白酶酶切的利妥昔单抗酪氨酸衍生化肽段和相同氨基酸序列组成的非酪氨酸衍生化肽段的二级质谱图，上述数据结果表明，通过使用酪氨酸衍生化试剂标记肽段，可以显著降低肽段的疏水性，色谱保留时间左移；肽段的离子化效率提高，碎片离子增多，实现了对含有酪氨酸的疏水性肽段的高效鉴定。
综上所述，本发明使用特定的酪氨酸衍生化试剂，能够使衍生化的肽段，疏水性显著降低，反相色谱分离肽段的保留时间左移，二级谱图中b离子或y离子的数目增加，肽段检测灵敏度提高，从而实现含有酪氨酸的疏水性肽段的高效色谱分离和质谱鉴定，提高质谱鉴定蛋白质的序列覆盖度，此外，实验操作步骤简单，只需在常规的蛋白质样品预处理流程的基础上，增加酪氨酸衍生化反应步骤。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (6)
1.一种以非疾病诊断为目的的基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法，其特征在于，所述方法包括：
将含有酪氨酸的肽段与酪氨酸衍生化试剂混合，进行反应，得到标记后的肽段；
所述酪氨酸衍生化试剂含有具备酪氨酸反应活性的基团，以及带有正电荷或易于携带正电荷的碱性基团；
所述酪氨酸衍生化试剂的结构式如式I所示；式I。
2.权利要求1所述的基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法在以非疾病诊断为目的的蛋白质检测中的应用。
3.一种以非疾病诊断为目的的蛋白质质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括：
对蛋白质样品进行预处理，利用蛋白酶对预处理后蛋白质样品进行酶切处理，得到肽段混合物，利用权利要求1所述的基于酪氨酸衍生化的肽段标记方法进行标记，得到标记后肽段混合物，对标记后肽段混合物进行质谱检测，获得蛋白质鉴定结果。
4.根据权利要求3所述的以非疾病诊断为目的的蛋白质质谱检测方法，其特征在于，所述预处理的方法包括对蛋白质样品进行变性处理、还原处理和烷基化处理。
5.根据权利要求3所述的以非疾病诊断为目的的蛋白质质谱检测方法，其特征在于，所述蛋白酶包括酪氨酸特异性的蛋白酶或胰蛋白酶；
所述酪氨酸特异性的蛋白酶选自糜蛋白酶和/或胃蛋白酶。
6.根据权利要求3所述的以非疾病诊断为目的的蛋白质质谱检测方法，其特征在于，所述质谱检测的方法包括液相色谱质谱联用；
所述获得蛋白质鉴定结果的方法包括对质谱检测数据进行数据检索和分析整理，对含有酪氨酸的肽段进行鉴定。
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