CN107384998A - 一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质c-端富集方法 - Google Patents

一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质c-端富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C‑端富集方法，包括：封闭蛋白质自由羧基、蛋白质碱性位点酶切、离子交换色谱分离、肽段羧基端碱性氨基酸剪切。蛋白质样品首先在蛋白质水平上封闭C末端及侧链的自由羧基，然后对蛋白的碱性位点进行酶切以产生羧基端为碱性氨基酸的中间肽段，并采用离子交换色谱对酶切产物进行分级得到多个级分，最后对中间肽段羧基端的碱性氨基酸进行剪切，并将每个级分进行二次离子交换色谱分离以排除保留时间发生偏移的中间肽段，获得蛋白质的C端肽段。本发明的优点是酶切效率高、去除效率高、富集效率高、可采用多种酶酶切、提高了C端鉴定的覆盖度。

Description

一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C-端富集方法
技术领域
本发明涉及蛋白质C-端富集方法，即一种羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C-端富集方法，以实现蛋白C-端的高效高选择性富集。
背景技术
蛋白质C末端的修饰与剪切是生物体内常见的翻译后修饰之一，与蛋白质的活性、定位及复合物形成等过程相关。此外，生物体内蛋白的降解促使蛋白产生新的C末端，此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。但是，生物样品中蛋白组分复杂，并且含量的动态分布范围宽，而Bottom-up策略使样品的复杂性进一步增加。因此，发展蛋白质C末端肽段的富集方法以提高C末端肽段鉴定的覆盖度，对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都起到重要作用。
蛋白质末端的富集分为正向富集与反向富集。Guoqiang Xu等(ACS Chemical Biology 2011,6,1015–1020)报道了一种对C-末端肽进行正向富集的方法。利用羧肽酶Y在pH 11.6时转肽酶的活性，在蛋白质C-末端特异性的标记上一个带有生物素的氨基化合物，经酶切后，采用生物素-抗生素亲和作用对C-末端肽进行亲和富集。OliverSchilling等(Nature Methods 2010,7,508-511)采用乙醇胺在酶解前对末端和侧链羧基进行封闭后，进行酶切，随后采用带有多个氨基的聚合物链与羧基的共价键合去除中间肽段，实现了蛋白质C端肽段的反相富集。根据C-末端与非C-末端所带电荷的差异，还可以采用强阳离子交换色谱富集不含碱性氨基酸的C-末端肽(Journal of ProteomeResearch 2007,6,4634–4645)。但是这些富集方法存在化学反应效率低，存在难以控制的副反应，过程繁琐耗时，特异性不足等缺点。
为克服以上方法所存在的问题，建立一种高效的富集方法，我们选择了高效率高选择性的酶促方法替代化学标记，并且结合离子交换色谱实现中间肽段的高效去除，提高C末端肽段富集的选择性和效率。
发明内容
本发明发展了一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C-端富集方法，反应效率高，选择性高，富集效率高。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1)采用羧基活性试剂封闭蛋白质上C端以及侧链的自由羧基
将蛋白质按照参考文献(Analytical Chemistry 2015,87,10354-10361)进行变性、还原、烷基化后，将溶液转移至3000-10000Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用pH为3-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于pH为3-10的缓冲液中，加入终浓度10-500mM的羧基活化试剂，以及终浓度10-4000mM的羧基活性试剂，反应1-48h后，离心去除溶剂并采用pH为6-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于pH为6-10的缓冲液中，得到溶液A；
羧基活化试剂由脱水剂和稳定剂组成，脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，N,N′-二异丙基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺中的一种或二种以上，稳定剂为N-羟基苯并三氮唑，N-羟基琥珀酰亚胺，五氟苯酯，N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑中的一种或二种以上，质量比例为1:0.5-1:5；
羧基活性试剂含有伯胺基团，且分子量为30-300Da；
缓冲液由磷酸二氢纳，碳酸氢纳，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，三乙二胺碳酸盐，2-(N-吗啡啉)乙磺酸，磷酸氢二纳中的一种或二种以上配置而成，浓度为10-500mM；
2)采用酶切位点为精氨酸或赖氨酸羧基端的蛋白水解酶酶解蛋白质
于溶液A中加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/5-1/50，25-45℃酶解2-48h，酶解完成后将超滤膜进行离心，离心液为溶液B；
蛋白水解酶为胰蛋白酶，蛋白内切酶Lys-C，蛋白内肽酶Arg-C中的一种或二种以上。
3)采用强阳离子交换色谱分离肽段
将溶液B按照文献(Analytical Chemistry 2015,87,10354-10361)除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到强阳离子交换柱上进行分离，分离梯度为：0％A相-100％B相线性分离40-100min，流速为0.1-3mL/min，按照2-10min的时间窗口收集4-50个级分，分别冻干，除盐，重溶于10-100mM碳酸氢铵溶液，得到溶液C；
按体积百分浓度计，A相：5-30％乙腈+5-10mM pH 2-4磷酸二氢纳缓冲液；B相：5％-30％乙腈+200-1000mM pH 2-4磷酸二氢纳缓冲液；
强阳离子交换色谱柱为磺酸基阳离子交换柱和磷酸基阳离子交换柱中的一种或二种以上；
色谱柱内径为1-8mm，长度为5-30cm。
4)采用羧肽酶B特异性剪切肽段羧基端精氨酸和赖氨酸后二次强阳离子交换色谱分离
往溶液C中分别加入羧肽酶B，酶用量为肽段质量的1/5-1/100，25-45℃酶解0.5-12h后，将溶液冻干，并将每个级分重溶于A相，并分别进行第二次强阳离子交换分离，分离条件同步骤3)所述，收集原时间窗口内的级分，例如级分1在第一次分离时的时间窗口为10-14min，那么在对级分1进行第二次分离时同样收集10-14min内的级分，其他时间的级分不收集，同样的在级分2进行第二次分离时仅收集14-18min内的级分，以此类推，得到4-50个级分，分别除盐，冻干。
本发明的有益效果为：
1、羧肽酶酶切效率高，选择性好；
2、强阳离子交换色谱的分离能力强，促进中间肽段的高效去除；
3、可使用多种酶酶切，提高了C端肽段的鉴定覆盖度；
4、对不同性质的C末端肽段无歧视，避免C端肽段的损失；
本发明的优点是酶切效率高、去除效率高、富集效率高、可采用多种酶酶切、提高了C端鉴定的覆盖度。
附图说明
图1蛋白质N-末端富集流程；
图2结尾为K肽段(AVGNHLK)羧肽酶B酶切前(a)后(b)质谱峰；
图3结尾为R肽段(APNHAVVR)羧肽酶B酶切前(a)后(b)质谱峰；
图4结尾为K肽段羧肽酶B酶切前后强阳离子交换色谱峰(a)；结尾为R肽段羧肽酶B酶切前后强阳离子交换色谱峰(b)；
图5大肠杆菌样品级分5-级分8羧肽酶B酶切前后强阳离子交换色谱峰。
图6大肠杆菌样品分别采用胰蛋白酶和蛋白内切酶Lys-C进行酶切所富集到的C端肽段的维恩图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，蛋白质样品首先在蛋白质水平上封闭C末端及侧链的自由羧基，然后对蛋白的碱性位点进行酶切以产生羧基端为碱性氨基酸的中间肽段，并采用离子交换色谱对酶切产物进行分级得到多个级分，最后对中间肽段羧基端的碱性氨基酸进行剪切，并将每个级分进行二次离子交换色谱分离以排除保留时间发生偏移的中间肽段，获得蛋白质的C端肽段
以结尾为K的肽段AVGNHLK为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/5，温度为37℃，酶解30min后，进行质谱分析，如图2所示，肽段羧基端的赖氨酸得到了高效高选择性的剪切。
实施例2
以结尾为K的肽段AVGNHLK为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/10，温度为37℃，酶解30min后，进行质谱分析，同样的肽段羧基端的赖氨酸得到了高效高选择性的剪切。
实施例3
以结尾为K的肽段AVGNHLK为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/10，温度为37℃，酶解45min后，进行质谱分析，同样的肽段羧基端的赖氨酸得到了高效高选择性的剪切。
实施例4
以结尾为K的肽段AVGNHLK为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/10，温度为37℃，酶解60min后，进行质谱分析，同样的肽段羧基端的赖氨酸得到了高效高选择性的剪切。
实施例5
以结尾为R的肽段APNHAVVR为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/10，温度为37℃，酶解30min后，进行质谱分析，如图3所示，肽段羧基端的精氨酸得到了高效高选择性的剪切。
实施例6
以结尾为K的肽段AVGNHLK为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/10，温度为37℃，酶解30min后，冻干，重溶于A相，上样到磺酸基离子交换柱(4.6mmi.d×15cm)进行线性分离，分离梯度：10-60min 0％A-60％B，流速为0.5mL/min。A相：25％乙腈+10mM pH 3磷酸二氢钠缓冲液，B相：25％乙腈+700mM pH 3磷酸二氢钠缓冲液，将未酶切的肽段AVGNHLK溶于A相，按照上述的分离条件进行分离，如图4(a)所示，肽段羧基端的赖氨酸被剪切后，其在强阳离子交换上的保留发生了较大的偏移。
实施例7
以结尾为R的肽段APNHAVVR为样品，溶于50mM碳酸氢铵，采用羧肽酶B酶切，其中酶用量为样品质量的1/5，温度为37℃，酶解45min后，冻干，重溶于A相，上样到磺酸基阳离子交换柱(4.6mm i.d×15cm)进行线性分离，分离梯度：10-60min 0％A-60％B，流速为0.5mL/min。A相：25％乙腈+10mM pH 3磷酸二氢钠缓冲液，B相：25％乙腈+700mM pH 3磷酸二氢钠缓冲液，将未酶切的肽段APNHAVVR溶于A相，按照上述的分离条件进行分离，如图4(b)所示，肽段羧基端的精氨酸被剪切后，其在强阳离子交换上的保留发生了较大的偏移。
实施例8
以大肠杆菌细胞为样品，将提取蛋白质按照参考文献(AnalyticalChemistry 2015,87,10354-10361)进行变性、还原、烷基化后，将溶液转移至10 000Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用250mM pH 5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于250mMpH 5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，加入终浓度100mM的羧基活化试剂，以及终浓度1000mM的羧基活性试剂，反应3h后，离心去除溶剂并采用100mM pH为8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于100mM pH为8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，加入胰蛋白酶在超滤膜上进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50，温度为37℃，酶解12h。将超滤膜进行离心，得到的滤液即为蛋白酶解产物。将溶液按照文献(Analytical Chemistry 2015,87,10354-10361)除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到磺酸基阳离子交换柱(4.6mm i.d×15cm)上进行线性分离，分离梯度为：10-70min：0％A相-70％B相，流速为0.5mL/min，A相：25％乙腈+10mM pH 2.7磷酸二氢钠缓冲液，B相：25％乙腈+700mM pH 2.7磷酸二氢钠缓冲液。按照6min的时间窗口收集10个级分，分别冻干，除盐，重溶于50mM碳酸氢铵溶液。
往溶液中分别加入羧肽酶B，酶用量为肽段质量的1/10，25℃酶解1h后，将溶液冻干，并将每个级分重溶于A相，并分别进行第二次强阳离子交换分离，分离条件同上所述，收集原时间窗口内的级分，例如级分1在第一次分离时的时间窗口为10-16min，那么在对级分1进行第二次分离时同样收集10-16min内的级分，其他时间的级分不收集，同样的在级分2进行第二次分离时仅收集16-22min内的级分，以此类推，得到10个级分，分别除盐，冻干。如图5所示，羧肽酶酶切后，每个级分在强阳离子交换上的保留都发生了向前的偏移，原位置的肽段的紫外响应大大降低，说明了高效的中间肽段去除效率。
实施例9
以大肠杆菌细胞为样品，将提取蛋白质按照参考文献(AnalyticalChemistry 2015,87,10354-10361)进行变性、还原、烷基化后，将溶液转移至10000Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用250mM pH 5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于250mMpH 5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，加入终浓度100mM的羧基活化试剂，以及终浓度1000mM的羧基活性试剂，反应3h后，离心去除溶剂并采用100mM pH为8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于100mM pH为8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，加入蛋白内切酶Lys-C在超滤膜上进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50，温度为37℃，酶解12h。将超滤膜进行离心，得到的滤液即为蛋白酶解产物。将溶液按照文献(Analytical Chemistry 2015,87,10354-10361)除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到磺酸基阳离子交换柱(4.6mm i.d×15cm)上进行线性分离，分离梯度为：10-70min：0％A相-70％B相，流速为0.5mL/min，A相：25％乙腈+10mMpH 2.7磷酸二氢钠缓冲液，B相：25％乙腈+700mM pH 2.7磷酸二氢钠缓冲液。按照6min的时间窗口收集10个级分，分别冻干，除盐，重溶于50mM碳酸氢铵溶液。往溶液中分别加入羧肽酶B，酶用量为肽段质量的1/10，25℃酶解1h后，将溶液冻干，并将每个级分重溶于A相，并分别进行第二次强阳离子交换分离，分离条件同上所述，收集原时间窗口内的级分，例如级分1在第一次分离时的时间窗口为10-16min，那么在对级分1进行第二次分离时同样收集10-16min内的级分，其他时间的级分不收集，同样的在级分2进行第二次分离时仅收集16-22min内的级分，以此类推，得到10个级分，分别除盐，冻干，进行质谱分析。如图6所示，采用不同酶酶切进行互补，得到了适合质谱鉴定的C末端肽段，提高了C末端鉴定的覆盖度。

Claims (8)

1.一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C端富集方法，包括：
1)封闭蛋白质上的自由羧基：采用羧基活性试剂封闭蛋白质上C端以及侧链的自由羧基；
2)蛋白质碱性位点酶切：采用酶切位点为精氨酸或赖氨酸羧基端的蛋白水解酶酶解蛋白质；
3)强阳离子交换色谱分离：采用强阳离子交换色谱分离肽段；
4)羧肽酶剪切肽段羧基端碱性氨基酸后二次强阳离子交换色谱分离：采用羧肽酶B特异性剪切肽段羧基端精氨酸和赖氨酸后二次强阳离子交换色谱分离。
2.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：
1)所述的羧基活性试剂封闭蛋白质自由羧基，具体步骤如下：
将蛋白质进行变性、还原、烷基化后，将溶液转移至3000-10 000Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用pH为3-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于pH为3-10的缓冲液中，加入终浓度10-500mM的羧基活化试剂，以及终浓度10-4000mM的羧基活性试剂，反应1-48h后，离心去除溶剂并采用pH为6-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于pH为6-10的缓冲液中，得到溶液A；
2)所述的蛋白质碱性位点酶切，具体步骤如下：
于所述的溶液A中加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100，酶解时间为2-48h，酶解温度25-45℃，酶解完成后将超滤膜进行离心，离心液为溶液B；
3)所述的阳离子交换色谱分离肽段，具体步骤如下：
将溶液B除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到强阳离子交换柱上进行分离，分离梯度为：0％A相-100％B相线性分离40-100min，流速为0.1-3mL/min，按照2-10min的时间窗口收集4-50个级分，分别冻干，除盐，重溶于10-100mM碳酸氢铵溶液，得到溶液C；
按体积百分浓度计，A相：5-30％乙腈+5-10mM pH 2-4磷酸二氢纳缓冲液；B相：5％-30％乙腈+200-1000mM pH 2-4磷酸二氢纳缓冲液；
4)所述的肽段羧基端碱性氨基酸剪切后二次强阳离子交换色谱分离，具体步骤如下：
往溶液C中分别加入羧肽酶B，酶用量为肽段质量的1/5-1/50，酶解时间为0.5-12h，酶解温度25-45℃，酶解后，将溶液冻干，并将每个级分重溶于A相，并分别进行第二次强阳离子交换分离，分离条件同步骤3)所述，收集原时间窗口内的级分，例如级分1在第一次分离时的时间窗口为10-14min，那么在对级分1进行第二次分离时同样收集10-14min内的级分，其他时间的级分不收集，同样的在级分2进行第二次分离时仅收集14-18min内的级分，以此类推，得到4-50个级分，分别除盐，冻干。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的羧基活性试剂，其含有伯胺基团，且分子量为30-300Da。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：蛋白水解酶为胰蛋白酶，蛋白内切酶Lys-C，蛋白内肽酶Arg-C中的一种或二种以上。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的强阳离子交换色谱柱为磺酸基阳离子交换柱和磷酸基阳离子交换柱中的一种或二种；色谱柱内径为1-8mm，长度为5-30cm。
6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的缓冲液由磷酸二氢纳，碳酸氢纳，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，三乙二胺碳酸盐，2-(N-吗啡啉)乙磺酸，磷酸氢二纳中的一种或二种以上配置而成；缓冲液浓度为10-500mM。
7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的羧基活化试剂由脱水剂和稳定剂组成，脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，N,N′-二异丙基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺中的一种或二种以上，稳定剂为N-羟基苯并三氮唑，N-羟基琥珀酰亚胺，五氟苯酯，N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑中的一种或二种以上，质量比例为1:0.5-1:5。
8.按照权利要求1所述的方法，其可应用于生物样品中蛋白C-端的测序，蛋白异构体的鉴定，蛋白剪切加工的鉴定，以及水解酶水解底物及位点的鉴定中的任意一种或二种以上的操作过程中；生物样品为细胞、组织、体液中的一种或二种以上。
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