KR101711953B1 - 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈청을 포함한 체액 및 조직에서 유래된 당단백질 시료 또는 당단백질, 항체 의약품에서 당사슬 추출시 시료가 대용량일 경우 높은 재현성을 보장하면서 기존의 방법보다 고속으로 당사슬을 추출하는 자동화 시스템에 관한 것이다.

Description

고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템 {Rapid, high-throughput automated glycan sample preparation system}
본 발명은 혈청을 포함한 체액 및 조직에서 유래된 당단백질 시료 또는 항체 및 EPO(Erythropoietin)와 같은 당단백질 의약품에서 당사슬 추출시 시료가 대용량일 경우 높은 재현성을 보장하면서 기존의 방법보다 고속으로 당사슬을 추출하는 자동화 시스템에 관한 것이다.
당쇄화는 가장 널리 알려진 번역 후 변형 (PTM, post-translational modification) 과정으로 단백질의 기능에 크게 관여하고 있으며, 체내 단백질의 약 50% 이상은 당쇄화된 단백질인 당단백질로 이루어져 있다. 혈액, 침, 눈물 등의 체액은 물론 대부분의 생체 조직에도 당단백질이 존재한다. 당쇄화의 결과물인 당사슬은 체내·외의 환경 변화에 매우 민감하여 암을 포함한 여러 종류의 질병에 대한 바이오마커로 활용되고 있다. 또한, 바이오 의약품에서 당사슬은 의약품의 체내 지속시간 및 약효에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
당사슬의 한 종류인 N-당사슬은 2개의 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)과 세 개의 만노스로 이루어진 구조가 기본 코어가 되어 이 코어를 바탕으로 어떤 종류와 개수의 단당류가 결합하는가에 따라서 크게 세 가지 클래스로 분류된다. 고만노스형(High mannose) N-당사슬은 코어에 만노스만 더해진 구조이며, 복합형(complex) N-당사슬은 만노스 외의 단당류들 즉, N-아세틸헥소사민(N-acetyl hexosamine), 퓨코스, 갈락토스 및 시알산(sialic acid) 중 1종 이상이 결합한 구조이다. 하이브리드형은 코어를 중심으로 한쪽 가지는 만노스가, 다른 한쪽 가지는 복합형에 해당하는 단당류가 붙어있는 구조를 말한다.
N-당사슬 분석을 위해서는 단백질에서 당사슬만을 잘라내어 분리하는 당사슬 분리 단계와 분리된 당사슬을 추출 및 농축하는 당사슬 정제의 2단계 전처리 과정을 거치게 된다.
당사슬 분리 단계는 N-당사슬의 경우 아스파라진(asparagine)에 붙어있고 이를 선택적으로 잘라내는 PNGase F 효소를 사용한다. 이 효소처리 과정은 약 16~18시간의 과정을 요구하므로 시료의 처리에 소요되는 시간 중 가장 많은 부분을 차지한다.
당사슬 정제 과정은 일반적으로 고체상 추출법 (solid phase extraction, SPE)을 이용한다. 고체상 추출법은 추출하고자 하는 혼합물을 극성, 친수성, 산·염기성을 비롯한 화학적·물리적 친화도에 따라 분리하는 방법으로, 당사슬이 분리된 혼합 시료상태에서는 용액 내에 시료에서 유래하거나 단백질 변성 과정에서 사용된 염이 다량 존재하므로 고체상 추출법을 이용하여 염과 남아있는 단백질을 제거하고 당사슬만을 분리·정제한다.
당사슬 분석실험에서는 시험대상 시료의 양이 적을수록 분석시 재현성과 감도가 낮고, 질병 마커 역시 정확히 나타나지 않을 가능성이 크다. 또한, 당사슬을 분리하기 위한 효소처리 단계는 N-당사슬 시료 준비에서 가장 긴 시간인 16~18시간이 소요된다. 뿐만 아니라, 실험자가 직접 수행하는 고체상 추출법의 경우 시료의 수가 많아질수록 많은 시간이 소요되며 높은 재현성을 보장하기 어렵고, 다량의 시료를 두 명 이상의 실험자가 처리하는 경우에도 역시 재현성을 보장하기 힘들어진다. 또한, 시료의 효소처리 이전에 시행되는 단백질 변성 과정은 대량의 시료의 경우 반복 실험 동안 발생할 수 있는 피펫팅의 오차나 장시간 실험으로 인한 실험자의 실수 등으로 인하여 실험방법에 차이가 생기거나, 두 명 이상의 실험자가 과정을 진행할 경우 개인차에 따라 발생하는 오차로 인하여 재현성을 잃을 수 있다. 상기와 같은 종래 기술의 한계로 인하여 고속 대용량 자동화 시료 전처리 시스템의 구축 및 최적화는 다양한 배치의 생산품을 분석해야 하는 바이오 의약품 산업에서의 당사슬의 특성분석 분야와 당사슬 질병 표지자 발굴 및 실제 임상 진단을 위한 연구적 측면 모두에서 지속적으로 그 필요성이 커지고 있다.
상기 종래 당사슬 분석용 시료 전처리의 문제점을 해결하고, 단시간 내에 적은 양의 시료로 재현성을 높이고, 다량의 시료 처리도 가능한 당사슬 분석용 시료 전처리 시스템을 제공하려는 것이 본 발명의 목표이다.
본 발명의 특징을 살펴본다.
(1) 24웰 시료 처리 플랫폼
본 발명의 24웰 플랫폼에서는 현재 혈청 당사슬 분석에 사용되는 시료의 양 (50~100㎕)보다 적은 양 (25㎕)의 시료를 사용하여 당사슬 프로파일링 및 상대적 정량 분석을 수행하여 충분한 재현성을 확보하였으며, 난소암 바이오마커를 발굴하였다.
본 발명의 24웰 플랫폼은 종래에 16~18시간이 필요하던 효소처리 단계를 10분 내외로 단축하였다.
본 발명의 24웰 플랫폼은 주사기펌프 (syringe pump)를 사용한 수동 방법이나 진공 매니폴드 (vacuum manifold)를 사용한 기존의 처리방법에서 사용하던 흑연화 탄소 카트리지 (Graphitized carbon cartridge)와 동일한 카트리지를 사용하였다.
실험자가 직접 수행하는 고체상 추출법의 경우 시료의 수가 많아질수록 많은 시간이 걸리며 높은 재현성을 보장하기 어렵고, 다량의 시료를 두 명 이상의 실험자가 처리할 경우에도 역시 재현성을 보장하기 힘들어지는 반면, 본 발명에서는 액체시료 취급시스템(liquid handler system)을 이용하여 고체상 추출 과정 전체를 자동화하여 모든 시료에 대하여 동일한 실험 과정을 적용함으로써 재현성을 높이고 시료 준비과정에 필요한 노동력과 시간을 현저히 감소시켰다.
(2) 96웰 시료 처리 플랫폼
본 발명자들은 24웰 플랫폼의 기본적인 장점은 유지한 상태로 처리 시료의 수를 증가시킨 96웰 시료 처리 플랫폼을 개발하여 다른 종류의 액체시료 취급시스템(liquid handler system)에 적용하였다.
또한 96웰 플랫폼의 경우 시료 수의 증가로 기존에 사용하던 흑연화 탄소 카트리지 (Graphitized carbon cartridge)와는 다른 웰 형태의 새로운 흑연화 탄소 카트리지 플레이트를 사용하였다. 따라서 기존의 고체상 추출 과정을 기반으로 96웰 플랫폼에 적합하도록 새롭게 프로토콜을 작성하였고, 추가로 24웰 플랫폼에서 수동으로 이루어졌던 단백질 변성 과정을 자동화하였다.
96웰 플랫폼의 경우 시료의 양을 더 적게 (15㎕) 사용하여 당사슬 프로파일링을 실시하여 충분한 재현성을 확보하였다.
종래 방법에 의하면 시료의 효소처리 이전에 시행되는 단백질 변성 과정은 대량의 시료의 경우 반복 실험 동안 발생할 수 있는 피펫팅의 오차나 장시간 실험으로 인한 실험자의 실수 등으로 인하여 실험방법에 차이가 생기거나, 두 명 이상의 실험자가 과정을 진행할 경우 개인차에 따라 발생하는 오차로 인하여 재현성을 잃을 수 있으나, 본 발명의 96웰 플랫폼에서는 단백질 변성 과정 또한 자동화함으로써 대량 시료에서 발생할 수 있는 재현성 감소를 최소화하였다.
본 발명은 혈청 시료를 준비하는 단계; 혈청 시료 내의 단백질 변성 단계; 단백질 변성 처리한 시료에 PNGase F 효소를 처리하여 단백질로부터 N-당사슬을 절단하는 단계; 에탄올을 가하여 단백질을 침전시키고 상층액의 N-당사슬을 분리하는 단계; 및 분리한 N-당사슬을 농축 및 정제하는 단계;를 포함하는 N-당사슬 시료 전처리 방법을 수행함에 있어서,
상기 혈청 시료 준비 단계는 20개 이상의 시료를 단일 배치(batch) 상에 나열하며, 각 시료는 15~30㎕를 취하며,
상기 단백질 변성 단계는 시료가 든 용기를 70~90℃의 액체와 상온의 액체에 10~20초씩 번갈아 넣어 1분 30초~5분 동안 수행하거나, 시료가 든 용기를 가열 랙에 넣고 온도를 70~90℃ 내에서 1분~2분 동안 처리하고 상온으로 식히며,
상기 PNGase F 효소처리 단계는 상기 단백질 변성 처리한 시료에 효소를 가한 후 마이크로웨이브 반응기에서 30~38℃ 온도로 5~20분 동안 수행하며,
상기 분리한 N-당사슬 농축 및 정제는 액체시료 취급 시스템(liquid handling system)을 이용하여 흑연화 탄소 카트리지를 이용한 고체상 추출법으로 수행하되 세척, 시료 로딩, 탈염, 용출과정은 150~400mbar의 압력을 가하여 수행함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 시스템에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 혈청 시료 준비 단계가 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트를 이용하여 하나의 배치를 형성함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 시스템에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 변성 단계가 액체시료 취급 시스템(Liquid handling system) 내의 가열 랙(heating rack)을 이용하여 수행함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 시스템에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 고체상 추출법 수행시 20% 및 40% 아세토나이트릴의 2개 분획을 이용함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템을 이용하면 당사슬 변이와 관련 있는 질병의 당사슬 마커를 발굴 및 진단하는 분야에 응용 가능하다.
또한, 본 발명의 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템을 이용하면 당단백질 의약품에 관하여 용이하게 특성을 분석할 수 있다.
또한, 본 발명의 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템을 이용하면 다량의 시료에 대하여 단시간에 시료 전처리 및 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명의 24웰 시료처리 시스템에 의한 인간 혈청 유래 당사슬 분석 절차를 도시한 도면이다.
도 2는 종래 당사슬 시료 처리시스템과 본 발명의 24웰 처리시스템 및 96웰 처리시스템의 시료 양 및 각 단계별 소요시간, 처리가능 용량, 장·단점을 비교한 비교표이다.
도 3은 본 발명 시스템중 24웰 시료처리 시스템으로 처리된 전체 시료의 배치를 나타낸다. 난소암 환자 144명, 정상인 202명, 상용표준시료 134개, 총 480개의 시료로 구성되어 있다.
도 4는 본 발명의 24웰 시료처리 시스템에서 배치(batch) 내 재현성을 확인하기 위해 배치 내 시료 간의 변동계수(coefficient of variation: CV)를 나타낸 그래프이다. 변동계수가 0에 가까울수록 재현성이 높다. 네 개의 배치가 모두 0.2 이하의 우수한 재현성을 나타내었다.
도 5는 본 발명의 24웰 시료처리 시스템에서 배치 내 위치별 재현성을 확인한 것으로서, 상용표준시료만으로 구성된 네 개의 배치에 대하여 재현성을 확인하였다. 그래프의 숫자는 상관계수 (corelation coefficient)를 나타낸다. 상관계수가 1에 가까울수록 재현성이 높다.
도 6은 본 발명의 24웰 시료처리 시스템에서 배치 간 재현성을 확인한 것이다. 당사슬뿐만 아니라 분석시 나타난 모든 피크(peak)를 대상으로 하였으며, 직선성(linearity)이 좋을수록 배치 간 재현성이 높다. 당사슬이 포함된 1 이상의 구간에서 높은 재현성을 나타내었다.
도 7은 난소암 바이오마커를 탐지하기 위한 당사슬 분석 실험에 사용된 기기의 재현성을 확인한 그래프이다. 상용표준시료만으로 이루어진 13번 배치의 전체 24개 시료에 대하여 전체 이온 크로마토그램을 중첩한 것으로, 당사슬 검출구간에서 높은 재현성을 나타내었다.
도 8은 본 발명의 96웰 시료처리 시스템에 의한 인간 혈청 유래 당사슬 분석 절차를 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 96웰 시료처리 시스템의 재현성을 확인한 그래프이다. 96개의 상용표준시료 처리시 최대값은 1, 최소값은 0.960을 나타내었다.
도 10은 본 발명의 96웰 시료처리 시스템을 구성하는 파일과 실시예를 나타낸 것이다. 전체 프로토콜은 총 4개의 파일로 구성되어 있으며, 각 파일은 하단 그림과 같이 장비의 세부적인 실시 사항을 포함한다.
도 11은 96웰 시료처리 시스템 중 첫 번째 구성 및 진행 순서로서 상기 도 10의 파일 01~03번은 이 구성에서 실시된다. 세부적인 압력이나 용액의 양은 실험에 따라 변경될 수 있다.
도 12는 96웰 시료처리 시스템 중 두 번째 구성 및 진행 순서로서 상기 도 10의 파일 04번은 이 구성에서 실시된다. 세부적인 압력이나 용액의 양은 실험에 따라 변경될 수 있다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실험 방법
본 발명에서는 두 종류의 서로 다른 액체시료 취급시스템(liquid handling system)을 이용하여 실험을 진행하였다.
(1) 24웰 시료처리 시스템 (도 1)
난소암 환자(Patient; P) 144명과 정상인(Control; C) 202명, 상용표준시료(Standard; S) 134개, 총 480개의 시료를 본 실험에 사용하였다. 환자 시료와 정상인 시료는 서울소재 K병원에서 입수하였다. 시료 양은 동일하게 25㎕씩을 취하였다.
상기 세 종류의 시료(P, C, S)는 실험에 앞서 적절하게 임의 추출하여 16개의 배치를 구성하였으며, 배치 중간 및 각 배치에 동일한 상용표준시료를 추가하였다 (1, 7, 13, 20번 네 개의 배치). 하나의 배치는 24개의 시료로 구성되어 있으며 (6×4), 동일한 배치는 한 번에 시료처리하였다.
원활한 N-당사슬 분리를 위하여 혈청 시료는 먼저 단백질 변성 과정을 통하여 3차 구조를 제거하였다. 혈청시료 25㎕에 200mM NH4HCO3 (10mM dithiothreitol 포함) 25㎕를 넣고 격렬하게 교반한 다음 90℃ 이상의 뜨거운 물과 차가운 물에 10초씩 번갈아가며 2분 동안 처리하여 단백질 변성을 유도함과 동시에 과도한 열로 인한 단백질 집적을 방지하였다.
시료에서 N-당사슬을 추출하기 위하여 New England BioLabs (Ipswich, MA)에서 구입한 PNGase F (peptide N-glycosidase F; 500,000 unit/㎖)를 시료에 처리하였다. 상기 단백질 변성 과정이 끝난 시료에 1㎕ (500 units)의 PNGase F를 가하고 마이크로웨이브 반응기 (400W, 37℃, 10분)를 이용하여 배양하여 N-당사슬을 분리하였다.
N-당사슬 분리 효소 반응이 완료된 시료에 차가운 상태의 에탄올 200㎕를 가한 후 -45℃에서 한 시간 동안 방치하여 N-당사슬이 분리되고 남은 단백질을 침전시켰다.
단백질 침전 후 4℃에서 분당 14,400rpm으로 20분간 원심분리한 다음 각 시료마다 200㎕의 상층액을 취하여 완전히 건조하였다.
건조된 각 시료에 1㎖의 초순수를 가하고 격렬히 교반하여 분리 및 정제를 위한 당사슬 시료를 준비하였다.
시료에서 N-당사슬만을 분리 및 정제하기 위하여 흑연화 탄소 카트리지 (Graphitized carbon cartridge)를 이용한 고체상 추출법 (solid phase extraction, SPE)을 적용하였다. 고체상 추출 단계는 Beckman coulter사의 액체시료 취급시스템인 Biomek FXp Laboratory Automation Workstation을 이용하여 진행하였다. 흑연화 탄소 카트리지는 Grace에서 구입하였다. 먼저 카트리지를 초순수 2㎖, 80% (v/v) 아세토나이트릴 (0.1% 트리플루오로초산 포함) 2㎖, 초순수 2㎖의 순서로 세척하였다. 이후 당사슬 시료를 흑연화 탄소 카트리지에 주입한 후, 4㎖의 초순수를 흘려주어 염을 제거하는 과정을 수행하였다. 카트리지에 남은 당사슬은 각각 2㎖의 20% (v/v) 아세토나이트릴, 40% (v/v) 아세토나이트릴 (0.05% 트리플루오로초산 포함)의 순서로 용출하였다. 각 구간 분획을 수집하여 진공 원심 증발기로 건조하였으며 질량분석에 앞서 15㎕의 초순수로 용해하였다.
발명의 재현성 확인을 위한 질량분석은 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량분석기 (Ulterflextreme, Bruker daltonics)를 사용하였다. 매트릭스로는 2,5-DHB(2,5-dihydroxy benzoic acid)를 사용하였다. 20% 아세토나이트릴 분획은 플레이트에 시료 1㎕, 0.01M NaCl 0.3㎕ (dopant), 매트릭스 0.5㎕의 순서로 도포되었으며, 진공건조 후 양성 모드(positive mode)에서 분석하였다. 40% 아세토나이트릴 분획은 플레이트에 시료 1㎕, 매트릭스 0.8㎕의 순서로 도포되었으며, 진공건조 후 음성 모드(negative mode)에서 분석하였다.
바이오마커 발굴을 위한 질량분석은 nanoLC chip/Q-TOF 질량분석기(6530 Q-TOF, Agilent technologies)를 사용하였다. 사용한 칩(chip)은 기기와 동일한 Agilent사의 다공성 흑연화 탄소 칩을 사용하였다. 이동상은 (A) 3% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산 포함), (B) 90% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산 포함)이 사용되었으며, 각 시료당 총 50분의 분석시간을 가지고 진행하였다.
MALDI-TOF MS의 결과에 대하여 FlexAnalysis (version 3.3 build 75, Bruker)를 이용하여 S/N 비율 트레스홀드 4로 피크(peak) 리스트를 추출하였으며, nanoLC chip/Q-TOF MS의 결과에 대하여 Mass hunter qualitative analysis (B.05.00 SP1, Agilent technologies)의 분자 특성 추출 (molecular feature extractor) 알고리즘을 통하여 인간 혈청 라이브러리 (Kronewitter, S. R. et al., Proteomics, 9, 2986-2994, 2009)를 이용하여 N-당사슬 목록을 추출하였다.
(2) 96웰 시료처리 시스템 (도 8)
상기 실험에서 확립한 대용량 시료 자동화 플랫폼을 다른 종류의 액체시료 취급시스템에 적용하였다. 상용표준시료 96개를 사용하여 재현성 확인 실험을 진행하였으며, 시료 양은 24웰 시료처리 시스템보다 더 소량인 15㎕를 사용하였다. 96개의 시료가 1배치 (12×8)이며, 96웰 PCR 플레이트를 사용하여 동일한 배치 내의 시료는 한 번에 처리하였다.
마이크로웨이브 반응기를 이용한 N-당사슬 분리 과정과, 단백질 침전과정을 제외한 모든 과정은 자동화되었으며, 자동화된 과정은 Agilent사의 Encore Multispan Liquid Handling System을 이용하였다.
단백질 변성과정을 통하여 혈청 시료의 3차 구조를 제거하였다. 혈청 시료 15㎕에 200mM NH4HCO3 (10mM dithiothreitol 포함) 15㎕를 넣고 쉐이커에서 혼합하였으며, 80℃의 가열 랙(heating rack)에 1분 동안 두어 단백질을 변성하였다.
상기 단백질 변성과정이 끝난 시료를 2분간 상온에서 식힌 후 PNGase F 1㎕와 100mM NH4HCO3 (5mM dithiothreitol 포함) 4㎕의 혼합용액 5㎕를 넣고 마이크로웨이브 반응기 (400W, 37℃, 10분)를 이용하여 배양하여 N-당사슬을 분리하였다.
N-당사슬 분리 효소 반응이 완료된 시료에 차가운 상태의 에탄올 140㎕를 가한 후 45℃에서 1시간 동안 방치하여 N-당사슬이 분리되고 남은 단백질을 침전시켰다.
침전 후 4℃에서 분당 4,680rpm으로 40분간 원심분리한 후 각 시료마다 140㎕의 상층액을 취하고 완전히 건조하였다.
건조된 각 시료에 800㎕의 초순수를 가하고 쉐이커에서 교반하여 분리 및 정제를 위한 당사슬 시료를 준비하였다.
시료에서 N-당사슬만을 분리 및 정제하기 위하여 흑연화 탄소 카트리지 (Graphitized carbon cartridge)를 이용한 고체상 추출법 (solid phase extraction, SPE)을 적용하였다. 96웰 형태의 카트리지 플레이트를 사용하였으며 Thermo Scientific에서 구입하였다. 먼저 카트리지를 초순수 1㎖, 80% (v/v) 아세토나이트릴 (0.1% 트리플루오로초산 포함) 1㎖, 초순수 1㎖의 순서로 세척하였다. 이후 당사슬 시료를 카트리지에 주입한 다음, 1㎖의 초순수를 흘려주어 염을 제거하는 과정을 수행하였다. 카트리지에 남은 당사슬은 각각 1㎖의 20% (v/v) 아세토나이트릴, 40% (v/v) 아세토나이트릴 (0.05% 트리플루오로초산 포함)의 순서로 용출하였다. 각 구간 분획을 수집하여 진공 원심 증발기로 건조시켰으며 질량분석에 앞서 10㎕의 초순수로 용해하였다.
재현성 확인을 위한 질량분석과 MALDI-TOF MS 분석 결과의 처리는 상기 24 시료처리 시스템과 동일하다.
결과
위 실험의 결과는 도면을 참조하여 자세히 설명한다.
1) 도 1은 본 발명인 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템 중 24웰 시료처리 시스템의 개념도이다.
PNGase F를 이용한 N-당사슬 분리 과정은 효소 반응시 마이크로웨이브 반응기를 이용하였다. 종래 가열욕조를 이용하는 효소처리과정이 16~18시간 소요되는데 비해 본 발명에서 마이크로웨이브 반응기를 이용하는 효소처리과정은 10분이 걸려 전체 시간을 대폭 단축할 수 있었다.
고체상 추출법을 이용한 N-당사슬 추출 및 정제 과정은 자동화된 액체시료 취급시스템을 이용하였다.
2) 도 2는 종래 혈청 시료 전처리방법과 본 발명 방법의 차이점을 정리한 표이다.
본 발명에서는 24웰의 경우 25㎕, 96웰의 경우 15㎕의 적은 양의 시료를 사용하였다.
또한, 본 발명에서는 N-당사슬을 분리하는 효소 반응시간을 16~18시간에서 10분으로 단축하였다.
또한, 본 발명에서는 추출·정제 단계에서 1회에 24개 또는 96개의 시료를 한 번에 처리할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 자동화 시스템을 이용한 동일한 실험방법으로 높은 재현성을 보장한다.
3) 도 3 상단은 본 발명 실시예에 사용된 난소암 환자 혈청시료에 관한 간략한 정보이다. 난소암 진행단계 별로 분류하였고, "R"은 Recurrence 즉, 재발환자를 나타낸다. 진행단계를 알 수 없는 경우는 "Unknown"으로 나타내었다. "Median Age"는 환자 연령 중간값을 나타내며, "Mean Age(SD)"는 평균연령(표준편차)을 나타낸다.
도 3의 하단은 본 발명의 방법으로 처리된 전체 시료의 배치이다. 난소암 환자 144명, 정상인 202명, 상용표준시료 134개, 총 480개의 시료로 구성되어 있다.
배치 1, 7, 13, 20의 네 개 배치는 배치 간 재현성 확인을 위하여 같은 상용표준시료 24개씩으로 구성되어 있다.
배치 2-6, 8-12, 14-19의 16개 배치는 환자, 정상인, 상용표준시료로 구성되어 있으며 적절하게 임의 추출하였다.
4) 도 4는 본 발명의 배치 내 재현성 확인시험 결과로서, 상용표준시료만으로 구성된 네 개의 배치에 대하여 재현성을 확인하였다. 그 결과, 변동계수(Coefficient of variation; CV) 값은 0.2 이하로 나타나 배치 내 재현성이 있음을 확인하였다.
5) 도 5는 본 발명의 배치 내 위치별 재현성 확인시험 결과로서, 상용표준시료만으로 구성된 네 개의 배치에 대하여 배치 내 위치별 재현성을 확인하였다. 재현성은 검출된 N-당사슬의 빈도(frequency)와 강도(intensity)를 바탕으로 상관계수(correlation coefficient) 값으로 확인하였다. 이 경우 상관계수가 1에 가까울수록 재현성이 높은 것이다.
배치 1의 경우 상관계수 최대값은 1, 최소값은 0.954,
배치 7의 경우 상관계수 최대값은 1, 최소값은 0.985,
배치 13의 경우 상관계수 최대값은 1, 최소값은 0.991,
배치 20의 경우 상관계수 최대값은 1, 최소값은 0.994이다.
좌측의 그림에서 노란색 원은 다른 위치의 시료와 재현성에서 차이를 보이는 위치로, 4개의 배치에서 어느 한 위치가 일정하게 계속 나타나지 않고 불규칙적으로 나타나므로 특정 위치에 따른 결과의 차이가 나타나지 않았다. 또한 재현성에서 차이가 나더라도 최대 4.6%의 차이만을 보였다.
6) 도 6은 본 발명의 배치간 재현성 확인 결과로서, 상용표준시료만으로 구성된 네 개의 배치에 대하여 배치 간 재현성을 확인하였다. 당사슬만이 아닌 모든 피크(peak)를 대상으로 하였으며, 강도(intensity)가 높은 피크들에서 높은 직선성(linearity)을 나타낸다. 강도가 낮은 피크에서 직선성이 다소 낮아지는 경향이 있으나 이 부분에는 분석하고자 하는 시료인 당사슬이 거의 포함되어 있지 않다.
7) 도 7은 난소암 바이오마커 실험에 사용된 기기의 재현성을 확인한 결과이다. 상용표준시료만으로 이루어진 배치 13의 전체 24개 시료에 대한 전체 이온 크로마토그램을 겹친 것으로, 당사슬이 검출되는 구간에 대하여 높은 재현성을 보여준다.
8) 도 8은 고속 대용량 자동화 당사슬 시료 전처리 시스템 중 96웰 플랫폼의 전체 개념도이다. 96웰 시료 전처리 시스템은 액체시료 취급시스템을 이용하여 N-당사슬을 분리하기 위한 효소처리 후 배양 단계와 에탄올을 이용한 단백질 침전을 제외한 모든 과정을 자동화하였다. PNGase F를 이용한 N-당사슬 분리 과정은 배양시 마이크로웨이브 반응기를 이용하였다.
9) 도 9는 96웰 플랫폼의 재현성을 확인한 결과이다. 재현성은 검출된 N-당사슬의 빈도 (frequency)와 강도 (intensity)를 바탕으로 상관계수(correlation coefficient) 값으로 확인하였다. 이 경우 1에 가까울수록 재현성이 높다. 96개의 상용 표준시료 처리시 최대값은 1, 최소값은 0.960이었다.
10) 도 10은 본 발명의 96웰 시료처리 시스템을 구성하는 파일과 실시예를 나타낸 것이다. 전체 프로토콜은 총 4개의 파일로 구성되어 있으며, 각 파일은 하단 그림과 같이 장비의 세부적인 실시 사항을 포함한다.
11) 도 11은 96웰 시료처리 시스템 중 첫 번째 구성 및 진행 순서로서 상기 도 10의 파일 01~03번은 이 구성에서 실시된다. 세부적인 압력이나 용액의 양은 실험에 따라 변경될 수 있다.
01. 단백질 변성
프로토콜 시작 전에 ③의 가열 랙의 온도를 80℃로 설정한다.
1. 완충액 옮김
(1) ②의 96웰 PCR 플레이트에 시료 15㎕가 담겨있는 상태로 시작한다.
(2) ①에 담겨있는 200mM NH4HCO3 (10mM 다이티오쓰레이톨 포함) 용액을 15㎕씩 ②로 옮긴다.
(3) ②에서 800rpm으로 30초간 교반한다.
2. 단백질 변성
(1) ②의 PCR 플레이트를 ③의 가열 랙으로 이동 후 1분간 가열한다.
(2) PCR 플레이트를 ④의 위치로 이동 후 2분간 식힌다.
3. PNGase F 가함
(1) ①에 담겨있는 PNGase F 1㎕ 와 100mM NH4HCO3 (5mM 다이티오쓰레이톨 포함) 4㎕의 혼합용액 5㎕를 ④로 옮긴다.
(2) ④의 PCR 플레이트를 ②로 옮기고 600rpm에서 30초간 교반한다.
※ 교반한 PCR 플레이트는 마이크로웨이브 반응기로 옮겨 당사슬 분리반 응을 실시한다. 실시 후 PCR 플레이트는 ⑤로 옮긴다.
02. 에탄올 침전 (이동)
1. 에탄올 옮김
(1) ⑥에 담겨있는 차가운 100% 에탄올을 140㎕씩 ⑤로 옮긴다.
※ -45℃에서 1시간 방치하여 단백질 침전 후 원심분리한다.
03. 에탄올 침전 ( 상층액 )
1. 상층액 모음
(1) ⑤로부터 상층액을 140㎕씩 ⑦로 옮긴다.
※ 상층액을 완전히 건조하고 도 12 워크스페이스 2의 ②로 옮긴다.
위의 ※표시된 단계는 자동화 시스템을 사용하지 않고 수행한다.
12) 도 12는 96웰 시료처리 시스템 중 두 번째 구성 및 진행 순서로서 상기 도 10의 파일 04번은 이 구성에서 실시한다. 세부적인 압력이나 용액의 양은 실험에 따라 변경될 수 있다.
04. 고체상 추출법
1. 건조시료 용해(Reconstitution)
(1) ①에 담겨있는 초순수를 ②의 건조된 시료가 담겨있는 딥 웰 플레이트에 800㎕ 씩 옮기고 1000rpm으로 1분간 교반한다.
(2) 플레이트를 ③의 위치로 이동한다.
2. 카트리지 세척(Conditioning)
(1) ④의 PGC 플레이트로 ①의 초순수를 1ml씩 옮기고 300mbar의 압력으로 40초간 내린다.
(2) ④의 PGC 플레이트로 ⑤의 80% 아세토나이트릴 (0.1% 트리플루오로초산 포함)을 1ml씩 옮기고 300mbar의 압력으로 35초간 내린다.
(3) ④의 PGC 플레이트로 ①의 초순수를 1ml씩 옮기고 300mbar의 압력으로 40초간 내린다.
3. 시료 로딩
(1) ③의 위치의 시료를 ④의 카트리지에 주입하고 200mbar의 압력으로 30초간 내린다.
(2) ③의 플레이트는 다시 ②로 이동한다.
4. 염 제거
(1) ④의 PGC 플레이트로 ①의 초순수를 1ml씩 옮기고 250mbar의 압력으로 1분간 내린다.
5. 20% 용출
(1) ⑧의 용출 플레이트를 ④의 아래, 진공 체임버 내부로 이동한다.
(2) ④의 PGC 플레이트로 ⑥의 20% 아세토나이트릴을 1ml씩 옮기고 200mbar의 압력으로 70초간 내린다.
(3) 용출 플레이트를 ③의 위치로 이동한다.
6. 40% 용출
(1) ⑨의 용출 플레이트를 ④의 아래, 진공 체임버 내부로 이동한다.
(2) ④의 PGC 플레이트로 ⑦의 40% 아세토나이트릴(0.05% 트리플루오로초산 포함)을 1ml씩 옮기고 200mbar의 압력으로 65초간 내린다.
(3) 용출 플레이트를 다시 ⑨의 위치로 이동한다.
7. 20% 용출물 옮김
(1) ③의 20% 용출 플레이트에서 ⑩의 24웰×4의 튜브로 시료를 이동한다.
(2) 빈 용출 플레이트는 ⑧로 이동한다.
8. 40% 용출물 옮김
(1) ⑨의 40% 용출 플레이트를 ③으로 이동한다.
(2) ③의 40% 용출 플레이트에서 ⑪의 24웰×4의 튜브로 시료를 이동한다.
본 발명에서는 대량 당사슬 분석을 위한 대량 당사슬 시료 준비를 위해 먼저 시료의 양을 조절하였다. 종래의 방법과는 다른 플레이트 형태의 고체 추출 카트리지를 사용하며, 카트리지의 용량에 따라 용출 양이 변경되어 초기 시료 양 조절이 불가피하다.
또한, 본 발명에서는 액체시료 취급 시스템을 이용하여 단백질 변성 단계를 수행하기 때문에 변성 시간 및 온도를 최적화하였다.
또한, 본 발명에서는 각 시료의 양을 줄였으므로, 이로 인하여 이후의 모든 단계에서 완충용액 등의 양을 이에 맞게 조절하였다. 또, 세척, 탈염, 용출 양 및 용출분획의 종류를 조절하였다.
또한, 본 발명에서는 고체 추출 카트리지에서 펌프를 이용하여 용출할 때 압력 및 시간을 최적화하였다.
또한, 본 발명에서는 서로 다른 배치 간 또는 같은 배치 내 위치 간 재현성을 최대로 높였다.
뿐만 아니라, 본 발명에서는 피펫팅 속도, 시험관의 위치 및 이동속도를 조절하여 전체적인 실험시간을 단축하였다.

Claims (6)

  1. 혈청 시료를 준비하는 단계; 혈청 시료 내의 단백질 변성 단계; 단백질 변성 처리한 시료에 PNGase F 효소를 처리하여 단백질로부터 N-당사슬을 절단하는 단계; 에탄올을 가하여 단백질을 침전시키고 상층액의 N-당사슬을 분리하는 단계; 및 분리한 N-당사슬을 농축 및 정제하는 단계;를 포함하는 N-당사슬 시료 전처리 방법에 있어서,
    상기 혈청 시료 준비 단계는 20개 이상의 시료를 단일 배치(batch) 상에 나열하며, 각 시료는 15~30㎕를 취하며,
    상기 단백질 변성 단계는 시료가 든 용기를 70~90℃의 액체와 상온의 액체에 10~20초씩 번갈아 넣어 1분 30초~5분 동안 수행하거나, 시료가 든 용기를 가열 랙에 넣고 70~90℃ 내에서 1분~2분 동안 처리하고 상온으로 식히며,
    상기 PNGase F 효소처리 단계는 상기 단백질 변성 처리한 시료에 효소를 가한 후 마이크로웨이브 반응기에서 30~38℃ 온도로 5~20분 동안 수행하며,
    상기 분리한 N-당사슬 농축 및 정제단계는 액체시료 취급 자동화 시스템을 이용하여 흑연화 탄소 카트리지를 이용한 고체상 추출법으로 수행하되 세척, 시료 로딩, 탈염, 용출과정은 150~400mbar의 압력을 가하여 30초~70초간 수행하고, 시료는 15~25㎕를 로딩하며, 용출량은 1~2ml로 하며,
    상기 분리한 N-당사슬 농축 및 정제단계의 용출과정은 20% 및 40% 아세토나이트릴의 2개 분획을 이용하되, 아세토나이트릴 1ml씩을 옮기고, 200mbar의 압력으로 70초간 내리며, 0.05% 트리플루오로초산 포함 40% 아세토나이트릴을 1ml씩 옮기고 200mbar의 압력으로 65초간 내리며,
    상기 분리한 N-당사슬 농축 및 정제단계의 세척과정은 초순수를 300mbar의 압력으로 40초간 내리고, 0.1 트리플루오로초산 포함 80% 아세토나이트릴로 300mbar의 압력으로 35초간 내리고, 초순수를 300mbar 압력으로 40초간 내려 수행하며,
    상기 분리한 N-당사슬 농축 및 정제단계의 시료 로딩과정은 시료를 주입하고 200mbar의 압력으로 30초간 내리고, 탈염과정은 초순수를 250mbar 압력으로 1분간 내려 수행함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈청 시료 준비 단계는 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트를 이용하여 하나의 배치를 형성함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 혈청 시료 준비 단계에서 96웰 플레이트를 이용하여 하나의 배치를 형성하는 경우 상기 단백질 변성단계는 액체시료 취급 자동화 시스템을 이용하여 수행함을 특징으로 하는 고속 대용량 자동화 N-당사슬 시료 전처리 방법.
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