CN111239271A - 利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,针对目标样本设计伴随样本,重标标记伴随样本,将蛋白检测的损失转移到伴随样本上,实现微量生物样本蛋白质的检测,解决现有技术目前对微量生物样本的蛋白质组分析存在的技术障碍,获取可用于鉴定或定量的实用信息。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组学领域,特别涉及一种利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法。
背景技术
蛋白质组学,是以蛋白质组为研究对象,研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学,通过研究蛋白质组不仅能为生命活动提供物质基础,也能为众多疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。在生物医学研究中经常需要分析微量生物样本的蛋白质,比如:通过研究单细胞或少量细胞可以理解其生物发生发展的规律,通过分析少量临床组织可以分析其异质性,通过分析少量体液(尿液、血液等)有望提高诊疗效果。
然而,目前对微量生物样本的蛋白质组分析具有多个技术障碍,其中最为显著的两点,一是蛋白质提取过程的蛋白质丢失严重,导致可用于检测的产物过少;二是质谱的响应信号由于过低而受到噪声等的严重干扰,这使得研究者们很难得到具有统计学意义的蛋白信号、更加难以获得其鉴定或定量的信息。
为了实现微量生物样本的蛋白质组分析,现有技术往往采用复杂精密的系统或工作流,以尽可能降低细胞内的蛋白在样本制备中及质谱检测前的损失,主要的方法可以划分为如下几种:
(1)基于微流控系统。方群教授和Ying Zhu等早期开发的微流控系统,可以处理皮升级别的液体,在液滴内对单个细胞进行裂解、加反应试剂等处理、从而提取其蛋白,但这类装置只限于细胞的处理,并且受限于通量和仪器的使用权,不能为利于生物医学研究者。
(2)基于新型实验方案。如,Jeroen Krijgsveld开发出一套在磁珠表面进行蛋白质各项反应的方法,Max Plank生物化学所的研究者们则将这些操作移至滤膜上进行,但这些方法大多尚处在开发阶段,且过于依赖操作者的经验,现阶段的通用度不强。
(3)基于改进的工作流。Peter Nemes教授使用显微操作技术吸取细胞内液中的蛋白质,并将液相系统换成毛细管电泳系统以减少多肽的非特异性吸附,但这种方法只能做特定类型的细胞,如体积巨大的蛙卵等。Nikolai Slavov教授通过兼容和优化自动化样本制备系统,混合使用多肽体外标记(tandem mass tag)技术,来减少人工操作带来的干扰和损失,该制备系统有极高的技术门槛,且多肽体外标记技术需搭配特定的算法和程序进行数据分析,也不适合大规模的应用。
整体来说,现行的针对少量样本和单细胞的蛋白质组学方法,或极大地增加实验成本、或在开发的初始阶段、接受度不强,还没有一个能适应现有蛋白质组工作流程的方法,可以被研究者们广泛接受、直接应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,该定量方法可用于定量微量生物样本内的蛋白质,解决现有技术目前对微量生物样本的蛋白质组分析存在的技术障碍,获取可用于鉴定或定量的实用信息。
相较现有技术,本技术方案具有以下的特点和有益效果:首先,这种定量方法实现了对于多种类型的微量生物样本,包括细胞,组织(如石蜡或新鲜组织)、体液等的蛋白质组鉴定,以低至针对纳克级别的生物样本也能获得丰富的蛋白质组信息,是对生物或临床资源的合理应用。再者,这种方法不依赖特殊的仪器设备,其在常规蛋白质组提取技术的方法下就能根据实验需要轻易地对微量样本进行处理,而使样本损失被分担到大多数作为“伴随”的伴随细胞中去,因此,方法普适、易接受、硬件成本低廉。同时,该方案也减弱了噪声干扰。在这种方法下,目标样本和伴随细胞(组)在质谱中的相应信号“成双成对”地出现,通过伴随细胞(组)的信息可以推断和挖掘目标样本的信号响应,从而使数据的准确度更高,并支持数据的进一步验证。最后,数据分析简单易执行,大多数的商用和开源软件都支持该同位素标记样本的蛋白质分析方法,该方法的可接受度广、技术门槛低。
附图说明
图1是根据本发明的一实施例的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法的过程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员应理解的是,在本发明的揭露中,术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系,其仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
本方案提供了一种利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,包括以下步骤:
S1:针对待测的目标样本设计伴随样本,其中伴随样本和目标样本在生物学上同源同系:
具体的,若目标样本为细胞系,则选择相同的细胞系作为伴随样本;若目标样本为原代细胞,选择生物学相近的一种或若干种细胞系作为伴随样本;若目标样本为组织或体液样本,选择生物学相近的一种或若干种细胞系作为伴随样本。
对三种情况的举例说明:
细胞系:如K562人慢性髓系白血病细胞系,选择K562人慢性髓系白血病细胞系作为伴随样本。
原代细胞:如人脐带血内的造血干细胞,选择CD34阳性的造血细胞系(如CD34+KG-1α急性髓系细胞白血病细胞系)作为伴随样本、或多种白血病细胞系(如:HEL人慢性髓系白血病细胞系,K562人慢性髓系白血病细胞系,KG-1急性髓系细胞白血病细胞系,HL-60人原髓细胞白血病细胞系等)作为伴随样本。
组织或体液样本:如人卵巢癌新鲜组织,选择多种人卵巢癌细胞系(如SK-OV-3人卵巢腺癌细胞系,ES-2人卵巢透明细胞癌细胞系,OV-1063人卵巢上皮细胞癌细胞等)作为伴随样本。
目标样本可以是细胞系、原代细胞、组织或体液样本。
S2:同位素标记伴随样本:
将伴随样本置于混合有同位素标记的氨基酸的完全细胞培养基中培养,达到伴随样本对同位素标记的氨基酸的吸收率达到95%以上。
其中标记氨基酸选择为稳定同位素标记的赖氨酸、稳定同位素标记的精氨酸,稳定同位素标记的亮氨酸的一种或几种,当然,标记氨基酸还可选择为其他稳定同位素标记的氨基酸。
具体的培养过程如下:
选择缺乏标记氨基酸的细胞培养基,除去氨基酸和小分子的透析胎牛血清,或链霉素、青霉素,混合得到混合液,选择标记氨基酸添加至混合液中配置得到完全培养基。
此处的细胞培养基可以是Thermo Scientific公司的DMEM for SILAC细胞培养基,细胞培养基起到为细胞提供生长环境的作用;此处的透析胎牛血清可选择为ThermoScientific公司的Dialyzed Fetal Bovine Serum,起到为细胞提供营养物质的作用;其中青霉素、链霉素可选择Hyclone公司的链霉素-青霉素100倍溶液,起到防止细菌或真菌对细胞的污染的作用。
其中混合液的比例:以链霉素-青霉素的体积为1比例,透析胎牛血清的比例为5-20,细胞培养基的比例为80-95,在本方案的一实施例中,混合液内的组分细胞培养基:透析胎牛血清:链霉素、青霉素以90:10:1的体积比例混合。
其中标记氨基酸的浓度根据实验目的和条件进行添加,无特定建议浓度范围,在本方案的一实施例中,标记氨基酸和混合液的混合浓度为:稳定同位素标记的赖氨酸0.798毫摩尔浓度,稳定同位素标记的精氨酸0.398毫摩尔浓度。
如若伴随样本中含有多类伴随细胞,则对每类的伴随细胞进行分别培养。
在本方案中用完全培养基培养伴随样本至六代以上,对伴随样本进行标记吸收效率的检测直至伴随样本对标记氨基酸的吸收率达到95%以上。
S3:混合目标样本和伴随样本得到检测样本:
由上可知:伴随样本可以被一种标记氨基酸标记也可以被多种标记氨基酸标记。
当伴随样本仅被一种标记氨基酸标记时,将伴随样本和目标样本进行混合,其中伴随样本和目标样本之间混合比例不大于100;当伴随样本被多种标记氨基酸标记时,将不同标记的伴随样本均和目标样本进行混合,其中每个不同标记的伴随样本和目标样本混合比例不大于100。
混合的方式有两种:第一种,裂解处理伴随样本得到伴随样本裂解液,等分伴随样本裂解液得到等份伴随样本裂解液,将等份伴随样本裂解液和目标样本进行混合。第二种:分选出已知数目的伴随样本,与目标样本进行混合。
S4:对检测样本进行蛋白处理得到蛋白质样本:
对检测样本依次进行细胞裂解、蛋白质孵化、蛋白质酶解以及除盐得到蛋白质样本。
细胞裂解的过程:
对伴随细胞或伴随细胞裂解液和目标样本的检测样本,通过机械裂解法(研磨、压力循环、超声加热、反复冻融热休克)、化学裂解法(SDS-碱裂解液法、尿素/硫脲裂解法)或酶裂解法(溶菌酶处理),破碎或溶解检测样本的细胞膜,使细胞内和细胞壁的蛋白暴露。
蛋白质孵化的过程:
往细胞裂解后的样本中加入还原剂和烷基化试剂,将蛋白质的二硫键彻底打开,以破环蛋白质的二级结构,为充分酶解和多肽的鉴定做准备,常用的还原化试剂有非硫醇还原剂(三(2-羧乙基)膦盐酸盐等)、硫醇类还原剂(二硫苏糖醇等)等,烷基化试剂有碘乙酰胺等,在部分特殊实验要求下,蛋白质的孵化步骤可以省略。
蛋白质酶解的过程:
加入蛋白酶,将检测样本的蛋白质按序列的特点位点进行水解,按照蛋白质酶解前处理的方式,分为胶内酶解和溶液酶解,根据掺杂的标记氨基酸的不同,选用如:胰蛋白酶(特异性水解赖氨酸和精氨酸的羧基端、适用标记赖氨酸和精氨酸)、胞内蛋白酶Lys-C(特异性水解赖氨酸的羧基端,适用标记赖氨酸)或其他可有效特异/非特异氨基酸序列的水解酶(胃蛋白酶、Glu-C、LysN、Asp-N等)。
其中酶量/检测样本蛋白量在1/20至1/100之间加入蛋白酶,反应体系根据酶反应的要求确定最适pH、最适温度和最适反应时长,部分实验中,可能有多种酶的使用。得到的产物是目标样本和伴随细胞的多肽混合物。
脱盐的过程:
将样本中因裂解、缓冲pH引入的盐分除去,一般情况下,使用多肽脱盐柱,进行树脂材料的活化和平衡后,注入多肽混合物溶液,离心;离心后的液体再次注入脱盐柱中、再次离心,以确保多肽尽可能保留在除盐柱内的C18或其它吸附材料上。清洗吸附材料后,以洗脱液洗脱多肽。收集洗脱液,旋蒸至全干,并用质谱缓冲液复溶。在其它情况下,反应体系中未引入盐分或仅少量盐分,除盐步骤可以省略,或在液相色谱系统中采用线上除盐的方案。
S5:通过液相色谱与质谱联用的方法对蛋白质样本进行液相质谱数据采集。
色谱条件为:
液体流速:小于1000纳升每分钟或者控制在5-10微升每分钟;流动相A相建议选择:乙腈、水和乙酸的混合溶液;流动相B相建议选择:乙腈、水和乙酸的混合溶液;洗脱梯度时间控制在30分钟至4小时之间,色谱柱采用预柱-分析柱串联模式或分析柱模式,选取具有多肽保留能力的材料(如C18树脂等)作填充填料。
其中流动相A选择低比例的乙腈和高比例的水,比如可以选择2%-10%的乙腈,98%-90%的水;其中流动相B选择低比例的乙腈和高比例的水,比如可选择70-90%比例的乙腈以及20%-30%比例的水。在一个具体的实施例中,流动相A相建议选择:2%乙腈、98%水和0.1%乙酸的混合溶液;流动相B相建议选择:80%乙腈、20%水和0.1%乙酸的混合溶液,每个混合溶液中乙酸的含量均十分少量,控制在0.1%上下。
使用数据非依赖型(data independent acquisition,DIA)、数据依赖型方法(data dependent acquisition,DDA)或靶向质谱方法(selected/parallel reactionmonitoring)等进行质谱数据采集。一级质谱建议分辨率在10k-60k,建议扫描范围设为400-1500m/z以内;二级质谱建议分辨率在10k-60k,若使用数据非依赖型方法,建议扫描范围在400-2000m/z以内。
S6:数据分析定量目标样本的蛋白质:
选用合适的商用或开源软件,对质谱数据进行分析。部分软件支持对于稳定同位素标记的搜索模块(如MaxQuant,pFind等),可以对质谱得到的数据进行直接分析;部分软件通过将稳定同位素标记设为固定修饰,以实现结果诠释。非上述两种描述的部分新算法也可以被吸收成为分析软件。将分析结果中属于目标细胞标记类型(非标记型)的多肽和蛋白筛选出来,即得到其定量蛋白质组信息。
该利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,通过将样本制备过程中损失分担到占多数的伴随样本中,减少了来自感兴趣的微量生物样本的蛋白质损失;在任何液相质谱条件下,采集的信号都呈“成双成对”地出现,因此通过伴随样本的高信号可以推断微量生物样本的低信号,从而对低丰度的微量生物样本蛋白质进行鉴定。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:针对待测的目标样本设计伴随样本,其中伴随样本和目标样本在生物学上同源同系;
S2:同位素标记伴随样本;
S3:混合目标样本和伴随样本得到检测样本;
S4:对检测样本进行蛋白处理得到蛋白质样本;
S5:通过液相色谱与质谱联用的方法对蛋白质样本进行液相质谱数据采集;以及
S6:数据分析定量目标样本的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,若目标样本为细胞系,则选择相同的细胞系作为伴随样本;若目标样本为原代细胞,选择生物学相近的一种或若干种细胞系作为伴随样本;若目标样本为组织或体液样本,选择生物学相近的一种或若干种细胞系作为伴随样本。
3.根据权利要求1所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,在步骤S3当中,当伴随样本仅被一种标记氨基酸标记时,将伴随样本和目标样本进行混合,其中伴随样本和目标样本之间混合比例不大于100;当伴随样本被多种标记氨基酸标记时,将不同标记的伴随样本均和目标样本进行混合,其中每个不同标记的伴随样本和目标样本混合比例不大于100。
4.根据权利要求1所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,在步骤S3当中,混合的方式有两种:第一种,裂解处理伴随样本得到伴随样本裂解液,等分伴随样本裂解液得到等份伴随样本裂解液,将等份伴随样本裂解液和目标样本进行混合;第二种:分选出已知数目的伴随样本,与目标样本进行混合。
5.根据权利要求1所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,在步骤S2当中,标记氨基酸选择为稳定同位素标记的赖氨酸、稳定同位素标记的精氨酸,稳定同位素标记的亮氨酸的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,在步骤S5当中,将伴随样本置于混合有标记氨基酸的完全细胞培养基中培养,达到伴随样本对标记氨基酸的吸收率达到95%以上。
7.根据权利要求5所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,选择缺乏标记氨基酸的细胞培养基,除去氨基酸小分子的透析胎牛血清和链霉素-青霉素混合得到混合液,选择标记氨基酸添加至混合液中配置得到完全培养基。
8.根据权利要求7所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,以链霉素-青霉素的体积为1比例,透析胎牛血清的比例为5-20,细胞培养基的比例为80-95。
9.根据权利要求1所述的利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法,其特征在于,液体流速:小于1000纳升每分钟或者控制在5-10微升每分钟;流动相A相选择:乙腈、水和乙酸的混合溶液;流动相B相选择:乙腈、水和乙酸的混合溶液;洗脱梯度时间控制在30分钟至4小时之间,色谱柱采用预柱-分析柱串联模式或分析柱模式,选取具有多肽保留能力的材料作填充填料。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111855861A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-10-30 | 西湖大学 | 伴随蛋白/肽及其在提高蛋白质组实验效率中的应用 |
CN113866332A (zh) * | 2021-11-23 | 2021-12-31 | 上海交通大学 | 一种非标记蛋白质组学检测方法及装置 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150198612A1 (en) * | 2012-07-24 | 2015-07-16 | University Of Dundee | Isotopic Labelling of Proteins |
US20190187151A1 (en) * | 2016-06-06 | 2019-06-20 | Uvic Industry Partnerships Inc. | Assay for quantitation of proteins and peptides using stable isotope standards |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150198612A1 (en) * | 2012-07-24 | 2015-07-16 | University Of Dundee | Isotopic Labelling of Proteins |
US20190187151A1 (en) * | 2016-06-06 | 2019-06-20 | Uvic Industry Partnerships Inc. | Assay for quantitation of proteins and peptides using stable isotope standards |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
TAMAR GEIGER等: "Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue", 《NATURE METHODS》 * |
王巍伟等: "肺癌患者体液生物标志物的蛋白质组学研究现状", 《标记免疫分析与临床》 * |
王巍巍等: "SILAC技术研究DNP对鼻咽癌细胞株6-10B蛋白质组的影响", 《热带医学杂志》 * |
谭贵良 等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 * |
高红军等: "细胞培养稳定同位素标记技术与肿瘤标志分子研究", 《基础医学与临床》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111855861A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-10-30 | 西湖大学 | 伴随蛋白/肽及其在提高蛋白质组实验效率中的应用 |
CN113866332A (zh) * | 2021-11-23 | 2021-12-31 | 上海交通大学 | 一种非标记蛋白质组学检测方法及装置 |
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