CN106770814B - 一种蛋白质色谱分离平台及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白质色谱分离平台及其应用，所述的平台包括蛋白质组反应器(1)和与液相色谱‑质谱仪(2)；其中，蛋白质组反应器(1)包括移液枪枪头(3)、强阴离子交换树脂(4)和固相萃取膜(5)；固相萃取膜(5)填充于移液枪枪头(3)的下端，强阴离子交换树脂(4)填充于移液枪枪头(3)下端并位于固相萃取膜(5)之上。本发明提供的蛋白质色谱分离平台集成了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的强阴离子交换分级、高pH值反相分级和低pH值液相色谱分离等操作，具有一维分离、二维分离和三维分离三种工作模式，可用于少量细胞、组织或血液样品的蛋白质大规模鉴定和定量蛋白质组学中。
Description
技术领域
本发明涉及定性和定量蛋白质组学技术领域，具体涉及一种蛋白质色谱分离平台及其应用，尤其涉及一种蛋白质样品前处理和三维色谱分离平台及其应用。
背景技术
蛋白质组学研究中，通过将样品中的蛋白质酶解成多肽后，用于液相色谱-质谱分析以获得蛋白质信息，该分离鉴定方法是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段。
蛋白质样品成分复杂，在液相色谱-质谱分析前对样品进行预分级，是降低样品复杂度，提高蛋白质鉴定数量的有效方法。二维色谱分离是常用的手段，包括强阳离子交换-反相色谱分离方法、高pH值反相色谱-低pH值反相色谱分离方法、强阴离子交换-反相色谱分离方法和亲水作用色谱-反相色谱分离方法等。三维色谱分离方法能够进一步降低样品复杂度和提高蛋白质鉴定的覆盖度，包括高pH值反相色谱-强阳离子交换-低pH值反相色谱分离方法、强阳离子交换-高pH值反相色谱-低pH值反相色谱分离方法和强阳离子交换-亲水作用色谱-低pH值反相色谱分离方法等。
Anal.Chem.2016,88,2847中公开的低pH值反相色谱-高pH值反相色谱-低pH值反相色谱分离方法体现出很好的三维分离正交性，通过126个分级可从720μg样品中鉴定14000个蛋白质。Anal.Chem.2011,83,6996中公开了高灵敏的高pH值反相色谱-强阴离子交换-低pH值反相色谱分离平台，通过101个分级能够从5μg样品中鉴定约4000个蛋白质。但是，这些方法仪器结构复杂、检测时间长、需专业培训过才能使用，不适合应用在日常分析中。
在同一装置中将多肽样品的预分级集成到蛋白质样品前处理过程中可有效减少样品损失、降低样品复杂度。Mol.Cell.Proteomics 2011,10,M110.000679公开了一种稀有细胞蛋白质组反应器(Rare Cell Proteomic Reactor,RCPR)，其基于强阳离子交换树脂(Strong Cation Exchange,SCX)毛细管整体柱，实现了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解以及多肽的强阳离子交换分级，从5000和50000个细胞中分别鉴定到409和2281个蛋白质。Nat.Methods 2014,11,319公开了一种狭小封闭空间的蛋白质样品前处理方法(in-StageTip method)，在封闭的小管内实现了蛋白质的样品前处理，并通过小管下端的SCX膜、强阴离子交换(Strong Anion Exchange,SAX)膜等实现多肽的强阳/阴离子交换分级，从20μg蛋白样品中鉴定到大于7000个蛋白质。
CN 105866317 A公开了集成蛋白质样品前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器，通过5个分级可从100000个细胞中鉴定7800个蛋白质，上述蛋白质样品前处理技术集成了多肽样品的一维预分级，与液相色谱-质谱仪形成二维分离检测系统。但是，二维分离后样品的复杂度仍然很高。因此，如何开发一种蛋白质样品前处理和三维色谱分离平台已成为目前亟待解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种蛋白质色谱分离平台及其应用。通过采用本发明提供的蛋白质色谱分离平台，能够实现蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的强阴离子交换分级、高pH值反相分级和低pH值液相色谱分离的全过程，可实现少量细胞或者组织样品的蛋白质大规模鉴定，提高重现性以及定量分析准确性。此外，本发明提供的蛋白质色谱分离平台可实现自动化操作。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种蛋白质色谱分离平台，其能够集成蛋白质样品前处理以及多肽的强阴离子交换分级、高pH值反相分级和低pH值液相色谱分离；所述的蛋白质色谱分离平台包括蛋白质组反应器1和与液相色谱-质谱仪2；
其中，所述蛋白质组反应器1包括移液枪枪头3、强阴离子交换树脂4和固相萃取膜5；固相萃取膜5填充于移液枪枪头3的下端，强阴离子交换树脂4填充于移液枪枪头3下端并位于固相萃取膜5之上。
本发明中所述的“蛋白质样品前处理”包括蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐和洗脱等操作，其在各操作过程中用到的蛋白酶、还原剂、烷基化试剂以及缓冲盐溶液等都为本领域公知的试剂，典型但非限制性的实例为：蛋白质可以为生物样品的组织、细胞或体液的蛋白质提取液或标准蛋白；蛋白酶可以选自碱性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶等；还原剂可以选自二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯、β-巯基乙醇等，烷基化试剂可以是碘代乙酸或碘乙酰胺等。
本发明中所述的“强阴离子交换分级”是指基于离子交换色谱的原理实现多肽分级，即使用不同pH值的溶液按pH值从高到低的顺序将多肽从强阴离子交换树脂上依次洗脱下来，进行强阴离子交换分级。强阴离子树脂按pH值从高到低的洗脱方式与后续多肽的高pH值反相分级是兼容的，即进行每一个强阴离子交换分级后，都可以进行高pH值反相分级。而强阳离子树脂并没有此作用，因为强阳离子分级是按pH值从低到高的顺序来洗脱的，进行完一个低pH值的分级后，若进行多肽的高pH值反相分级，会把强阳离子树脂上的多肽也洗脱下来，无法再进行后面的强阳离子交换分级(高pH值的分级)。即使用强阳离子树脂时，不能同时进行多肽的强阳离子交换分级和高pH值反相分级，而使用强阴离子树脂时，则能同时进行多肽的强阴离子交换分级和高pH值反相分级。
本发明中所述的“高pH值反相分级”和“低pH值液相色谱分离”是指基于反相液相色谱的原理实现多肽分级和分离。其中反相液相色谱(reverse-phase liquidchromatography，RPLC)的特点是固定相的极性比流动相弱，由于RPLC固定相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离，疏水性较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱，在流动相中有机溶剂含量较低时就能流出；反之，疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用，在流动相中有机溶剂含量较高时才能流出，因而实现了多肽的分级和分离。其中，高pH值是指pH值高于8，例如pH值为8、9、9.5或10等；低pH值是指pH值高于3，例如pH值为3、2.5、2、1.5或1。
本发明蛋白质色谱分离平台中，优选地，所述强阴离子交换树脂4为含有季铵基的树脂。
优选地，所述固相萃取膜5为C18膜。
本发明中蛋白质色谱分离平台使用基于强阴离子交换树脂和固相萃取膜的蛋白质组反应器，能够同时进行多肽的强阴离子交换分级和高pH值反相分级，与液相色谱-质谱仪配合实现多肽的三维正交分离，极大地提高了蛋白质的鉴定数量。
本发明所述蛋白质组反应器在使用时，其具体操作如下：如图1(B)所示，将支撑块6置于收集管7上端，将蛋白质组反应器1通过支撑块6置于收集管7之上，将收集管7放入离心机8中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的强阴离子交换分级和高pH值反相分级等操作。此外，本发明提供的蛋白质组反应器可实现自动化操作；例如，可以在安捷伦公司的自动化液体处理平台Bravo上使用所述蛋白质组反应器技术自动化、高通量地同时处理多个样品。
第二方面，本发明提供一种蛋白质样品前处理的自动化系统，所述自动化系统包括如第一方面所述的蛋白质组反应器。
优选地，所述自动化系统还包括能实现自动化的装置都是可行的，可以是靠气压推力实现自动化的装置，也可以是靠真空抽力实现自动化的装置，具体可以是自动化液体处理平台和/或蠕动泵，例如可以是安捷伦Bravo平台。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的蛋白质色谱分离平台在细胞、组织或者血液样品的蛋白质鉴定和蛋白质定量分析中的应用，尤其是用于少量细胞或组织样品的蛋白质大规模鉴定和定量蛋白质组学中。
在具体应用时，主要是将所述蛋白质色谱分离平台用于生物样本中蛋白质的前处理、多肽的强阴离子交换分级、高pH值反相分级和低pH值液相色谱分离；具体地，将生物样本中的蛋白质样品在强阴离子交换树脂上进行酶解和强阴离子交换分级，并转移到固相萃取膜上进行高pH值反相分级，最后将生成的多肽转移到液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测，从而实现蛋白质样品的前处理和三维正交分离。
优选地，所述高pH值反相分级的pH值高于8。
优选地，所述低pH值液相色谱分离的pH值低于3。
本发明中，第一方面所述的蛋白质色谱分离平台具有三种不同的工作模式，每种工作模式可以单独进行：
一维分离模式：即蛋白样品酶解后不进行分级，直接在液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测；
二维分离模式：即蛋白样品酶解后只进行强阴离子交换分级或者高pH值反相分级，然后在液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测；
三维分离模式：即蛋白样品酶解后进行强阴离子交换分级和高pH值反相分级，最后在液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测。
本发明中，在将第一方面所述的蛋白质色谱分离平台用于细胞或者组织样品的蛋白质鉴定和蛋白质定量分析中时，其具体操作包括以下步骤：
(1)细胞或者组织样品经裂解液裂解并碱化后，加到预先活化好的蛋白质组反应器中，通过离心使蛋白质富集到强阴离子交换树脂上；
(2)使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到固相萃取膜上的表面活性剂，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原、烷基化和酶解；
(3)使用不同pH值的溶液按pH值从高到低的顺序将生成的多肽从强阴离子交换树脂上依次转移到固相萃取膜上，进行强阴离子交换分级；
(4)除盐后，使用高pH值的含有不同比例有机溶剂的溶液按从低到高的比例依次将多肽洗脱下来，进行高pH值反相分级；
(5)使用液相色谱-质谱仪对多肽样品进行低pH值液相色谱分离检测。
优选地，步骤(3)所述不同pH值的溶液按pH值从高到低时使用溶液的pH值从pH12到pH2。
优选地，步骤(4)所述高pH值反相分级时使用溶液的pH值高于8。
优选地，步骤(5)所述低pH值液相色谱分离的pH值低于3。
步骤(1)所述裂解液中的表面活性剂是高pH值反相分级和液相色谱-质谱兼容的，优选为正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-dodecylβ-D-maltoside,DDM)、胆固醇琥珀酸单酯三羟甲基氨基甲烷盐(Cholesteryl hemisuccinate tris salt,CHS)中的任意一种或两种的混合物。
步骤(2)所述含有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液，其中，乙腈和/或甲醇在所述溶液中的体积含量为20％，柠檬酸钾在所述溶液中的浓度为8mmol/L。
优选地，步骤(2)所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的蛋白质色谱分离平台在一个移液枪枪头内集成了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的强阴离子交换分级和高pH值反相分级等操作，结合液相色谱-质谱仪的低pH值色谱分离实现少量细胞、组织或者血液样品的蛋白质三维分离和大规模鉴定，提高重现性以及定量分析准确性；
(2)本发明包括的蛋白质组反应器可实现自动化操作；例如，可以在安捷伦公司的自动化液体处理平台Bravo上使用所述蛋白质组反应器技术自动化、高通量地同时处理多个样品。
附图说明
图1为本发明所述蛋白质色谱分离平台，其中，图1(A)为蛋白质色谱分离平台，图1(B)为具体操作时的结构示意，图中：3-移液枪枪头，4-强阴离子交换树脂，5-C18膜，6-支撑块，7-收集管，8-离心机；
图2为使用本发明的蛋白质色谱分离平台分析30μg细胞中蛋白样品时每个分级鉴定的蛋白质和多肽数量分布图，其中，图2(A)为蛋白质数量分布图及蛋白质数量随分级的累积变化，图2(B)为多肽数量分布图及多肽数量随分级的累积变化。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
如图1(A)所示，一种蛋白质色谱分离平台，包括蛋白质组反应器1和液相色谱-质谱仪2(Orbitrap Fusion,Thermo Fisher Scientific,USA)；其中，蛋白质组反应器1包括标准的200μL枪头3、强阴离子交换膜4(3M Empore,USA)和C18膜5(3M Empore,USA)；C18膜5填充于移液枪枪头3的下端，强阴离子交换膜4填充于移液枪枪头3下端并位于C18膜5之上。
如图1(B)所示，操作时将支撑块6置于1.5mL收集管7上端，将蛋白质组反应器1通过支撑块6置于收集管7之上，将收集管7放入离心机8中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的除盐等操作，具体步骤如下：
细胞或者组织样品使用兼容性的裂解液进行裂解，提取蛋白质成分，测量蛋白浓度，兼容性裂解液的成分为25mmol/L HEPES，pH7.4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2，600mmol/L guanidine HCl，1％DDM和蛋白酶抵制剂。取6μg蛋白样品，加入3mol/L的氨水将样品溶液碱化至pH12。蛋白质组反应器首先分别通过20μL的甲醇和20μL的3mol/L氨水活化。活化后，将样品加入蛋白质组反应器中，通过在离心机8内离心使蛋白质富集到强阴离子交换膜4上；接着，使用含有20％乙腈(acetonitrile,ACN)的3mol/L的氨水溶液清洗掉结合到C18膜5上的表面活性剂DDM；接着，加入50mmol/L的二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)溶液，在室温下反应30分钟，完成蛋白质的还原。接着，加入5μL的20mmol/L碳酸氢铵洗去DTT，再加入含有4μg胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，使用20μL含250mmol/L NaCl的pH 2溶液将生成的多肽从强阴离子交换膜4转移到C18膜5上；接着，加入20μL的1％甲酸水溶液进行除盐。最后，使用40μL 80％乙腈-0.5％乙酸溶液将多肽洗脱下来。洗脱下来的多肽在冻干机冻干后复溶于0.1％甲酸水溶液，在液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测，即一维分离工作模式。
结果如表1所示，鉴定到了19949条多肽和4269个蛋白质。
表1一维分离工作模式下鉴定的多肽和蛋白质数量
| 工作模式 | 样品量(μg) | 多肽数量 | 蛋白数量 | 分级数目 | 质谱时间(h) |
| 一维分离 | 6 | 19949 | 4269 | 无 | 1.4 |
实施例2
如图1(A)所示，一种蛋白质色谱分离平台，包括蛋白质组反应器1和液相色谱-质谱仪2(Orbitrap Fusion,Thermo Fisher Scientific,USA)；其中，蛋白质组反应器1包括标准的200μL枪头3、强阴离子交换膜4(3M Empore,USA)和C18膜5(3M Empore,USA)；C18膜5填充于移液枪枪头3的下端，强阴离子交换膜4填充于移液枪枪头3下端并位于C18膜5之上。
如图1(B)所示，操作时将支撑块6置于1.5mL收集管7上端，将蛋白质组反应器1通过支撑块6置于收集管7之上，将收集管7放入离心机8中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的强阴离子交换分级等操作，具体步骤如下：
细胞或者组织样品使用兼容性的裂解液进行裂解，提取蛋白质成分，测量蛋白浓度，兼容性裂解液的成分为25mmol/L HEPES，pH7.4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2，600mmol/L guanidine HCl，1％DDM和蛋白酶抵制剂。取30μg蛋白样品，加入3mol/L的氨水将样品溶液碱化至pH12。蛋白质组反应器首先分别通过60μL的甲醇和60μL的3mol/L氨水活化。活化后，将样品加入蛋白质组反应器中，通过在离心机8内离心使蛋白质富集到强阴离子交换膜4上；接着，使用含有20％ACN的3mol/L的氨水溶液清洗掉结合到C18膜5上的表面活性剂DDM；接着，加入50mmol/L的DTT溶液，在室温下反应30分钟，完成蛋白质的还原。接着，加入5μL的20mmol/L碳酸氢铵洗去DTT，再加入含有8μg胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，分别使用20μL pH12、pH6和pH2的溶液将生成的多肽从强阴离子交换膜4转移到C18膜5上，即进行强阴离子交换分级。上述分级使用的溶液由20mmol/L CH3COOH、20mmol/L H3PO4和20mmol/L H3BO3组成，用NaOH来调节pH。在每一个强阴离子交换分级之后，加入20μL的5mmol/L甲酸铵水溶液进行除盐。接着，使用pH值为10的含有80％乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液将多肽洗脱下来。洗脱下来的多肽在冻干机冻干后复溶于0.1％甲酸水溶液，在液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测，即二维分离工作模式。
结果如表2所示，鉴定到了35085条多肽和5324个蛋白质。
表2二维分离工作模式下鉴定的多肽和蛋白质数量
| 工作模式 | 样品量(μg) | 多肽数量 | 蛋白数量 | 分级数目 | 质谱时间(h) |
| 二维分离 | 30 | 35085 | 5324 | 3 | 4.2 |
实施例3
如图1(A)所示，一种蛋白质色谱分离平台，包括蛋白质组反应器1和液相色谱-质谱仪2(Orbitrap Fusion,Thermo Fisher Scientific,USA)；其中，蛋白质组反应器1包括标准的200μL枪头3、强阴离子交换膜4(3M Empore,USA)和C18膜5(3M Empore,USA)；C18膜5填充于移液枪枪头3的下端，强阴离子交换膜4填充于移液枪枪头3下端并位于C18膜5之上。
如图1(B)所示，操作时将支撑块6置于1.5mL收集管7上端，将蛋白质组反应器1通过支撑块6置于收集管7之上，将收集管7放入离心机8中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的强阴离子交换分级和高pH值反相分级等操作，具体步骤如下：
细胞或者组织样品使用兼容性的裂解液进行裂解，提取蛋白质成分，测量蛋白浓度，兼容性裂解液的成分为25mmol/L HEPES，pH7.4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2，600mmol/L guanidine HCl，1％DDM和蛋白酶抵制剂。取30μg蛋白样品，加入3mol/L的氨水将样品溶液碱化至pH12。蛋白质组反应器首先分别通过60μL的甲醇和60μL的3mol/L氨水活化。活化后，将样品加入蛋白质组反应器中，通过在离心机8内离心使蛋白质富集到强阴离子交换膜4上；接着，使用含有20％ACN的3mol/L的氨水溶液清洗掉结合到C18膜5上的表面活性剂DDM；接着，加入50mmol/L的DTT溶液，在室温下反应30分钟，完成蛋白质的还原。接着，加入5μL的20mmol/L碳酸氢铵洗去DTT，再加入含有8μg胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，分别使用20μL pH12、pH8、pH6、pH5、pH4和pH2的溶液将生成的多肽从强阴离子交换膜4转移到C18膜5上，即进行强阴离子交换分级。上述分级使用的溶液由20mmol/L CH3COOH、20mmol/L H3PO4和20mmol/L H3BO3组成，用NaOH来调节pH。在每一个强阴离子交换分级之后，加入20μL的5mmol/L甲酸铵水溶液进行除盐。接着，使用pH值为10的分别含有3％、6％、9％、15％、80％乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值反相分级。洗脱下来的多肽在冻干机冻干后复溶于0.1％甲酸水溶液，在液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测，即三维分离工作模式。
结果如表3所示，鉴定到了75298条多肽和8097个蛋白质。
表3三维分离工作模式下鉴定的多肽和蛋白质数量
| 工作模式 | 样品量(μg) | 多肽数量 | 蛋白数量 | 分级数目 | 质谱时间(h) |
| 三维分离 | 30 | 75298 | 8097 | 11 | 20.4 |
经过三维分离后，大大提高了蛋白质和多肽的鉴定数量。图2是每个分级鉴定的蛋白质图2(A)和多肽图2(B)数量分布图，图中同时给出了蛋白质图2(A)和多肽图2(B)数量随分级的累积变化。可以看出，除了2个分级鉴定的蛋白质和多肽较少外，其它9个分级鉴定的蛋白质和多肽数量分布较均匀，体现出较好的分级效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种蛋白质色谱分离平台在细胞、组织或者血液样品的蛋白质鉴定和蛋白质定量分析中的应用，其特征在于，所述的蛋白质色谱分离平台包括蛋白质组反应器(1)与液相色谱-质谱仪(2)；
其中，所述蛋白质组反应器(1)包括移液枪枪头(3)、强阴离子交换树脂(4)和固相萃取膜(5)；固相萃取膜(5)填充于移液枪枪头(3)的下端，强阴离子交换树脂(4)填充于移液枪枪头(3)下端并位于固相萃取膜(5)之上；
所述的蛋白质色谱分离平台的应用为：将生物样本中的蛋白质样品在强阴离子交换树脂上进行酶解和强阴离子交换分级，完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上进行高pH值反相分级，再将多肽转移到液相色谱-质谱仪上进行低pH值液相色谱分离检测，实现三维分离，包括以下步骤：
(1)细胞或者组织样品经裂解液裂解并碱化后，加到预先活化好的蛋白质组反应器中，通过离心使蛋白质富集到强阴离子交换树脂上；
(2)使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到固相萃取膜上的表面活性剂，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原、烷基化和酶解；
(3)使用不同pH值的溶液按pH值从高到低的顺序将生成的多肽从强阴离子交换树脂上依次转移到固相萃取膜上，进行强阴离子交换分级；
(4)除盐后，使用高pH值的含有不同比例有机溶剂的溶液按从低到高的比例依次将多肽洗脱下来，进行高pH值反相分级；
(5)使用液相色谱-质谱仪对多肽样品进行低pH值液相色谱分离检测。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述强阴离子交换树脂(4)为含有季铵基的树脂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固相萃取膜(5)为C18膜。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述不同pH值的溶液按pH值从高到低时使用溶液的pH值从pH12到pH2。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述高pH值反相分级时使用溶液的pH值高于8。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(5)所述低pH值液相色谱分离的pH值低于3。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述裂解液中的表面活性剂是高pH值反相分级和液相色谱-质谱兼容的。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述裂解液中的表面活性剂为正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、胆固醇琥珀酸单酯三羟甲基氨基甲烷盐中的任意一种或两种的混合物。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述含有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液，其中，乙腈和/或甲醇在所述溶液中的体积含量为20％，柠檬酸钾在所述溶液中的浓度为8mmol/L。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
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