CN108548876B - 一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，该方法利用双甲基化标记技术实现相对定量并结合二氧化钛富集技术对复杂生物样本中含量极低的磷酸化肽段进行准确鉴定和定量；并将脱盐和双甲基化标记结合起来同时进行，减少了样品制备过程，有利于磷酸化位点的保持；在二氧化钛富集过程中，在上样缓冲液中加入乙醇酸，能够排除一些含有酸性氨基酸的肽段对磷酸化肽段的干扰，有利于提高富集效率；在脱盐和富集过程中，将制好的柱子放入EP管中通过离心的方法使柱子中加入的液体流过填料代替传统的柱层析方法，不仅节约了实验时间而且提高了一次处理样品的通量，有利于大通量磷酸化肽段的鉴定及定量分析。

Description

一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法

技术领域

本发明涉及磷酸化肽段检测领域，尤其涉及一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法。

背景技术

生物样本中磷酸化肽段的鉴定与定量通常需要将磷酸化肽段进行富集，富集主要有三种常用方法：(1)磷酸钙沉淀法富集技术；(2)固相金属离子亲和层析法；(3)二氧化钛富集技术。磷酸钙沉淀法效率不高，只适用于磷酸化肽段含量较高的样本；固相金属离子亲和层析技术对磷酸化肽段的选择性较弱，并且含有多个磷酸基团的肽段与金属离子固相基质结合过紧而难以通过氨水溶液洗脱下来；二氧化钛富集技术具有较高的灵敏度和较好的广谱选择性，高灵敏度使其能够在磷酸化肽段含量非常低的条件下依旧可以发挥作用，而且所需的起始肽段少。但是二氧化钛富集技术通量较低而且二氧化钛富集技术的富集效率较低，通常在经过富集后的样品中还是能够检测到较多的非磷酸化肽段。磷酸化肽段的定量主要是基于液相色谱质谱联用仪的非标记或标记定量技术。非标记定量技术通常准确性较差因此对仪器及操作人员要求较高；而标记技术多种多样且价格都比较昂贵，标记技术的引入会增加样本的制备过程，样本制备过程的增多会影响磷酸化肽段的稳定性，从而导致鉴定和定量到的磷酸化肽段数量下降。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，该方法利用双甲基化标记技术标记磷酸化肽段与脱盐化处理同时进行实现对磷酸化肽段的相对定量并结合二氧化钛富集技术对复杂生物样本中含量极低的磷酸化肽段进行准确鉴定和定量。

优选的，所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，所述方法具体过程如下：

S1、蛋白质提取、酶解

选取含有磷酸化肽段的细菌、组织、细胞或体液的蛋白质提取物或标准蛋白样品；所述蛋白质提取物或标准蛋白样品经过蛋白质变性、还原和烷基化过程处理，用蛋白酶酶解，酶解反应过后，将肽段溶液加入三氟乙酸终止酶解反应；

S2、肽段脱盐和双甲基化标记

使用C18SepPak脱盐柱，将脱盐柱用甲醇溶液反复润湿；使用60～90％ACN/0.05～2％TFA溶液清洗脱盐柱；再使用0.05～2％TFA溶液平衡脱盐柱，重复一次；将步骤S1所得的肽段溶液室温下离心，得上清液；然后将上清液加入润湿平衡好的脱盐柱中，样品加完后向脱盐柱中加入0.5～5％乙酸，洗掉残留在脱盐柱上的盐离子，重复一次；再向脱盐柱中分五次加入双甲基化标记试剂，标记完后向脱盐柱中加入蒸馏水洗一遍；再加入60～90％ACN/0.05～2％乙酸溶液，将肽段从脱盐柱上洗脱下来，得到的肽段溶液抽干，得到干燥的肽段，保存备用；

优选的，所述60～90％ACN/0.05～2％TFA溶液、0.05～2％TFA溶液、0.5～5％乙酸、双甲基化标记试剂、蒸馏水、60～90％ACN/0.05～2％乙酸溶液的加入量分别为200μl；所述肽段的保存条件为-80℃；

S3、强阳离子交换层析分离、二氧化钛富集

S31、使用强阳离子交换层析技术对样品进行预分离：

所述强阳离子交换层析技术采用含亲水性阴离子聚合物磺酸基与硅胶结合的高效液相色谱仪，通过梯度洗脱将步骤S2中所得肽段进行预分离，得到若干组分，收集样品，抽干备用，以降低步骤S2中所得标记好的肽段的复杂度，提高样品纯度；

优选的，所述梯度洗脱条件为5mM KH₂PO₄/20％ACN，pH2.7的流动相A，500mMKCl/20％ACN，pH2.7的流动相B，不同比值的肽段分离梯度为0到10min为0％B，然后进行40min从20～100％B的梯度进行分离，流速为0.2ml/min，检测波长为216nm，收集样品，抽干备用；

S32、脱盐

将移液枪枪头的尖端用C8填料封住，然后在枪头中装入oligo R3作为脱盐柱填料，再将装好的脱盐柱放入EP管中，脱盐柱依次用100％ACN、60～80％ACN、0.05～2％TFA平衡；然后用0.05～2％TFA溶解步骤S31抽干后的肽段并加入脱盐柱中，通过脱盐柱流出的液体再重新加到脱盐柱中，接着用0.05～2％TFA冲洗脱盐柱两遍；最后，向脱盐柱中加入60～90％ACN，2～8％TFA，0.5～5M乙醇酸洗脱液，离心，收集EP管中洗脱液；

优选的，所述移液枪的枪头为200μl；

S33、二氧化钛富集

将移液枪枪头的尖端用C8填料封住，然后在枪头中装入TiO₂小球形成富集柱，将制好的富集柱放入EP管中，将装好的枪头依次用100％ACN和60～90％ACN，2～8％TFA，0.5～5M乙醇酸上样液平衡，然后将步骤S32收集的洗脱液加到EP管中让其通过TiO₂填料，通过富集柱流出的液体再重新加到柱子上以使磷酸化肽段充分与TiO₂结合；接着用60～90％ACN，2～8％TFA，0.5～5M乙醇酸上样液洗一遍使TiO₂结合的含有酸性氨基酸的肽段被洗脱掉；用60～90％ACN，0.5～2％TFA洗脱液将非磷酸化肽段洗掉；用去离子水洗一遍；最后，加入1～2％氨水洗脱液洗脱，离心，收集EP管中洗脱液。

在样品制备过程中利用双甲基化标记技术标记肽段对磷酸化肽段进行相对定量，并将双甲基化标记与肽段的脱盐同时进行，减少了样品的制备步骤并且对双甲基标记效率没有影响，有利于磷酸化位点的保持；在用二氧化钛富集过程中，在上样缓冲液中加入乙醇酸，由于乙醇酸结合二氧化钛的能力比酸性氨基酸强但是比磷酸化肽段弱，因此能够排除一些含有酸性氨基酸的肽段对磷酸化肽段的干扰，从而提高富集效率；在脱盐和富集过程中，将制好的柱子放入EP管中通过离心的方法使柱子中加入的液体流过填料代替传统的柱层析方法，不仅节约了实验的时间而且提高了一次处理样品的通量，有利于大通量磷酸化肽段的鉴定及定量分析。

优选的，所述双甲基化标记试剂为甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，对肽段进行标记，是指：不同肽段分别用轻标记试剂、中标记试剂和重标记试剂进行同位素标记；

其中，所述不同肽段选取自不同含有磷酸化肽段的细菌、组织、细胞或体液的蛋白质提取物或标准蛋白样品；所述蛋白质提取物或标准蛋白样品经过蛋白质变性、还原和烷基化过程处理，用蛋白酶酶解，酶解反应过后，将肽段溶液加入三氟乙酸终止酶解反应；

所述轻标记试剂为：CH₂O、NaBH₃CN；

所述中标记试剂为：CD₂O、NaBH₃CN；

所述重标记试剂为：¹³CD₂O、NaBD₃CN；

所述CH₂O、CD₂O、¹³CD₂O为反应试剂，所述NaBH₃CN和NaBD₃CN为还原试剂。

优选的，所述轻标记试剂为：CH₂O、NaBH₃CN；所述中标记试剂为：CD₂O、NaBH₃CN；所述重标记试剂为：¹³CD₂O、NaBD₃CN。

优选的，每100μg肽段溶液分别加入所述轻标记试剂或中标记试剂或重标记试剂的量为10nmol～1mol标记试剂，其中所述反应试剂的浓度为0.01～38％体积浓度，所述还原试剂的浓度为0.006～6M。

优选的，每次加入的所述轻标记试剂的组成为10μl 4％CH₂O，10μl 0.6M NaBH₃CN，40μl 50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄；

或者，每次加入的所述中标记试剂的组成为10μl 4％CD₂O，10μl 0.6M NaBH₃CN，40μl50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄；

或者，每次加入的所述重标记试剂的组成为10μl 4％¹³CD₂O，10μl 0.6M NaBD₃CN，40μl 50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄。

优选的，所述步骤S3的S33步骤中枪头中装入TiO₂小球按照肽段溶液与TiO₂小球质量比为1:6～10装入。

优选的，所述步骤S3的S33步骤中枪头中装入TiO₂小球按照肽段溶液与TiO₂小球质量比为1:8装入。

优选的，所述步骤S1中蛋白酶为内肽酶lys-C或胰蛋白酶；所述蛋白质变性采用的变性剂为尿素；所述蛋白质还原采用的还原剂为二硫苏糖醇DTT；所述烷基化过程采用的试剂为碘乙酰胺。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)将脱盐和双甲基化标记结合起来同时进行，减少了样品制备过程并且对双甲基标记效率没有影响，有利于磷酸化位点的保持；

(2)在用二氧化钛富集过程中，在上样缓冲液中加入乙醇酸，由于乙醇酸结合二氧化钛的能力比酸性氨基酸强但是比磷酸化肽段弱，因此能够排除一些含有酸性氨基酸的肽段对磷酸化肽段的干扰，从而提高富集效率；

(3)在脱盐和富集过程中，将制好的柱子放入EP管中通过离心的方法使柱子中加入的样品流过填料代替传统的柱层析方法，不仅节约了实验的时间而且提高了一次处理样品的通量，有利于大通量磷酸化肽段的鉴定及定量分析。

附图说明

图1为磷酸化肽段在phoP^-10μM Mg²⁺组(a组)、野生型10μM Mg²⁺组(b组)、野生型10mM Mg²⁺组(c组)三个条件中的分布情况。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

细菌样本中磷酸化肽段的含量是公认较低的，本实施例以鼠伤寒沙门氏菌为例具体阐述。

细菌培养：本实例使用的细菌是野生型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Typhimurium)和phoP基因缺陷型鼠伤寒沙门氏菌。细菌培养所使用的培养基配方为N-minimal:5mMKCl，7.5mM(NH₄)₂SO₄，0.5mM K₂SO₄，1mM KH₂PO₄，0.1M Trisbase，38mMglycerol，0.1％casamino acids，培养基中不同浓度的镁离子由MgCl₂·6H₂O提供。

细菌培养如下：将phoP^-菌株在含有10μM Mg²⁺的N-minimal培养基中培养，野生型菌株则分别在含10μM Mg²⁺和10mM Mg²⁺的N-minimal培养基中培养，得到三种菌液进行下一步提取蛋白。

S1、细菌蛋白提取、酶解

将步骤S1中培养好的3种细菌分别用预冷的由8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.27g/LKH₂PO₄，1.42g/L Na₂HPO₄配制的PBS溶液清洗一次，然后用pH 7.5 50mM Tris–HCl，5mMEDTA细菌裂解液重悬，并加入蛋白酶抑制剂protease inhibitor Cocktail(Roche)和磷酸酶抑制剂Phosphostop(Roche)，混匀后在冰水浴中进行超声波破碎，破碎后的菌液在4℃条件下12000g离心力下离心30min，得到的上清液即为目标蛋白溶液；往目标蛋白溶液中加入3倍体积的由50％乙醇/50％丙酮/0.1％乙酸组成的混合有机溶剂，边加边混匀，然后在-40℃条件下静置2小时使蛋白沉淀，然后4000g离心力下离心20min，弃去上清后，常温晾干；得到的蛋白固体用8M尿素，4mM CaCl₂，pH 8.0 200mM Tris-Cl溶液充分重悬使蛋白变性；在重悬液中加入DTT至终浓度10mM，在55℃水浴中反应30min，使蛋白中的二硫键被还原；加入碘乙酰胺至终浓度为40mM，置于暗处，烷基化反应30min；反应结束后用Bradford法测定蛋白的浓度，按蛋白与酶50:1的质量比例加入蛋白酶lys-C(Woke)，然后在37℃摇床中预酶解3h；预酶解后的蛋白液加水稀释4倍使尿素的浓度低于2M，然后再用Bradford法测定蛋白的浓度，分别取三种菌液蛋白500μg至新EP管中，按蛋白与酶50:1的质量比例加入胰蛋白酶，并在37℃摇床中酶解12h过夜，酶解反应过后，将肽段溶液加入三氟乙酸调整pH至6左右以终止酶解反应。

S2、肽段脱盐和双甲基化标记

使用的脱盐柱为Waters公司的C18SepPak脱盐柱。具体过程如下：将C18脱盐柱用纯的甲醇溶液反复润湿；使用200μl80％ACN/0.1％TFA溶液清洗脱盐柱一次；使用200μl的0.1％TFA溶液平衡脱盐柱，重复一次；将酸化后的肽段室温下12000g离心力下离心5min，得上清液；然后将上清液加入润湿平衡好的脱盐柱中，样品加完后向脱盐柱中加入200μl1％乙酸，洗掉残留在脱盐柱上的盐离子，重复一次；再向脱盐柱中分五次加入轻标记试剂、或中标记试剂、或重标记试剂，具体方法为：每500μg肽段溶液分五次每次加入轻标记试剂10μl 4％CH₂O，10μl 0.6M NaBH₃CN，40μl 50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄；或中标记试剂10μl 4％CD₂O，10μl 0.6M NaBH₃CN，40μl 50mM NaH₂PO₄，140μl50mM Na₂HPO₄；或重标记试剂10μl 4％¹³CD₂O，10μl 0.6M NaBD₃CN，40μl 50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄，标记完后向脱盐柱中加入200μl蒸馏水洗一遍；再加入200μl 80％ACN/0.1％乙酸溶液，将肽段从脱盐柱上洗脱下来，得到的肽段溶液在真空浓缩仪中抽干，得到干燥的肽段，在-80℃条件下保存备用。

S3、强阳离子交换层析分离、二氧化钛富集

S31、使用强阳离子交换层析技术对样品进行预分离：

使用强阳离子交换层析(SCX)技术对样品进行预分离，使用Agilent 1200HPLC进样系统，将经过上述步骤肽段脱盐和双甲基化标记处理得到的肽段结合到含有亲水性阴离子聚合物磺酸基与硅胶结合的色谱柱上进行预分离，然后通过提高流动相中阳离子的浓度将肽段按其与柱子的结合强度先后洗脱下来；所述洗脱条件为5mM KH₂PO₄/20％ACN,pH2.7的流动相A，500mMKCl/20％ACN，pH2.7的流动相B；

具体操作过程如下：将经过上述步骤肽段脱盐和双甲基化标记处理得到的1.5mg混合肽段用流动相A液溶解，通过Agilent 1200HPLC进样系统使肽段首先结合在聚合物磺酸基与硅胶结合的柱子(2.1×50mm,

The Nest Group,Inc.)上。设定流动相B液的比例使KCl的浓度不断提高，肽段被逐渐洗脱下来。液相的流速为0.2ml/min，检测波长为216nm，每1min收集一管样品，获得的样品根据肽段的量等量地分成8个组分，抽干后进行下一步实验；流动相A和流动相B的梯度及洗脱时间如下表所示：

S32、脱盐

将200μl枪头的尖端用C8填料封住，然后在枪头中装入oligo R3作为脱盐柱填料，再将装好的脱盐柱放入EP管中，脱盐柱依次用100％ACN、70％ACN、0.1％TFA平衡；然后用0.1％TFA溶解抽干后的肽段并加入脱盐柱中，通过脱盐柱流出的液体再重新加到脱盐柱中，接着用0.1％TFA冲洗脱盐柱两遍；最后，向脱盐柱中加入80％ACN，5％TFA，1M乙醇酸洗脱液，离心，收集EP管中洗脱液；

S33、二氧化钛富集

将200μl枪头的尖端用C8填料封住，然后在枪头中按照肽段洗脱液与二氧化钛小球质量比为1:8装入TiO₂小球形成富集柱，将制好的富集柱放入EP管中，将装好的枪头依次用100％ACN和80％ACN，5％TFA，1M乙醇酸上样液平衡，然后将步骤S32收集的洗脱液加到EP管中让其通过TiO₂填料，通过富集柱流出的液体再重新加到柱子上以使磷酸化肽段充分与TiO₂结合；接着用80％ACN，5％TFA，1M乙醇酸上样液洗一遍使TiO₂结合的含有酸性氨基酸的肽段被洗脱掉；用80％CAN，1％TFA洗脱液将非磷酸化肽段洗掉；用去离子水洗一遍；最后，加入1.25％氨水洗脱液洗脱，离心，收集EP管中洗脱液。

质谱分析：

质谱分析使用的是Thermo公司的QE-HF与Easy-nLC1000结合的液质联用系统。磷酸化富集肽段用5μl流动相A(去离子水加上0.1％甲酸)溶解，经过进样系统进入液相中，首先结合到一个C18的预柱(AcclaimPepMap^R100，100μm×2cm，nanoViper C18，5μm，

)上；然后经过120min流动相梯度(流动相A：去离子水加上0.1％甲酸；流动相B：ACN加上0.1％甲酸)洗脱下来，然后进入分析柱(AcclaimPepMap^RRSLC，75μm×25cm,nanoViperC18,，2μm，

)，不同的肽段依次被离子化后进入质量分析器被分析。流动相A和流动相B的梯度及洗脱时间如下表所示：

数据采集方式为Full MS/dd-MS²(Top20)模式，前体离子扫描范围是300到1800m/z。质谱原始数据使用PD2.1进行定性定量分析。搜索引擎Sequest参数设置如下：母离子容错为10ppm，子离子容错为0.02Da；半胱氨酸的烷基化设置为固定修饰；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化，甲硫氨酸的氧化以及肽段N段和赖氨酸侧链的双甲基化((K)/(N-term)/2H(4)K/2H(4)N-term/13C(2)2H(6)K/13C(2)2H(6)N-term)设置为可变修饰；肽段的带电量设置为+2或+3；肽段最多允许两个漏切位点。phosphoRS得分90以上认定为可信的磷酸化肽段。

采用上述分析方法分析实施例1步骤S33收集得到的洗脱液，共鉴定到了337个磷酸化位点，这些磷酸化位点分布在293条磷酸化肽段上，属于224个蛋白，其中44条肽段含有多个磷酸化位点，有70条磷酸化肽段定量信息，这些数据在细菌中是比较高的水平，所述磷酸化肽段定量信息如下表所示。在337个磷酸化位点中，其中最多的是丝氨酸磷酸化占48.96％，其次是苏氨酸磷酸化占38.58％，最后是酪氨酸磷酸化占12.46％；其中，这些磷酸化位点在phoP^-10μM Mg²⁺组中鉴定到140个，野生型10μM Mg2+组中鉴定到了139个，野生型10mM Mg2+组鉴定到了143个；鉴定得到的293条磷酸化肽段在phoP^-10μM Mg²⁺组、野生型10μM Mg²⁺组、野生型10mM Mg²⁺组三个条件中的分布情况分别如图1(a)(b)(c)所示，由图1可知，在phoP^-10μM Mg²⁺组中鉴定到了128个磷酸化肽段，野生型10μM Mg²⁺组中鉴定到了126个磷酸化肽段，野生型10mM Mg²⁺组鉴定到了122个磷酸化肽段，虽然在三个条件中鉴定到的磷酸化肽段大致相同，但是共同的肽段却比较少。

以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变，均仍属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，所述方法具体过程如下：

S1、蛋白质提取、酶解

选取含有磷酸化肽段的细菌、组织或体液的蛋白质提取物或标准蛋白样品；所述蛋白质提取物或标准蛋白样品经过蛋白质变性、还原和烷基化过程处理，用蛋白酶酶解，酶解反应过后，将肽段溶液加入三氟乙酸终止酶解反应；

S2、肽段脱盐和双甲基化标记

使用C18SepPak脱盐柱，将脱盐柱用甲醇溶液反复润湿；使用60～90％ACN/0.05～2％TFA溶液清洗脱盐柱；再使用0.05～2％TFA溶液平衡脱盐柱，重复一次；将步骤S1所得的肽段溶液室温下离心，得上清液；然后将上清液加入润湿平衡好的脱盐柱中，样品加完后向脱盐柱中加入0.5～5％乙酸，洗掉残留在脱盐柱上的盐离子，重复一次；再向脱盐柱中分五次加入双甲基化标记试剂，标记完后向脱盐柱中加入蒸馏水洗一遍；再加入60～90％ACN/0.05～2％乙酸溶液，将肽段从脱盐柱上洗脱下来，得到的肽段溶液抽干，得到干燥的肽段，保存备用；

S3、强阳离子交换层析分离、二氧化钛富集

S31、使用强阳离子交换层析技术对样品进行预分离：

所述强阳离子交换层析技术采用含亲水性阴离子聚合物磺酸基与硅胶结合的高效液相色谱仪，通过梯度洗脱将步骤S2中所得肽段进行预分离，得到若干组分，收集样品，抽干备用，以降低步骤S2中所得标记好的肽段的复杂度，提高样品纯度；

S32、脱盐：

将移液枪枪头的尖端用C8填料封住，然后在枪头中装入oligoR3作为脱盐柱填料，再将装好的脱盐柱放入EP管中，脱盐柱依次用100％ACN、60～80％ACN、0.05～2％TFA平衡；然后用0.05～2％TFA溶解步骤S31抽干后的肽段并加入脱盐柱中，通过脱盐柱流出的液体再重新加到脱盐柱中，接着用0.05～2％TFA冲洗脱盐柱两遍；最后，向脱盐柱中加入60～90％ACN，2～8％TFA，0.5～5M乙醇酸洗脱液，离心，收集EP管中洗脱液；

S33、二氧化钛富集

将移液枪枪头的尖端用C8填料封住，然后在枪头中装入TiO₂小球形成富集柱，将制好的富集柱放入EP管中，将装好的枪头依次用100％ACN和60～90％ACN，2～8％TFA，0.5～5M乙醇酸上样液平衡，然后将步骤S32收集的洗脱液加到EP管中让其通过TiO₂填料，通过富集柱流出的液体再重新加到柱子上以使磷酸化肽段充分与TiO₂结合；接着用60～90％ACN，2～8％TFA，0.5～5M乙醇酸上样液洗一遍使TiO₂结合的含有酸性氨基酸的肽段被洗脱掉；用60～90％ACN，0.5～2％TFA洗脱液将非磷酸化肽段洗掉；用去离子水洗一遍；最后，加入1～2％氨水洗脱液洗脱，离心，收集EP管中洗脱液。

2.根据权利要求1所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，所述双甲基化标记试剂为甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，对肽段进行标记，是指：不同肽段分别用轻标记试剂、或中标记试剂、或重标记试剂进行同位素标记；

所述轻标记试剂为：CH₂O、NaBH₃CN；

所述中标记试剂为：CD₂O、NaBH₃CN；

所述重标记试剂为：¹³CD₂O、NaBD₃CN；

定义所述CH2O、CD2O、¹³CD2O为反应试剂，所述NaBH₃CN和NaBD₃CN为还原试剂。

3.根据权利要求2所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，每100μg肽段溶液分别加入所述轻标记试剂或中标记试剂或重标记试剂的量为10nmol～1mol标记试剂，其中所述反应试剂的浓度为0.01～38％体积浓度，所述还原试剂的浓度为0.006～6M。

4.根据权利要求2所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，每次加入的所述轻标记试剂的组成为10μl 4％CH₂O，10μl 0.6M NaBH₃CN，40μl50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄；

或者，每次加入的所述中标记试剂的组成为10μl 4％CD₂O，10μl 0.6M NaBH₃CN，40μl50mM NaH₂PO₄，140μl 50mM Na₂HPO₄；

或者，每次加入的所述重标记试剂的组成为10μl 4％13CD₂O，10μl 0.6M NaBD₃CN，40μl50mM NaH₂PO4，140μl 50mM Na₂HPO₄。

5.根据权利要求1所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，所述步骤S3的S33步骤中枪头中装入TiO₂小球按照肽段溶液与TiO₂小球质量比为1:6～10装入。

6.根据权利要求5所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，所述步骤S3的S33步骤中枪头中装入TiO₂小球按照肽段溶液与TiO₂小球质量比为1:8装入。

7.根据权利要求1所述的一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法，其特征在于，所述步骤S1中蛋白酶为内肽酶lys-C或胰蛋白酶；所述蛋白质变性采用的变性剂为尿素；所述蛋白质还原采用的还原剂为二硫苏糖醇DTT；所述烷基化过程采用的试剂为碘乙酰胺。

Images