CN116953253A - 一种用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，包括以下步骤：1)设置至少两组外源蛋白参考品，每组外源蛋白参考品至少包含一种含有三个不同磷酸化修饰位点的蛋白，并且对于每一组中每种蛋白，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应蛋白；2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源蛋白参考品，且任意两组外源蛋白参考品加入的时间点之间，均包括磷酸化蛋白提取的步骤；3)进样检测，提取处理数据，定量外源蛋白参考品，计算不同磷酸化修饰位点的蛋白的得率比值，以此评价两个外源蛋白参考品加入时间点之间的提取过程是否合格。该方法能有效评价磷酸化位点降解程度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法。
背景技术
蛋白质磷酸化是由蛋白质激酶催化的，将ATP的磷酸基团转移到底物氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)等上的过程，是生物体内一种常见而重要的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。磷酸化蛋白质组学是主要的研究手段，质谱法是鉴别蛋白磷酸化位点和定量磷酸化变化的关键工具。磷酸化蛋白的富集对于成功的磷酸肽质谱分析至关重要。目前富集方法包括TiO2富集方法、抗体、固定化金属亲和层析(IMAC)、化学修饰和强阳离子交换层析(SCX)等。
但蛋白质磷酸化具有不稳定性，一是蛋白质磷酸化具有可逆性，其逆向过程则是由蛋白质磷酸酶去除相应的磷酸基团；二是由于磷酸化基团在高温或高pH条件下容易降解。因此减少磷酸化修饰位点的损失，质控磷酸化蛋白过程变得极为必要。目前，大多数磷酸化蛋白提取过程中并不做质控，只在质谱上机后通过鉴定数与富集效率判断此次实验是否成功，但无法确定是降解还是富集过程导致的富集效率或鉴定数低。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于监测磷酸化蛋白质组学中，磷酸化蛋白提取过程磷酸化位点降解程度的方法。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，包括以下步骤：
1)设置至少两组外源蛋白参考品，每组外源蛋白参考品至少包含一种含有三个不同磷酸化修饰位点的蛋白，并且对于每一组中每种蛋白，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应蛋白；
2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源蛋白参考品，且任意两组外源蛋白参考品加入的时间点之间，均包括磷酸化蛋白提取的步骤；
3)进样检测，提取处理数据，定量外源蛋白参考品，计算不同磷酸化修饰位点的蛋白的得率比值，以此评价两个外源蛋白参考品加入时间点之间的提取过程是否合格。
该方法用以评估磷酸化蛋白提取过程中，磷酸化蛋白得率及实验流程是否合格。
优选的，步骤1)中，所述不同磷酸化修饰位点选自分布在苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸残基上的磷酸化修饰位点，优选分布在苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基上的磷酸化修饰位点。
优选的，步骤1)中，每组中有磷酸化修饰位点的蛋白，与其他组中有磷酸化修饰位点的蛋白相比，序列一致的，磷酸化修饰位点也相同。
优选的，步骤1)中，所述同位素标记不同包括：一组中蛋白没有同位素标记，其他各组中蛋白有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同；或者各组中蛋白都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
优选的，步骤1)中，所述同位素标记中的同位素包括：12C、13C、14C、14N、15N、16O、18O、1H、2H、32S、34S、30P、32P。
优选的，步骤2)中，所述样品选自细胞、组织、血浆、血清、全血、尿液、脑脊液、唾液、淋巴液、胸腔积水、乳汁、组织液、微生物或植物。
优选的，步骤2)中，所述外源蛋白参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入。
作为具体实施方案，所述磷酸化蛋白提取的步骤，包括磷酸化蛋白提取的所有步骤或者部分步骤。即两组外源蛋白参考品加入的时间点之间，有的可以包括磷酸化蛋白提取的所有步骤，有的可以包括磷酸化蛋白提取的部分步骤。
优选的，步骤3)中，所述检测的方法为质谱检测，如LC-MS/MS，MALDI-TOF。
进一步的，步骤3)中，若在前加入的外源蛋白参考品是在磷酸化蛋白提取前或者富集开始时加入，在后加入的外源蛋白参考品是在磷酸化蛋白提取完成时或者富集完成后加入，则将在前加入的外源蛋白参考品的磷酸化修饰蛋白丰度除以在后加入的外源蛋白参考品的相同序列蛋白的丰度，得到不同磷酸化修饰蛋白的得率比值，以此评价整个磷酸化蛋白提取过程是否合格。
进一步的，步骤3)中，所述在前加入的外源蛋白参考品和在后加入的外源蛋白参考品，若两者加入时间点之间仅包括磷酸化蛋白提取过程的部分步骤，则将在前加入的外源蛋白参考品的磷酸化修饰蛋白丰度除以在后加入的外源蛋白参考品的相同序列蛋白的丰度，得到不同磷酸化修饰蛋白的得率比值，以此评价上述磷酸化蛋白提取过程的部分步骤是否合格。
优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，可以使用软件对蛋白参考品的蛋白进行定性定量数据提取，可使用部分先进质谱检测软件自带的实时鉴定方法，或在获得全数据后进行定性定量数据提取。
优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，使用蛋白质组分析软件如：ProteomeDiscoverer、PEAKs、DIA-NN、Spectronaut、Maxquant、Skyline，将所有定性定量蛋白数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应蛋白丰度。
作为优选方案，当外源蛋白参考品设置两组时，具体的方法如下：
1)准备两组外源蛋白参考品A和B，A组和B组外源蛋白参考品均包含一种含三个不同磷酸化修饰位点的蛋白，A组作为检测标品，B组中的外源蛋白参考品与A组中蛋白序列对应相同，但同位素标记不同，作为标定标品，同位素标记为精氨酸(R)、赖氨酸(K)13C标记与15N标记，其磷酸化修饰位点分布均为：苏氨酸，丝氨酸、酪氨酸残基上；
2)将两组参考品分开使用，在进行磷酸化蛋白提取前或提取中检测标品蛋白组A混合加入样本中，提取完成后将标定标品蛋白组B混合加入样本中，进样检测；
3)使用蛋白质组分析软件Proteome Discoverer，将所有定性定量蛋白数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应蛋白丰度，根据检测标品蛋白组A与标定标品蛋白组B比例计算得率，以评价磷酸化蛋白提取过程是否合格，计算公式为：回收率＝检测标品蛋白组A的蛋白强度/标定标品蛋白组B的蛋白强度。
有益效果：与现有技术相比，本发明可以有效评估磷酸化蛋白提取流程是否合格，本方法可以直观、定量评估磷酸化蛋白提取流程对样本造成的影响，从而评估样本操作过程中磷酸化位点的损失情况，进一步可以指导磷酸化蛋白提取流程的改良，也可以用于评估不同磷酸化蛋白提取方法对样本中磷酸化蛋白提取效果。
附图说明
图1：为本发明评估方法的流程示意图。
图2：为实施例1的实验流程示意图。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例
1.使用昆虫细胞表达系统表达同位素标记(R与K使用13C6标记)的重组蛋白，纯化后使用Fam20C激酶与ATP处理，得到磷酸化蛋白，命名为检测标品蛋白组A，其序列如下：
MSEVPVARVWLVLLLLTVQVGVTAGAPWQCAPCSAEKLALCPPVSASCSEVTRSAGCGCCPMCALPLGAACGVATARCARGLSCRALPGEQQPLHALTRGQGACVQESDASAPHAAEAGSPESPESTEITEEELLDNFHLMAPSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVT(Phos)NEKKWKEPCRIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFY(Phos)LENCNKNGFYHSRQCETSMDGEAGLCWCVYPWNGKRIPGS(Phos)PEIRGDPNCQIYFNVQN
2.同样使用昆虫细胞表达系统，但同位素标记不同(R使用13C6与15N4标记，K使用13C6与15N2标记)，纯化后使用Fam20C激酶与ATP处理，得到磷酸化蛋白，命名为标定标品蛋白组B，其序列与检测标品蛋白组A相同；(标品蛋白组A和标品蛋白组B均通过生物公司定制表达)。
3.将检测标品蛋白组A及标定标品蛋白组B均稀释到浓度为100ng/μL；
4.向50μLHEK293细胞沉淀中加入300μL裂解液(0.5％ SDC,100mM Tris pH＝8.8,磷酸酶抑制剂)并加入5μL检测标品蛋白组A，吹打混匀，进行两个重复；
5.一份样本使用探头超声仪常温超声8min(3s-on，3s-off，195W功率)，得到样品1；另一份使用探头超声仪冰水浴超声8min(3s-on，3s-off，195W功率)，得到样品2；
6. 4℃12,000g离心10min后将上清转移到新的EP管中，使用DTT与IAM进行还原烷基化；
7.进行蛋白质组提取完成后，样本1与样本2分别取1mg蛋白并加入5μL标定标品蛋白组B，分别加入20μg胰蛋白酶，用50mMNH4HCO3溶液补齐至500μL体系，37℃酶解过夜；
8.取SPE C18 1mL除盐柱，按如下顺序加入：甲醇1mL，0.1％甲酸1mL*2次，上样*2遍，0.1％甲酸1mL*3次，使用70％乙腈1mL洗脱样品；
9.将洗脱样品进行离心真空冷冻干燥；
10.使用High-SelectTM磷酸化多肽富集试剂盒进行磷酸化富集；
11.将富集后的样品进行离心真空冷冻干燥，并使用20μL 0.1％甲酸水复溶；
12.分别进样15μL至液相质谱进行150min DDA数据采集，液相质谱为ThermoU3000+QE-HF进行检测；流动相A为2％乙腈、0.1％甲酸水溶液，流动相B为80％乙腈和0.1％甲酸水溶液；设置梯度为0-5min，3％ B，5-140min，3％-90％ B，
140-150min，90％-3％ B；
13.本实例使用Proteome Discoverer软件对数据进行抽提，固定化修饰为半胱氨酸的烷基化修饰，可变修饰为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化修饰，导出peptide定性定量
数据表，得到两组蛋白在2个样本中丰度如下表：
表1.样品1和样品2抽提蛋白标品3个肽段的定量信息
表2.样品1、2中抽提部分样品肽段定量信息
通过分析比例数据，发现样品1中三种磷酸化蛋白定量比例明显偏小，且对比样品1与样品2中相同蛋白定量比例可知，样品1中的磷酸化蛋白回收比例同样偏小，说明在对蛋白溶液进行超声处理时，使用低温条件能够有效降低磷酸化蛋白的损失。
Claims (10)
1.一种用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设置至少两组外源蛋白参考品，每组外源蛋白参考品至少包含一种含有三个不同磷酸化修饰位点的蛋白，并且对于每一组中每种蛋白，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应蛋白；
2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源蛋白参考品，且任意两组外源蛋白参考品加入的时间点之间，均包括磷酸化蛋白提取的步骤；
3)进样检测，提取处理数据，定量外源蛋白参考品，计算不同磷酸化修饰位点的蛋白的得率比值，以此评价两个外源蛋白参考品加入时间点之间的提取过程是否合格。
2.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤1)中，所述不同磷酸化修饰位点选自分布在苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸残基上的磷酸化修饰位点，优选分布在苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基上的磷酸化修饰位点。
3.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤1)中，每组中有磷酸化修饰位点的蛋白，与其他组中有磷酸化修饰位点的蛋白相比，序列一致的，磷酸化修饰位点也相同。
4.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素标记不同包括：一组中蛋白没有同位素标记，其他各组中蛋白有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同；或者各组中蛋白都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
5.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素标记中的同位素包括：12C、13C、14C、14N、15N、16O、18O、1H、2H、32S、34S、30P、32P。
6.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤2)中，所述样品选自细胞、组织、血浆、血清、全血、尿液、脑脊液、唾液、淋巴液、胸腔积水、乳汁、组织液、微生物或植物。
7.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤2)中，所述外源蛋白参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入；所述磷酸化蛋白提取的步骤，包括磷酸化蛋白提取的所有步骤或者部分步骤。
8.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤3)中，所述检测的方法为质谱检测。
9.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤3)中，若在前加入的外源蛋白参考品是在磷酸化蛋白提取前或者提取开始时加入，在后加入的外源蛋白参考品是在磷酸化蛋白提取完成时或者提取完成后加入，则将在前加入的外源蛋白参考品的磷酸化修饰蛋白丰度除以在后加入的外源蛋白参考品的相同序列蛋白的丰度，得到不同磷酸化修饰蛋白的得率比值，以此评价整个磷酸化蛋白提取过程是否合格。
10.根据权利要求1所述的用于监测磷酸化蛋白质组学中磷酸化位点降解程度的方法，其特征在于，步骤3)中，所述在前加入的外源蛋白参考品和在后加入的外源蛋白参考品，若两者加入时间点之间仅包括磷酸化蛋白提取过程的部分步骤，则将在前加入的外源蛋白参考品的磷酸化修饰蛋白丰度除以在后加入的外源蛋白参考品的相同序列蛋白的丰度，得到不同磷酸化修饰蛋白的得率比值，以此评价上述磷酸化蛋白提取过程的部分步骤是否合格。
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