CN109439654A - 一种免前处理自动化提取大体积全血dna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种免前处理自动化提取大体积全血DNA的方法，其特征在于包括下列步骤：1、制备一种能够吸附白细胞的磁性微球A；使用活化剂将羧基磁性纳米微球活化，再用含1～10%质量体积百分比浓度的多聚赖氨酸或多聚丙氨酸的10～50mmol/L pH8.0～9.0的磷酸钠或磷酸钾缓冲液（简称PB）交联，然后用封闭液封闭，最后，将微球悬浮于10～50mmol/L pH8.0～9.0的缓冲液中，即得磁性微球A；2、从大体积全血中提取DNA；1）使用红细胞裂解液裂解红细胞，其过程中同时用磁性微球A吸附白细胞；2）使用白细胞裂解液裂解吸附在磁性微球A上的白细胞，并将释放的DNA用磁性微球B提取出来。本发明的主要优点是：整个过程克服了现有大体积全血技术先用手工操作进行前处理再进行自动化提取的弊端。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种免前处理工序并能实现完整自动化提取大体积全血DNA的方法。
背景技术
随着基因组测序技术快速进步，以及生物信息与大数据科学的交叉应用，使人们可以更准确地理解环境和人类遗传分子之间的相互作用，以期精确地描绘疾病发生的本质，从而改进目前对于疾病的诊查和治疗，推动了转化医学和以个体化医疗为基础的精准医疗的快速发展。生物样本库(Biobank)，尤其是DNA样本库是众多重要科研成果快速产业化、应用到临床，实现“转化医学”和“精准医疗”的重要保证。随着医院和第三方独立医学实验室等医疗机构建立DNA样本库的需求越来越广泛，1～10ml大体积全血DNA提取的工作量迅速增加，传统的手工操作已经不能满足建立DNA样本库的要求，采用自动化工作站进行大体积全血DNA的快速提取已经成为大势所趋。
目前，市场上大体积全血DNA提取的主流技术主要有两类：离心柱法和磁性纳米微球法。不管是哪种技术，都需要在DNA提取之前，对大体积全血进行前处理，把血细胞或者白细胞分离出来，或者较新鲜的全血可以分离制备得到白膜，然后再用离心柱法或者磁性纳米微球法从血细胞、白细胞或者白膜样品中分离提取DNA。常用的分离血细胞的方法：用离心机对全血样品进行离心，弃掉血浆，得到去血浆血细胞。常用的分离白细胞的方法：先用红细胞裂解液裂解红细胞，然后离心，并经过PBS洗涤得到白细胞。常用的制备白膜的方法：对较新鲜的全血进行离心，全血会分为三层，中间是被称作白膜的白细胞层，然后用移液器小心吸取中间层得到白膜。不管是制备去血浆血细胞，还是制备白细胞或者白膜的过程都需要用到离心机，需要手工弃掉上清，或者手工吸取中间层，仍需手工操作，很难实现自动化操作。因此，虽然前处理之后使用离心柱法或磁性纳米微球法从血细胞、白细胞或白膜样品中提取DNA的过程都可实现自动化操作，但大体积全血的前处理过程仍需手工操作，无法实现整个大体积全血DNA提取过程的完整自动化操作。
发明内容
本发明的目的就是克服现有技术需要手工操作进行前处理的不足，发明了一种能够吸附白细胞的磁性微球A，利用磁性微球A吸附白细胞的方法取代现有大体积全血DNA提取技术中利用离心方法分离制备血细胞/白细胞/白膜的前处理步骤，然后再通过传统方法利用磁性微球B将白细胞中的DNA提取出来。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种免前处理自动化提取大体积全血DNA的方法，其特征在于包括下列步骤：
1、制备一种能够吸附白细胞的磁性微球A
使用活化剂将羧基磁性纳米微球活化，再用含1～10％质量体积百分比浓度的多聚赖氨酸或多聚丙氨酸的10～50mmol/L pH8.0～9.0的磷酸钠或磷酸钾缓冲液(简称PB)交联，然后用封闭液封闭，最后，将微球悬浮于10～50mmol/L pH8.0～9.0的缓冲液中，即得磁性微球A。
2、从大体积全血中提取DNA
1)使用红细胞裂解液裂解红细胞，其过程中同时用磁性微球A吸附白细胞；
2)使用白细胞裂解液裂解吸附在磁性微球A上的白细胞，并将释放的DNA用磁性微球B提取出来。
所述羧基磁性纳米微球为表面修饰羧基的磁性微球B。本发明中使用的羧基磁性纳米微球和磁性微球B可购买商品化的成品，也可使用文献公开报道的方法直接合成。
所述红细胞裂解液能够裂解红细胞，并促进白细胞吸附于磁性微球A。其包含促进白细胞吸附于磁性微球A的质量体积百分比浓度0.1～1％的非表面活性剂型磺基甜菜碱(NDSB)，还包含但不限于质量体积百分比浓度0.5～5％的曲拉通(TritonX-100)或吐温(Tween20)、1～10mmol/L氯化镁或硫酸镁，以及调节pH在8.0～9.0范围的10～100mmol/L缓冲液。
所述白细胞裂解液能够使吸附于磁性微球A表面的白细胞在加热条件下裂解从而释放DNA，并且促进释放的DNA吸附于磁性微球B。其包含但不限于质量体积百分比浓度为1～10％的表面活性剂、2～8mol/L变性剂、10～50mmol/L EDTA，以及调节pH在7.5～8.5范围的10～100mmol/L缓冲液。
所述大体积全血为新鲜或冻存的含有EDTA、或枸橼酸钠、或柠檬酸钠的抗凝剂的抗凝全血。
本发明的主要优点在于：利用磁性微球A吸附白细胞的方法取代现有大体积全血DNA提取技术中利用离心方法分离制备血细胞/白细胞/白膜的前处理步骤，然后再用磁性微球B将白细胞中的DNA提取出来，整个过程可以很方便地在本技术领域常用的磁棒式提取仪或移液式工作站上实现自动化操作，克服了现有大体积全血技术必须先用手工操作进行前处理再进行自动化提取的弊端，能够实现整个大体积全血DNA提取过程的完整自动化操作。实验证明，20个1ml全血样品自动化提取的平均提取量为18.8μg，平均提取纯度260/280为1.86，260/230为2.07；24个5ml全血样品自动化提取的平均提取量为151.1μg，平均提取纯度260/280为1.85，260/230为1.99；24个10ml全血样品自动化提取的平均提取量为230.8μg，平均提取纯度260/280为1.86，260/230为1.97，满足建立DNA样本库的要求。
附图说明
图1为实施例2从5ml冻存全血中提取的DNA进行琼脂糖凝胶(1％)电泳的电泳图。泳道M为DNA Ladder D2000，泳道1～24为提取的DNA，样品用高纯水稀释5倍之后上样5μl。
具体实施方式
实施例1
第一步：磁性微球A的制备
本实施例所使用活化剂为：含4％(w/v质量体积百分比)EDC和3％(w/v)NHS的水溶液。
本实施例所使用封闭液为：1.5％(w/v)牛血清白蛋白(简称BSA)。
1)取1ml采用文献报道方法合成的羧基磁性纳米微球，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
2)加入10ml活化剂，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
3)加入10ml 10mmol/L pH8.0PB后振荡混匀1分钟，加入0.1g多聚赖氨酸，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
4)加入5ml封闭液，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
5)加入1ml 10mmol/L pH8.0PB，振荡混匀1分钟至微球均匀分散。
第二步：使用Pure-20B全自动核酸提取仪自动化提取20个1ml新鲜全血样品DNA
本实施例所使用红细胞裂解液的组分为：0.5％TritonX-100,0.1％NDSB、1mmol/L氯化镁，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。
本实施例所使用白细胞裂解液的组分为：2mol/L异硫氰酸胍、10％SLS、10mmol/LEDTA、10mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.5。
本实施例所使用的洗涤液组分为80％乙醇；所使用的洗脱液组分为5mmol/LTris-HCl，pH7.5。
1)取20个新鲜全血样品，分别取1ml加入板条的A孔，再加入1ml红细胞裂解液、20μl磁性微球A；
2)按照表1加入其它试剂：
表1 Pure-20B全自动核酸提取仪自动化提取样品和试剂加样表
3)将板子放入仪器中，磁套安装到仪器上，运行程序(见表2)。
表2 Pure-20B全自动核酸提取仪自动化提取程序
4)程序结束后洗脱孔中即为纯化的DNA溶液。
实施例2
第一步：磁性微球A的制备
本实施例所使用活化剂为：含6％(w/v)EDC和4.5％(w/v)NHS的水溶液。
本实施例所使用封闭液为：9％(w/v)BSA。
1)取10ml采用文献报道方法合成的羧基磁性纳米微球，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
2)加入10ml高纯水，振荡混匀1分钟，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
3)加入50ml活化剂，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
4)加入50ml 25mmol/L pH8.5PB后振荡混匀1分钟，加入2.5g多聚丙氨酸，混匀2小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
5)加入25ml封闭液，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
6)加入10ml 25mmol/L pH8.5PB，振荡混匀1分钟至微球均匀分散。
第二步：使用KingFisherFlex全自动核酸提取仪自动化提取24个5ml冻存全血样品DNA
本实施例所使用红细胞裂解液的组分为：2.5％Tween20,0.5％NDSB、5mmol/L氯化镁，50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH8.5。
本实施例所使用白细胞裂解液的组分为：5mol/L尿素、3％Tween20、30mmol/LEDTA、50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH8.0。
本实施例所使用的洗涤液组分为70％乙醇，10mmol/L Tris-HCl，pH7.0；所使用的洗脱液组分为10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.5。
本实施例使用自动化提取仪器为：KingFisher Flex全自动核酸提取仪。
本实施例使用耗材：KingFisher Flex全自动核酸提取仪专用24深孔板、磁套。
1)取24个-80℃冻存2年的全血样品，分别取5ml，分别加入两块24深孔板的对应孔中，每块24深孔板2.5ml(见表3)，再加入2.5ml红细胞裂解液、50μl磁性微球A。
2)按照表3加入其它试剂：
表3KingFisher Flex全自动核酸提取仪自动化提取样品和试剂加样表
3)将各96孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序(见表4)。
表4 KingFisherFlex全自动核酸提取仪自动化提取程序
4)程序结束后洗脱板中即为纯化的DNA溶液。
实施例3
第一步：磁性微球A的制备
本实施例所使用活化剂为：含8％(w/v)EDC和6％(w/v)NHS的水溶液。
本实施例所使用封闭液为：15％(w/v)BSA。
1)取100ml采用文献报道方法合成的羧基磁性纳米微球，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
2)加入100ml高纯水，振荡混匀1分钟，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
3)加入100ml活化剂，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
4)加入100ml 50mmol/L pH9.0PB，振荡混匀1分钟，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
5)加入100ml 50mmol/L pH9.0PB后振荡混匀1分钟，加入10g多聚赖氨酸，混匀4小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
6)加入50ml封闭液，混匀1小时，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
7)加入100ml 50mmol/L pH9.0PB，振荡混匀1分钟，置于磁力架上磁吸1分钟或至澄清，吸弃上清；
8)加入100ml 50mmol/L pH9.0PB，振荡混匀1分钟至微球均匀分散。
第二步：使用KingFisherFlex全自动核酸提取仪自动化提取24个10ml冻存全血样品DNA
本实施例所使用红细胞裂解液的组分为：5％Tween20,1％NDSB、10mmol/L硫酸镁，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH9.0。
本实施例所使用白细胞裂解液的组分为：8mol/L盐酸胍、7.5％LDAO、50mmol/LEDTA、100mmol/L Tris-HCl，pH8.5。
本实施例所使用的洗涤液组分为4mol/L氯化钠，10mmol/L Tris-HCl，pH8.5；
本实施例所使用的其余试剂同实施例2。
本实施例使用自动化提取仪器为：KingFisher Flex全自动核酸提取仪。
本实施例使用耗材：KingFisher Flex全自动核酸提取仪专用24深孔板、磁套。
1)取24个-80℃冻存2年的全血样品，分别取10ml，分别加入4块24深孔板的对应孔中，每块24深孔板2.5ml(见表5)，再加入2.5ml红细胞裂解液、50μl磁性微球A。
2)按照表5加入其它试剂：
表5 KingFisher Flex全自动核酸提取仪自动化提取样品和试剂加样表
3)将各96孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序(见表6)。
表6 KingFisherFlex全自动核酸提取仪自动化提取程序
4)程序结束后洗脱板中即为纯化的DNA溶液。
试验例1：使用紫外分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度
使用紫外分光光度计检测实施例1、实施例2和实施例3中从全血中提取出来的DNA的浓度和纯度。
紫外分光光度计型号：岛津UV1800。
取10μl DNA样品，加入90μl洗脱液稀释10倍，混匀之后，吸取60μl加入比色杯，放入紫外分光光度计，进行检测。结果见表7、表8和表9。
表7实施例1提取20个1ml新鲜全血样品得到DNA的紫外分光光度计检测结果
| 样品编号 | 浓度(ng/μl) | 260/280 | 260/230 | 提取量(μg) |
| 1 | 124.7 | 1.85 | 2 | 12.5 |
| 2 | 160.4 | 1.85 | 1.93 | 16.0 |
| 3 | 169.8 | 1.84 | 1.89 | 17.0 |
| 4 | 103.8 | 1.81 | 1.42 | 10.4 |
| 5 | 217 | 1.86 | 2.26 | 21.7 |
| 6 | 110.3 | 1.86 | 2.29 | 11.0 |
| 7 | 214.4 | 1.86 | 2.33 | 21.4 |
| 8 | 59.2 | 1.94 | 2.2 | 5.9 |
| 9 | 363.6 | 1.85 | 2.12 | 36.4 |
| 10 | 405.7 | 1.84 | 2.09 | 40.6 |
| 11 | 330.2 | 1.85 | 2.04 | 33.0 |
| 12 | 107.3 | 1.86 | 1.79 | 10.7 |
| 13 | 33.8 | 1.84 | 1.82 | 3.4 |
| 14 | 289.5 | 1.84 | 2.04 | 29.0 |
| 15 | 204.2 | 1.87 | 2.22 | 20.4 |
| 16 | 200.7 | 1.86 | 2.3 | 20.1 |
| 17 | 101.2 | 1.86 | 2.07 | 10.1 |
| 18 | 246 | 1.86 | 2.21 | 24.6 |
| 19 | 155.2 | 1.86 | 2.23 | 15.5 |
| 20 | 163 | 1.86 | 2.09 | 16.3 |
| 平均值 | 188.0 | 1.86 | 2.07 | 18.8 |
表8实施例2提取24个5ml冻存全血样品得到DNA的紫外分光光度计检测结果
| 样品编号 | 浓度(ng/μl) | 260/280 | 260/230 | 提取量(μg) |
| 1 | 225.9 | 1.86 | 2.16 | 113.0 |
| 2 | 240.8 | 1.87 | 2.22 | 120.4 |
| 3 | 310.2 | 1.85 | 2.29 | 155.1 |
| 4 | 180.2 | 1.85 | 1.98 | 90.1 |
| 5 | 355.5 | 1.85 | 2.16 | 177.8 |
| 6 | 443 | 1.84 | 2.16 | 221.5 |
| 7 | 310.6 | 1.85 | 2.27 | 155.3 |
| 8 | 340.1 | 1.85 | 2.07 | 170.1 |
| 9 | 381.2 | 1.85 | 2.23 | 190.6 |
| 10 | 388.1 | 1.85 | 2.07 | 194.1 |
| 11 | 299.3 | 1.85 | 2.26 | 149.7 |
| 12 | 274.8 | 1.85 | 2.08 | 137.4 |
| 13 | 345.1 | 1.84 | 1.9 | 172.6 |
| 14 | 329.4 | 1.84 | 1.69 | 164.7 |
| 15 | 321.4 | 1.83 | 1.5 | 160.7 |
| 16 | 203.8 | 1.85 | 1.93 | 101.9 |
| 17 | 324.2 | 1.85 | 2 | 162.1 |
| 18 | 238.1 | 1.86 | 2.01 | 119.1 |
| 19 | 356.8 | 1.85 | 1.9 | 178.4 |
| 20 | 339.8 | 1.87 | 1.99 | 169.9 |
| 21 | 348.2 | 1.84 | 1.98 | 174.1 |
| 22 | 355.5 | 1.83 | 1.96 | 177.8 |
| 23 | 246.8 | 1.8 | 1.4 | 123.4 |
| 24 | 94.8 | 1.86 | 1.56 | 47.4 |
| 平均值 | 302.2 | 1.85 | 1.99 | 151.1 |
表9实施例3提取24个10ml冻存全血样品得到DNA的紫外分光光度计检测结果
试验例2：使用琼脂糖凝胶电泳鉴定提取DNA质量
使用琼脂糖凝胶电泳鉴定实施例2中提取的DNA的质量，琼脂糖凝胶浓度为1％，电压150v，电泳时间30分钟。提取DNA主带清晰，条带完整，质量非常好。M为DNA LadderD2000，1～24为提取的DNA，样品用高纯水稀释5倍之后上样5μl。
Claims (4)
1.一种免前处理自动化提取大体积全血DNA的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）制备一种能够吸附白细胞的磁性微球A
使用活化剂将羧基磁性纳米微球活化，再用含1～10%质量体积百分比浓度的多聚赖氨酸或多聚丙氨酸的10～50mmol/L pH8.0～9.0的磷酸钠或磷酸钾缓冲液交联，然后用封闭液封闭，最后，将微球悬浮于10～50mmol/L pH8.0～9.0的缓冲液中，即得磁性微球A；
2）从大体积全血中提取DNA
2.1）使用红细胞裂解液裂解红细胞，其过程中同时用磁性微球A吸附白细胞；
2.2）使用白细胞裂解液裂解吸附在磁性微球A上的白细胞，并将释放的DNA用磁性微球B提取出来。
2.根据权利要求1所述的一种免前处理自动化提取大体积全血DNA的方法，其特征在于：所述羧基磁性纳米微球为表面修饰羧基的磁性微球B。
3.根据权利要求1所述的一种免前处理自动化提取大体积全血DNA的方法，其特征在于：所述红细胞裂解液能够裂解红细胞，并促进白细胞吸附于磁性微球A，其包含促进白细胞吸附于磁性微球A的质量体积百分比浓度0.1～1%的非表面活性剂型磺基甜菜碱，还包含但不限于质量体积百分比浓度0.5～5%的曲拉通或吐温、1～10mmol／L氯化镁或硫酸镁，以及调节pH在8.0～9.0范围的10～100mmol／L缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种免前处理自动化提取大体积全血DNA的方法，其特征在于：所述白细胞裂解液能够使吸附于磁性微球A表面的白细胞在加热条件下裂解从而释放DNA，并且促进释放的DNA吸附于磁性微球B，其包含但不限于质量体积百分比浓度为1～10%的表面活性剂、2～8mol/L变性剂、10～50mmol/L EDTA，以及调节pH在7.5～8.5范围的10～100mmol／L缓冲液。
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