CN109535239A - 一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法 - Google Patents

一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法 Download PDF

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Abstract

一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，包括步骤：将蜂王浆溶于抽提缓冲液中，混合均匀，离心取上清，上清加入饱和硫酸铵进行沉淀，离心后取上清，通过滤膜过滤得样品缓冲溶液；通过超滤离心管将样品缓冲溶液置换为pH7.0缓冲液A；将蜂王浆样品上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；以缓冲液A和缓冲液B的混合液对柱子进行梯度洗脱，并从0到100％逐渐提高缓冲液B的比例，依次分离纯化出蜂王浆主蛋白2和3。本发明的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，增加了蜂王浆主蛋白2和3的丰度，提高了蜂王浆主蛋白2和3的产量，重复性好，产量高，可大量生产蜂王浆主蛋白2和3。

Description

一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法
技术领域
本发明涉及化学提取、分离，具体涉及一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法。
背景技术
蜂王浆的蛋白组分主要由蜂王浆主蛋白1、2、3组成，蜂王浆主蛋白1、2、3各具有独特的生理功能，均有益于人类健康。传统的纯化蜂王浆主蛋白1、2、3的方法主要有透析、多种层析分离方法叠加组合等，不仅耗时、费力而且成本高、收率低，难以满足生物学研究所需，也不适合规模化生产，其中丰度低是一个很重要的原因。因此，开发一种简单快速的样品处理方法，通过提高样品中蜂王浆主蛋白2和3的丰度提高其相应产量是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，以克服传统分离方法存在的收率低的缺陷。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，包括步骤：
S1：将蜂王浆溶于pH 7.4的抽提缓冲液中，震荡过夜，低温离心，取上清，将饱和硫酸铵加入上清混合均匀，至硫酸铵终浓度为30％～60％，低温孵育1小时或过夜；
S2：取步骤S1中混合液4℃离心20分钟，取上清，上清以0.2微米孔径的滤膜过滤得样品缓冲溶液；
S3：通过截留分子量为10K的超滤离心管将样品缓冲溶液置换为pH7.0缓冲液A；
S4：将步骤S3制备的蜂王浆样品上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；
S5：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，并从0到100％逐渐提高缓冲液B的比例，依次分离纯化出蜂王浆主蛋白2和3。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述步骤S1具体包括：将蜂王浆按照1：5溶于pH 7.4的抽提缓冲液中，震荡过夜，4℃条件下离心20分钟后，取上清，将饱和硫酸铵加入上清混合均匀，至硫酸铵的终浓度为30％～60％，4℃下孵育1小时或者过夜。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述硫酸铵的终浓度为50％。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述抽提缓冲液的组成为500mM NaCl，8mMNaH2PO4，42mM Na2HPO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3，pH7.4。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述缓冲液A的组成为22mM NaH2PO3，3mMNa2HPO3，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3，pH7.0。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述缓冲液B的组成为2M NaCl，84mMNa2HPO4，16mM NaH2PO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3，pH7.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，通过采用硫酸铵对蜂王浆蛋白进行分级处理，增加了蜂王浆主蛋白2和3的丰度，从而提高蜂王浆主蛋白2和3的产量；本发明的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，重复性好，产量高，可级联放大，如采用大体积层析填料，可大量生产蜂王浆主蛋白2和3，可充分满足科研和规模化生产的需要，克服了传统分离方法存在的收率低的缺陷。
附图说明
图1为用饱和硫酸铵对蜂王浆样品进行处理后的电泳图，其中，M：蛋白分子量标准，
泳道1和2：硫酸铵终浓度为30％，
泳道3和4，硫酸铵终浓度为40％，
泳道5和6，硫酸铵终浓度为50％，
泳道7和8，硫酸铵终浓度为60％，
图2为硫酸铵处理后的蜂王浆样品的层析洗脱图谱，从上到下硫酸铵的终浓度依次为30％，40％，50％，其中，
蛋白峰1：蜂王浆主蛋白1，
蛋白峰2：蜂王浆主蛋白2；
蛋白峰3：蜂王浆主蛋白3；
图3为蛋白峰1-3的SDS-PAGE电泳图，其中，M：蛋白分子量标准，泳道1，2，3分别对应洗脱的蜂王浆主蛋白1、2、3；
图4为蜂王浆主蛋白1、2、3的Western印迹。
具体实施方式：
实施例：
一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，包括：
a.将蜂王浆按照1：5(w/v)溶于抽提缓冲液(500mM NaCl，8mM NaH2PO4，42mMNa2HPO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3(0.05g/100mL)，pH 7.4)里，震荡过夜，以便于蜂王浆蛋白彻底溶解于缓冲溶液中；
b.取步骤a制备的混合液在4℃，20000g条件下离心20分钟后，取上清；
c.将3.9M的饱和硫酸铵加入步骤b制备的蜂王浆样品里，硫酸铵终浓度分别为30％，40％，50％，4℃下孵育1小时或者过夜；
d.取步骤c中孵育的溶液在4℃，75000g条件下离心30分钟，取上清。硫酸铵终浓度分别为30％、40％、50％的样品，上清溶液走SDS-PAGE电泳图如图1所示。从图1可看出随着硫酸铵浓度提高，上清中蜂王浆主蛋白1丰度降低，蜂王浆主蛋白2和3的丰度提高；
e.将步骤d制备的上清样品以0.2微米孔径的滤膜过滤后，通过截留分子量为10K的超滤离心管Amicon Ultra-15(Millipore Corp，Billerica，MA，USA)将样品缓冲溶液置换为缓冲液A(22mM NaH2PO3，3mM Na2HPO3，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3(0.05g/100mL)，pH7.0)；
f.将步骤e制备的蜂王浆样品溶液上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱HiTrap Capto MMC column(GE Healthcare Life Science，Piscataway，NJ，USA)；
g.通过层析仪的梯度混合器，混合缓冲液A和B(2M NaCl，84mM Na2HPO4，16mMNaH2PO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3(0.05g/100mL)，pH7.5)，形成盐离子梯度，以1ml/min的流速冲洗柱子，从而分离纯化蜂王浆主蛋白2和3。其中，未结合在柱子上的蜂王浆主蛋白1作为透过洗脱下来，随着缓冲液B的比例提高(从0到100％)，盐离子浓度逐步提高，与柱子结合较弱的蜂王浆主蛋白2首先被洗脱下来，与柱子结合较强的蜂王浆主蛋白3随后被洗脱下来。硫酸铵终浓度分别为30％、40％、50％的样品，上清溶液层析洗脱图谱如图2所示。从图2可看出随着硫酸铵浓度提高，上清中蜂王浆主蛋白1丰度降低，蜂王浆主蛋白2和3的丰度提高，当硫酸铵终浓度为50％时，蜂王浆样品中蜂王浆主蛋白2和3的产量可得到显著提高。
整个蛋白洗脱过程用280纳米的紫外检测器进行检测。每出现蛋白峰即可收集，每个蛋白峰组成可以用SDS-PAGE电泳系统检测，蛋白纯度也可以用SDS-PAGE电泳系统检测，检测除了目的蛋白外，是否有杂蛋白带。所有的SDS-PAGE电泳采用Laemmli系统，选用10％的分离胶和5％积层胶。跑完胶后用考马斯亮蓝R250染色液染色(0.25克考马斯亮蓝R250溶解于100毫升的45％甲醇、10％冰醋酸的混合液)2-4小时，随后用30％甲醇，10％冰醋酸脱色。蛋白浓度可通过Bradford方法，用酶标仪检测。分离纯化的蛋白浓缩后，-80℃分装保存。蜂王浆主蛋白1、2、3的SDS-PAGE电泳图检测结果如图3所示，蜂王浆主蛋白1、2、3的Western印迹如图4所示。SDS-PAGE电泳上的蛋白带的质谱鉴定结果如下表1所示。
表1SDS-PAGE电泳上的蛋白带的质谱鉴定结果
其中，序列号Accession number是NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心)数据库中每个蛋白唯一的识别标志，蛋白数据库是2016年2月8日下载。质谱数据采用PEAKS软件8.5(Bioinformatics SolutionsInc.waterloo，Canada)进行搜库。-10lgP值由P值转换过来的，代表蛋白鉴定的确定性、显著性。Peptides是鉴定出来的蛋白的肽段数。Unique peptide是鉴定出来的蛋白所特有的肽段数目。Sequence coverage是鉴定出来的肽段氨基酸序列长度占蛋白序列总长度的比率。MRJP为蜂王浆主蛋白(major royal jelly protein)。

Claims (6)

1.一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将蜂王浆溶于pH7.4的抽提缓冲液中，震荡过夜，低温离心，取上清，将饱和硫酸铵加入上清，至硫酸铵终浓度为30％～60％，混合均匀，低温孵育1小时或过夜；
S2：取步骤S1中混合液4℃离心20分钟，取上清，上清以0.2微米孔径的滤膜过滤得样品缓冲溶液；
S3：通过截留分子量为10K的超滤离心管将样品缓冲溶液置换为pH7.0缓冲液A；
S4：将步骤S3制备的蜂王浆样品上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；
S5：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，并从0到100％逐渐提高缓冲液B的比例，依次分离纯化出蜂王浆主蛋白2和3。
2.根据权利要求1所述的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：将蜂王浆按照1：5溶于pH 7.4的抽提缓冲液中，震荡过夜，4℃条件下离心20分钟后，取上清，将饱和硫酸铵加入上清混合均匀至硫酸铵的终浓度为30％～60％，4℃下孵育1小时或者过夜。
3.根据权利要求2所述的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，其特征在于，所述硫酸铵的终浓度为50％。
4.根据权利要求1所述的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，其特征在于，所述抽提缓冲液的组成为500mM NaCl，8mM NaH2PO4，42mM Na2HPO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3，pH7.4。
5.根据权利要求1所述的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，其特征在于，所述缓冲液A的组成为22mM NaH2PO3，3mM Na2HPO3，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3，pH7.0。
6.根据权利要求1所述的一种提高液相色谱纯化中蜂王浆主蛋白2和3产量的方法，其特征在于，所述缓冲液B的组成为2M NaCl，84mM Na2HPO4，16mM NaH2PO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3，pH7.5。
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