CN106543283A - 转铁蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备转铁蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)将Cohn组分IV溶解在水中，得到Cohn组分IV水溶液；(b)用阴离子交换层析对所述Cohn组分IV水溶液进行纯化，收集洗脱液；(c)使用疏水层析对步骤(b)中所收集的洗脱液进一步纯化，得到转铁蛋白。本发明中所述方法操作简单，产物纯度高，并且处理量大，成本低，适合工业化生产。

Description

转铁蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明一般地涉及蛋白质分离纯化领域，特别地涉及转铁蛋白、转铁蛋白的制备方法、及其用作标准物质的用途。
背景技术
转铁蛋白(简写Tf)是一种非血红素结合铁的球蛋白，负责传递和调节铁离子浓度，其为含有679个氨基酸的单链糖蛋白，等电点为5.9，分子量为79000，主要由肝脏合成，在血浆中的浓度为2.5g/L左右。
转铁蛋白的主要生理功能是结合、运输Fe3+，调控铁的代谢，阻止游离铁通过自由基的形成对细胞产生毒副作用。已有的许多研究证实转铁蛋白具有抗菌的功能，同时也是细胞生长和增殖所必须的生长因子。另外，由于肿瘤细胞中转铁蛋白受体的数量显著高于正常细胞中的水平，近年来由转铁蛋白-转铁蛋白受体介导的靶向药物系统在肿瘤的治疗方面取得了不错的进展。所以对转铁蛋白的需求不断增加。
但是制备转铁蛋白的常规纯化方法(例如冷乙醇沉淀法，硫酸铵沉淀法，利凡诺沉淀法等)由于生产效率低，生产过程繁琐以及产品纯度不够高等原因已经不能满足现阶段对于转铁蛋白的需求。
E.J.Cohn等发明了用冷乙醇分离血浆蛋白质的一系列方法。在血浆蛋白的生产工艺链中，Cohn组分IV(以沉淀形式存在)作为低温乙醇法分离血浆白蛋白的废弃物被抛弃，但其中含有多种有价值的血浆蛋白，如下表1所示。
表1Cohn组分IV中的蛋白成分
因此，有需要寻找一种从Cohn组分IV制备转铁蛋白的方法，其将是廉价且节约资源的。
发明内容
本发明旨在提供一种制备转铁蛋白的方法，该方法操作简单，成本低，产物纯度高，稳定性强，且处理量大，适合大规模生产。
本发明的一些方面涉及一种制备人转铁蛋白的方法，其包括以下步骤：
a、将Cohn组分IV溶解在水中，得到Cohn组分IV水溶液；
b、用阴离子交换层析对所述Cohn组分IV水溶液进行纯化，收集洗脱液；和
c、使用疏水层析对步骤b中所收集的洗脱液进一步纯化，得到转铁蛋白。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b的阴离子交换层析中使用的平衡缓冲液为pH 6.0-9.0、5-100mmol/L的缓冲液，洗脱缓冲液为含有0.01-0.3mol/L氯化钠且pH为6.0-9.0的5-100mmol/L的缓冲液；优选地所述缓冲液选自乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液；更优选所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。具体地，所述平衡缓冲液和洗脱缓冲液可以具有相同或不同的pH和/或缓冲液(如磷酸根)浓度。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b中平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH范围各自独立地为6.0-9.0、6.0-8.5、6.0-8.0、6.0-7.5、6.0-7.0、6.0-6.5、6.5-8.5、6.5-8.0、6.5-7.5、6.5-7.0、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.0-7.5、7.5-9.0、7.5-8.5、7.5-8.0、8.0-9.0、或8.0-8.5，更优选6.5-7.5，最优选6.5-7.0。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b中平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH各自独立地为6.0至9.0的任意值，例如为约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0。
在一些具体实施方案中，所述步骤b中平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液中的磷酸根浓度可以相同或不同，并且各自独立地选自5-100、10-80、15-60、20-50mmol/L。具体地，所述磷酸根浓度各自独立地可以是5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100mmol/L的磷酸根浓度。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b中的阴离子交换层析使用弱碱型阴离子交换介质。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b中的弱碱型阴离子交换介质的电荷基团是二乙基氨基乙基。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b中的弱碱型阴离子交换介质的基质选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。优选地，所述离子交换介质的基质是琼脂糖，例如是Capto介质、Sepharose FF、Sepharose。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤b还包括向所收集的洗脱液添加高水溶性盐溶液，使得其终浓度为约1.0-2.0mol/L，优选约1.0mol/L或1.5mol/L，所述高水溶性盐优选为硫酸铵。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤c中疏水层析的平衡缓冲液为含有1.0-2.0mol/L高水溶性盐的pH为6.0-9.0、5-100mmol/L的缓冲液，洗脱缓冲液为含有1.0-2.0mol/L高水溶性盐的pH为6.0-9.0、5-100mmol/L的缓冲液；优选地所述缓冲液选自乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液；例如是磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤c中平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH范围各自独立地为6.0-9.0、6.0-8.5、6.0-8.0、6.0-7.5、6.0-7.0、6.0-6.5、6.5-8.5、6.5-8.0、6.5-7.5、6.5-7.0、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.0-7.5、7.5-9.0、7.5-8.5、7.5-8.0、8.0-9.0、或8.0-8.5，更优选6.5-7.5，最优选6.5-7.0。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤c中平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH各自独立地为6.0至9.0的任意值，例如为约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0。
在一些具体实施方案中，所述步骤c中平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液中的磷酸根浓度可以相同或不同，并且各自独立地选自5-100、5-80、5-50、10-80、15-60、20-50mmol/L。具体地，所述磷酸根浓度各自独立地可以是5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100mmol/L的磷酸根浓度。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤c中疏水层析之介质的疏水配基选自丁基、新戊基、辛基和苯基，优选地所述疏水配基是辛基。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤c中疏水层析之介质的基质选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸甲酯和聚苯乙烯；优选地所述疏水层析介质的基质是琼脂糖。
本发明的另一些方面涉及通过本文所述方法制备的转铁蛋白，其纯度优选大于99％，例如大于99.2％。本文中纯度计算按照本领域技术人员熟知的方法进行，例如根据HPLC中280nm紫外吸收值积分获得。优选地，所述转铁蛋白用作标准物质。
本发明的另一些方面涉及通过本文所述方法制备的转铁蛋白用作转铁蛋白标准物质的用途。
本发明的另一些方面涉及通过本文所述方法制备的转铁蛋白在制备用于治疗炎症、癌症以及细菌感染性疾病的药物中的用途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了以下几种成分的SDS-PAGE电泳的结果，1：Cohn组分IV；2：阴离子交换层析纯化得到的粗制转铁蛋白；3：疏水层析纯化得到的转铁蛋白；4：Sigma转铁蛋白标准品。
图2示出了对根据实施例1制备的纯转铁蛋白进行高效液相色谱分析所得到的结果。
图3示出了根据实施例2在pH值6.5和7.5条件下Capto DEAE洗脱组分的HPLC图谱。
图4A-D示出了在实施例3中硫酸铵浓度不同时的疏水层析图谱及相应的SDS-PAGE分析图谱。图4-A示出了盐浓度为1.5mol/L硫酸铵时的疏水层析图谱及相应的SDS-PAGE分析图谱，M：标准分子量蛋白；1：Sigma Tf：2：峰1；3：峰2；图4-B示出了盐浓度为1.2mol/L硫酸铵时的疏水层析图谱及相应的SDS-PAGE分析图谱，M：标准分子量蛋白；1：Sigma Tf：2：峰1；3：峰2；4：峰3；图4-C示出了盐浓度为1.0mol/L硫酸铵时的疏水层析图谱及相应的SDS-PAGE分析图谱，M：标准分子量蛋白；1：Sigma Tf：2：峰1；3：峰2；图4-D示出了盐浓度为0.7mol/L硫酸铵时的疏水层析图谱及相应的SDS-PAGE分析图谱，M：标准分子量蛋白；1：Sigma Tf：2：峰1；3：峰2。
图5示出了根据实施例1获得的转铁蛋白的圆二色鉴定光谱图。
图6示出了质谱检测根据实施例1所得转铁蛋白之分子量的结果。
图7示出了根据实施例1所得的铁饱和转铁蛋白扫描图谱。
图8示出了根据实施例1所得之转铁蛋白的抗菌活性分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例是举例性的，而非限制本发明的范围。
实验材料
本发明所使用的部分实验材料见下表。
表2实验材料
其他试剂均为购自上海生工的分析试剂。
实验仪器
表3主要仪器
实施例1
纯化血清转铁蛋白：
1.制备Cohn组分IV的溶液
1)称取20g Cohn组分IV溶于100mL超纯水中，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，静置使不溶物沉淀；
2)弃去沉淀，取上层溶液于10 000r/分钟，4℃条件下离心30分钟，取上清液；
3)用0.45μm滤膜对上清液进行过滤，得到Cohn组分IV的水溶液。
2.阴离子交换层析纯化
1)使Cohn组分IV水溶液通过HiPrep 26/10Desalting 53mL脱盐柱并用10倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行超滤缓冲液置换；
2)Capto DEAE层析柱(14.0cm×1.0cm)预先用十倍体积的20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡，直至pH和电导率检测器显示与平衡缓冲液的一致；
3)将上述置换缓冲液过后的Cohn组分IV水溶液进料适当体积，柱平衡后用平衡缓冲液洗脱，然后用含有0.1mol/L氯化钠的pH为7.0、20mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，取一部分洗脱液冻干，获得粗制转铁蛋白；
4)取5mL洗脱液，加入5mL浓度为2mol/L的(NH4)2SO4溶液，充分混合。
3.疏水层析纯化
1)Octyl-Sepharose 4Fast Flow层析柱预先用十倍体积含有1mol/L硫酸铵的pH7.0、50mmol/L磷酸盐缓冲液平衡，直至pH与电导率检测器显示与平衡缓冲液的一致；
2)将上述步骤2所得的混合溶液上柱，柱平衡后用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，收集洗脱液，其中含有转铁蛋白；
3)经疏水层析得到的转铁蛋白溶液用10倍体积超纯水进行缓冲液置换，并冷冻干燥保存。
按照本领域已知的常规方法，对以下组分进行SDS-PAGE电泳，1：Cohn组分IV；2：经步骤2的阴离子交换层析纯化得到的粗制转铁蛋白；3：经步骤3的疏水层析纯化得到的转铁蛋白；4：Sigma转铁蛋白标准品。结果如图1所示，可以看出在疏水层析后得到了与标准品大小一致且纯度非常高的纯转铁蛋白。
然后按照本领域已知的常规方法，使用TSK-GEL G3000 SWXL分析柱和岛津LC-20A高效液相色谱仪对所得的纯转铁蛋白进行高效液相色谱。色谱条件如下：流动相为20mmol/L PB+0.1mol/L Na2SO4(pH 7.0)，流速为0.6mL/min，样品进样量为100μL，紫外检测波长设定为280nm，柱温为常温。由图2示出的结果计算出根据本发明方法所制备的转铁蛋白的纯度约为99.2％。
实施例2
按照实施例1中的步骤1和2从Cohn组分IV制备粗制转铁蛋白，不同之处在于磷酸盐缓冲液的pH分别为6.5和7.5。
图3示出了pH分别为6.5和7.5条件下Capto DEAE洗脱组分的HPLC图谱。三种条件所得的粗制产物的比较如下。
表4三种pH值条件下洗脱组分的HPLC分析汇总
在三种不同的pH条件下，均可以获得较为理想的纯度，但优选pH为7.0。
实施例3
按照实施例1中的方法从Cohn组分IV制备粗制转铁蛋白，不同之处在于步骤2所得混合溶液中，硫酸铵的最终浓度分别为1.5、1.2、1.0、0.7mol/L。
图4A-D示出了实验结果，硫酸铵浓度从1.5mol/L逐渐下降至0.7mol/L时，吸附在层析柱上的蛋白质越来越少。当磷酸缓冲液中添加的硫酸铵浓度为1.5mol/L时，所有的蛋白质均吸附在层析柱上，使用线性梯度进行洗脱，此时一共产生三个洗脱峰，收集洗脱峰进行SDS-PAGE实验，第一个被洗脱下来的是转铁蛋白，纯度较好呈单一条带，第二个洗脱峰中也含有少量的转铁蛋白；当硫酸铵浓度为1.2mol/L时，有部分蛋白未能吸附在层析柱上，收集穿透峰，电泳图显示穿透峰为转铁蛋白，线性洗脱阶段产生的两个洗脱峰中也均含有转铁蛋白。当硫酸铵浓度为1.0mol/L可以发现，有大量的蛋白质未吸附在层析柱上而直接穿透，将该穿透峰进行电泳发现，穿透峰主要为转铁蛋白，几乎不含有其他杂质蛋白，呈现单一条带纯度较好，后面的线性洗脱阶段得到一个峰，电泳分析表明该峰主要含有杂质蛋白，转铁蛋白的含量很少；当硫酸铵浓度为0.7mol/L时，大量杂质蛋白组分未能与层析柱结合而直接穿透，线性洗脱得到的洗脱峰浓度很低，进行电泳发现穿透峰组成与离子交换层析纯化得到的组分一样，未能达到纯化效果。
综上所述，盐浓度为1.5mol/L及1.0mol/L时的纯化效果较好，前者所有蛋白质均吸附，通过改变盐浓度的方式进行洗脱后，得到的样品经HPLC分析显示纯度为98％；而当盐浓度为1.0mol/L时绝大部分的转铁蛋白样品穿透，杂质蛋白质被吸附在层析柱上，收集这部分穿透峰通过HPLC分析显示样品纯度在99％以上。
转铁蛋白的纯化效率
通过制备Cohn组分IV的水溶液、阴离子交换层析以及疏水层析过程，成功的从组分IV沉淀中纯化得到了转铁蛋白样品。两步层析方法得到了纯度达到99％以上的转铁蛋白样品(见表5)，根据ELISA方法测得的转铁蛋白活性收率达到了79％。
表5Cohn组分IV依次经Capto DEAE柱和Octyl-Sepharose 4F.F.柱纯化后的Tf纯度和收率
＊Tf收率＝Tfa/Tfb.Tfa是得到的样品中的Tf含量，Tfb是进样样品中的Tf含量。Tfa和Tfb均通过ELISA方法测定，ELISA标准曲线：y＝0.0742x-0.0601.R2＝0.993。
相比于文献[2，4]中报道的一步色谱方法，本实验制备得到的样品纯度有了较大提升，同时收率并未出现明显下降。
表6市售转铁蛋白标准品规格
通过对市售的几种转铁蛋白标准品进行对比(表6)可以发现，目前还没有纯度达到99％以上的标准品。
实施例4
对实施例1所得的高纯度转铁蛋白进行鉴定。
4.1圆二色光谱鉴定
蛋白质的二级结构通常指蛋白主链的构象，常见的有α-螺旋和β-折叠等[5]。圆二色光谱(circular dichroism，CD)是目前广泛应用的蛋白质二级结构分析方法，它是研究蛋白质构象的一种较为简单、快速的方法。它可以在溶液状态下进行测定，从而在较为接近蛋白质生理环境的状况下进行分析测定，所以测量结果较为准确，且对构象变化灵敏[6-8]。
用圆二色光谱仪测定蛋白质二级结构的具体方法如下：圆二色光谱的扫描波长设定为190～260nm，分辨率为1nm，使用0.1cm样品池。将冻干的Tf样品溶于超纯水中(0.5mg/mL)，然后加入0.5mL左右的蛋白样品至样品池中，超纯水作空白对照，测定CD值，再将CD值转换为氨基酸残基的摩尔椭圆率(θ)，以deg·cm2·dmol-1表示。
所得结果在图5中示出。
4.2基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定
MALDI-TOF-MS是有机化合物以及生物大分子分析中最重要的一种表征技术之一，可直接应用于蛋白质样品的分子量测定[25]，相比于常用的SDS-PAGE电泳以及高效液相色谱技术，其准确率远远高于前面二者。
纯化得到的样品送交中国科学院化学研究所质谱中心进行质谱鉴定。如图6显示，纯化后的Tf分子量为78726，理论值为79kDa左右，进一步证实了两步层析方法得到了结构完整的转铁蛋白分子。
4.3全波长扫描鉴定
转铁蛋白的主要结构包含两个能够结合铁离子的位点(N端和C端结合位点)[9-11]，按照转铁蛋白结合铁离子的状态的不同可以将其分为脱铁转铁蛋白(apo-Tf)，单铁转铁蛋白(FeN-Tf或FeC-Tf)，以及铁饱和转铁蛋白(holo-Tf)[19，29，30]。而通常情况下人体中只有约30％的转铁蛋白是铁饱和的[2-4]。
转铁蛋白在结合了铁离子后会在465nm波长处出现特征吸收峰[11]。根据转铁蛋白的这一特性可以通过全波长扫描的方法进行铁离子结合活性的测定，具体操作方法为：
(1)将冻干的转铁蛋白样品溶解于超纯水中(1mg/mL)；
(2)向溶液中添加FeNTA溶液(0.2mol/L NTA和0.2mol/L Fe(NO3)3按1∶1混合后用固体NaHCO3调pH至8.5)，使转铁蛋白分子与Fe3+的摩尔比为1∶4；
(3)室温下反应2小时，再使用脱盐柱将溶液置换为纯水；
(4)使用分光光度计(UV1800)进行全波长扫描，扫描波长设定为250～600nm，超纯水作空白对照。
全波长扫描图谱见图7所示，纯化后的holo-Tf在465nm处有明显的特征吸收峰。A280/A465的值为22.3，重复实验的结果在21～23之间，与文献[21]中的报道一致。这表明纯化后的转铁蛋白具有结合两个铁离子的能力。
4.3.5体外抗菌活性分析
转铁蛋白具有光谱抗菌作用，目前比较有说服性的原因是：铁离子是很多细菌生长不可缺少的因子，转铁蛋白通过对铁离子的螯合作用导致细菌无法生长，因此具有抗菌功能[14]。本实验通过转铁蛋白对大肠杆菌的抑制作用来考察转铁蛋白的体外抗菌活性。
具体操作按文献(张焱.乳腺生物反应器表达的重组人乳清蛋白质的纯化策略与应用[D].北京：中国科学院研究生院，2010)中的方法。
抗菌活性测定结果如图8所示。结果表明纯化得到的转铁蛋白样品对大肠杆菌的生长有明显的抑制作用，随着转铁蛋白的浓度升高，抑菌效果越明显。当浓度为0.5mg/mL时的抑菌效果并不明显，当浓度达到5mg/mL时则具有明显的抑菌效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
符号与缩写说明
参考文献
以下参考文献均通过引用整体并入本文。
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Claims (10)

1.一种制备转铁蛋白的方法，其包括以下步骤：
a、将Cohn组分IV溶解在水中，得到Cohn组分IV水溶液；
b、用阴离子交换层析对所述Cohn组分IV水溶液进行纯化，收集洗脱液；
c、使用疏水层析对步骤b中所收集的洗脱液进一步纯化，得到转铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤b的阴离子交换层析中使用的平衡缓冲液为pH 6.5-7.5、5-50mmol/L的缓冲液，洗脱缓冲液为含有0.05-0.15mol/L氯化钠且pH为6.5-7.5的5-50mmol/L的缓冲液；优选地所述缓冲液选自乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述步骤b中的阴离子交换层析使用弱碱型阴离子交换介质，优选地所述弱碱型阴离子交换介质的电荷基团是二乙基氨基乙基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换层析介质的基质选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤c中所述疏水层析的平衡缓冲液为含有1.0-2.0mol/L高水溶性盐的pH为6.5-7.5、5-50mmol/L的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含有1.0-2.0mol/L高水溶性盐的pH为6.5-7.5、5-50mmol/L的磷酸盐缓冲液；优选地所述高水溶性盐是硫酸铵。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤c中所述疏水层析介质的疏水配基选自丁基、新戊基、辛基和苯基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述步骤c中所述疏水层析介质的基质选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。
8.根据权利要求1至7中任一项所述方法制备的转铁蛋白，其纯度大于99％。
9.根据权利要求8所述的转铁蛋白，其用作标准物质。
10.根据权利要求8或9所述转铁蛋白用作标准物质的用途。
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