CN102977180A - 一种综合利用Cohn组分IV的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从组分IV中提取人血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、铜蓝蛋白、抗凝血酶III、载脂蛋白A1、C1酯酶抑制剂等蛋白的方法。所述方法包括：a）用不同pH值的溶液对沉淀进行分布溶解，将不同的蛋白富集在不同的pH值缓冲液中；b）将溶出液用离子交换层析处理，将组分IV分穿透峰（HSA，IgG，Apo A1，转铁蛋白）和洗脱峰（结合珠蛋白，α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、铜蓝蛋白和C1酯酶抑制剂），再进一步针对不同的蛋白采用不同层析处理。本发明中所述方法蛋白收率高，容易放大，适合工业化生产，实现了目前血浆生产中废弃物的综合利用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白制备领域，尤其涉及综合利用Cohn组分IV的方法。
背景技术
目前，从血浆中制备白蛋白和IgG所采用的大都为Cohn冷乙醇沉淀法。这种方法中的组分IV中主要是含有蛋白，其中包括很多有潜在价值的蛋白质，但现在通常作为废弃物丢掉。其中这些蛋白无论作为临床使用还是作为生化诊断试剂都有着非常广阔的前景。比如α1-抗胰蛋白酶可以治疗α1-抗胰蛋白酶先天性缺乏伴肺气肿患者，是美国FDA批准的药品；α2-巨球蛋白：用于质量放射损伤的治疗以及眼角膜损伤和角膜炎的治疗；补体1酯酶抑制剂：遗传性血管神经性水肿；结合珠蛋白：静脉输注结合珠蛋白或用固相化结合珠蛋白体外循环去除血液中的游离血红蛋白，防止和治疗溶血性肾衰竭；运铁蛋白：治疗先天性无运铁蛋白血症，用脱铁的运铁蛋白治疗铁血黄素沉着症；铜蓝蛋白：促进红细胞生成，治疗贫血。此外血液中的很多检测指标都是针对某一种蛋白的检测，这对于判断疾病类型有着重要的临床意义，而检测试剂盒的制备需要采用纯度非常高的抗原来免疫动物，得到相应的抗体。这类产品的市场空间也非常大，因为随着技术的成熟，会有越来越多的医院都采用这类检测指标更有效的辅助疾病类型的判断。比如铜蓝蛋白的升高可以作为某些疾病的前兆，现在医院对于载脂蛋白检测的需求也越来越多。
目前有一些专门针对组分IV中某一种蛋白质进行分离的报道，比如黄凯等人用尿素溶解组分IV，然后从中提取载脂蛋白A1（CN 101205250A），此方法中采用的尿素浓度可以高达6-8M，这可能会对组分IV中其它的组分造成潜在的破坏。
周燕翔等人采用Con A Sepharose 4B以及DEAE Sepharose FF从组分IV中分离α1-抗胰蛋白酶（周雁翔，端义坤，李策生，彭良俊，张爱华，邹汉武，低温乙醇法分离正常人血浆组分IV沉淀中α1-抗胰蛋白酶的分离纯化，中国生物制品学杂质，2011，24：1090-1093）。Coan等人采用PEG沉淀结合DEAE离子交换层析的方法从组分IV中提取α1-抗胰蛋白酶（Coan MH,Brockway WJ,Eguizabal H,Krieg T,Fournel M.Preparation and properties of alpha1-proteinaseinhibitor concentrate from human plasma.Vox Sanguinis,1985,48:333–342）。这些方法中要么采用了沉淀技术，要么采用亲和层析技术，所使用的工艺与本发明不同。
Deutsch等人采用硫酸铵沉淀、DEAE层析以及乙醇-氯仿沉淀的工艺从组分IV中提取铜蓝蛋白（Deutsch HF,Kasper CB,Walsh DA,Papid method forpreparation of crystalline human ceruloplasmin from Cohn Fraction IV-1.Archives ofBiochemistry and Biophysics,1962,99:132-135）。该工艺采用两步沉淀，而且其中一步沉淀为含有氯仿的有机溶剂沉淀，对蛋白质的破坏比较大。
目前也从组分IV同时提取多种蛋白的报道，处理过程包括先对组分IV进行PEG沉淀处理，然后再依次用疏水层析和离子交换层析处理，能够得到的蛋白包括5种（白高英，Cohn组分IV沉淀中血浆蛋白的分离工艺及过程自动化研究，2010，兰州大学硕士生学位论文；Kong YJ,Li XN,Bai GY，Ma GH,SuZG.An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography,Journal of Chromatography A,2010,1217:6898-6904）。此方法中采用了蛋白损失率较高的沉淀步骤，而且所采用层析的顺序也与本发明存在不同。
这些方法虽然能够得到比较高纯度的蛋白，但是往往具有如下缺点：①在纯化过程中往往不得不牺牲其它的蛋白质组分，或者将其它的蛋白往往作为废弃物丢弃了，这对于宝贵的血液资源也是一种浪费；②这些方法包括超速离心法，沉淀法等等，处理量比较小，蛋白的损失比较多；③蛋白质的收率比较低，纯化步骤多，有的纯化中还涉及有机溶剂或者变性剂，不利于蛋白质活性的保持；④采用抗体或者抗体片段亲和层析技术针对某种蛋白进行纯化，虽然效率比较高，但是由于亲和介质的价格比较贵而且稳定性可能存在问题，所以仅适合实验室用，而不适合工业生产放大；
因此，本领域非常需要一种能够充分利用组分IV中丰富而且宝贵的蛋白资源的方法。该方法的蛋白质得率高，过程中不涉及有机溶剂和变性剂，容易放大适合工业生产。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本发明旨在提供一种综合利用组分IV的方法。该方法的蛋白质得率高，过程中不涉及有机溶剂和变性剂，容易放大进行工业生产。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种综合利用组分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a：将Cohn低温乙醇法获得的组分IV溶液I溶解，分离沉淀，获得上清I和沉淀I，将所述沉淀I溶液II溶解，分离沉淀，获得上清II和沉淀II，再将所述沉淀II溶液III溶解，分离沉淀，获得上清III；
其中，优选地，所述溶液I为酸性缓冲溶液，pH值为优选地3.8-5.2、更优选地4.1-4.8、最优选地4.3-4.5，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M，所述溶液II为中性缓冲溶液，pH值为优选地6.0-7.5、更优选地6.3-7.2、最优选地6.5-7.0，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M和/或所述溶液III为碱性缓冲溶液，pH值为优选地8.0-9.5、更优选地8.3-9.2、最优选地8.5-9.0，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M，且优选地，所述酸性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系和柠檬酸-柠檬酸钠体系、所述中性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于磷酸盐缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系和/或所述碱性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于Tris-HCl缓冲体系和硼酸-硼砂缓冲体系；
优选地，所述组分IV与所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的质量比分别为1:500-1:1，更优选地1:100-1:2，最优选地1:10-1:4，
优选地，所述分离通过离心来进行，
优选地，所述步骤a在0-4℃下进行。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤b：将上清I经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分A，之后用洗脱缓冲液I洗脱，获得组分B，最后用洗脱缓冲液II洗脱，获得α2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为平衡缓冲液I；
其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤c：将上清II的pH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分C，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分D和根据610nm处的特征吸收收集的富含铜蓝蛋白的组分E，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得α2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I；
其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤d：将上清III的pH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分F，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分G，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得α2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I；
其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤e：将组分A、C、F或其组合的pH值调节至平衡缓冲液II的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得免疫球蛋白，用洗脱缓冲液III洗脱获得转铁蛋白，再用洗脱缓冲液IV洗脱获得白蛋白和载脂蛋白A1的混合物，将所述白蛋白和载脂蛋白A1的混合物的盐浓度调节至平衡缓冲液III的盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液V洗脱获得白蛋白，再用洗脱缓冲液VI洗脱获得载脂蛋白A1；其中，离子交换层析柱分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液II，疏水层析分离过程中所使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III；
其中，优选地，所述平衡缓冲液II的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5M、更优选地6.8-7.2M，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4和Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，
优选地，所述洗脱缓冲液III为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.06-0.14M、更优选地0.08-0.12M,最优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液IV为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液IV的浓度为0.15-0.35M、优选地0.18-0.3M、更优选地0.20-0.28M，最优选地0.25M，
优选地，所述洗脱缓冲液V与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液V的盐浓度为0.25-0.8M、优选地0.3-0.6M、最优选地0.4-0.5M，
优选地，所述洗脱缓冲液VI与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VI的盐浓度为0-0.2M、优选地0.01-0.1M、最优选地0.02-0.05M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q，
优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤f：分别将组分B、D和G的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液III的pH值和盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液VII洗脱组分B、D和G均获得结合珠蛋白，再用洗脱缓冲液VIII洗脱，分别获得α1-抗胰蛋白酶，组分H和组分I，其中，疏水层析分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III；
其中，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4和Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，
优选地，所述洗脱缓冲液VII与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VII的盐浓度为0.6-0.9M、优选地0.75-0.85M、最优选地0.8M，
优选地，所述洗脱缓冲液VIII与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VIII的盐浓度为0-0.6M、优选地0.01-0.4M、更优选地0.02-0.1M，最优选地0.05M，
优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤g：将组分D、H或其组合的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液II的pH值和盐浓度，经由亲和层析柱分离，用洗脱缓冲液IX洗脱去除杂质，再用洗脱缓冲液X洗脱获得抗凝血酶III，其中亲和层析分离过程中使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液IV；
其中，优选地，所述平衡缓冲液IV的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5M、更优选地6.8-7.2M，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液IX为在所述平衡缓冲液IV中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0.05-0.25M、优选地0.1-0.2M、更优选地0.15M，
优选地，所述洗脱缓冲液IX为在所述平衡缓冲液IV中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐的度为0.4-0.6M、优选地0.45-0.55M、更优选地0.5M，
优选地，所述亲和层析介质包括但是不限于过程所生产的肝素琼脂糖介质以及GE公司的heparin Sepharose FF。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤h：将组分E的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液III的pH值和盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液VII洗脱获得富含铜蓝蛋白的组分，将所述富含铜蓝蛋白的组分用超滤膜浓缩，之后用凝胶过滤层析柱分离，按照紫外信号收集洗脱峰，获得铜蓝蛋白，其中，疏水层析分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III，凝胶过滤层析分离过程中所用的平衡缓冲液为缓冲液V；
其中，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4和Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，
优选地，所述平衡缓冲液V的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系，pH值为5.5-9.9，优选地6.0-8.0、更优选地6.5-7.5、最优选地6.8-7.2且所述平衡缓冲液IV还含有包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述平衡缓冲液IV的盐浓度为0.05-0.4M，优选地0.1-0.25M，更优选地0.15-0.2M，
优选地，所述洗脱缓冲液VII与平衡缓冲液III相同，但其中所述另外的盐的浓度为0.6-0.9M、优选地0.75-0.85M、最优选地0.8M，
优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub，
优选地，所述凝胶过滤层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的快球速琼脂糖介质和魔芋葡糖聚糖介质以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex75、Superdex200、Sephadex G 75、Sephacryl 200HR和SephadexG150，
优选地，所述超滤膜为截留分子为1-100kDa、优选地5-30kDa、更优选地10kDa的膜包。
本发明的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤i：将组分G、I或其组合的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液VI的pH值和盐浓度，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰获得C 1酯酶抑制剂；
其中，优选地，所述平衡缓冲液VI的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.0-3.8、优选地3.2-3.6、更优选地3.4，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地为20-40mM，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
本发明的综合利用组分IV的方法，在步骤a之后和步骤b-i之前可进行步骤j：分别将所述步骤a中的上清I、II、III离心除去助滤剂，之后用微滤膜过滤；
其中，所述离心的离心速度为优选地5000-1000rpm，更优选地6000-8000rpm，所述离心的离心时间为优选地10-60min，更优选地30-45min；
所述微滤膜的孔径为优选地0.1-1.0μm，更优选地0.45μm。
Cohn组分IV是指按照Cohn等人的冷乙醇沉淀法分离血浆蛋白时获得的沉淀组分IV，其含有多种有药用价值的血浆蛋白。
附图说明
图1本发明的工艺生产流程图。
图2上清I、II和III的SDS-PAGE电泳结果图。
其中1为marker，2为上清I，3为上清II，4为上清III。
图3上清I的离子交换层析谱图，其中横坐标为洗脱体积，左侧纵坐标为280nm处的吸光度，右侧纵坐标为电导率。
图4上清I在离子交换层析上洗脱峰的SDS-PAGE电泳结果图，其中1为marker，2为图3中的P1峰，3为图3中的P2峰，4为图3中的P3峰，5为图3中的P4峰。
图5中试得到产品的SDS-PAGE电泳结果，其中1和5为marker，2为IgG，3为转铁蛋白，4为白蛋白，6为结合珠蛋白，7为α1-抗胰蛋白酶。
发明详述
本发明提供的综合利用组分IV的方法见附图1的流程图。其纯化工艺由以下几个步骤组成。
（1）组分IV沉淀的溶解
本专利所采用的原料是人血浆经Cohn低温冷乙醇沉淀法得到的沉淀，沉淀采用压滤法得到，吸附于珍珠岩等助滤剂上。将组分IV先用酸性的缓冲溶液溶解，离心分离沉淀，得到的上清作为物料I；再将沉淀中性的缓冲溶液溶解，离心分离沉淀，得到的上清作为物料II，其中富含铜蓝蛋白和抗凝血酶III；在将沉淀用碱性的缓冲溶液溶解，离心分离沉淀，得到的上清作为物料III，其中富含C1酯酶抑制剂。
所使用酸性缓冲液可以是醋酸-醋酸钠缓冲液，也可以是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。溶液的pH值为3.8-5.2，优选地4.1-4.8，最优选地4.3-4.5。缓冲液浓度为0.01M-0.5M，优选地0.01-0.2M，最优选地0.02-0.05M。组分IV与缓冲液的质量比为1:500-1:1，优选地1:100-1:2，最优选地1:10-1:4。
所使用中性缓冲液可以是磷酸盐缓冲体系，也可以是Tris-HCl缓冲体系。溶液的pH值为6.0-7.5，优选地6.3-7.2，最优选地6.5-7.0。缓冲液浓度为0.01M-0.5M，优选地0.01-0.2M，最优选地0.02-0.05M。组分IV与缓冲液的质量比为1:500-1:1，优选地1:100-1:2，最优选地1:10-1:4。
所使用碱性缓冲液可以是Tris-HCl体系，也可以是硼酸-硼砂缓冲体系。溶液的pH值为8.0-9.5，优选地8.3-9.2，最优选地8.5-9.0。缓冲液浓度为0.01M-0.5M，优选地0.01-0.2M，最优选地0.02-0.05M。组分IV与缓冲液的质量比为1:500-1:1，优选地1:100-1:2，最优选地1:10-1:4。
在另一优选地例中，组分IV的溶解操作在0-4度条件下进行。
在另一优选地例中，组分IV的溶出物首先采用离心出去助滤剂，然后用微滤膜过滤。离心速度为5000-1000rpm，离心时间为10-60min，离心速度更优选地为6000-8000rpm，离心时间更优选地为30-45min。微滤膜孔径为0.1-1.0m，更优选地为0.45m滤膜。所得到的上清用于后续的层析处理。
（2）离子交换层析对组分的初步分离
将物料I上到离子交换层析柱上，通过对平衡缓冲液的控制白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白以及载脂蛋白A1在不会吸附在层析柱上，收集此穿透峰（FractionA），而结合珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶和α2-巨球蛋白则会吸附到层析介质上。再用洗脱缓冲液I将结合珠蛋白和α1-抗胰蛋白酶洗脱下来，收集此洗脱峰（Fraction B），接着再用洗脱缓冲液II将α2-巨球蛋白洗脱下来，得到α2-巨球蛋白的纯品。
所使用的离子交换层析介质可以是中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q等等。优选地中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更优选地选择中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介质。
平衡缓冲液为醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系。缓冲液pH为3.5-5.2，优选地3.8-5.0，更优选地为4.2-4.6。缓冲液浓度为5-200mM，优选地10-100mM，更优选地为20-40mM。
洗脱缓冲液与平衡缓冲液相同，但是其中含有一定浓度的盐类。所含的盐类为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。第一步洗脱的盐浓度为0.05-0.15M，优选地0.08-0.12，更优选地为0.1M。第二个阶梯洗脱的盐浓度为0.18-0.35M，优选地0.2-0.3M，最优选地0.25M。
将物料II的pH调节到与平衡缓冲液的pH值一致，然后上到离子交换层析柱上，通过对平衡缓冲液的控制白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白以及载脂蛋白A1在不会吸附在层析柱上，收集此穿透峰（Fraction C），而结合珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白和抗凝血酶III则会吸附到层析介质上。再用洗脱缓冲液I将结合珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III洗脱下来，收集此洗脱峰（Fraction D），洗脱时根据610nm处的特征吸收收集富含铜蓝蛋白的组分（Fraction E），接着再用洗脱缓冲液II将α2-巨球蛋白洗脱下来，得到α2-巨球蛋白的纯品。
所使用的离子交换层析介质可以是中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q等等。优选地中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更优选地选择中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介质。
平衡缓冲液为醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系。缓冲液pH为3.5-5.2，优选地3.8-5.0，更优选地为4.2-4.6。缓冲液浓度为5-200mM，优选地10-100mM，更优选地为20-40mM。
洗脱缓冲液与平衡缓冲液相同，但是其中含有一定浓度的盐类。所含的盐类为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。第一步洗脱的盐浓度为0.05-0.15M，优选地0.08-0.12，更优选地为0.1M。第二个阶梯洗脱的盐浓度为0.18-0.35M，优选地0.2-0.3M，最优选地0.25M。
将物料III的pH调节到与平衡缓冲液的pH值一致，然后上到离子交换层析柱上，通过对平衡缓冲液的控制白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白以及载脂蛋白A1在不会吸附在层析柱上，收集此穿透峰（Fraction F），而结合珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白和C1酯酶抑制剂则会吸附到层析介质上。再用洗脱缓冲液I将结合珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶、C1酯酶抑制剂洗脱下来，收集此洗脱峰（Fraction G），接着再用洗脱缓冲液II将α2-巨球蛋白洗脱下来，得到α2-巨球蛋白的纯品。
所使用的离子交换层析介质可以是中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q等等。优选地中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更优选地选择中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介质。
平衡缓冲液为醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系。缓冲液pH为3.5-5.2，优选地3.8-5.0，更优选地为4.2-4.6。缓冲液浓度为5-200mM，优选地10-100mM，更优选地为20-40mM。
洗脱缓冲液与平衡缓冲液相同，但是其中含有一定浓度的盐类。所含的盐类为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。第一步洗脱的盐浓度为0.05-0.15M，优选地0.08-0.12，更优选地为0.1M。第二个阶梯洗脱的盐浓度为0.18-0.35M，优选地0.2-0.3M，最优选地0.25M。
（3）人血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白和载脂蛋白A1的纯化
调节FractionA或D或F的pH值与平衡缓冲液的pH值一致，然后上到阴离子交换层析介质上，收集穿透峰，其中所含蛋白为IgG。再用洗脱缓冲液洗脱得到转铁蛋白。在提高盐浓度洗脱的到白蛋白和载脂蛋白A1。将白蛋白和载脂蛋白A1的混合物的盐浓度调节到与疏水层析平衡缓冲液的盐浓度一致，然后降低洗脱缓冲液的盐浓度进行洗脱，得到白蛋白，再进一步降低洗脱缓冲液的盐浓度得到载脂蛋白A1。
所使用的离子交换层析介质可以是中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q等等。优选地中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更优选地选择中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介质。
离子交换层析平衡缓冲液为磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系。缓冲液pH为6.0-8.0，优选地6.5-7.5，更优选地为6.8-7.2。缓冲液浓度为5-200mM，优选地10-100mM，更优选地为20-40mM。
洗脱缓冲液与平衡缓冲液相同，但是其中含有一定浓度的盐类。所含的盐类为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。第一步洗脱的盐浓度为0.05-0.15M，优选地0.08-0.12，更优选地为0.1M。第二个阶梯洗脱的盐浓度为0.18-0.35M，优选地0.2-0.3M，更优选地为0.25M。
疏水介质为中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛基以及苯基琼脂糖介质，也可以是GE公司的Butyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF、PhenylSepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。优选地中国科学院过程工程研究所生产的辛基以及苯基琼脂糖介质，也可以是GE公司的PhenylSepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。更优选地为中国科学院过程工程研究所生产的苯基琼脂糖介质，也可以是GE公司的Phenyl SepharoseFF high sub。
疏水层析平衡缓冲液为磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系。缓冲液pH为6.0-8.0，优选地6.5-7.5，更优选地为6.8-7.2。其中含有较高浓度的盐类。盐为为(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4，更优选地为(NH4)2SO4。盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M。第一步洗脱盐浓度为0.6-0.25M，优选地0.3-0.5M，最优选地为0.4M。第二部洗脱盐浓度为0-0.2M，优选地0.01-0.1M，最优选地0.02-0.05M。
（4）结合珠蛋白和α1-抗胰蛋白酶的纯化
调节Fraction B的pH值和盐浓度与疏水层析的平衡缓冲液一致，然后上到疏水层析柱上，降低盐浓度洗脱得到结合珠蛋白，在进一步降低盐浓度洗脱可以得到α1-抗胰蛋白酶。对于Fraction D按此工艺处理也可以得到结合珠蛋白纯品以及α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的混合物（Fraction H）。对于Fraction G按此工艺处理可以得到结合珠蛋白纯品以及α1-抗胰蛋白酶和C1酯酶抑制剂的混合物（Fraction I）。
疏水介质为中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛基以及苯基琼脂糖介质，也可以是GE公司的Butyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF、PhenylSepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。优选地中国科学院过程工程研究所生产的丁基或者辛基介质，也可以是GE公司的Butyl SepharoseFF、Octyl Sepharose FF。更优选地为中国科学院过程工程研究所生产的丁基琼脂糖介质，也可以是GE公司的Butyl Sepahrose FF high sub。
疏水层析平衡缓冲液为磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系。缓冲液pH为6.0-8.0，优选地6.5-7.5，更优选地为6.8-7.2。其中含有较高浓度的盐类。盐为为(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4，更优选地为(NH4)2SO4。盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M。第一步洗脱盐浓度为0.9-0.6M，优选地0.85-0.75M，最优选地为0.8M。第二部洗脱盐浓度为0-0.6M，优选地0.01-0.4M，最优选地0.02-0.1M。
（5）抗凝血酶III的纯化
调节Fraction D或者H的pH值和盐浓度与平衡缓冲液一致，然后上到亲和层析柱上，提高盐浓度洗脱去除杂质，再进一步提高盐浓度洗脱得到抗凝血酶III纯品。
所用亲和层析介质为中国科学院过程工程研究所生产的肝素亲和琼脂糖介质，也可以是GE公司的heparin Sepharose FF。
亲和层析的平衡缓冲液为磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系。缓冲液pH为6.0-8.0，优选地6.5-7.5，更优选地为6.8-7.2。缓冲液浓度为5-200mM，优选地10-100mM，更优选地为20-40mM。
洗脱缓冲液与平衡缓冲液相同，但是其中含有一定浓度的盐类。所含的盐类为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。第一步洗脱的盐浓度为0.05-0.25M，优选地0.1-0.2，更优选地为0.15M。第二个阶梯洗脱的盐浓度为0.4-0.6M，优选地0.45-0.55M，更优选地为0.5M。
（6）铜蓝蛋白的纯化
调节Fraction E的pH值与盐浓度与疏水层析的平衡缓冲液一致，然后上到疏水层析柱中。然后减低盐浓度洗脱得到富含铜蓝蛋白的组分，在进一步降低盐浓度洗脱洗去其它杂质。将得到的富含铜蓝蛋白的组分用超滤膜进行浓缩，然后上到凝胶过滤层析柱上进行分离，按照紫外信号收集洗脱峰，可以得到铜蓝蛋白的纯品。
疏水介质为中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛基以及苯基琼脂糖介质，也可以是GE公司的Butyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF、PhenylSepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。优选地中国科学院过程工程研究所生产的丁基或者辛基介质，也可以是GE公司的Butyl SepharoseFF、Octyl Sepharose FF。更优选地为中国科学院过程工程研究所生产的丁基琼脂糖介质，也可以是GE公司的Butyl Sepahrose FF high sub。
疏水层析平衡缓冲液为磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系。缓冲液pH为6.0-8.0，优选地6.5-7.5，更优选地为6.8-7.2。其中含有较高浓度的盐类。盐为为(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4，更优选地为(NH4)2SO4。盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M。第一步洗脱盐浓度为0.9-0.6M，优选地0.85-0.75M，最优选地为0.8M。第二部洗脱盐浓度为0-0.6M，优选地0.01-0.4M，最优选地0.02-0.1M。
超滤过程可以选择截留分子为1-100kDa的膜包进行浓缩，优选地截留分子量为5-30kDa的膜包进行浓缩，更优选地选择截留分子量为10kDa的膜包。
中国科学院过程工程研究所生产的快球速琼脂糖介质和魔芋葡糖聚糖介质以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex75、Superdex200、Sephadex G 75、Sephacryl 200HR以及Sephadex G150。优选地中国科学院过程工程研究所生产的快球速琼脂糖介质和魔芋葡糖聚糖介质以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex200、以及Sephacryl 200HR，最优选地选择中国科学院过程工程研究所生产的快球速琼脂糖介质和魔芋葡糖聚糖介质以及GE公司的Sepharose 6FF或者Superdex200。
凝胶过滤层析的缓冲液为磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系。缓冲液pH为6.0-8.0，优选地6.5-7.5，更优选地为6.8-7.2。其中含有一定浓度的盐类。盐可以为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。盐浓度为0.05-0.25M，优选地0.1-0.2，更优选地为0.15M。
（7）C1酯酶抑制剂的纯化
调节Fraction G或者I的pH值和盐浓度和洗脱缓冲液的盐浓度一致，然后上到离子交换层析柱上，收集穿透峰为C1酯酶抑制剂纯品。再用洗脱峰洗去层析介质上吸附的其它杂质。
所使用的离子交换层析介质可以是中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q等等。优选地中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更优选地选择中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介质。
平衡缓冲液为醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系。缓冲液pH为3.0-3.8，优选地3.2-3.6，更优选地为3.4。缓冲液浓度为5-200mM，优选地10-100mM，更优选地为20-40mM。
洗脱缓冲液与平衡缓冲液相同，但是其中含有一定浓度的盐类。所含的盐类为NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，优选地NaCl、KCl、NaBr，更优选地为NaCl。洗脱液的盐浓度为0.1-2M，优选地0.5-1.5，更优选地为1.0M。
实施例1
组分IV的溶解过程
称取5g组分IV，加入20mL pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，用磁力搅拌器进行搅拌，在冰箱中放置4h，然后取出。在5000rpm条件下进行离心，离心30min。分离上清和沉淀，得到上清I。将此沉淀再用20mL pH7.2的磷酸盐缓冲液溶解，用磁力搅拌器进行搅拌，在冰箱中放置4h，然后取出。在5000rpm条件下进行离心，离心30min。分离上清和沉淀，得到上清II。再将此沉淀再用50mL pH9.5的Tris-HCl缓冲液溶解，用磁力搅拌器进行搅拌，在冰箱中放置4h，然后取出。在5000rpm条件下进行离心，离心30min。分离上清和沉淀，得到上清III。
将上清I、II和III用SDS-PAGE进行分析，结果如图2所示。可以看出上清I中含有人血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶和载脂蛋白A1。而上清II中除了I中含有的组分外，还富含铜蓝蛋白和抗凝血酶III，上清III中除了I中含有的组分外，还富含C1酯酶抑制剂。
实施例2
制备血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、载脂蛋白A1、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶
将中国科学院过程工程研究所生产的DEAE快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。平衡后进料10mL上清I，进料流速为1.5mL/min，进料结束以后用平衡缓冲液淋洗，淋洗流速为1.5mL/min，收集穿透峰1。然后用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4，含0.1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰1。再用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4，含0.2M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰2。此洗脱峰中主要含有α2-巨球蛋白。层析谱图如图3所示。各洗脱峰的SDS-PAGE分析如图4所示。
调节将穿透峰的pH至7.0，然后用20mM PB，pH7.2的缓冲溶液平衡此DEAE层析柱，平衡10个柱体积。平很厚开始进料，进料流速为1.5mL/min，进料结束以后用平衡缓冲液淋洗，淋洗流速为1.5mL/min，收集穿透峰2。然后用20mM PB，pH7.2，含0.1M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰3，其中主要含有转铁蛋白。再用20mM PB，pH7.2，含0.2M NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰4，其中含有白蛋白和载脂蛋白A1。
用中国科学院过程工程研究所生产的苯基快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM PB，pH7.2，含有1M硫酸铵的缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。再将洗脱峰4的电导率调节至于平衡缓冲液相同。然后开始进料，进料流速为1.5mL/min，无穿透峰。然后用20mM PB，pH7.2，含有0.4M硫酸铵的缓冲溶液进行洗脱，得到白蛋白，最后用水洗，得到载脂蛋白A1。
用中国科学院过程工程研究所生产的丁基快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM PB，pH7.2，含有1M硫酸铵的缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。再将洗脱峰2的电导率调节至于平衡缓冲液相同。然后开始进料，进料流速为1.5mL/min，无穿透峰。然后用20mM PB，pH7.2，含有0.8M硫酸铵的缓冲溶液进行洗脱，得到结合珠蛋白，再用20mMPB，pH7.2洗脱，得到α1-抗胰蛋白酶。
实施例3
制备抗凝血酶III
将中国科学院过程工程研究所生产的DEAE快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。调节上清II的pH值至4.4，平衡后进料10mL上清II，进料流速为1.5mL/min，进料结束以后用平衡缓冲液淋洗，淋洗流速为1.5mL/min，得到穿透峰。然后用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4，含0.1M NaCl的缓冲液进行洗脱，此洗脱峰中富含抗凝血酶III。
用中国科学院过程工程研究所生产的丁基快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM PB，pH7.2，含有1M硫酸铵的缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。调节富含抗凝血酶III的物料pH值和盐浓度与平衡缓冲液一致。然后开始进料，进料流速为1.5mL/min，无穿透峰。然后用20mM PB，pH7.2，含有0.8M硫酸铵的缓冲溶液进行洗脱，得到结合珠蛋白，再用20mM PB，pH7.2洗脱，得到α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的混合物。
将此混合物用进一步上到肝素亲和层析柱上。用中国科学院过程工程研究所生产的肝素亲和快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM PB，pH7.2的缓冲液平衡，平衡10个柱体积，然后开始进料。首先用20mM PB，pH7.2，含有0.23M NaCl的缓冲液洗脱，洗去其中α1-抗胰蛋白酶，然后再用20mM PB，pH7.2，含有1.0M NaCl的缓冲液洗脱得到抗凝血酶III的纯品。
实施例4
制备铜蓝蛋白
将中国科学院过程工程研究所生产的DEAE快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。调节上清II的pH值至4.4，平衡后进料10mL上清II，进料流速为1.5mL/min，进料结束以后用平衡缓冲液淋洗，淋洗流速为1.5mL/min，得到穿透峰。然后用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4，含0.1M NaCl的缓冲液进行洗脱，根据610nm出吸收收集洗脱组分，此组分中富含铜蓝蛋白。
用中国科学院过程工程研究所生产的丁基快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM PB，pH7.2，含有1M硫酸铵的缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。调节富含铜蓝蛋白的物料pH值和盐浓度与平衡缓冲液一致。然后开始进料，进料流速为1.5mL/min，无穿透峰。然后用20mM PB，pH7.2，含有0.8M硫酸铵的缓冲溶液进行洗脱富含铜蓝蛋白的组分。
将上述富含铜蓝蛋白的组分用Satorious Vavaflow 50（截留分子量为10kDa）进行浓缩，浓缩后的样品用用Superdex 200预装柱（HiLoad 16/60）进行分离，进料1mL，收集洗脱峰。其中第一个洗脱峰中主要为结合珠蛋白，第二个洗脱峰主要为铜蓝蛋白。
实施例5
制备C1酯酶抑制剂
将中国科学院过程工程研究所生产的DEAE快流速琼脂糖介质装柱，柱子大小为7.0*1.6cm I.D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。调节上清II的pH值至4.4，平衡后进料10mL上清III，进料流速为1.5mL/min，进料结束以后用平衡缓冲液淋洗，淋洗流速为1.5mL/min，得到穿透峰。然后用20mM醋酸-醋酸钠，pH4.4，含0.1M NaCl的缓冲液进行洗脱，此组分中C1酯酶抑制剂。
用20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.4缓冲溶液进行平衡，平衡10个柱体积。然后将富含C1酯酶抑制剂组分的pH值调节至3.4，再将调节pH值后的物料上到上述DEAE柱子上，收集穿透峰，其中为C1酯酶抑制剂的纯品。
实施例6
组分IV综合利用的放大（中试）
近期根据上述工艺采用400mL的柱子对上述工艺进行了放大。放大过程实际操作如下：称取组分IV 642g，加入3210mL 20mM NaAc-HAc缓冲液（pH4.4），室温下溶解2个小时，然后离心；沉淀再用3L 20mM PB缓冲液（pH7.0）溶解，离心得到的沉淀再用3L50mM Tris-HCl缓冲液（pH8.5）溶解，沉淀丢弃。
将pH4.4的缓冲液溶出的蛋白上DEAE Sepharose FF柱子（柱体积400mL）。分两次进料（相当于每毫升介质处理4mL溶出液），得到穿透峰和洗脱峰。把穿透峰的pH值调节到7.0，然后再上相同的DEAE Sepharose FF柱子，穿透峰共分三次进料，分别得到IgG，转铁蛋白和白蛋白。pH4.4条件下的洗脱峰用Butyl Sepharose 4FF介质处理，得到结合珠蛋白和富含α1-抗胰蛋白酶的组分。得到产品的纯度分析如图所示。得到产品的总量如下：免疫球蛋白：2.5g，转铁蛋白6.2g，白蛋白1.6g，结合珠蛋白1.2g，α1-抗胰蛋白酶1.2g。放大得到的纯品的SDS分析如图5所示。
实施例6
转铁蛋白的ELISA鉴定
用奇松生物公司的酶联免疫吸附试剂盒测定以上各实施例中所得到的蛋白为相应的活性蛋白。
设施标品孔和样品孔，标准品孔各家不同浓度的标准品50L。取10L待测样品，再加入样本稀释液40L，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本空中每个孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100L，用封板膜封住反应孔，37度避光孵育1个小时。弃去液体，拍干，然后用洗液洗板，重复5次。然后每孔加入底物A和B各50L，度避光孵育15分钟。然后每孔加入终止液50L。在450nm波长处测定各孔的OD值。检测结果表明所纯化出来的蛋白为相应的活性蛋白。
以上结果仅是本发明中比较具有代表性的实施例，并非用于限定本发明专利的实质技术范围，本专利的实质技术内容广义定义于申请的权利要求范围内，任何他人完成的技术实体或者方法，若与申请的权利要求范围完全相同，也或是一种等效的变更，均将视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种综合利用组分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a：将Cohn低温乙醇法获得的组分IV溶液I溶解，分离沉淀，获得上清I和沉淀I，将所述沉淀I溶液II溶解，分离沉淀，获得上清II和沉淀II，再将所述沉淀II溶液III溶解，分离沉淀，获得上清III；
其中，优选地，所述溶液I为酸性缓冲溶液，pH值为优选地3.8-5.2、更优选地4.1-4.8、最优选地4.3-4.5，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M，所述溶液II为中性缓冲溶液，pH值为优选地6.0-7.5、更优选地6.3-7.2、最优选地6.5-7.0，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M和/或所述溶液III为碱性缓冲溶液，pH值为优选地8.0-9.5、更优选地8.3-9.2、最优选地8.5-9.0，浓度为优选地0.01M-0.5M、更优选地0.01-0.2M、最优选地0.02-0.05M，且优选地，所述酸性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系和柠檬酸-柠檬酸钠体系、所述中性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于磷酸盐缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系和/或所述碱性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于Tris-HCl缓冲体系和硼酸-硼砂缓冲体系；
优选地，所述组分IV与所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的质量比分别为1:500-1:1，更优选地1:100-1:2，最优选地1:10-1:4，
优选地，所述分离通过离心来进行，
优选地，所述步骤a在0-4℃下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤b：将上清I经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分A，之后用洗脱缓冲液I洗脱，获得组分B，最后用洗脱缓冲液II洗脱，获得α2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为平衡缓冲液I；
其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤c：将上清II的pH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分C，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分D和根据610nm处的特征吸收收集的富含铜蓝蛋白的组分E，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得α2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I；
其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤d：将上清III的pH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分F，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分G，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得α2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I；
其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.5-5.2、优选地3.8-5.0、更优选地4.1-4.9、最优选地4.2-4.6，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.08-0.12M、更优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0.18-0.35M、优选地0.2-0.3M、更优选地0.25M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤e：将组分A、C、F或其组合的pH值调节至平衡缓冲液II的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得免疫球蛋白，用洗脱缓冲液III洗脱获得转铁蛋白，再用洗脱缓冲液IV洗脱获得白蛋白和载脂蛋白A1的混合物，将所述白蛋白和载脂蛋白A1的混合物的盐浓度调节至平衡缓冲液III的盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液V洗脱获得白蛋白，再用洗脱缓冲液VI洗脱获得载脂蛋白A1；其中，离子交换层析柱分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液II，疏水层析分离过程中所使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III；
其中，优选地，所述平衡缓冲液II的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5M、更优选地6.8-7.2M，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4和Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，
优选地，所述洗脱缓冲液III为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0.05-0.15M、优选地0.06-0.14M、更优选地0.08-0.12M,最优选地0.1M，
优选地，所述洗脱缓冲液IV为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液IV的浓度为0.15-0.35M、优选地0.18-0.3M、更优选地0.20-0.28M，最优选地0.25M，
优选地，所述洗脱缓冲液V与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液V的盐浓度为0.25-0.8M、优选地0.3-0.6M、最优选地0.4-0.5M，
优选地，所述洗脱缓冲液VI与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VI的盐浓度为0-0.2M、优选地0.01-0.1M、最优选地0.02-0.05M，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q，
优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤f：分别将组分B、D和G的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液III的pH值和盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液VII洗脱组分B、D和G均获得结合珠蛋白，再用洗脱缓冲液VIII洗脱，分别获得α1-抗胰蛋白酶，组分H和组分I，其中，疏水层析分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III；
其中，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4和Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，
优选地，所述洗脱缓冲液VII与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VII的盐浓度为0.6-0.9M、优选地0.75-0.85M、最优选地0.8M，
优选地，所述洗脱缓冲液VIII与所述平衡缓冲液III相同，且所述洗脱缓冲液VIII的盐浓度为0-0.6M、优选地0.01-0.4M、更优选地0.02-0.1M，最优选地0.05M，
优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤g：将组分D、H或其组合的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液II的pH值和盐浓度，经由亲和层析柱分离，用洗脱缓冲液IX洗脱去除杂质，再用洗脱缓冲液X洗脱获得抗凝血酶III，其中亲和层析分离过程中使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液IV；
其中，优选地，所述平衡缓冲液IV的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5M、更优选地6.8-7.2M，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地20-40mM，
优选地，所述洗脱缓冲液IX为在所述平衡缓冲液IV中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0.05-0.25M、优选地0.1-0.2M、更优选地0.15M，
优选地，所述洗脱缓冲液X为在所述平衡缓冲液IV中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐的度为0.4-0.6M、优选地0.45-0.55M、更优选地0.5M，
优选地，所述亲和层析介质包括但是不限于过程所生产的肝素琼脂糖介质以及GE公司的heparin Sepharose FF。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤h：将组分E的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液III的pH值和盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液VII洗脱获得富含铜蓝蛋白的组分，将所述富含铜蓝蛋白的组分用超滤膜浓缩，之后用凝胶过滤层析柱分离，按照紫外信号收集洗脱峰，获得铜蓝蛋白，其中，疏水层析分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III，凝胶过滤层析分离过程中所用的平衡缓冲液为缓冲液V；
其中，优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6.0-8.0、优选地6.5-7.5、更优选地6.8-7.2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、NaH2PO4和Na2HPO4，优选地(NH4)2SO4、K2SO4和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为1.5-0.8M，优选地1.2-0.8M，最优选地1M，
优选地，所述平衡缓冲液V的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl体系，pH值为5.5-9.9，优选地6.0-8.0、更优选地6.5-7.5、最优选地6.8-7.2且所述平衡缓冲液IV还含有包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2，优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述平衡缓冲液IV的盐浓度为0.05-0.4M，优选地0.1-0.25M，更优选地0.15-0.2M，
优选地，所述洗脱缓冲液VII与平衡缓冲液III相同，但其中所述另外的盐的浓度为0.6-0.9M、优选地0.75-0.85M、最优选地0.8M，
优选地，所述疏水层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的丁基、辛集以及苯基琼脂糖介质，GE公司的Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub，
优选地，所述凝胶过滤层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的快球速琼脂糖介质和魔芋葡糖聚糖介质以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex75、Superdex200、Sephadex G 75、Sephacryl 200HR和SephadexG150，
优选地，所述超滤膜为截留分子为1-100kDa、优选地5-30kDa、更优选地10kDa的膜包。
9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤i：将组分G、I或其组合的pH值和盐浓度分别调节至平衡缓冲液VI的pH值和盐浓度，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰获得C1酯酶抑制剂；
其中，优选地，所述平衡缓冲液VI的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH值为3.0-3.8、优选地3.2-3.6、更优选地3.4，浓度为5-200mM、优选地10-100mM、更优选地为20-40mM，
优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的DEAE以及Q琼脂糖介质，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE以及Capto Q。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a之后和步骤b-i之前进行步骤j：分别将所述步骤a中的上清I、II、III离心除去助滤剂，之后用微滤膜过滤；
其中，优选地，所述离心的离心速度为5000-1000rpm，优选地6000-8000rpm，所述离心的离心时间为10-60min，优选地30-45min；
优选地，所述微滤膜的孔径为0.1-1.0μm，优选地0.45μm。
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