RU2453555C2 - Способ очистки аполипопротеина а-1 - Google Patents
Способ очистки аполипопротеина а-1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2453555C2 RU2453555C2 RU2009127816/04A RU2009127816A RU2453555C2 RU 2453555 C2 RU2453555 C2 RU 2453555C2 RU 2009127816/04 A RU2009127816/04 A RU 2009127816/04A RU 2009127816 A RU2009127816 A RU 2009127816A RU 2453555 C2 RU2453555 C2 RU 2453555C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- buffer
- urea
- column
- conductivity
- apoa
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Способ очистки аполипопротеина А-1 включает смешивание фракции плазмы IV, полученной по способу низкотемпературного фракционирования этанолом с 1-8 М раствором мочевины для формирования подготовительного раствора фракции IV; загрузку подготовительного раствора в первую колонку для анионной хроматографии и последующее элюирование с 1-8 М раствором мочевины с получением раствора ароА-1 протеина; и загрузку раствора ароА-1 протеина во вторую колонку для анионной хроматографии и элюирование с 0-1 М раствором мочевины с получением чистого ароА-1 протеина. 25 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к получению протеинов и, в частности, к получению ароА-1.
Уровень техники
Липопротеин высокой плотности (HDL) является важным липопротеином крови. Он участвует в процессе, называемом обратный транспорт холестерина (RCT), посредством которого холестерин из клеток тканей может транспортироваться в печень, где метаболизируется до безвередной субстанции, тем самым сдерживая возникновение и развитие атеросклероза (AS). Аполипопротеин А-1 (ароА-1) является основной формой аполипопротеина в липопротеине высокой плотности (HDL). Он тесно связан с физиологической функцией HDL в крови. Он является главным участником в HDL антиатеросклеротическом действии. Кроме того, согласно последним данным исследований, недостаток в ароА-1 может вызвать развитие атеросклероза и усиливать воспалительный процесс. Также ароА-1 снижает содержание липопротеинов низкой плотности (LDL) и очищает бляшки. В дополнение, согласно последним данным исследований, ароА-1 является перспективным для применения в лекарственных средствах с противовоспалительным действием или действием, направленным на печень.
Для очистки ароА-1 обычно используются способы, такие как скоростное ультрацентрифугирование, осаждение органическим растворителем и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). Однако существуют некоторые существенные недостатки в этих способах, такие как низкий выход, высокая стоимость, небезопасность и небольшой объем производства. Эти способы не пригодны для промышленного получения ароА-1.
С другой стороны, при получении одной из фракций после фракционирования плазмы фракция плазмы IV всегда исключается, поскольку пригодный продукт не может быть очищен для коммерческого применения. В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается способ очистки, пригодный для крупносерийного производства, в результате которого из фракции плазмы IV получают ароА-1 с высокой чистотой.
Раскрытие изобретения
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что мочевина может сильно влиять на действие ароА-1 при ионообменной хроматографии. Если ароА-1 не связан с мочевиной, то он очень легко адсорбируется на анионообменной колонке и относительно тяжело элюируется из колонки. Однако, если ароА-1 связан с мочевиной, то он очень легко элюируется из анионообменной колонки. Таким образом, по настоящему изобретению ароА-1 очищали с помощью двух анионообменных колонок, используя два разных профиля элюции.
Настоящее изобретение обеспечивает способ очистки аполипопротеина А-1, включая следующие стадии: а) фракцию плазмы крови IV (полученную по способу низкотемпературного фракционирования этанолом) смешивают с 1-8 М раствором мочевины, формируя предварительный раствор, содержащий фракцию IV; b) предварительный раствор, полученный в стадии а), загружают в первую колонку для анионной хроматографии, и затем элюируют 1-8 М раствором мочевины с получением ароА-1 протеина; с) раствор ароА-1 протеина из стадии b) загружают во вторую колонку для анионной хроматографии, и затем элюируют 0-1 М раствором мочевины с получением чистого ароА-1 протеина. Этот способ имеет преимущества, такие как высокий выход, низкая стоимость и пригодность для промышленного производства. Кроме того, этот способ использует фракцию плазмы IV в качестве исходного материала, вследствие чего существует возможность применения источников плазмы.
Чистый ароА-1, полученный в данном изобретении, является перспективным для применения в лечении атеросклероза, противовоспалительном лечении, антитоксическом лечении, лекарствах, направленных на лечение печени, и др.
Подробное описание чертежей
Фиг.1 представляет схему, показывающую способ получения ароА-1 из фракции плазмы крови IV.
Фиг.2 показывает процесс элюции первой ионообменной хроматографии в примере 1.
Фиг.3 показывает результат электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) образца, полученного при первой ионообменной хроматографии в примере 1.
Фиг.4 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного при второй ионообменной хроматографии в примере 1.
Фиг.5 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного в примере 4.
Фиг.6 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного в примере 2.
Фиг.7 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного в примере 3.
Раскрытие предпочтительного воплощения изобретения
Воплощение способа настоящего изобретения проиллюстрировано на фиг.1, которая представляет схему, показывающую способ получения ароА-1 из фракции плазмы крови IV.
(1) Предварительная подготовка фракции плазмы крови IV
Описываемую фракцию IV получают с помощью способа низкотемпературного фракционирования этанолом (Cohn, Е. J.; Strong, L.E.; Huges, W.L.; et al., Preparation and properties of serum and plasma proteins IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. Amer Chem Soc, 1946, 68:459-475). Фракцию IV растворяют в буфере, к раствору добавляют определенное количество и тщательно перемешивают. В этом способе ароА-1 связан с мочевиной, и такая комбинация является обратимой. Концентрация добавляемой мочевины составляет 1-8 М, предпочтительно 3-7 М и более предпочтительно 5-6 М. Массовое соотношение фракции IV и мочевины составляет 1:30-300, предпочтительно 1:90-240, и более предпочтительно 1:150-210.
Буфер, который обычно используется в данном случае, выбирают из следующих: Tris буфер, фосфатный буфер или HEPES буфер, предпочтительно Tris буфер. pH буфера составляет 7,2-8,5, предпочтительно 7,5-8, и более предпочтительно 7,8.
В другом примере фракцию IV при низкой температуре (0-4°С).
В другом примере подготовительный раствор центрифугируют для удаления и затем фильтруют. Скорость центрифугирования составляет 6000-10000 об/мин, предпочтительно 8000 об/мин, размер пор фильтрационной мембраны составляет 0,2-0,6 мкм, предпочтительно 0,45 мкм.
(2) Первая DEAE анионообменная хроматография
Раствор, полученный в стадии (1), загружают в DEAE (диэтиламиноэтанол) анионообменную колонку, и протеин в растворе, включая ароА-1, присоединяется в колонке. В частности, содержащий ароА-1 раствор, полученный в стадии (1), растворяют водой 1-10 кратно, и предпочтительно 3-7 кратно. После растворения раствор загружают в анионообменную колонку при скорости потока 0,5-1,5 мл/мин, предпочтительно 0,8-1,2 мл/мин.
Затем протеин элюируют посредством двух стадий элюции. В первой стадии для элюирования колонки используется буфер со слабой проводимостью. В этот период времени ароА-1 слабо соединяется с колонкой, и протеин, содержащий по большей части ароА-1, может быть элюирован первым. Во второй стадии для элюирования колонки используется буфер с высокой проводимостью, и элюирует протеин, содержащий главным образом примеси.
Элюент, который элюирует ароА-1, содержит 1-8 М мочевину, предпочтительно 3-7 М, и более предпочтительно 5-6 М. Проводимость составляет 1-4 мс/см, предпочтительно 2-3,8 мс/см, и более предпочтительно 2,5-3,6 мс/см. Соли в элюенте могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl2 и СаСl2. NaCl является предпочтительным.
Элюент, который элюирует примеси, содержит 0-1 М мочевину; 0 М является предпочтительным. Проводимость составляет 4,5-100 мс/см. Соли в элюенте могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl2 и СаСl2. NaCl является предпочтительным.
Буфер, который обычно используется в данном случае, выбирают из следующих: Tris буфер, фосфатный буфер или HEPES буфер, предпочтительно Tris буфер. pH буфера составляет 7,2-8,5, предпочтительно 7,5-8, и более предпочтительно 7,8.
Скорость потока в колонке раствора, содержащего подготовительную фракцию, на стадии 1 составляет 0,5-1,5 мл/мин, предпочтительно 0,8-1,2 мл/мин. Соотношение объемов фракции IV и колонки составляет 1:5-50, предпочтительно 1:15-40, и более предпочтительно 1:20-30.
(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография
АроА-1 раствор, полученный в первой DEAE анионообменной хроматографии стадии 1, содержащий ароА-1, мочевину и следовое количество примесей, разбавляли водой с получением раствора с низкой проводимостью и затем загружали во вторую DEAE колонку.
Протеин связывется во второй DEAE колонке, и мочевина остается в растворе и элиминируется как элюат. Затем протеин элюируется посредством двух стадий. В первой стадии для элюирования колонки используется буфер со слабой проводимостью. АроА-1 сильно соединяется с колонкой, и примеси элюируются из колонки. Во второй стадии для элюирования колонки используется буфер с высокой проводимостью, и элюируется чистый ароА-1.
Проводимость элюента, который элюирует примеси, составляет 1-20 мс/см, предпочтительно 7-15 мс/см, более предпочтительно 9-12 мс/см. 0-1 М мочевина может присутствовать в элюенте, и 0 М является предпочтительным. Соли в элюент могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl2 и СаСl2. NaCl является предпочтительным.
Проводимость элюента, который элюирует ароА-1, составляет 50-100 мс/см, предпочтительно 70-95 мс/см, и более предпочтительно 80-90 мс/см. 0-1 М мочевина может присутствовать в элюенте, и 0 М является предпочтительным. Соли в элюенте могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl2 и СаСl2. NaCl является предпочтительным.
В другом примере после связывания ароА-1 и следового количества примесей во второй DEAE колонке применяется градиент проводимости 3 мс/см/мин для элюирования протеина. Проводимость элюента возрастает от 1 до 100 мс/см. Чистый ароА-1 элюирует при проводимости между 30 и 60 мс/см и его собирают.
Буфер, который обычно используется в данном случае, выбирают из следующих: Tris буфер, фосфатный буфер или HEPES буфер, предпочтительно Tris буфер. pH буфера составляет 7,2-8,5, предпочтительно 7,5-8, более предпочтительно 7,8.
В данном изобретении также обеспечиваются способы постпроцессинга для обработки чистого ароА-1 раствора, полученного в (3). Способы включают стадию ультрафильтрации, стадию добавления стабилизатора и стадию лиофилизации. В итоге получают лиофилизированный ароА-1 после стадий постпроцессинга.
Ультрафильтрация, которая наиболее часто используется в данной области, используется для приведения ароА-1 раствора в необходимое состояние, устанавливая соответствующее рН и концентрацию протеина. Для ультрафильтрации используют ультрафильтрационную мембрану Millipore PES с предельной молекулярной массой 5000, рабочая температура составляет 4°С и рабочее давление находится под 0,3 МПа.
Добавляемый стабилизатор выбирают из часто используемого в данной области, включая, но, не ограничиваясь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гликолят щелочной целлюлозы, сахарозу, сорбиерит и др.
Применяют способ лиофилизации, который часто используется в данной области, а именно: продукт замораживают ниже -36°С в течение 3-4 часов и затем лиофилизируют под вакуумом 7-9 Па. Температура в холодной ловушке составляет около -55°С, и затем, во второй период, температура равна 40°С и время составляет около 15 часов.
Хроматографические колонки, применяемые в данном изобретении, могут выбираться среди часто используемых колонок в данной области, и среда для хроматографии может быть средой для QAE (четвертичный амин) или DEAE анионообменной хроматографии, предпочтительно DEAE.
Изобретение в дальнейшем иллюстрируется подробно в следующих примерах. Необходимо понимать, что эти примеры применяются для объяснения изобретения, но не для ограничения объема изобретения. Для тех экспериментов в следующих примерах, если условие не определено, это означает, что условие является рутинным или рекомендовано производителем. Если же определено, то соотношения, указанные ниже, являются массовыми соотношениями.
Если указано другое, определения технических и научных терминов являются теми, которые обычно подразумеваются специалистом в данной области техники.
ПРИМЕР 1. Очистка АроА-1
Исходные материалы включают: 0,2 г фактора плазмы IV, две 5 мл DEAE анионообменные колонки (от GE Healthcare) и оборудование для очистки и определения проводимости, а именно АКТА EXPLORER 100 (от GE Healthcare).
(1) Предварительная обработка фактора плазмы IV
0,2 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). К раствору добавляют мочевину до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и тщательно перемешивают. Раствор центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка, затем фильтруют с помощью 0,45 мкм фильтра.
(2) Первая DEAE анионообменная хроматография
Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 6 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в DEAE колонку при скорости потока 1 мл/мин. Используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см) с концентрацией мочевины 6 моль/л для элюирования колонки. АроА-1 элюируется. Объем элюции составляет 20 мл. Используют четыре разных Tris буферов (каждый с pH 7,8, и с проводимостями 4,3 мс/см, 5,4 мс/см, 6,7 мс/см и 59,2 мс/см, соответственно) для элюирования колонки, и элюируются примеси. Результаты процесса элюции и SDS-PAGE электрофореза показаны на фиг.2 и 3, соответственно. Х-координата на фиг.2 представляет объем элюции в процессе хроматографии, и y-координата - концентрацию протеина в элюате. Числа 1-9 показывают зоны, откуда взят образец. Образец определяли с помощью электрофореза SDS-PAGE на фиг.3. Стрелка показывает положение ароА-1 протеина.
(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография
АроА-1, элюированный в стадии (2) (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см), содержащий ароА-1, мочевину и следовое количество примеси, разбавляли водой 5-кратно и загружали в DEAE колонку при скорости потока 10 мл/мин. АроА-1 и следовое количество примеси связывались в колонке, и мочевина оставалась в растворе и вытекала в качестве элюата.
Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 11,7 мс/см) используют для элюирования колонки и элюируют примеси из колонки. Затем используют Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 85,2 мс/см) для элюирования колонки, в результате элюируется ароА-1.
Результаты SDS-PAGE электрофореза показывают, что на данной стадии получается чистый ароА-1 (Фиг.4). Образец 1 представляет собой протеин в растворе элюата колонки в течение процесса элюции. Образец 2 представляет собой протеиновый маркер. Числа 3-5 показывают образец, собранный в течение первого процесса элюции, который содержит, главным образом, примеси. Числа 6-10 определяют образец, собранный в течение второго процесса элюции, который содержит по большей части ароА-1. Образцы 6 и 7 разбавляли 5-кратно, а образец 8-10-кратно. Стрелка показывает положение ароА-1 протеина.
ПРИМЕР 2. Очистка АроА-1
0.2 г фракции плазмы IV и оборудование являются такими же, как в примере 1.
(1) предварительная подготовка фракции плазмы крови IV
0,2 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). Мочевину добавляют к раствору до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и раствор тщательно перемешивают. Раствор центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка и затем фильтруют фильтром с 0,45 мкм.
(2) Первая DEAE анионообменная хроматография
Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 1 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в первую DEAE колонку при скорости потока 1 мл/мин. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см) с мочевиной в концентрации 1 моль/л. Элюируется АроА-1. Объем элюции составляет 20 мл. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, 59,2 мс/см, соответственно), при этом элюируются примеси.
(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография
Процедура аналогична указанной в примере 1. Результаты очистки представлены на фиг.5. Образец 1 представляет собой супернатант фракции плазмы IV после процесса предварительной подготовки. Образцы 4-8 являются ароА-1, собранным в процессе очистки. Образец 10 представляет примеси, собранные в течение процесса очистки. Стрелка показывает положение ароА-1 протеина.
ПРИМЕР 3. Очистка ароА-1
0.2 г фракции плазмы IV и оборудование являются такими же, как в Примере 1.
(1) предварительная подготовка фракции плазмы крови IV
0,2 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). Мочевину добавляют к раствору до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и раствор тщательно перемешивают. Раствор центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка и затем фильтруют фильтром с 0,45 мкм.
(2) Первая DEAE анионообменная хроматография
Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 8 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в DEAE колонку при скорости потока 1 мл/мин. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см) с 8 моль/л мочевины. АроА-1 элюируется. Объем элюции составляет 20 мл. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 59,2 мс/см) и элюируются примеси.
(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография
Процедуры аналогичны указанным в примере 1. Результаты очистки показаны на фиг.7.
ПРИМЕР 4. Очистка ароА-1 в лабораторных условиях
Исходные материалы включают: 60 г фракция плазмы IV, две 1500 мл ионообменные колонки (от Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Cooperaration), среда для анионообменной хроматографии, а именно DEAE Sepharose FF (от GE Healthcare), насос и ультрафиолетовый детектор (от Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Corporation), и оборудование для определения проводимости, а именно АКТА EXPLORER 100 (от GE Healthcare).
(1) предварительная подготовка фракции плазмы крови IV
60 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). Мочевину добавляют к раствору до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и раствор тщательно перемешивают, центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка и затем фильтруют 0,45 мкм фильтром.
(2) Первая DEAE анионообменная хроматография
Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 6 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в DEAE колонку при скорости потока 10 мл/мин. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,7 мс/см) с 8 моль/л мочевины. АроА-1 элюируется. Объем элюции составляет 10 мл. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 80,3 мс/см) и элюируются примеси.
(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография
АроА-1, элюированный в стадии (2) (pH 7,8, проводимость 3,7 мс/см), содержащий ароА-1, мочевину и следовое количество примеси, разбавляли водой 5-кратно и загружали в DEAE колонку при скорости потока 10 мл/мин. АроА-1 и следовое количество примеси связывались в колонке, и мочевина оставалась в растворе и вытекала в качестве элюата.
Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 12.2 мс/см) используют для элюирования колонки и из колонки элюируются примеси. Затем используют Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 50,4 мс/см) для элюирования колонки, в результате элюируется ароА-1.
Результаты SDS-PAGE электрофореза показаны на фиг.5. Результаты показывают, что чистый ароА-1 также может быть получен в лабораторных условиях.
ПРИМЕР 5. Определение протеина ароА-1
АроА-1 протеин, очищенный в примере 1, определяют с помощью набора для определения ароА-1, полученного от Shanghai SUN Biotech Co. LTD.
10 мкл очищенного протеина добавляют к 1 мл ароА-1 антисыворотке, и затем инкубируют при температуре 37°С в течение 15 минут. После инкубации раствор определяют посредством определения абсорбции при длине волны 505 нм. Результаты показывают, что этим протеином является ароА-1.
ПРИМЕР 6. Определение протеина ароА-1
Используя способ, описанный в примере 5, ароА-1 протеины из примеров 2 и 3, соответственно, и ароА-1 протеин из примера 4 определяют с помощью набора для определения ароА-1 от Shanghai SUN Biotech Co. LTD.
Получены аналогичные результаты.
Для специалистов ясно и очевидно, что варианты и воплощения, проиллюстрированные и описанные здесь, могут выполняться, не выходя за сущность и объем настоящего изобретения. Соответственно, необходимо понимать, что вышеприведенное описание является только иллюстративным, и истинные сущность и объем изобретения будут определяться представленной далее формулой изобретения.
Claims (26)
1. Способ очистки аполипопротеина А-1, включающий стадии:
a) смешивание фракции плазмы IV с раствором 1-8 М мочевины, формируя подготовительный раствор фракции IV;
b) загрузка подготовительного раствора, полученного на стадии а), в первую колонку для анионообменной хроматографии, и последующее элюирование с буфером I, содержащим 1-8 М мочевину, имеющим проводимость 1-4 мс/см, с получением элюента I, который главным образом содержит ароА-1 протеин;
c) загрузка элюента I во вторую колонку для анионной хроматографии, сначала элюирование буфером II, имеющим проводимость 1-15 мс/см, и затем элюирование буфером III, имеющим проводимость 30-100 мс/см, с получением чистого ароА-1 протеина.
a) смешивание фракции плазмы IV с раствором 1-8 М мочевины, формируя подготовительный раствор фракции IV;
b) загрузка подготовительного раствора, полученного на стадии а), в первую колонку для анионообменной хроматографии, и последующее элюирование с буфером I, содержащим 1-8 М мочевину, имеющим проводимость 1-4 мс/см, с получением элюента I, который главным образом содержит ароА-1 протеин;
c) загрузка элюента I во вторую колонку для анионной хроматографии, сначала элюирование буфером II, имеющим проводимость 1-15 мс/см, и затем элюирование буфером III, имеющим проводимость 30-100 мс/см, с получением чистого ароА-1 протеина.
2. Способ по п.1, в котором фракцию плазмы IV получают с помощью способа низкотемпературного фракционирования этанолом.
3. Способ по п.1, в котором буфер II включает 0-1 М мочевину.
4. Способ по п.1, в котором буфер III включает 0-1 М мочевину.
5. Способ по п.1, в котором концентрация мочевины в стадии а) и b) составляет 3-8 М.
6. Способ по п.1, в котором концентрация мочевины в стадии а) и b) составляет 5-7 М.
7. Способ по п.1, в котором проводимость буфера I составляет 2-4 мс/см, проводимость буфера II составляет 7-15 мс/см и проводимость буфера III составляет 70-95 мс/см.
8. Способ по п.1, в котором проводимость буфера I составляет 2,5-3,6 мс/см, проводимость буфера II составляет 9-12 мс/см, проводимость буфера III составляет 80-90 мс/см.
9. Способ по п.1, в котором каждая колонка для анионообменной хроматографии является одной из 1) высокоэффективной колонкой для ионообменной хроматографии и 2) низкоэффективной колонкой для ионообменной хроматографии.
10. Способ по п.1, в котором каждая колонка для анионообменной хроматографии является одной из 1) колонкой для QAE ионного обмена и 2) колонкой для DEAE ионного обмена.
11. Способ по п.1, в котором массовое соотношение фракции IV в стадии а) и мочевины составляет 1:30-300.
12. Способ по п.1, в котором массовое соотношение фракции IV в стадии а) и мочевины составляет 1:90-240.
13. Способ по п.1, в котором массовое соотношение фракции IV в стадии а) и мочевины составляет 1:150-210.
14. Способ по п.1, в котором буферы I, II, III стадий b) и с) содержат, по меньшей мере, одну соль, выбранную из группы, включающей NaCl, KCl, MgCl2 и CaCl2.
15. Способ по п.1, в котором буферы элюирования I, II, III стадий b) и с) содержат NaCl.
16. Способ по п.1, в.котором между стадиями а) и b) центрифугируют подготовительный раствор фракции IV с удалением осадков и затем фильтруют.
17. Способ по п.16, котором подготовительный раствор фракции IV центрифугируют при скорости 6000-10000 об/мин и фильтруют с помощью мембраны, имеющей размер пор 0,2-0,6 мкм.
18. Способ по п.1, в котором между стадиями а) и b) наибольшее количество примесей илюируют с помощью буфера IV, имеющего проводимость 4,5-70 мс/см.
19. Способ по п.18, в котором буфер IV содержит 0-1 М мочевину.
20. Способ по п.18, в котором буфер IV содержит, по меньшей мере, одну соль, выбранную из группы, включающей NaCl, KCl, MgCl2 и CaCl2.
21. Способ по п.18, в котором буфер IV содержит NaCl.
22. Способ по п.1, в котором рН буферов I, II и III составляет 7,2-8,5.
23. Способ по п.1, в котором буферы I, II и III содержат Tris буфер.
24. Способ по п.1, в котором рН буферов I, II и III составляет 7,5-8.
25. Способ по п.1, в котором рН буферов I, II и III составляет 7,8.
26. Способ по п.1, дополнительно содержащий после стадии с), по меньшей мере, одну ультрафильтрацию чистого ароА-1 протеин, добавление стабилизатора к чистому ароА-1 протеину и лиофилизацию чистого ароА-1 протеина.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200610147503A CN100586958C (zh) | 2006-12-20 | 2006-12-20 | 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法 |
CN200610147503.7 | 2006-12-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009127816A RU2009127816A (ru) | 2011-01-27 |
RU2453555C2 true RU2453555C2 (ru) | 2012-06-20 |
Family
ID=39565747
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009127816/04A RU2453555C2 (ru) | 2006-12-20 | 2007-09-19 | Способ очистки аполипопротеина а-1 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2125861B1 (ru) |
JP (1) | JP2010513480A (ru) |
KR (1) | KR101363106B1 (ru) |
CN (1) | CN100586958C (ru) |
AU (1) | AU2009202827B8 (ru) |
BR (1) | BRPI0721238B8 (ru) |
CA (1) | CA2673516C (ru) |
EG (1) | EG26516A (ru) |
MX (1) | MX2009006766A (ru) |
MY (1) | MY154897A (ru) |
RU (1) | RU2453555C2 (ru) |
TW (1) | TWI357347B (ru) |
WO (1) | WO2008088403A2 (ru) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120177610A1 (en) * | 2007-09-19 | 2012-07-12 | Kieu Hoang | Manufacturing and Purification Processes of Complex Protein found in Fraction IV to make a separated Apo, Transferrin , and Alpha 1 Anti strepsin (A1AT) or A combined Transferrin / Apo/Human Albumin/A1AT and all new found proteins |
CN102127165B (zh) * | 2010-01-15 | 2013-09-04 | 上海莱士血液制品股份有限公司 | 一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺 |
TR201903209T4 (tr) * | 2010-06-30 | 2019-03-21 | Csl Ltd | Yeniden yapılandırılan yüksek yoğunluğa sahip bir lipoprotein formülasyonu ve bunun üretim yöntemi. |
CN102731642B (zh) * | 2011-04-14 | 2014-01-29 | 上海莱士血液制品股份有限公司 | 从人血浆组分四沉淀制备高纯Apoa-I的生产工艺 |
US20140087419A1 (en) * | 2011-04-28 | 2014-03-27 | Riken | Method for making biological material transparent and use thereof |
CN107300496B (zh) | 2011-05-20 | 2020-11-24 | 国立研究开发法人理化学研究所 | 生物材料用透明化试剂、及其利用 |
CN103703015B (zh) | 2011-08-25 | 2019-07-05 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 阳离子和阴离子交换层析法 |
CN103505720A (zh) * | 2012-06-30 | 2014-01-15 | 复旦大学 | 载脂蛋白a-i在制备预防和治疗肝病代谢综合征药物中的用途 |
US9534029B2 (en) | 2012-10-03 | 2017-01-03 | Csl Behring Ag | Method of purifying proteins |
US10267714B2 (en) | 2013-08-14 | 2019-04-23 | Riken | Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof |
CN107033237B (zh) * | 2017-05-11 | 2021-07-20 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 一种人血浆载脂蛋白a-i的分离纯化方法 |
CN110590935B (zh) * | 2019-09-23 | 2024-01-30 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 人血白蛋白去除多聚体工艺 |
CN111153985B (zh) * | 2020-01-20 | 2023-06-13 | 宁波赛珀生物技术有限公司 | 血清载脂蛋白a-ii的分离纯化方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1752187A3 (ru) * | 1990-12-11 | 1992-07-30 | А.Б.Сигалов | Способ делипидировани лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека |
US5525472A (en) * | 1991-06-26 | 1996-06-11 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification or recombinant Apolipoprotein E from bacteria |
US6423830B1 (en) * | 1996-08-23 | 2002-07-23 | Esperion Therapeutics, Inc. | Process for purifying apolipoprotein A or apolipoprotein E |
EP0813541B1 (en) * | 1995-03-03 | 2003-05-14 | Esperion Therapeutics Inc. | Process for producing a protein |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004010939A2 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-05 | Esperion Therapeutics, Inc. | Methods of using non-human animal apoliprotein a-i protein |
-
2006
- 2006-12-20 CN CN200610147503A patent/CN100586958C/zh active Active
-
2007
- 2007-09-19 KR KR1020097014720A patent/KR101363106B1/ko active IP Right Grant
- 2007-09-19 BR BRPI0721238A patent/BRPI0721238B8/pt active IP Right Grant
- 2007-09-19 CA CA2673516A patent/CA2673516C/en active Active
- 2007-09-19 EP EP07861342.9A patent/EP2125861B1/en active Active
- 2007-09-19 RU RU2009127816/04A patent/RU2453555C2/ru active
- 2007-09-19 MY MYPI20092514A patent/MY154897A/en unknown
- 2007-09-19 WO PCT/US2007/020258 patent/WO2008088403A2/en active Application Filing
- 2007-09-19 MX MX2009006766A patent/MX2009006766A/es active IP Right Grant
- 2007-09-19 JP JP2009542756A patent/JP2010513480A/ja active Pending
- 2007-11-30 TW TW096145616A patent/TWI357347B/zh active
-
2009
- 2009-06-18 EG EG2009060940A patent/EG26516A/en active
- 2009-07-14 AU AU2009202827A patent/AU2009202827B8/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1752187A3 (ru) * | 1990-12-11 | 1992-07-30 | А.Б.Сигалов | Способ делипидировани лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека |
US5525472A (en) * | 1991-06-26 | 1996-06-11 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification or recombinant Apolipoprotein E from bacteria |
EP0813541B1 (en) * | 1995-03-03 | 2003-05-14 | Esperion Therapeutics Inc. | Process for producing a protein |
US6423830B1 (en) * | 1996-08-23 | 2002-07-23 | Esperion Therapeutics, Inc. | Process for purifying apolipoprotein A or apolipoprotein E |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
H. Mezdour «Anion-exchange fast protein liquid chromatographic characterization and purification of apolipoproteins A-I, A-II, C-I, C-II, C-III 0 , C-III 1 , C-III 2 and E from human plasma», Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1987, v. 414, p.35-45. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EG26516A (en) | 2014-01-08 |
CN101205250A (zh) | 2008-06-25 |
RU2009127816A (ru) | 2011-01-27 |
AU2009202827A8 (en) | 2012-03-08 |
CA2673516C (en) | 2013-10-08 |
CN100586958C (zh) | 2010-02-03 |
AU2009202827A1 (en) | 2009-08-06 |
JP2010513480A (ja) | 2010-04-30 |
WO2008088403A2 (en) | 2008-07-24 |
KR20090116706A (ko) | 2009-11-11 |
MY154897A (en) | 2015-08-28 |
EP2125861A4 (en) | 2011-02-02 |
TWI357347B (en) | 2012-02-01 |
BRPI0721238B8 (pt) | 2021-05-25 |
BRPI0721238B1 (pt) | 2018-05-29 |
AU2009202827B2 (en) | 2011-12-15 |
TW200922675A (en) | 2009-06-01 |
CA2673516A1 (en) | 2008-07-24 |
AU2009202827B8 (en) | 2012-03-08 |
EP2125861B1 (en) | 2014-07-16 |
EP2125861A2 (en) | 2009-12-02 |
BRPI0721238A2 (pt) | 2015-06-23 |
MX2009006766A (es) | 2009-08-12 |
KR101363106B1 (ko) | 2014-02-13 |
WO2008088403A3 (en) | 2008-11-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2453555C2 (ru) | Способ очистки аполипопротеина а-1 | |
JP6456376B2 (ja) | 組換えタンパク質の精製方法 | |
KR101769634B1 (ko) | 재조합 adamts13 및 기타 단백질을 정제하는 방법, 그리고 이들의 조성물 | |
JP3262128B2 (ja) | 蛋白質の精製方法 | |
CN103998456B (zh) | 用于蛋白质的混合式色谱纯化的固相 | |
JP2013519652A (ja) | 単一ユニット抗体精製 | |
EP1963367A2 (en) | Polishing steps used in multi-step protein purification processes | |
JP6788533B2 (ja) | 陰イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質の精製方法 | |
US8013122B2 (en) | Method of purifying apolipoprotein A-1 | |
CA2233552A1 (en) | Source of apolipoprotein e and method of isolating apolipoprotein e | |
Fan et al. | Directing membrane chromatography to manufacture α1-antitrypsin from human plasma fraction IV | |
NO874231L (no) | Rensing av rekombinant tumornekrosefaktor. | |
FI119377B (fi) | Menetelmä tekijän IX valmistamiseksi biologisista lähteistä | |
JP2023515123A (ja) | アダリムマブのnon-protein a精製方法 | |
CN103328000A (zh) | 用于从含有凝血因子的溶液中减少和/或除去FXI和FXIa的方法 | |
CN105738628A (zh) | 一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白a-i多克隆抗体的方法 | |
CZ291708B6 (cs) | Způsob výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X | |
Cedervall et al. | Rapid and facile purification of apolipoprotein AI from human plasma using thermoresponsive nanoparticles | |
Kong et al. | An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography | |
JP2014529330A (ja) | 単一ユニットクロマトグラフィー抗体精製 | |
CA1151542A (en) | Process for preparing the third component of the complement from human blood plasma | |
Ostrihoňová et al. | Recombinant human erythropoietin separation using a cation-exchange multimodal adsorbent | |
Vaskó et al. | Development and Comparison of Alternative Methods for the Purification of Adalimumab Directly from Harvested Cell Culture Fluid | |
Vaskó et al. | Razvoj i usporedba alternativnih metoda pročišćavanja adalimumaba izravno iz suspenzije stanične kulture | |
JP3891635B2 (ja) | ガングリオシド定量法及びそれに使用する定量キット |