FI119377B - Menetelmä tekijän IX valmistamiseksi biologisista lähteistä - Google Patents

Description

119377

Menetelmä tekijän IX valmistamiseksi biologisista lähteistä Tämä keksintö koskee menetelmää tekijän IX valmis-5 tamiseksi biologisista lähteistä kromatografisesti samoin kuin keksinnön mukaisella menetelmällä aikaansaatavissa olevaa tekijää IX.

Valmistettaessa tekijää IX esimerkiksi veriplasmasta ensin erotetaan kryogeeninen sakka. Jäädytetty sitraat-10 tiplasma sulatetaan ja suurin osa tekijästä VIII ja fibri-nogeenista erotetaan sentrifugoimalla. Siten saatava kryo-geenisesti köyhdytetty sakka sisältää K-vitamiinista riippuvaisia hyytymistekijöitä, joiden aktiivisuus on suuruusluokkaa 0,01 ky/mg proteiinia.

15 Tekniikan nykytasosta tutun menetelmän mukaan K- vitamiinista riippuvaiset hyytymistekijät sidotaan erottamalla ne anioninvaihtimilla, kuten DEAE Sephadexilla, vaikuttamatta haitallisesti albumiinin talteensaantiin. DEAE Sephadexin heikkojen virtausominaisuuksien vuoksi 20 tämä vaihe on tavallisesti kuitenkin toteutettava kiinteä-faasierotuksena erämenetelmällä. DEAE Sephadexin eluoinnin jälkeen saatavat jakeet toimivat sitten lähtömateriaalina • · · * . tekijän IX puhdistuksessa. Plasman sisältämät proteaasit- • · 1 **“1 kin rikastuvat kuitenkin tähän jakeeseen, mistä on seu- • · 1 25 rauksena kiinnostuksen kohteena oleva aineen, tekijän IX, • · · : .1 saannon pieneneminen proteolyyttisen hajotuksen johdosta ·· • ’·· ja valmisteen trombogeenisuuden vaaran kasvu.

• 1 1 : Keksinnön päämääränä on tarjota menetelmä, joka vähentää mainittuja vaaroja ilman proteaasi-inhibiittorei-30 den lisäystä. Yllättäen tämä päämäärä saavutetaan menetel- • · .1·1. mällä, jolla on patenttivaatimuksessa esitetyt tunnusmer- • · 1 kit. Se käsittää tekijää IX sisältävän biologisen lähteen * · · *·’·1 käsittelemisen proteiininsaostusaineella. Mahdollisia bio- • · 1 ·...1 logisia lähteitä ovat erityisesti veriplasma ja kryogeeni- ··· * · • · • · · · • · · • · • t 119377 2 nen sakka, josta on poistettu tekijä VIII ja fibrinogeeni (kryogeenisesti köyhdytetty plasma).

Proteiininsaostusaineen pitoisuus on erityisesti 1,5 - 2,3 mol/1, edullisesti 1,75 - 1,9 mol/1. Arvot tar-5 koittavat proteiininsaostusaineen pitoisuutta tekijää IX sisältävissä lähteissä (loppupitoisuutta).

Proteiininsaostusaineena tulee erityisesti kysymykseen ammoniumsulfaatti.

Keksinnön mukainen prosessi pienentää proteolyyt-10 tistä aktiivisuutta ainakin yhdellä kertaluvulla. Lisäksi saostusvaiheen avulla poistetaan häiritseviä komponentteja, kuten tekijä VII ja tekijä II, ennen varsinaista tekijän IX kromatografista puhdistusta. Myös proteiinit C ja S poistuvat. Mitä tekijään VII tulee, se saadaan poistetuksi 15 lähes täydellisesti. Myös tekijä II saadaan poistetuksi melko täydellisesti (70 - 90-prosenttisesti), kun sen sijaan proteiinien C ja S poistuma on noin 50 %.

Tekijän IX aktiivisuus proteiininsaostusaineella käsitellyn jakeen supernatantissa on tyypillisesti 20 -20 30 ky/ml, joka vastaa ominaisaktiivisuutta 1-5 ky/mg.

Keksinnön mukaista saostusvaihetta, joka toteute-taan edullisesti ammoniumsulfaattia käyttämällä, seuraa • · · * , runsaasti tekijää IX sisältävän jakeen erottaminen kroma- * * * ·“* tografisesti. Siinä käytetään hyväksi sitä seikkaa, että • · •••j 25 korkeiden suolapitoisuuksien läsnä ollessa proteiinit ky- : *.* kenevät osallistumaan hydrofobisiin vuorovaikutuksiin eri ·· i *·· asteisesti. Keksinnön mukaisesti tekijä IX sidotaan edul- • · · : lisesti proteiinien saostuksesta peräisin olevien suhteel lisen korkeiden suolapitoisuuksien läsnä ollessa kromato- ;V. 30 grafiamateriaaliin, joka on käyttökelpoinen hydrofobiseen • · .*··, vuorovaikutukseen perustuvassa kromatografiässä (HIC) .

Tämä alentaa samalla proteiinien saostuksesta peräisin * · · *·*·* olevaa korkeata suolapitoisuutta. Erityisesti voidaan Φ · · käyttää kromatografiamateriaalia, jossa on substraattima- t j***. 35 teriaaliin sidottuna hydrofiilinen taipuisa haara (tunto- • · * • · • · · • »* • · 3 119377 sarvi). Kyseisiin väliryhmiin on sitten kovalenttisesti sitoutunut vastaavia ligandeja, erityisesti hydrofobisia ligandeja, kuten propyyli-, butyyli- tai fenyyliryhmiä.

Proteiininsaostusaineella käsitellyn jakeen super-5 natantti laitetaan sitten asianmukaisen kromatografiamate-riaalin päälle ja mahdollisesti pestään. Pylvääseen sitoutunut tekijä IX, joka sisältää yhä tekijää X, voidaan elu-oida puskurilla, joka sisältää proteiininsaostusainetta pienempänä pitoisuutena; eluointiliuoksen ionivahvuus on 10 siis pienempi kuin pylvääseen laitetun liuoksen. HIC-mate-riaalia sisältävästä kromatografiapylväästä eluoituva jae, joka sisältää tekijää IX, kerätään ja siitä poistetaan vielä suola asianmukaisin keinoin. Suolan poisto voidaan toteuttaa esimerkiksi ultrasuodattamalla ja/tai diasuodat-15 tamalla.

Tekijän IX erottaminen edelleen esimerkiksi mukana seuranneesta tekijästä X toteutetaan yhdessä tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa affiniteettikromatografi-an avulla hepariinilla muunnetulla substraatilla. Kun mai-20 nittuja tekijöitä sisältävän liuoksen ionivahvuus on suh teellisen pieni, tekijät sitoutuvat kromatografiamateriaa-liin. Häiritsevä tekijä X, jos sitä on läsnä, eluoidaan i » » * . liuoksella, joka sisältää 150 - 300 mmol natriumkloridia/ • · · *··* 1. Kyseisissä olosuhteissa tekijä IX pysyy hepariinilla i«* ···! 25 muunnettuun af f initeettisubstraattiin sitoutuneena. Sen • · · * · : .· jälkeen kun vesiliuoksen ionivahvuus nostetaan suunnilleen • · • *·· kaksinkertaiseksi, tekijä IX alkaa erottua affiniteetti- • · · •ti : substraatin pinnasta.

Virusten inaktivointi voidaan tehdä kemiallisin 30 ja/tai fysikaalisin menetelmin. Fysikaalinen menetelmä • · .**·. virusten inaktivoimiseksi käsittää pääasiassa kunkin ja- ··· /m keen lämpökäsittelyn (5 - 30 tuntia lämpötilassa 60 - • · · *·*·* 65 °C) . Lämpökäsittely voidaan tehdä erityisesti heparii- ·♦· ·...* niaf f initeettikromatograf iän jälkeen. Kemiallinen menetel- .***. 35 mä virusten inaktivoimi seksi käsittää esimerkiksi tekijää • · • · · • ·· • · 119377 4 IX sisältävän jakeen käsittelemisen ionittomilla pinta-aktiivisilla aineilla ja dialkyyli- tai trialkyylifosfaa-teilla, Erityisesti voidaan käyttää Tweenin ja tri-n-but-yylifosfaatin (TNBP) yhdistelmiä. Menetelmiä virusten in-5 aktivoimiseksi on kuvattu EP-hakemusjulkaisuissa 0 131 740 ja Horowitz et ai., Blood 79 (1992) 826.

Virusteninaktivointimenetelmiä voidaan myös yhdistää, kuten julkaisussa W0 94/17 834 on kuvattu. Virusten kemiallinen inaktivointi tehdään edullisesti hydrofobiseen 10 vuorovaikutukseen perustuvaa kromatografiaa seuraavan ult-rasuodatuksen/diasuodatuksen j älkeen.

Keksinnön mukaista menetelmää käyttämällä erittäin puhtaan tekijän IX kokonaissaanto voidaan nostaa 20 -30 %:iin plasmasta.

15 Kuvio esittää keksinnön mukaista menetelmää kroma- tografisine jälkipuhdistusvaiheineen kulkukaavion muodossa. Nuolet osoittavat, mitkä jakeet erotetaan pois ja mitkä pysyvät vastaavissa eluaateissa ja supernatanteissa.

Seuraava esimerkki havainnollistaa keksintöä: 20 Jäähdytetty sitraattiplasma sulatetaan ja sitä se koitetaan lämpötilassa 0 - 3 °C. Tekijä VIII ja fibrino-geeni erotetaan sentrifugoimalla. Saatava kryogeenisesti • · * t köyhdytetty sakka sisältää K-vitamiinista riippuvaisia **; hyytymistekijöitä, joiden ominaisaktiivisuus on noin • · 25 0,01 ky/mg proteiinia. Seuraava sieppausvaihe käsittää • · · | ·* kiinteäfaasierotuksen tai -kromatografiakäsittelyn DEAE- : ** ioninvaihtimilla, jolloin IgG ja albumiini erottuvat. K- * · * ·.* · vitamiinista riippuvaisia hyytymistekijöitä on läsnä aktiivisuutta 10 - 50 ky/ml vastaava määrä, joka vastaa :V; 30 suunnilleen rikastuskerrointa 3 500 tekijän IX suhteen.

• * ·*"; Sieppausvaihetta seuraa sitten varsinainen puhdis- • · · ,*, tus. Sieppausvaiheesta saatavaan jakeeseen lisätään sei- • · *^·* lainen määrä ammoniumsulfaattiliuosta, että sen loppupi- · '···' toisuudeksi muodostuu 1,9 mol/1. C- ja S-proteiinit saa- 35 daan poistetuiksi noin 50-prosenttisesti, kun taas tekijä ··· • m • · t • »« • · 5 119377 II saadaan poistetuksi 50 - 70-prosenttisesti ja tekijä VII lähes kvantitatiivisesti. Ammoniumsulfaattisaostukses-ta saatavalle supernatantille tehdään hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuva kromatografinen käsittely sopivalla 5 tavalla muunnetulla tuntosarvigeelillä. Ammoniumsulfaatin pitoisuus geelille laitettavassa liuoksessa on noin 1,75 mol/1. Käytettävä puskuri sisältää myös fosfaatti-ioneja. Hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuva kromato-grafia johtaa jäljellä olevan tekijän VII ja tekijän IX 10 sitoutumiseen. Tekijä X sitoutuu materiaaliin 70 - 80-pro-senttisesti. Tekijän IX ja tekijän X seos eluoidaan liuoksella, joka sisältää 1,2 - 1,4 mol ammoniumsulfaattia/1. Eluentti ei sisällä tekijää VII eikä oleellisesti proteo-lyyttistä aktiivisuutta. Tekijän IX ominaisaktiivisuus 15 tekijän IX ja tekijän X seoksessa on 5 - 15 ky/mg proteiinia .

Eluaatissa läsnä oleva ammoniumsulfaatti poistetaan ultrasuodattamalla ja diasuodattamalla. Virusten inakti-vointi detergenteillä tehdään Tween 80 :n (noin 1 %) ja 20 TNBP:n (0,3 %) yhdistelmällä käsittelemällä.

Detergentin erotuksen jälkeen saatavalle jakeelle .···. tehdään sitten hepariiniaffiniteettikromatografiakäsitte- • · · ly. Tekijät X ja IX sitoutuvat hepariinigeeliin osmolaari- • · **I suuden ollessa alhainen. Tekijä X saadaan puskurilla, joka «·· :;·· 25 sisältää 0,25 ml NaCl:a/l, pesemällä. Tekijä IX eluoituu • · · • ·’ nostettaessa natriumkloridin pitoisuus arvoon 0,45 mol/1.

* · ϊ ’1 Tekijää IX on sen jälkeen läsnä eluaatissa 30 - 50 ky/ml ··· V· ja sen ominaisaktiivisuus on yli 100.

Tällä tavalla aikaansaatavasta jakeesta, joka si- :Y: 30 sältää tekijää IX, poistetaan suola ja se kylmäkuivataan.

»« • · • · ·φ« m • · • · ♦ I · « • «·1 • · • · • •e «·· • · • ♦ ··· · ♦ · · • ·· • ·

Claims (9)

119377

1. Menetelmä tekijän IX valmistamiseksi biologisista lähteistä kromatograf isesti, tunnettu siitä, että 5 ennen affiniteettikromatografisiä erotuksia mainittu lähde käsitellään ammoniumsulfaatilla pitoisuutena 1,5 - 2,3 mol/1 (loppupitoisuus).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu biologinen lähde on veriplasma tai plasma, josta 10 on poistettu tekijä VIII ja fibrinogeeni erottamalla kryo-geeninen sakka (kryogeenisesti köyhdytetty plasma).

3. Ainakin yhden patenttivaatimuksista 1 ja/tai 2 mukainen menetelmä, jossa ammoniumsulfaatin poisto ja tekijän IX rikastus adsorboimalla tekijä IX kromatografiamate- 15 riaaliin, joka on käyttökelpoinen hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvassa kromatografiässä (HIC), toteutetaan proteiinien saostuksen jälkeen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, jossa mainittu kromatografiamateriaali, johon tekijä IX on adsor- 20 boitunut, käsitellään vesiliuoksella, jolla on tekijän IX erottamisesta mainitusta HIC-materiaalista peräisin oleva :T: ionivahvuus. • .1·

5. Patenttivaatimuksen 3 ja/tai 4 mukainen menetel- «M mä, jossa jakeet, jotka saadaan sen jälkeen, kun tekijä IX on ··", 25 erotettu mainitusta HIC-materiaalista, alistetaan prosessi- • · I. ' vaiheeseen, jossa tekijää ix sisältävän liuoksen suolapi- • t· toisuutta pienennetään esimerkiksi ultrasuodattamalla/diasuo- • t i *·1 1 dattamalla.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jota • · \V 30 seuraa affiniteettikromatografia hepariinilla muunnetulla ·«· ϊ.,.ϊ substraattimateriaalilla.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukai- • 1 1 nen menetelmä, jossa virusten inaktivointi tehdään kemial- • · Ί1 lisella ja/tai fysikaalisella menetelmällä. ··· • · • Φ ·1· · * · 1 • 1 · • 1 119377

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa mainittu fysikaalinen virusten inaktivointi käsittää 5-30 tuntia kestävän kuumennuskäsittelyn lämpötilassa 60 - 65 °C, erityisesti mainitun, patenttivaatimuksen 6 mukaisen, hepa- 5 riinilla toteutettavan affiniteettikromatografiän jälkeen.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa mainittu kemiallinen virusten inaktivointi käsittää tekijää IX sisältävän näytteen käsittelemisen ionittomilla deter-genteillä/dialkyloiduilla tai trialkyloiduilla fosfaateil- 10 la. ··· • 1 · • · · • 1 · • · · «·· * *·· « ···· ·1 · • · « • · • 1 ·» • · • »· »·· • · · • · · • · • 1 1 » I 4 t · ··· • · • « ··· • · • · · • · · • · ··· • · • · »1· ··1 • 9 « · ··· · • · · • ·# • · 119377