CN1181782A - 一种从生物原料中制备因子ix的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过层析从生物材料中制备因子IX的方法,其特征在于:在所有的层析之前,所述原料经过了蛋白质沉淀剂处理。
Description
本发明涉及一种通过层析从生物原料中制备因子IX的方法,以及可从根据本发明的方法得到的因子IX。
例如,从血浆中制备因子IX时,低温沉淀物是首先被分离的。冷冻的柠檬酸盐血浆被解冻,其中主要的因子VIII和纤维蛋白原可通过离心被分离出来。这样得到的冷冻处理后(cryopoor)的血浆包含了一些依赖于维生素K的凝固因子,它们的活性在0.01IU/mg蛋白的数量级。
就已知的现有技术来说,维生素K依赖性因子可通过阳离子交换剂吸附而被结合,如DEAE-Sephadex,且对白蛋白的回收无不利影响。然而,由于DEAE-Sephadex的流动特性差,在批量操作时这一步常必需进行固相提的。经DEAE-Sephadex洗脱后的级分即作为纯化因子IX的初始材料。然而,血浆中的蛋白酶在级分中也被浓缩,它们对蛋白质的水解作用可导致因子IX这一目标材料的损失,并增加了制剂中凝血的危险性。
本发明的目的是提供一种方法,使该过程既减少了上述的危险性,又不增加蛋白酶抑制剂。令人惊异的是,通过使用权利要求特征的方法,实现了这一目标。这包括用蛋白质沉淀剂处理含因子IX的生物原料。具体的候选生物材料是血浆或经冷冻沉淀除去了因子VIII和纤维蛋白原的血浆(即冷冻处理后的血浆)
具体地,蛋白质沉淀剂的浓度为1.5~2.3mol/l,优选浓度可为1.75~1.9mol/l。该值与含因子IX的生物材料中存在的蛋白质沉淀剂浓度有关。
蛋白质沉淀剂,可特别考虑硫酸铵。
据发明所述的方法,蛋白水解活性至少被降低了一个数量级。另外,象因子VII和因子II等干扰组分也可通过实际层析纯化因子IX前的蛋白质沉淀步骤而除去。蛋白质C和S也被剔除。至于因子VII,几乎可全部除去。因子II相当完全地被去除(70到90%),蛋白质C和S被除去约50%。
在用蛋白质沉淀别处理过的级分上清中,因子IX的活性一般在20到30IU/ml,相当于比活1到5IU/mg。
按照本发明的沉淀步骤,优选使用硫酸铵,沉淀步骤之后即是对因子IX浓集的级分进行层析分离。这利用了高盐浓度下蛋白质有不同程度疏水性相互作用的特点。根据本发明,因子IX优选在相对高盐浓度存在下被结合,该高盐浓度来源于蛋白质沉淀,被加到了可用于疏水相互作用层析的层析材料中。该步同时降低了由蛋白质沉淀处理所导致的高盐浓度。尤其是,当层析材料已被结合在亲水弹性臂(触角)基质材料上时,即可使用该层析材料。接着与这些间隔壁共价结合的是相应的配基,特别是疏水配基,例如丙基,丁基,和苯基基团。
将蛋白质沉淀处理后的级分上清液上适当的层析材料。并任意洗涤。结合在层析柱上的因子IX以及因子X可用较低浓度的含蛋白质沉淀剂的缓冲液洗脱,其中,洗脱液离子强度的减少视所用的溶液浓度而定。含有因子IX的级分从含有疏水互作层析材料上被洗脱和收集,并被用于以后适当方法的脱盐步骤。比如,脱盐步骤可用超滤和/或透滤。
进一步地将因子IX分离,如从所伴随因子X中,可以本发明的优选实施方案进行,即用肝素修饰基质的亲和层析进行分离。当包含了上述因子的溶液离子强度相对较低时,这些因子被吸附到层析材料上。如果有干扰因子X存在,因子X可用浓度为150-300mmol/l的氯化钠溶液洗脱。在这种条件下,因子IX仍将结合在肝素处理的亲和层析基质上。将水溶液中的离子强度提高到约二倍,因子IX便开始从亲和基质上被分离。
病毒的灭活可以用化学和或物理方法。物理方法的灭活基本上包括了每个级分经60到65℃下5至30小时的热处理。这样的热处理尤其可在肝素亲和层析之后进行。化学方法的病毒灭活包括的方法如一种用非离子表面活性剂及二烷基或三烷基磷酸酯对含因子IX的级分的处理,尤其是,吐温和三正丁基磷酸酯(TNBP)的结合使用。病毒灭活的方法在EP0131740或Horowitz等人发表在血液,79(1992)826上的文章已有描述。
病毒灭活的方法间可以联合使用,如WO 94/17834中所描述的方法。优选的方法是,疏水性层析之后进行超滤或透滤,之后再进行化学灭活。
按照本发明的应用办法,从血浆中获取高纯度的因子IX的产率可增加到为血浆的20到30%。
附图示本发明的方法,连续的纯化步骤以流程图形式表示。流程图中的箭头指的是被分离的物品和残留下的,即存在于上清液和洗脱液中的物质。
下面的实施例将用于阐明本发明。
冷冻的含柠檬酸盐的血浆被解冻至0到3℃,搅拌。离心分离因子VIII和纤维蛋白原。所获的冷冻处理后血浆级分含有维生素K依赖性凝固因子。其比活约0.01IU/mg。之后的收集步骤包括了固相提取或用DEAE-Sephadex离子交换层析。从而分离了IgG和白蛋白。维生素K依赖性凝固因子所表现的活性为10-50IU/ml,以因子IX为参照,这一结果相当于浓缩了3500倍。
在实际的纯化之后进行捕获。向从捕获步骤得到的级分中加入硫酸铵,并使最后浓度达到约为1.9mol/l,这时,蛋白质C和S被除去约50%,因子II被除去70-90%,因子VII几乎全部被除去。经硫酸铵沉淀处理后的上清液被用于疏水互作层析,这种层析的基质是经过了适当修饰后的具“触角”的凝胶。使用的硫酸铵浓度约为1.75mol/l。所用的缓冲液也含有磷酸根离子。疏水互作层析使残留的因子VII和因子IX吸附在材料上, 因子X被吸附70到80%。因子IX/因子X混合物的洗脱用硫酸铵溶液进行,其中,硫酸铵溶液的浓度为1.2-1.4mol/l。洗脱液中不含因子VII,也基本上无蛋白水解活性。在因子IX和因子X混合物中,因子IX的比活为5-15IU/mg蛋白。
存在于洗脱液中的硫酸铵可通过超滤和透滤除去。用去污剂灭活病毒可用约1%吐温80/0.3%TNBP进行。
分离了去污剂后,所获的分离液被用于肝素亲合层析。在低渗透势下,因子X和IX被吸附到肝素凝胶上。用0.25mol/l NaCl缓冲液可将因子X洗脱。将NaCl的浓度增加至0.45mol/l时,因子IX也被洗脱。洗脱物中存在的因子IX约为30~50IU/ml,其比活大于100。
所获含因子IX的提取物被脱盐和冷冻干燥。
Claims (12)
1.一种通过层析从生物原料中制备因子IX的方法,其特征在于,在对原料进行任何层析分离之前,先用蛋白质沉淀剂处理。
2.权利要求1的方法,其中的生物材料是血浆或者是经冷冻沉淀分离并除去了因子VIII及纤维蛋白原的血浆(冷冻处理后的血浆)。
3.权利要求1或2的方法,其中所述蛋白质沉淀剂是硫酸铵。
4.权利要求1~3中至少之一的方法,其中所指的蛋白质沉淀剂的应用浓度为1.5-2.3mol/l(终浓度)。
5.权利要求1-4中至少之一的方法,其中在蛋白质沉淀之后,可除去蛋白质沉淀剂并通过将因子IX吸附到能用于疏水相互作用层析(HIC)的层析材料上而浓缩因子IX。
6.权利要求5的方法,其中所述含有被吸附的因子IX的层析材料被其离子强度可导致因子IX从所述HIC材料中分离出来的水溶液处理。
7.权利要求5和/或6的方法,其中所说的来自疏水相互作用层析材料分离后得到的含因子IX的级分进入降低含因子IX的溶液的盐浓度的步骤,如超滤或透滤。
8.权利要求7的方法,其后用肝素修饰的基质材料进行亲和层析。
9.权利要求1-8任一项的方法,其中的病毒灭活可用化学和/或物理学方式进行。
10.权利要求9的方法,其中所说的病毒物理灭活包括60-65℃下热处理5-30小时,特别是在权利要求8的肝素亲和层析之后进行。
11.权利要求9的方法,其中所说的病毒化学灭活包括了用非离子去污剂/二烷基化磷酸酯或三烷基化磷酸酯对含因子IX的样品进行处理。
12.可由权利要求1-11中至少之一的方法得到的因子IX。
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